CN109628480B - 玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用 - Google Patents

玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109628480B
CN109628480B CN201811554223.7A CN201811554223A CN109628480B CN 109628480 B CN109628480 B CN 109628480B CN 201811554223 A CN201811554223 A CN 201811554223A CN 109628480 B CN109628480 B CN 109628480B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
gene
zmpla1e
haploid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811554223.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109628480A (zh
Inventor
陈绍江
钟裕
刘晨旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Publication of CN109628480A publication Critical patent/CN109628480A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109628480B publication Critical patent/CN109628480B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用。本发明首次利用交换单株后代测验的方法，成功证明ZmPLA1E基因在编码区发生突变后，在自交或作为父本与其他玉米材料杂交过程中能够产生并显著提高孤雌生殖单倍体诱导能力。本发明的单倍体诱导基因ZmPLA1E对于培育高频孤雌生殖单倍体诱导系及单倍体技术的应用具有重要意义。

Description

玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用，特别涉及玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其在产生并显著提高孤雌生殖单倍体诱导能力的应用。
背景技术
玉米是我国种植面积第一大作物，2012年，玉米播种面积超过3400万hm2。我国97％以上的玉米播种面积使用杂交玉米(Li J，2009)。优良玉米自交系的选育是玉米利用杂种优势、选育优良杂交种的基础和关键。但传统选育方法需要7～8个世代才能获得较为稳定的自交系，而单倍体育种技术只需2个世代(Weber D F，2014)。因此，单倍体育种技术作为一种快速获得纯系的方法已经被国内外许多种业公司规模化应用，成为可与转基因技术、分子标记辅助育种技术相媲美的现代化玉米育种三大核心技术之一(陈绍江等，2009)。
由于诱导系通过生产孤雌生殖而产生孤雌生殖单倍体的方法具有广泛的应用前景和价值，因此，全球多家科研单位对于Stock6及其衍生系诱导产生孤雌生殖单倍体的遗传基础和生物学基础进行了大量的研究。结果表明：玉米孤雌生殖诱导能够产生玉米单倍体这一性状是可遗传的，并受到多个遗传位点的控制。
Figure BDA0001911423840000011
等(1999)首次检测到2个控制诱导率性状的遗传位点，分别位于1号染色体和2号染色体，共能解释约17.9％的表型变异。Barrant等(2008)同样在1号染色体相同区域检测到了一个既影响单倍体诱导率又引起群体偏分离的主效QTL。Prigge等(2012)利用多个群体进行全基因组扫描，共发现8个控制诱导率的遗传位点，其中有2个为主效QTL。位于1号染色体上的1.04bin区域的主效QTL位点qhir1能够解释66％的遗传变异，位于9号染色上的9.01bin区域的主效QTL位点qhir8能够解释20％的遗传变异。其中qhir1已被定位到了243kb的物理区间(Dong X et al.,2013)，并成功在该区间克隆到一个磷脂酶基因，该基因功能丧失能够诱导单倍体的产生(Kelliher T et al.,2017；Liu C et al,2017；Gilles L M,et al,2017)。qhir8作为另一个主效QTL，能够显著提高单倍体诱导率。Liu等(2015)对qhir8进行了精细定位，以诱导能力低的诱导系CAUHOI(2％)和诱导率高的诱导系UH400(8％)杂交后代为定位群体，最终将qhir8定位到了标记4292232和umc1867之间，其物理距离约为789kb。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物母本单倍体诱导系的制备方法。
本发明提供的植物母本单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA1E基因的表达和/或活性或敲除ZmPLA1E基因，得到转基因植物，即为植物母本单倍体诱导系。
上述方法中，所述沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA1E基因的表达和/或活性或敲除ZmPLA1E基因为突变目的植物基因组中ZmPLA1E基因使目的植物基因组中ZmPLA1E基因表达量降低或使目的植物基因组中ZmPLA1E基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。
上述方法中，所述使目的植物基因组中ZmPLA1E基因表达量降低的方式可为RNAi干扰或过表达或启动子编辑。所述RNAi干扰可为单链RNA干扰，如miRNA，也可为双链RNA干扰，如siRNA、dsRNA、shRNA等。
所述使目的植物基因组中ZmPLA1E基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式可为CRISPR/Cas9或TELLEN或T-DNA插入或EMS诱变。
进一步的，所述使目的植物基因组中ZmPLA1E基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式可为CRISPR/Cas9。
更进一步的，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第163-182位或第210-229位；所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列为序列6。
在本发明的具体实施例中，所述使目的植物基因组中ZmPLA1E基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方法包括如下步骤：将表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体导入目的植物中，得到转基因植物。所述CRISPR/Cas9载体具体为将序列5所示的sgRNA的编码DNA分子插入pBUE411载体后得到的载体。
本发明的另一个目的是提供一种植物母本单倍体的制备方法。
本发明提供的植物母本单倍体的制备方法包括如下步骤：将由上述方法制备的植物母本单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他植物材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述植物母本单倍体。
所述植物母本单倍体的制备方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定、叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为植物母本单倍体。
所述单倍体性状鉴定方法可按照如下方法进行：若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，披散，育性正常等特征，则该植株为或候选为二倍体。
所述叶片倍性鉴定方法可按照如下方法进行：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体玉米叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的信号峰出现在100附近，其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，则该植株为或候选为二倍体。
所述分子标记鉴定可按照如下方法进行：采用父本(母本单倍体诱导系)和母本间多态性引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测植株为单倍体还是二倍体：若待测植株的扩增产物仅具有母本的带型，不存在父本的带型，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的扩增产物具有父本和母本的杂合带型，则该植株为或候选为二倍体。
本发明还有一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列3或序列4所示的蛋白质；
b)在序列3或序列4所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列3或序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
d)与序列3或序列4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。
本发明的单倍体诱导基因ZmPLA1E编码的蛋白的氨基酸序列如序列3所示。突变后的ZmPLA1E编码的蛋白的氨基酸序列可为序列4，如CAU5中的ZmPLA1E蛋白的氨基酸序列。序列3所示的ZmPLA1E蛋白的氨基酸序列或经过改造使序列3所示的ZmPLA1E蛋白丧失功能后得到的氨基酸序列(如序列4所示)均属于本发明的保护范围。
本发明还有一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述相关生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列1或序列2所示的cDNA分子或基因组DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
本发明的单倍体诱导基因ZmPLA1E序列如序列1所示。突变后的ZmPLA1E基因序列可为序列2，如CAU5中的ZmPLA1E基因序列。序列1所示的ZmPLA1E基因序列或经过改造使序列1所示的ZmPLA1E基因序列发生缺失突变或插入突变或碱基替换后得到的DNA分子均属于本发明的保护范围。
本发明的最后一个目的是提供如下1)-6)任一种应用：
1)由上述方法制备的植物母本单倍体诱导系在制备植物母本单倍体中的应用；
2)沉默或抑制目的植物基因组中ZmPLA1E基因的表达和/或活性或敲除ZmPLA1E基因的物质在制备植物母本单倍体诱导系或植物母本单倍体中的应用；
3)由上述方法制备的植物母本单倍体诱导系或由上述方法制备的植物母本单倍体在植物杂交种选育或植物单倍体育种中的应用；
4)上述蛋白质或生物材料在调控植物母本单倍体诱导系的诱导率中的应用；
5)上述蛋白质或生物材料在提高植物母本单倍体诱导系的诱导率中的应用；
6)上述蛋白质或生物材料在培育植物母本单倍体中的应用。
上述应用中，所述敲除ZmPLA1E基因的物质为上述表达所述sgRNA的CRISPR/Cas9载体。所述CRISPR/Cas9载体具体为将序列表中序列5所示的sgRNA的编码DNA分子插入pBUE411载体后得到的载体。
上述应用或方法中，所述目的植物或植物可为玉米；所述玉米可为野生型玉米B104。
本发明从玉米中克隆了孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E。实验证明，ZmPLA1E的突变能够产生并显著提高孤雌生殖单倍体诱导能力，这在选育新型的诱导系、进一步提高诱导率、以及提高玉米单倍体育种效率方面具有重要的意义。并为揭示玉米孤雌生殖单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础。鉴于目前育种行业中单倍体育种技术利用的广泛性，本发明具有十分广泛的应用空间和市场前景。
附图说明
图1为初定位结果。
图2为交换单株家系表型。左：ZmPLA1E基因未突变；中：ZmPLA1E基因杂合突变；右：ZmPLA1E基因纯合突变。
图3为精细定位结果。
图4为转基因果穗表现。左：ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变；中：ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变；右：ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变。
图5为转基因单倍体表型验证。图a为单倍体和二倍体在植株，雄穗和花药上的对比图(H表示单倍体，D表示二倍体)。图b为单倍体和二倍体的分子标记验证胶图，I为母本材料带型，II为父本材料带型，III为单倍体带型，IV为二倍体带型。图c为单倍体植株流式细胞仪器检测信号图。图d为二倍体植株流式细胞仪器检测信号图。
图6为ZmPLA1基因突变位点检测引物。图a为引物对PLA1-F和PLA1-R扩增条带。图b为引物对pla1-F和pla1-R扩增条带。M为2K的DNA marker；I为ZmPLA1杂合突变型植株；II为ZmPLA1纯合野生型植株；III为ZmPLA1纯合突变型植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pBUE411载体记载于文献“A CRISPR/Cas9toolkit formultiplex genome editing in plants.Xing HL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,LiuB,Wang XC,Chen QJ.BMC Plant Biol.2014 Nov 29；14(1):327.10.1186/s12870-014-0327-y PubMed 25432517”中，公众可从文章作者处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的CAU5记载于文献“Dong,X.,et al.(2014)."Marker-assistedselection and evaluation of high oil in vivo haploid inducers in maize."Molecular Breeding 34(3):1147-1158.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的CAUHOI记载于文献“Li,L.and X.Xu,et al.(2009)."Morphological and molecular evidences for DNA introgression in haploidinduction via a high oil inducer CAUHOI in maize."Planta 230(2):367-376.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的野生型玉米B104记载于文献“Hallauer A R,Lamkey K R,WhiteP R.Registration of five inbred lines of maize:B102,B103,B104,B105,and B106[J].Crop science,1997,37(4):1405-1406.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E的克隆
1)玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E的初定位
为了分离ZmPLA1E基因，本发明采用图位克隆的方法，首先建立一个大的多态性高的定位群体，由诱导能力低的诱导系CAUHOI(2％)和诱导率高的诱导系UH400(8％)杂交后代组成。并利用两亲本间多态性分子标记对玉米孤雌生殖单倍体诱导基因进行初步定位。初步定位结果如图1所示，定位结果表明，单倍体诱导基因ZmPLA1E初步定位在第9号染色体的9.01bin，介于bnlg1272和umc1040两个标记之间。
2)玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E的精细定位
由诱导能力低的诱导系CAUHOI(2％)和诱导率高的诱导系CAU5(8％)或UH400(8％)组配F2大群体，利用分子标记bnlg1272和umc1040来检测这些单株。利用覆盖分子标记bnlg1272和umc1040间区域、新开发的分子标记检测从大群体筛选到交换单株，通过这些高密度的分子标记来确定交换单株准确的交换位置。进一步将这些交换单株自交的家系种植田间，对其基因型及诱导率进行检测，结合每个交换单株家系的基因型和诱导率进行定位。交换单株家系表型如图2所示。精细定位结果如图3所示，精细定位结果表明，单倍体诱导基因ZmPLA1E最终定位于GALT-1S2和GALT-1S5两个标记之间，其对应B73的物理距离为318bp。通过对这318bp的B73序列进行查看，发现其只覆盖1个预测基因，本发明将该候选基因命名为ZmPLA1E。
3)CAU5的BAC文库筛选及测序
为了获得CAU5在候选区间范围内的序列及其旁侧更多的序列信息。利用定位区间附近的分子标记对CAU5的BAC文库进行筛选，最终筛选到4个阳性单克隆，通过比较，选择插入片段最长的单克隆A52进行测序。
4)CAUHOI和CAU5中ZmPLA1E等位基因的序列比对
由于没有CAUHOI的BAC文库，为了获得CAUHOI中候选基因ZmPLA1E的DNA序列，分析CAUHOI和CAU5中ZmPLA1E等位基因在DNA水平上的差异，本发明利用了引物ZmPLA1E-FL-F/ZmPLA1E-FL-R对CAUHOI中等位基因ZmPLA1E进行PCR扩增并测序。
CAUHOI中等位基因ZmPLA1E的PCR扩增引物序列如下：
ZmPLA1E-FL-F：TGATAGCCTCTGAAATGGGAACT；
ZmPLA1E-FL-R：ATAGATGGTGGATTGAGACG。
在获得CAUHOI中等位基因ZmPLA1E序列后，分析等位基因ZmPLA1E在CAUHOI和CAU5间的多态性。发现等位基因ZmPLA1E在CAUHOI和CAU5间存在6个SNP的多态性位点，其中4个可以导致氨基酸的替换变异。
5)CAUHOI和CAU5中ZmPLA1E等位基因cDNA全长克隆
为了进一步确认CAUHOI和CAU5中ZmPLA1E等位基因间差异是否会改变其转录本，本发明分别对CAUHOI和CAU5中ZmPLA1E等位基因cDNA全长进行克隆。
具体方法如下：
5-1)引物设计：根据B73参考序列提供的转录本设计引物；引物序列如下：
F：ATGGATCGCAGCAACGCCGG；
R：TTACGGAGCCAAACAACCGA。
5-2)总RNA的提取：采用天根试剂盒RNAprep Pure Plant Kit(DP441)分别提取CAUHOI和CAU5授粉后5天的籽粒进行总RNA提取。
5-3)cDNA的获得：采用全式金试剂盒TransScript One-Step gDNA Removal andcDNA Synthesis SuperMix)对提取的总RNA进行反转录，得到cDNA。
5-4)以获得的cDNA为模板进行扩增，得到PCR产物，并将PCR产物连接T载体，挑选阳性单克隆测序。
测序结果表明：CAUHOI中PCR扩增得到大小为1061bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列1所示，将序列1所示的基因命名为基因ZmPLA1E，开放阅读框(ORF)为序列1第78-695位，编码序列3所示的蛋白，将序列3所示的氨基酸序列命名为蛋白ZmPLA1E。
CAU5中PCR扩增得到大小为1055bp的扩增产物，其核苷酸序列如序列2所示，将序列2所示的基因命名为突变基因ZmPLA1E，开放阅读框(ORF)为序列2第78-695位，编码序列4所示的蛋白，将序列4所示的氨基酸序列命名为突变蛋白ZmPLA1E。
经比对发现：CAU5中，ZmPLA1E等位基因分别在4个SNP发生突变导致氨基酸的替换：M44T、A87T、T153A、G183A。经预测，发现这4个SNP分别位于该蛋白的4个跨膜结构域上，其突变有可能改变其跨膜结构，从而影响其功能。
实施例2、玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E在产生并显著提高孤雌生殖单倍体诱导能力中的应用
一、CRISPR/Cas9系统敲除玉米ZmPLA1E基因
利用CRISPR/Cas9系统敲除玉米ZmPLA1E基因，获得转基因玉米ZmPLA1E基因突变体。具体步骤如下：
1)sgRNA序列的选择
在玉米ZmPLA1E基因上设计靶位点序列，长度为20bp。
靶位点1位于序列1第163-182位，靶位点1序列为CACGCCCCTCGCCACCGCGC。
靶位点2位于序列1第210-229位，靶位点2序列为TGGCCAACTTCCTCCCCACG。
靶位点设计sgRNA序列为GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACU UGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(序列6)，该sgRNA的编码DNA分子为序列5。
2)CRISPR/Cas9载体的构建
CRISPR/Cas9载体为将序列表中序列5所示的sgRNA的编码DNA分子插入pBUE411载体后得到的载体。
3)转基因玉米的获得
将步骤2)获得的CRISPR/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105(农杆菌EHA105感受态细胞购自北京奥森鼎信生物技术有限公司，公众可通过购买获得)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9。
再将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，扩繁后的菌液用于玉米幼胚侵染)转化玉米B104(中国农业大学国家玉米改良中心)幼胚，经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因玉米植株。
4)ZmPLA1E基因发生突变的转基因玉米鉴定
采集步骤3)获得的T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用如下引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。
ZmPLA1E突变序列检测引物的序列如下：
ZmPLA1E_F：CGAAAACAGTTCCACGCTCTC；
ZmPLA1E_R：CATCTCGAAGGTTAGCAGCG。
将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果与野生型玉米B104中的ZmPLA1E基因进行比对。
自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则该株系的基因型为杂合基因型(2条同源染色体中的1条染色体上的ZmPLA1E基因突变，且另1条染色体上的ZmPLA1E基因未突变)，该株系为T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变杂合型株系；
自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，与野生型玉米B104的ZmPLA1E基因序列对比，若一样，则该株系的基因型为野生型，即ZmPLA1E基因序列没有发生突变，下面分析不考虑；若有突变，则该株系的基因型为纯合基因型(2条同源染色体上的ZmPLA1E基因均发生突变)，该株系为T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系。
鉴定结果如表1和表2所示(表1为T0代转基因玉米植株等位基因1即1条同源染色体上的ZmPLA1E基因突变情况；表2为T0代转基因玉米植株等位基因2即另1条同源染色体上的ZmPLA1E基因突变情况)：24株T0代转基因玉米植株中，14株T0代转基因玉米植株的ZmPLA1E基因发生突变，其中7株ZmPLA1E基因发生纯合突变。进一步选择纯合突变单株中导致移码突变(缺失不是3的倍数)的单株进行表型鉴定，具体单株编号如下：T0-8，T0-13，T0-15和T0-17。
表1、等位基因1序列
T0 ID 突变类型 等位基因1序列(突变)
WT 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC
T0-1 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-2 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-3 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-4 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-5 纯合 AGGAAGCGCCGCGC(-57bp)CCGCACGGGCACGCTG(缺失)
T0-6 杂合 GTCCATGCTGGCCAACTTC(-6bp；+85bp)ACGGGCACGCTGCTAACCTTC(缺失和插入)
T0-7 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-8 纯合 CGGGAAGGAAGCGCCGCGCG(-59bp)CACGGGCACGCTGCTAACCT(缺失)
T0-9 纯合 GGGCGCGGGAAGGAAGCGCCGCGCG(-1bp)TGGCGAGGGGCGTGCAGAAGAC(缺失)
T0-10 杂合 CGGGAAGGAAGCGCCGCGCG(-59bp)CACGGGCACGCTGCTAACCT(缺失)
T0-11 杂合 GTCCATGCTGGCCAACTTC(-6bp；+85bp)ACGGGCACGCTGCTAACCTTC(缺失和插入)
T0-12 杂合 TGCGGTGTCCGGCGAG(-62bp)GG(30bp)CCC(+1bp)CACGGGC(缺失和插入)
T0-13 纯合 TCGAGGTGCGCGGCGGCG(-50bp)GGCGTGCAGAAGACGCTCTCCAA(缺失)
T0-14 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-15 纯合 GTCCATGCTGGCCAACTTC(-6bp；+85bp)ACGGGCACGCTGCTAACCTTC(缺失和插入)
T0-16 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-17 纯合 CGGGGAAGGAAGCGCCGCGCT(-59bp)CACGGGCACGCTGCTAACCT(替换和缺失)
T0-18 杂合 CCCATGGATCGCAGCAAC(-152bp)CTTCGAGATGCTACTCCCG(缺失)
T0-19 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-20 纯合 AGCGCCGCGCGGTGGCGAGGG(-54bp)GCACGCTGCTAACCTTCGAGATG(缺失)
T0-21 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-22 野生 GCGCCGCGCGGTGGCGAGGGGCGTGC(26bp)CTGGCCAACTTCCTCCCCACGGGCAC(野生)
T0-23 杂合 CGGGAAGGAAGCGCCGCGC(-60bp；+382bp)CACGGGCACGCTGCTAACCT(缺失和插入)
T0-24 杂合 CGGGAAGGAAGCGCCGCGCTGCGGAAA--------------ACGCTCT(替换和缺失)
表2、等位基因2基因序列
Figure BDA0001911423840000091
Figure BDA0001911423840000101
T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-8中2条同源染色体中均含有ZmPLA1E突变基因，ZmPLA1E突变基因为将ZmPLA1E基因(序列1)第168-226位发生缺失，且其他碱基保持不变得到的DNA分子。
T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-13中2条同源染色体中均含有ZmPLA1E突变基因，ZmPLA1E突变基因为将ZmPLA1E基因(序列1)第127-176位发生缺失，且其他碱基保持不变得到的DNA分子。
T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-15中2条同源染色体中均含有ZmPLA1E突变基因，ZmPLA1E突变基因为将ZmPLA1E基因(序列1)第222-227位发生缺失，且在缺失的位置插入了大小为85bp的如下序列：GAGATGCTACTCCAAGACGGGAGGAAGTTCTCCAAGGTTAGCATCTCCAAGACGTCCATGCTGGCCAACGTCCATGCTCTCCAAG，且其他碱基保持不变得到的DNA分子。
T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-17中2条同源染色体中均含有ZmPLA1E突变基因，ZmPLA1E突变基因为将ZmPLA1E基因(序列1)第168-226位发生缺失，且将第167位由G替换为T，且其他碱基保持不变得到的DNA分子。
5)T1代转基因玉米的基因型鉴定
将步骤4)获得的T0代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-8，T0-13，T0-15和T0-17自交，收获种子后再播种，得到T1代转基因玉米。鉴定T1代转基因玉米的ZmPLA1E基因的基因型，具体方法如下：以T1代转基因玉米的基因组DNA为模板，利用ZmPLA1E突变序列检测引物ZmPLA1E_F和ZmPLA1E_R按照步骤4)中的方法鉴定T1代转基因玉米的ZmPLA1E基因的基因型，结果表明所有T1代转基因玉米单株都与上一代基因型一致。选取T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-17用于下述单倍体诱导能力分析实验。
二、CRISPER/Cas9系统敲除玉米ZmPLA1E基因所获得突变体的单倍体诱导能力的鉴定
1、田间表型鉴定
将步骤一获得的T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-17的花粉授予杂交种郑单958(堵纯信,曹春景,曹青,等.玉米杂交种郑单958的选育与应用[J].玉米科学,2006,14(6):43-45或从奥瑞金种业股份有限公司获得)，获得杂交后代；将所得杂交后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常(图5a)。
以野生型玉米B104与郑单958的后代为对照。
T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-17与杂交种郑单958杂交的5080个后代中得到6个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。
2、流式细胞检测叶片倍性
将上述步骤1获得的表现为单倍体性状植株进行流式细胞检测，具体方法如下：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体玉米叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为该待测植株为单倍体植株(图5c)。若待测植株的信号峰出现在100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同(图5d)，该待测植株为二倍体。
结果如下：T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系与杂交种郑单958杂交后代中6个经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体，记做T1代转基因玉米ZmPLA1E纯合型基因突变株系拟单倍体植株。
3、分子标记鉴定
提取上述步骤2获得的T1代转基因玉米ZmPLA1E纯合型基因突变株系拟单倍体植株的基因组DNA，采用郑单958和T1代转基因玉米ZmPLA1E纯合型基因突变株系T0-17间多态性引物Chr4-222.7F(Chr4-222.7F：CACAAACTGGACAAAGTTGATGC)和Chr4-222.7R(Chr4-222.7R：TGACAACGCTTAAATGAACCTTGAT)进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖带型检测，若待测单株的扩增产物的大小为250bp，表现为1条带，认为该单株条带为郑单958带型，不存在父本材料的带型，则该单株是母本单倍体。若待测单株的扩增产物的大小为250bp和401bp，表现为2条带，认为该单株条带为郑单958和ZmPLA1E纯合型基因突变株系杂合带型，则该单株是正常杂交的后代，是二倍体。
分子标记鉴定结果如下：
T1代转基因玉米ZmPLA1E纯合型基因突变株系拟单倍体植株的分子标记鉴定结果表明，T1代转基因玉米ZmPLA1E纯合型基因突变株系拟单倍体植株均为母本单倍体植株(图5b)。
因此，转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系与杂交种的后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为玉米母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为玉米母本单倍体。
统计上述鉴定结果并按照如下公式计算诱导率：诱导率(％)＝(母本单倍体株数/总株数)×100。从表3可以看出，ZmPLA1E基因突变后与其他材料杂交，在后代中可获得玉米母本单倍体。
表3、ZmPLA1E基因突变后单倍体诱导率统计
Figure BDA0001911423840000121
zmpla1e：T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-17；野生型：野生型玉米B104
三、转基因玉米ZmPLA1E基因突变在提高单倍体诱导能力中的应用
ZmPLA1基因也是一个很重要的单倍体诱导基因，已经被克隆报道(Chen,C.L.X.L.(2017)."A 4-bp Insertion at ZmPLA 1 Encoding a Putative Phospholipase AGenerates Haploid Induction in Maize."分子植物：英文版10(3):520-522.)。为了进一步提高单倍体的诱导率，在ZmPLA1突变的基础上，鉴定ZmPLA1E基因突变体的单倍体诱导能力。
1、双基因突变体的获得
将步骤一获得的T1代转基因玉米ZmPLA1E基因突变纯合型株系T0-15和T0-17分别与CAUHOI(CAUHOI为孤雌生殖单倍体诱导系，诱导率为1～2％，ZmPLA1基因在该材料中已经突变)杂交获得F1。获得的F1再自交得到F2群体。F2群体按照家系种植，并采用引物对PLA1-F/PLA1-R，pla1-F/pla1-R及ZmPLA1E_F/ZmPLA1E_R分别鉴定F2群体单株的ZmPLA1基因和ZmPLA1E基因的基因型。从中选择如下三种基因型的单株：ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变；ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变；ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变。
野生型ZmPLA1和突变型ZmPLA1基因序列对比情况如表4所示。由于和野生型ZmPLA1基因对比，突变型ZmPLA1基因在第4外显子上有4bp的插入。利用kasp原理将F引物的3’端设计在突变的位置。
设计的检测ZmPLA1基因的基因型的引物序列如下：PLA1-F：ACGTGGAGACAGGGAGGTAC；PLA1-R：GTACGACGCACATCTAGAGCC。pla1-F：ACGTGGAGACAGGGAGCGAG；pla1-R：GCTTCTGGGGTTGATGGCAG。
引物对PLA1-F/PLA1-R和pla1-F/pla1-R扩增条带的表现如图6所示。引物对PLA1-F和PLA1-R特异扩增野生ZmPLA1条带，即ZmPLA1纯合野生型或ZmPLA1杂合突变型有条带，大小为155bp，而ZmPLA1纯合突变则无条带扩增(图6a)。引物对pla1-F和pla1-R特异扩增突变ZmPLA1条带，即ZmPLA1纯合突变型或ZmPLA1杂合突变型有条带，大小为141bp，而纯合野生ZmPLA1则无条带扩增(图6b)。结合2个引物对扩增的条带结果鉴定F2群体单株的ZmPLA1基因型：
若引物对PLA1-F/PLA1-R扩增得到大小为155bp的条带，且引物对pla1-F/pla1-R没有扩增条带，则该单株的基因型为ZmPLA1纯合野生型；
若引物对PLA1-F/PLA1-R没有扩增条带，且引物对pla1-F/pla1-R扩增得到大小为141bp的条带，则该单株的基因型为ZmPLA1纯合突变型；
若引物对PLA1-F/PLA1-R扩增得到大小为155bp的条带，且引物对pla1-F/pla1-R扩增得到大小为141bp的条带，则该单株的基因型为ZmPLA1杂合突变型。
采用ZmPLA1E_F/ZmPLA1E_R鉴定F2群体单株的ZmPLA1E基因的基因型的方法同上。
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变的单株中2条同源染色体中均含有ZmPLA1突变基因和野生型ZmPLA1E基因。ZmPLA1突变基因为将ZmPLA1基因(序列7)第409位由C替换为T、且将第421位由C替换为G、且将第441位由T替换为C、且将第887位由T替换为G、且将第1210位由G替换为C、且将第1306位由T替换为C、且将第1435位由G替换为A、且将第1471位由C替换为A、且将第1541位由A替换为C、且在第1572位置插入了4bp的“CGAG”碱基序列、且将第1588位由T替换为C、且将第1591位由C替换为A、且其他碱基保持不变得到的DNA分子。
表4、野生型ZmPLA1和突变型ZmPLA1序列对比
Figure BDA0001911423840000131
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变的单株中2条同源染色体中均含有上述ZmPLA1突变基因(基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变的单株中的ZmPLA1突变基因)。ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变单株中1条同源染色体中含有ZmPLA1E突变基因，ZmPLA1E突变基因为将ZmPLA1E基因(序列1)第168-226位发生缺失，且将第167位由G替换为T，且其他碱基保持不变得到的DNA分子，另1条同源染色体含有野生型ZmPLA1E基因。
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变的单株中2条同源染色体中均含有上述ZmPLA1突变基因(基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变的单株中的ZmPLA1突变基因)和上述ZmPLA1E突变基因(基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变的单株中的ZmPLA1E突变基因)。
2、田间表型鉴定
分别将步骤1获得的三种基因型的单株的花粉授予杂交种郑单958，获得的杂交果穗表现如图4所示。
将杂交所得的后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常。
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变的单株与杂交种郑单958杂交的5888个后代中得到47个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变的单株与杂交种郑单958杂交的5527个后代中得到179个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。
基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变的单株与杂交种郑单958杂交的3161个后代中得到244个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。
3、流式细胞检测叶片倍性
按照步骤二的2中的方法将上述单倍体单株进行流式细胞检测。结果表明：步骤2拟定的单倍体植株的倍性均为单倍体。
4、分子标记鉴定
按照步骤二的3中的方法将上述单倍体单株进行分子标记鉴定。结果表明：步骤2拟定的单倍体植株的倍性均为单倍体。
因此，以上三种基因型的单株与杂交种的后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为玉米母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为玉米母本单倍体。
统计上述鉴定结果并按照如下公式计算诱导率：诱导率(％)＝(母本单倍体株数/总株数)×100。从表5可以看出，在ZmPLA1基因纯合突变的基础上，ZmPLA1E基因突变后与其他材料杂交，在后代中获得玉米母本单倍体诱导率显著提高，说明ZmPLA1E基因突变后能够显著提高单倍体的诱导能力。
表5、ZmPLA1E基因突变单株与CAUHOI杂交后代的单倍体诱导率统计
Figure BDA0001911423840000151
注：A：基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因未突变的单株；H：基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变的单株；B：基因型为ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变的单株。
序列表
<110>中国农业大学
<120>玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>1061
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
aaaccaacag ctttgcattt ccagtctctg ggaacgtcgc gaaaacagtt ccacgctctc 60
cggacaagaa cgcgcccatg gatcgcagca acgccggtgc ggtgtccgtc gaggtgcgcg 120
gcggcggcgg cggctcgccg ccgggcgcgg gaaggaagcg ccgcgcggtg gcgaggggcg 180
tgcagaagac gctctccaag acgtccatgc tggccaactt cctccccacg ggcacgctgc 240
taaccttcga gatgctactc ccggccgccg caggcgacgg cacctgctcg gcggtcagcg 300
ccgcgatgct cagggccctg ctcgcgctct gcgccgcctc ctgcttcctc ttccacttca 360
ccgacagctt ccgcgccccg gacgggaagg tgtactacgg cttcgtcacg ccgcggggcc 420
tgtcgctgtt caggaccggg ctcggcgtcg aggtgcccag ggaggaaagg taccggctcg 480
ccttcgtcga cgtcgtgcac gctgtcatgt ccgtgctggt ctttgcggcc gtcacgctcg 540
ccgactaccg ggtctccggg tgcctcgtcg ccggccaccg caaggagatg gacgaggtga 600
tggagagctt cccgctcatg gtgggcgccg tgtgcagcgg cctcttcctc ttgttcccca 660
acacccgcta cggcatcggt tgtttggctc cgtaaaaaac agcagactgg aacagagagt 720
acggcagtgt aactttcttc cgtacctgtg aatctggctt gatcatttta tgcttcatgt 780
tttcttagca actgtaaaaa cttggatgtg atgtgatcct atctttaatc agtaccgatt 840
tgaaatttct tgagaatgga ttatacaaga gaatgaatgg tcaccaaaaa tagctttaca 900
tcagatgcaa aatgcattcc tttcaaaaga atggtagact ggctcaatct atcctaacgt 960
aagctgccgc ccatgtatcc tacattctgg caagatacta gtattttaca agccacacag 1020
taagcaaagc agcactctcc tacctaccca aaaaaaaaag a 1061
<210>2
<211>1055
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
aaaccaacag ctttgctttt ccagtctctg ggaacgtcgc gaaaacagtt ccacgctctc 60
cggacaagaa cgcgcccatg gatcgcagca acgccggtgc ggtgtccgtc gaggtgcgcg 120
gcggcggcgg cggctcgccg ccaggcgcgg gaaggaagcg ccgcgcggtg gcgaggggcg 180
tgcagaagac gctctccaag acgtccacgc tggccaactt cctccccacg ggcacgctgc 240
taaccttcga gatgctactc ccggccgccg caggcgacgg cacctgctcg gcggtcagcg 300
ccgcgatgct cagggccctg ctcgcgctct gcgccacctc ctgcttcctc ttccacttca 360
ccgacagctt ccgcgccccg gacgggaagg tgtactacgg cttcgtcacg ccgcggggcc 420
tgtcgctgtt caggaccggg ctcggcgtcg aggtgcccag ggaggaaagg taccggctcg 480
ccttcgtcga cgtcgtgcac gctgtcatgt ccgtgctggt ctttgccgcc gtcgcgctcg 540
ccgactaccg ggtctccggg tgcctcgtcg ccggccaccg caaggagatg gacgaggtga 600
tggagagctt cccgctcatg gtggccgccg tgtgcagcgg cctcttcctc ttgttcccca 660
acacccgcta cggcatcggt tgtttggctc cgtaaaaaac agcagactgg aacagagagt 720
acggcagtgt aactttcttc cgtacctgtg aatctggctt gatcatttta tgcttcatgt 780
tttcttagca actgtaaaaa cttggatgtg atgtgatcct atcttaatca gtaccgattt 840
gaaatttctt cagaatggat tatacaagag aatggccacc aaaaatagct ttacatcaga 900
tgcaaaatgc attcctttca aaagaatggt aagactggct caatctatcc taacgtaagc 960
tgctgccgat gtatcctaca ttatggcaag atactagtat tttacaagcg acacagtaag 1020
caaagcagca ctctcctacc tacccaaaaa aaaga 1055
<210>3
<211>205
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
Met Asp Arg Ser Asn Ala Gly Ala Val Ser Val Glu Val Arg Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Pro Pro Gly Ala Gly Arg Lys Arg Arg Ala Val Ala
20 25 30
Arg Gly Val Gln Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ser Met Leu Ala Asn Phe
35 40 45
Leu Pro Thr Gly Thr Leu Leu Thr Phe Glu Met Leu Leu Pro Ala Ala
50 55 60
Ala Gly Asp Gly Thr Cys Ser Ala Val Ser Ala Ala Met Leu Arg Ala
65 70 75 80
Leu Leu Ala Leu Cys Ala Ala Ser Cys Phe Leu Phe His Phe Thr Asp
85 90 95
Ser Phe Arg Ala Pro Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Phe Val Thr Pro
100 105 110
Arg Gly Leu Ser Leu Phe Arg Thr Gly Leu Gly Val Glu Val Pro Arg
115 120 125
Glu Glu Arg Tyr Arg Leu Ala Phe Val Asp Val Val His Ala Val Met
130 135 140
Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Val Thr Leu Ala Asp Tyr Arg Val Ser
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Ala Gly His Arg Lys Glu Met Asp Glu Val Met Glu
165 170 175
Ser Phe Pro Leu Met Val Gly Ala Val Cys Ser Gly Leu Phe Leu Leu
180 185 190
Phe Pro Asn Thr Arg Tyr Gly Ile Gly Cys Leu Ala Pro
195 200 205
<210>4
<211>205
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>4
Met Asp Arg Ser Asn Ala Gly Ala Val Ser Val Glu Val Arg Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Pro Pro Gly Ala Gly Arg Lys Arg Arg Ala Val Ala
20 25 30
Arg Gly Val Gln Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ser Thr Leu Ala Asn Phe
35 40 45
Leu Pro Thr Gly Thr Leu Leu Thr Phe Glu Met Leu Leu Pro Ala Ala
50 55 60
Ala Gly Asp Gly Thr Cys Ser Ala Val Ser Ala Ala Met Leu Arg Ala
65 70 75 80
Leu Leu Ala Leu Cys Ala Thr Ser Cys Phe Leu Phe His Phe Thr Asp
85 90 95
Ser Phe Arg Ala Pro Asp Gly Lys Val Tyr Tyr Gly Phe Val Thr Pro
100 105 110
Arg Gly Leu Ser Leu Phe Arg Thr Gly Leu Gly Val Glu Val Pro Arg
115 120 125
Glu Glu Arg Tyr Arg Leu Ala Phe Val Asp Val Val His Ala Val Met
130 135 140
Ser Val Leu Val Phe Ala Ala Val Ala Leu Ala Asp Tyr Arg Val Ser
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Ala Gly His Arg Lys Glu Met Asp Glu Val Met Glu
165 170 175
Ser Phe Pro Leu Met Val Ala Ala Val Cys Ser Gly Leu Phe Leu Leu
180 185 190
Phe Pro Asn Thr Arg Tyr Gly Ile Gly Cys Leu Ala Pro
195 200 205
<210>5
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>5
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210>6
<211>76
<212>RNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugc 76
<210>7
<211>1795
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
agttcatcac taatcacact tattgtgccc tcgacgagta tctatagcta gctcattaat 60
cgattcgggg gtgtgttgtc gaaggcggca atggcgagct actcgtcgcg gcgtccatgc 120
aatacctgta gcacgaaggc gatggccggg agcgtggtcg gcgagcccgt cgtgctgggg 180
cagagggtga cggtgctgac ggtggacggc ggcggcgtcc ggggtctcat cccgggaacc 240
atcctcgcct tcctggaggc caggctgcag gagctggacg gaccggaggc gaggctggcg 300
gactacttcg actacatcgc cggaaccagc accggcggtc tcatcaccgc catgctcacc 360
gcgcccggca aggacaagcg gcctctctac gctgccaagg acatcaacca cttttacatg 420
cagaactgcc cgcgcatctt tcctcagaag tgagtccgat gctgccgcca ttgttcttgc 480
atccatccag catcgtacgt acgtcctcta tacatctgcg gatcatcatg tgcgcatgtt 540
tgtggcatgc atgcatgcat gtgagcagga gcaggcttgc ggccgccatg tccgcgctga 600
ggaagccaaa gtacaacggc aagtgcatgc gcagcctgat taggagcatc ctcggcgaga 660
cgagggtaag cgagacgctg accaacgtca tcatccctgc cttcgacatc aggctgctgc 720
agcctatcat cttctctacc tacgacgtac gtacgtcgtc acgaatgatt catctgtacg 780
tcgtcgcatg cgaatggctg cctacgtacg ccgtgcgcta acatactcag ctctttccta 840
tctgctgcgc caatttgcag gccaagagca cgcctctgaa gaacgctctg ctctcggacg 900
tgtgcattgg cacgtccgcc gcgccgacct acctcccggc gcactacttc cagactgaag 960
acgccaacgg caaggagcgc gaatacaacc tcatcgacgg cggtgtggcg gccaacaacc 1020
cggtaactga ctagctaact ggaaaacgga cgcacagact ccatgtccat ggcggcccac 1080
aaggtcgatg ctaattgttg cttatgtatg tcgcccgatt gcacatgcgt agacgatggt 1140
tgcgatgacg cagatcacca aaaagatgct tgccagcaag gacaaggccg aggagctgta 1200
cccagtgaag ccgtcgaact gccgcaggtt cctggtgctg tccatcggga cggggtcgac 1260
gtccgagcag ggcctctaca cggcgcggca gtgctcccgg tggggtatct gccggtggct 1320
ccgcaacaac ggcatggccc ccatcatcga catcttcatg gcggccagct cggacctggt 1380
ggacatccac gtcgccgcga tgttccagtc gctccacagc gacggcgact acctgcgcat 1440
ccaggacaac tcgctccgtg gcgccgcggc caccgtggac gcggcgacgc cggagaacat 1500
gcggacgctc gtcgggatcg gggagcggat gctggcacag agggtgtcca gggtcaacgt 1560
ggagacaggg aggtacgaac cggtgactgg cgaaggaagc aatgccgatg ccctcggtgg 1620
gctcgctagg cagctctccg aggagaggag aacaaggctc gcgcgccgcg tctctgccat 1680
caacccaaga ggctctagat gtgcgtcgta cgatatctaa gacaagtggc tttactgtca 1740
gtcacatgct tgtaaataag tagactttat tttaataaaa cataaaaata tatat 1795

Claims (9)

1.一种植物母本单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：敲除植物基因组中的ZmPLA1E基因，得到转基因植物，即为植物母本单倍体诱导系；
所述转基因植物为ZmPLA1E基因纯合突变体；
所述ZmPLA1E基因序列如序列1所示；
所述植物为玉米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述敲除植物基因组中的ZmPLA1E基因的方式为CRISPR/Cas9。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第163-182位或第210-229位。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列为序列6。
5.一种植物母本单倍体的制备方法，包括如下步骤：将由权利要求1-4任一所述的方法制备的植物母本单倍体诱导系进行自交或者作为父本与其他植物材料杂交，得到自交后代或杂交后代，然后将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子标记鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株，即为植物母本单倍体；所述植物为玉米。
6.由权利要求1-4任一所述的方法制备的植物母本单倍体诱导系在制备植物母本单倍体中的应用；
所述植物为玉米。
7.敲除植物基因组中的ZmPLA1E基因的CRISPR/Cas9载体在制备植物母本单倍体诱导系或植物母本单倍体中的应用；
所述ZmPLA1E基因序列如序列1所示；
所述植物为玉米。
8.由权利要求1-4任一所述的方法制备的植物母本单倍体诱导系或由权利要求5所述的方法制备的植物母本单倍体在植物杂交种选育或植物单倍体育种中的应用；所述植物为玉米。
9.由权利要求1-4任一所述的方法制备的植物母本单倍体诱导系在提高植物母本单倍体诱导系的诱导率中的应用；
所述应用包括如下步骤：将ZmPLA1基因突变的植物母本单倍体诱导系CAUHOI与由权利要求1-4任一所述的方法制备的植物母本单倍体诱导系进行杂交，得到杂交F1代；将所述杂交F1代自交，得到F2代群体；在所述F2代群体中选择ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因纯合突变的双突变体或ZmPLA1基因纯合突变且ZmPLA1E基因杂合突变的双突变体；所述双突变体的单倍体诱导率高于所述ZmPLA1基因突变的植物母本单倍体诱导系CAUHOI；
所述ZmPLA1基因序列如序列7所示；
所述ZmPLA1E基因序列如序列1所示；
所述植物为玉米。
CN201811554223.7A 2018-02-08 2018-12-19 玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用 Active CN109628480B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810129251 2018-02-08
CN2018101292518 2018-02-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109628480A CN109628480A (zh) 2019-04-16
CN109628480B true CN109628480B (zh) 2021-09-28

Family

ID=66075178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811554223.7A Active CN109628480B (zh) 2018-02-08 2018-12-19 玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用

Country Status (6)

Country Link
US (1) US11371058B2 (zh)
EP (1) EP3739051A4 (zh)
CN (1) CN109628480B (zh)
BR (1) BR112020016171A2 (zh)
CA (1) CA3090472A1 (zh)
WO (1) WO2019153899A1 (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111996209B (zh) * 2019-05-27 2022-05-10 中国农业大学 孤雌生殖单倍体诱导基因dmp及其应用
CN111893203A (zh) * 2020-07-27 2020-11-06 吉林省农业科学院 一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物
CN117285610A (zh) * 2020-12-03 2023-12-26 中国农业大学 孤雌生殖单倍体诱导基因NtDMP及其应用
CN114902957B (zh) * 2021-02-09 2023-07-07 中国农业大学 一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的dna分子
CN113557955B (zh) * 2021-07-19 2022-09-16 中国农业大学 一种基于生殖隔离性状的单倍体诱导系遗传保纯方法
CN113317197B (zh) * 2021-08-03 2021-10-26 中国农业科学院生物技术研究所 一种快速显色孤雌生殖诱导系及其在鉴别玉米单倍体中的应用
CN113817036B (zh) * 2021-10-21 2022-06-14 中国农业科学院生物技术研究所 Dmp蛋白及其编码基因与应用
CN114196774B (zh) * 2021-12-07 2023-09-19 沈阳农业大学 用于快速鉴定玉米单倍体的荧光诱导系的标记基因以及荧光诱导系的构建方法
CN114342800B (zh) * 2022-01-05 2023-05-16 吉林省农业科学院 一种快速选育糯质单倍体诱导系的双重诱导方法
CN115568416B (zh) * 2022-02-21 2023-06-16 贵州省烟草科学研究院 一种利用烟草白粉病抗性筛选烟草单倍体及评估诱导率的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701803A (zh) * 2017-01-13 2017-05-24 中国农业大学 玉米母本单倍体主效诱导基因及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101377481B (zh) 2008-10-06 2012-04-18 中国农业大学 鉴别玉米孤雌生殖单倍体的方法
CN102440179A (zh) 2011-09-28 2012-05-09 广西壮族自治区玉米研究所 玉米孤雌生殖诱导系的选育方法和在选育玉米自交系中的应用
CN103081797B (zh) * 2011-10-27 2014-11-05 中国农业大学 一种诱导玉米单倍体的方法
US9677082B2 (en) * 2013-03-15 2017-06-13 Syngenta Participations Ag Haploid induction compositions and methods for use therefor
EP3091076A1 (en) * 2015-05-07 2016-11-09 Limagrain Europe Polynucleotide responsible of haploid induction in maize plants and related processes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106701803A (zh) * 2017-01-13 2017-05-24 中国农业大学 玉米母本单倍体主效诱导基因及应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank登录号：NM_001151404.2;Alexandrov NN等;《GenBank数据库》;20170907;参见序列及相关信息 *
GenBank登录号：NP_001144876.2;Alexandrov NN等;《GenBank数据库》;20170907;参见序列及相关信息 *
玉米单倍体诱导关键基因定位与克隆及新型高油诱导系选育研究;刘晨旭;《CNKI数据库》;20170501;参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3739051A4 (en) 2021-11-10
CN109628480A (zh) 2019-04-16
CA3090472A1 (en) 2019-08-15
US20200347402A1 (en) 2020-11-05
US11371058B2 (en) 2022-06-28
EP3739051A1 (en) 2020-11-18
BR112020016171A2 (pt) 2020-12-15
WO2019153899A1 (zh) 2019-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109628480B (zh) 玉米孤雌生殖单倍体诱导基因ZmPLA1E及其应用
US20200140874A1 (en) Genome Editing-Based Crop Engineering and Production of Brachytic Plants
CN111763687B (zh) 一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法
CN111996209B (zh) 孤雌生殖单倍体诱导基因dmp及其应用
US20240018606A1 (en) New native clubroot resistance in rapeseed brassica napus
CN112725374A (zh) 创制植物单倍体诱导系的方法及其应用
CN111073875B (zh) 小麦单倍体诱导基因及其应用
CN112609017B (zh) 检测水稻籽粒小粒形的分子标记及对应的基因和应用
CN109111511B (zh) 超长粒水稻的培育方法
US20210139925A1 (en) Maize female parent haploid major effect inducing gene and application
CN103130884B (zh) 与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用
CN117069814B (zh) 孤雌生殖单倍体诱导基因GhDMP及其应用
CN114946639B (zh) 两种小麦诱导系在小麦单倍体幼胚及籽粒鉴别中的应用
US20220333125A1 (en) GENE ZmPLD3 FOR INDUCING MAIZE MATERNAL HAPLOID PRODUCTION AND ITS APPLICATION THEREOF
CN114671931A (zh) Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用
CN112779265B (zh) 一种对植物特定基因进行饱和碱基编辑的育种方法
CN104031132A (zh) 与植物花梗发育相关的蛋白及其编码基因与应用
CN116083442A (zh) 甘蔗孤雌生殖单倍体诱导基因SaMTL及其应用
CN115927313A (zh) 一种GhDMP8基因作为靶点在提高棉花母本单倍体诱导率中的应用
CN115466748A (zh) 诱导玉米单倍体产生的基因ZmKNL2及应用
CN114525300A (zh) 多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系
CN112795576A (zh) 一种谷子单倍体诱导基因SiMTL及其应用
JP2005229854A (ja) 開閉花性を支配する遺伝子座に連鎖する遺伝マーカーおよびその利用
CN118028308A (zh) 穗发育相关转录因子TaMYC2及应用
CN103130883A (zh) 与植物穗形相关的蛋白及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant