CN114671931A

CN114671931A - Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用

Info

Publication number: CN114671931A
Application number: CN202210095668.3A
Authority: CN
Inventors: 李林; 朱万超; 苗馨心; 王席; 谢丹
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-01-26
Filing date: 2022-01-26
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-01-26
Also published as: CN114671931B

Abstract

本发明属于植物遗传学技术领域，尤其涉及Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用。本申请中利用sem1BC10F1材料进行自交，获得BC₁₀F₂，通过DNA混池测序，并结合BSR‑seq测序对候选基因进行初步定位，确定9号染色体25‑26Mb区域作为初步候选区域，之后进行精细定位，最终将Zm00001d045529基因确定为引起表型变异的候选基因。最终，通过基因敲除以及过表达实验证实该基因确实能够影响籽粒性状。群体内表型比较发现，阳性籽粒粒长、粒厚要显著大于阴性。

Description

Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用

技术领域

本发明属于植物遗传学技术领域，尤其涉及Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

背景技术

玉米是最重要的粮食作物之一，同时也是重要的饲料与能量来源。2014-2015年，世界范围内玉米种植面积接近1.778亿公顷(http://faostat.fao.org/)，而我国在2015年玉米种植面积也超过了3,800万公顷(国家统计局)，在面积及产量方面均超越其他粮食作物。作为中国甚至世界第一大粮食作物，玉米的诸多农艺性状影响其产量及品质高低。而在众多性状中，籽粒性状与产量最为密切，直接决定产量的高低。籽粒性状最直接的指标是籽粒大小，主要由籽粒长度、宽度、厚度以及灌浆程度所决定，这些性状最终也影响了籽粒的百粒重。据调查，玉米在14个国家粮食消费中最高占比达50％，而同时也为约27个国家提供了最高至25％的能量消费。所以，通过提高籽粒大小来增加玉米产量，是减少饥饿人群，缓解能源危机的一种有效途径。在保证玉米籽粒产量的同时，籽粒品质同样重要。种子往往是植物最为重要的营养贮存器官，而作为单子叶植物的玉米，其籽粒除了储存大量的光合碳水化合物外，还富含一些必需的氨基酸、脂肪酸及维生素等，因此营养丰富。而当今随着生活条件的不断改善，在解决温饱的基础上，人们越来越多的追求健康与合理膳食。因此，通过改良玉米籽粒品质，丰富其营养物质含量，均衡籽粒中必需营养元素的比例，能够不断满足人们对健康饮食的迫切要求。此外，玉米籽粒的发育是一个个体发育的最初始阶段，其质量的高低直接决定了下一代的发育过程，所以籽粒的好坏对玉米个体的育性具有较大影响。

玉米籽粒的发育进程：玉米籽粒发育是严密且复杂的生命过程，始于双受精过程。雌雄配子结合形成受精卵后约40个小时，细胞进行不对称分裂，形成两个体积不同的细胞。接下来经过随机分裂，在授粉后4天左右，顶端分化出胚顶，而底端形成胚柄，整个原胚呈现棒状。授粉后6-8天，原胚形状渐渐改变，呈现梨形；授粉后10天左右，分化出盾片、茎尖分生组织以及根尖分生组织，胚胎进入胚芽鞘期(Vernoud et al 2005)；授粉后14天左右，叶原基出现，并使胚叶增多，胚根分化出较多次生根；授粉后15-35天，胚内各种器官不断分化，逐渐成熟。胚乳早期发育与胚发育较为相似，但又有一定差别。受精极核形成后的约5小时分裂产生游离核，而游离核再不断分裂，使其数量呈指数增长，大约持续到授粉后3天；其间仅是核分裂，不伴随细胞质的分裂，形成腔细胞。授粉后约4天，这些含有多个核的细胞进行细胞化，临近胚的细胞首先产生细胞壁，而所有细胞快速分裂且体积不断变大，胚乳囊因此也不断膨大，该过程一直持续到授粉后12天左右。细胞化结束后，几种不同类型的细胞，包括糊粉层、淀粉胚乳、胚周围区以及基部转运层开始分化产生。种皮的发育也尤为重要，其发育起点为珠被，初期随着籽粒的增大而不断变大，灌浆期(约授粉后12天)种皮由于内部组织的不断膨大而逐渐被压缩变薄。直至种子完全成熟，种皮厚度也降至最低，而种皮组成细胞的细胞壁反而加厚，从而为籽粒内部物质提供坚实的屏障。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

本发明提供了Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

进一步地，通过在玉米植株中过表达Zm00001d045529基因调控玉米籽粒发育。

进一步地，所述玉米籽粒发育包括籽粒粒长和/或粒厚。

本发明还提供了一种调控玉米籽粒发育的方法，通过基因工程技术手段在玉米植株中过表达Zm00001d045529基因。

进一步地，所述Zm00001d045529基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，将SEQ ID NO.1所示的基因序列与线性化载体连接，之后采用农杆菌介导的遗传转化方法转入玉米受体材料中，培养，获得转基因植株。

进一步地，所述线性化载体为Sma1酶切载体PZZ01523-UBI-EGFP。

进一步地，SEQ ID NO.1所示的基因序列的扩增引物为：1F： AAACGCACTAGTATCCCGGGATGGAGGAGCACGGAGCGGA；1R： GGCGCGCCTTCCCGGATGTCTACTCCCTGGATAGAAG。

进一步地，所述农杆菌为农杆菌EHA105。

本发明还提供了如上述的一种调控玉米籽粒发育的方法在调控玉米籽粒发育中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本申请中利用sem1 BC10F1材料进行自交，获得BC₁₀F₂，通过DNA混池测序并结合BSR-seq测序对候选基因进行初步定位，确定9号染色体25-26Mb区域作为初步候选区域，之后进行精细定位，最终将Zm00001d045529基因确定为引起表型变异的候选基因。最终，通过基因敲除以及过表达实验证实该基因确实能够影响籽粒性状。群体内表型比较发现，阳性籽粒粒长、粒厚要显著大于阴性。

附图说明

图1是Sem1突变体表型；

图2是生长2周幼苗及茎尖部位；

图3是Sem1基因初定位结果；其中，A.SHOREmap对候选基因的定位结果；B.突变体相对于野生型，序列变异在全基因组范围内的分布；C.候选区域10M范围内的外显子变异类型及数量统计；D.9号染色体上外显子变异分布；

图4是KASP实验过程；

图5是精细定位结果；

图6是候选基因的鉴定结果；A.候选基因差异表达分析，“*”和“**”别代表P<0.05与P<0.01；B.序列变异分析；C.基于自交系群体表达差异分析；

图7是基因编辑情况；A.靶标设计；B.基因型鉴定；C.编辑情况；D.编辑表型。

图8是EMS突变体及等位性测验；A.EMS突变体中候选基因变异位置；B.变异碱基G到A；C.EMS突变体表型及其与sem1突变体的等位性测验；D.Sem-cas9突变体与sem1-ems 突变体等位性测验；

图9是EYFP+EGFP-26鉴定结果；A.Bar基因扩增检测基因型；B.试纸条检测基因型；C.分离群体内阳性籽粒与阴性籽粒粒长、粒宽、粒厚比较。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

本发明中涉及的植物材料：Sem1突变体最早被发现于Mutator突变体库，其子代野生型与突变体籽粒呈现3：1的表型分离，为单基因控制的隐性遗传突变体(Scanlon et al1994, Scanlon et al 2002)。该突变体不仅表现为籽粒变小，同时还影响株型，包括植株变矮、叶夹角增大、叶片缺刻、叶舌移位等，而且也导致雄性部分不育以及侧根发育受阻等表型(图1)，因此属于单基因调控多个性状的突变体。前期Scanlon教授通过遗传定位分析，将候选区段定位至9号染色体着丝粒附近。由于重组率低，难以进行克隆，所以他们又将该突变体与玉米参考基因组自交系B73进行10次回交，最终获得sem1 BC₁₀F1材料。通过授权，我们从 Scanlon教授实验室获得了该回交材料，并进行自交获得BC₁₀F2，多代自交后目前已获得 BC₁₀F8。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1候选基因的筛选

1.DNA混池测序

在获得BC₁₀F₁材料后，通过初次自交，获得10,000左右的BC₁₀F₂分离籽粒。根据籽粒大小，筛选出小籽粒进行播种，生长两周后，对单株进行表型鉴定，以确定为纯合隐性突变体植株。根据表型选取较为准确的突变体1,000株，基于叶片样品对每个单株进行DNA提取，浓度测定后等量混合，进行全基因组重测序。由于材料是BC₁₀F₂，其经过10代回交，背景已经基本成为B73的遗传背景，所以我们这里不再对BC₁₀F₂野生型材料进行测序。获得约200×B73基因组数据，经质检过滤后，利用Bowtie2(version 2.2.2)(Langmead and Salzberg2012) 将序列比对至B73参考基因组，比对文件经SAMtools(version 0.1.19)转变成BAM格式、排序后，利用samtools mpileup命令将比对信息记录于VCF4.1文件内。接下来利用SHOREmap (v3.0)(Sun and Schneeberger 2015)软件，设置默认参数，基于比对生成的标记进行基因组多态性位点鉴定并计算每个位点的等位基因频率(Allele Frequency)，进行可视化画图，确定候选基因的大致范围。

2.RNA混池测序

为了进一步确定候选基因，我们也进行了BSR-seq(Liu et al 2012)。将sem1BC₁₀F₂纯合隐性突变体籽粒与轮回亲本B73野生型籽粒同时同环境下播种。生长2周后，分离200份突变体茎尖组织与200份B73茎尖组织(图2)，分别混合进行RNA提取。待质检合格后，构建测序文库，于Illumina HiSeq 2500进行双端测序。获得的高通量数据中，质检合格的序列基于Hisat2(v2.0.4)(Kim et al 2015)，设置默认参数，比对至B73参考基因组上。接下来基于比对产生的文件，调用GATK/3.6-Java-1.8.0_92(McKenna et al 2010)对野生型与突变体进行 SNP-calling，获得含有SNP信息的VCF文件。最后，调用BSR-seq R脚本计算每个位点(SNP) 等位基因频率。

基于BC₁₀F₂ DNA混池测序数据，利用SHOREmap(v3.0)(Hequan Sun 2015)进行基因组多态性位点鉴定与等位基因频率测定，最终发现在9号染色体，大约25-26Mb处存在一显著的峰值，等位基因频率接近于1.0(图3中的A)，说明该峰附近序列的变异可能是引起突变体与野生型表型差异的原因。更为重要的一点是，我们的定位结果与Scanlon教授利用F₂初步定位的基因组区域重合。进一步的，结合BSR-seq测序结果，我们比较了突变体与野生型全基因组水平外显子区域的序列差异(主要是SNP与小的InDel)，发现在9号染色体存在大量的序列变异，而其他染色体变异较少(图3中的B)。这些序列变异的区域与SHOREmap定位结果存在明显的重合。我们统计了图3中的A图峰值上下5Mb区域外显子上的变异情况，发现大部分变异为SNP，只有少数为InDel(图3中的C)。将9号染色体上的所有变异单独呈现，发现在大约26Mb区域存在更多的变异数量(图3中的D)，说明该区域发生了剧烈的变化。该结果与SHOREmap定位区域基本一致，说明了这些变异中可能存在与表型变化连锁的位点。最后，结合以上两种方法的结果，我们将9号染色体25-26Mb区域作为初步候选区域。

3.KASP基因分型

KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)技术，即竞争性等位基因特异性PCR，由LGC 公司开发，可用于检测单核苷酸多态性(SNP)或插入与缺失(InDel)的遗传变异，目前已经被广泛应用。KASP实验过程如图4(图片引用自He et al 2014)，主要包括荧光引物(表1)的设计与混合，模板变性并结合特异荧光引物及反向引物进行扩增延伸，带特定荧光的拷贝的生成与信号读取。

表1 KASP通用荧光引物(LGC公司开发)

首先将不同荧光标记的两个等位基因前引物与普通后引物混合，混合体系如表2：

表2三种引物混合体系(引物mixture)

按照以下体系(表3)混合引物mixture、DNA模板及KASP Master mix等，并按照给定条件(表4)进行PCR反应，最后将反应产物于qPCR仪进行荧光读取，分辨基因型。

表3 PCR反应体系

表4 PCR反应条件

本实验室经连续多代自交，获得sem1子代BC₁₀F7，于2018年春种植于湖北鄂州。将所有杂合单株自交收获籽粒，经表型鉴定，收获BC₁₀F8小粒籽粒共计6454个，随机挑选4000个，切取种子胚乳组织，进行DNA提取。根据SHOREmap软件计算的等位基因频率峰值，以及BSR-seq分析得到的变异密度峰值所在位置，我们将候选区域锁定在大约1M的范围内。根据序列变异情况，在这1M区域内设计了多个标记(除一个Indel外，其他均为SNP标记，见表5-7)，尽量保证分布均匀。但由于一些区段序列保守性较低，导致后半段标记密度较低 (图5中的A)。基于两端标记层层筛选重组，最终利用标记SNP207与SNP183筛选得到7 个重组样品(图5中的A)，由于重组样品太少，且剩余区间内无法开发有效标记(序列非特异)，故无法继续缩小区间。两个标记相距约260kb，其间包含8个注释基因(图5中的A)。在加密标记的过程中，发现在25.5M附近有一个Indel标记与变异连锁程度最高(图5中的B)，说明该标记距离变异位点较近，附近序列含有潜在的目的基因。

表5开发标记的相关信息

表6 Indel标记的扩增引物信息

表7 SNP标记KASP引物设计的参考序列

区间内8个基因的相关功能注释如表8。包含一对编码Elongator complexprotein 6的同源基因，一个Growth-regulating factor 6转录因子，一个LincRNA以及其他编码特定蛋白的基因。转录延伸复合物(Elongator complex)与生长调控因子(Growth-regulating factor)可以调控植株形态及种子发育(Nelissen et al 2010；Omidbakhshfard et al 2015)，在拟南芥及水稻中多有报道。所以两类基因将是重点关注对象。

表8候选基因及注释

4.RNA-seq鉴定区间内差异基因

经混池测序与精细定位后，候选基因区间已经大大缩小。此时需要对突变体及野生型材料进行基因差异表达分析，以进一步预测候选基因。因为sem1突变体除籽粒表型外，还存在叶片与株型上的表型变化。所以，我们取纯合野生型与纯合突变体籽粒(大小籽粒)，每种材料设置两个生物学重复(两个生物学重复来自两个穗子)，间隔三天进行播种。待幼苗生长至V4时期，取叶片与茎尖组织做为实验样品。同时，两种类型幼嫩籽粒也进行RNA-seq。每个生物学重复至少混合来自10株幼苗的组织，或者10个以上籽粒。对野生型与突变体材料两个生物学重复样品分别进行总RNA的提取，质量检测合格后，送至公司进行建库测序。

获得的数据经质控后，利用STAR(Dobin and Gingeras 2015)比对至B73参考基因组(V4 版本)上。利用Cufflinks(Ghosh and Chan 2016)计算基因的表达量，利用cuffdiff软件包(Ghosh and Chan 2016)计算野生型与突变体差异表达基因，最后查看区间内差异表达的基因。

为了进一步确定候选基因，我们通过RNA-seq基因差异表达检测来缩小范围。由于突变体在叶片、株型及籽粒等性状存在“一因多效”的缺陷，所以我们分别基于野生型与突变体的叶片、茎尖及籽粒进行转录组测序。结果发现，Zm00001d045530与Zm00001d027071基因在三个组织中均不表达(图6中的A)，基本从候选基因中排除。Zm00001d045526基因除了在突变体茎尖组织中有微量表达，在野生型三个组织及突变体叶片与籽粒中也不表达(图6 中的A)，而且通过序列分析发现该基因没有序列变异(图6中的B)，基本排除候选基因的可能性。Zm00001d045527基因虽然在突变体叶片中表达上升，但在三个组织中表达量变化并不显著(图6中的A)，也被排除。Zm00001d045528基因虽然在突变体籽粒中显著下降，但在叶片与茎尖中变化很小，而且序列分析发现其编码区仅存在3个SNP的变异，作为目的基因的可能性较低。Zm00001d045533(叶片与茎尖)与Zm00001d045534(茎尖与籽粒)基因在突变体与野生型两个组织内表达差异并不显著(图6中的A)，且Zm00001d045534基因变异只发生在内含子上(图6中的B)，故两个基因也被排除。最后，我们发现Zm00001d045529基因在突变体三个组织内均不表达，且在茎尖与籽粒中显著下降(图6中的A)，说明该基因的表达可能与表型变异相关。进一步的，该基因在突变体中序列发生了剧烈的变化，包括启动子区两处100-200bp的Indel插入，及转录起始位点后整个基因区域无mapped reads，推测此处序列插入了更大片段序列，或者整段序列在突变体中被删除，因而导致基因不能表达。序列上的剧烈变化有力的证明该基因可能就是候选基因，而同时我们也关注了该基因在自然群体材料(300多份玉米自交系的籽粒)中的表达量差异，发现在自然状态下并不会存在像突变体与野生型间该基因巨大的表达量变化(图6中的C)。所以，我们初步将该基因当作引起表型变异的候选基因。

序列1-Zm00001d045529cds:

ATGGAGGAGCACGGAGCGGAAGACCTCCTGTGCGAGGCGATGGGATCTGCGGCGCAGGTCGTGGTGGTAGAGGAT TGCGTGGAAGCACCGGGGGCCTTCGTCCTCCACCTCCTCCTCAAGCGCGCGCTCGCCGGCTGCGGCTCCGCTGCCTTCC TCGCCCTCGCGCAGCCCTTCTCCCATTACGATCGCGTCCTGCGCAAGATGGGCTGTAACCTTTCCCTGCATAGGAGGAAT GAGAGGCTTCATTTCTTTGAATTGCTAGGATTCCCAGGTGGAGCAAGGGAAGGCACCATTGCTGATAGCTTTGCTCTATT GTACAATGAAATTCAAAGACTGGTGGAGGCAAACAGGGCTGGAGAAAATGAAGGCCAGTTCACCATCGTTATAGACGA CGCTTCCCTGTTGGAAGTCGTGGCCCTTGGTTCTGTAAGCGATGTGCTGGATTTCTTGCACTATTGTTTCACACTCACGT CTGAGATGAATTGCAAGCTAGTGATCCTCATTCACGAGGATATATACGCAAATGAGGAGAACATGGGTCTCCTTTTACAT CTGCGCTACATTGCGGATCTTGTGATTAAAGCAGCACCTTTAAGCACTGGTTTGGCTGCTGATGTTCATGGACAGCTGGC GGTTGTGAACAAGGGTACATTCAGCGAGCAAAGGGCAAAAGCACAGAAAGTTTGGAACTTCCATTTCAAAGTGAAAG AAAACGGTGCTGACTTCTTCTATCCAGGGAGTAGACATTAG

实施例2候选基因的验证

Crispr材料的构建及鉴定：首先利用在线软件CRISPR-P 2.0 (http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)(Liu et al 2017)，针对候选基因基因组序列设计特异性较高的gRNA靶标(靶标序列见表9)。靶标的位置一般选择位于基因的功能域区域，但是如果一个基因没有已注释的功能域则尽量将靶标靠基因前部设计，位于编码序列前端可以保证移码的成功概率。本实验候选基因就是因为无注释的功能域而选择将靶标设计在编码区前段。由于靶标一般是基于B73参考基因组序列设计的，所以要将靶标序列与受体材料基因组进行比对，保证其与受体的序列完全一致。设计好靶标后，通过扩增将其与gRNA连接，同时与事先扩增好的U6启动子序列进行overlap扩增，产物经纯化后，利用同源重组的方式将复合片段与线性化载体重组成环(重组按照诺唯赞

II One StepCloning Kit试剂盒说明进行，载体为CPB-ZmUbi-hspCas9)，完成载体的构建。质粒载体经测序检测无误后，采用电转化方法将其转化至EHA105农杆菌中，随后将农杆菌保种并送至北京博美兴奥生物公司对受体玉米材料(B104)进行转化。经除草剂筛选获得阳性T0代材料后，设计检测引物 (Crispr-jc-F和Crispr-jc-R，见表9)进行扩增测序，鉴定编辑情况。对有编辑的植株进行自交获得T1代种子，进行表型观察。T0代材料基因型为杂合的，自交后T1种子表现出籽粒大小的分离，进而统计分离比。

gRNA序列为：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT。

表9靶标及引物的设计

按照以下体系(表10)混合引物、DNA模板及Taq mix等，并按照给定条件(表11) 进行PCR反应：

表10 PCR反应体系

表11 PCR反应条件

基因敲除是验证候选基因功能的直接手段，而Cas9系统则最为常用(Behnom andFarboud 2017)。我们在候选基因第一个外显子上共设计了3个靶标(图7中的A)，以保证编辑效率，提高移码的可能性。最终，获得了一个有编辑的杂合阳性事件(sem1-cas9，图7中的B)，该事件在第一个靶标至第三个靶标区间内发生了126bp的片段删除，虽然没有移码，但改变了氨基酸的长度，因此可能改变了蛋白结构(图7中的C)。将基因型杂合的编辑单株与sem1 杂合野生型单株进行正反交(等位性测验)，并各自自交，产生的所有子代均产生籽粒大小表型的分离(图7中的D)，且大小籽粒数量比例接近3:1，因此，证明了候选基因即为目的基因。

通过创制等位突变是验证候选基因功能的最便捷手段。本研究从EMS突变体库(http://www.elabcaas.cn/memd/index.php)获得一个Zm00001d045529基因突变体。该突变体中候选基因第三个外显子的splice donor site发生G到A的单碱基突变(图8中的A和图8中的B)，可能会引起第三个内含子(90nt)的表达，因此可能由于片段插入而引起移码。将EMS 杂合材料进行自交，结果子代穗子表现出显著的籽粒大小表型分离，且数量比接近3:1。更进一步，我们将EMS杂合材料与sem1杂合野生型单株进行正反交，也出现相同的表型分离现象，因此进一步证明了Zm00001d045529基因就是目的基因(图8中的C)。此外，我们也将 EMS杂合材料与转基因杂合编辑材料进行了等位性测验(正反交)，子代也表现出表型分离，这些证据更加巩固了我们的研究结论(图8中的D)。

过表达材料的构建及鉴定：利用Sma1酶切载体PZZ01523-UBI-EGFP(该载体已经在文献Ning,Q.,Jian,Y.,Du,Y.et al.An ethylene biosynthesis enzyme controlsquantitative variation in maize ear length and kernel yield.Nat Commun 12,5832(2021).中公开)而获得线性化载体 (1ug质粒1ul酶，37℃下反应2h)。因为sem1突变体经回交后为B73背景，以B73 cDNA 为模板，并基于候选基因45529编码序列(SEQ ID NO.1)两端序列及线性化载体两端序列设计带有同源臂的引物(表12，引物1F,1R)，扩增候选基因的CDS全长序列。然后利用同源重组(重组按照诺唯赞

II One StepCloning Kit试剂盒说明进行)的方式将候选基因与线性化载体重组，形成质粒载体。对重组载体进行测序，检测是否含有正确序列的 UBI-CDS-EGFP表达组件，是否发生移码。测序完全正确，且未出现移码情况的质粒转化农杆菌EHA105，保菌后送至中国农科院作科所进行玉米受体材料的转化。从公司获得T0阳性植株叶片组织进行外源插入基因(如bar序列)的鉴定(表12，引物barF/barR)。后期将符合检测预期结果的事件进行自交，获得T1代。

表12候选基因编码序列扩增引物及阳性检测引物

反应体系及条件见表13和14：

表13 PCR反应体系

表14 PCR反应条件

本实施例中创制了sem1基因的过表达材料。测量单个家系籽粒表型，播种发苗。通过设计跨基因序列和GFP序列的前后引物，进行扩增检测基因型，同时利用试纸条进行基因型验证，发现群体内确实存在分离(图9中的A，图9中的B)。群体内表型比较后发现，阳性籽粒粒长、粒厚要显著大于阴性(图9中的C)。而粒宽则差异并不明显。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 玉米(corn)

<400> 1

atggaggagc acggagcgga agacctcctg tgcgaggcga tgggatctgc ggcgcaggtc 60

gtggtggtag aggattgcgt ggaagcaccg ggggccttcg tcctccacct cctcctcaag 120

cgcgcgctcg ccggctgcgg ctccgctgcc ttcctcgccc tcgcgcagcc cttctcccat 180

tacgatcgcg tcctgcgcaa gatgggctgt aacctttccc tgcataggag gaatgagagg 240

cttcatttct ttgaattgct aggattccca ggtggagcaa gggaaggcac cattgctgat 300

agctttgctc tattgtacaa tgaaattcaa agactggtgg aggcaaacag ggctggagaa 360

aatgaaggcc agttcaccat cgttatagac gacgcttccc tgttggaagt cgtggccctt 420

ggttctgtaa gcgatgtgct ggatttcttg cactattgtt tcacactcac gtctgagatg 480

aattgcaagc tagtgatcct cattcacgag gatatatacg caaatgagga gaacatgggt 540

ctccttttac atctgcgcta cattgcggat cttgtgatta aagcagcacc tttaagcact 600

ggtttggctg ctgatgttca tggacagctg gcggttgtga acaagggtac attcagcgag 660

caaagggcaa aagcacagaa agtttggaac ttccatttca aagtgaaaga aaacggtgct 720

gacttcttct atccagggag tagacattag 750

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat t 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacaaacaa gcattacact tagat 25

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctagccgtt gggatctagg at 22

<210> 6

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggtggcccg gttcacaggg cacagctttg gcagctggtc gagcagccat gaaaaaccaa 60

accagagttc gcagacaaca gacatgcccc agagccaaat ggcatcctca ttcttgtgct 120

taattctcca agtaaggaac agaccaagga cggccatgcg gataagaatg agaagcctgc 180

agaaagcacc agagccgccg a 201

<210> 7

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttacggttat ggcattctat cgattcatac aacttttgca aaataggaaa ttaaaactac 60

accatttcat acaccttatt tgtccatgag aaagtactct gaaattaaaa ttacattctt 120

ctagcaaata atgcatttga tcatgaatgt tattcatgtc tccctctccc tcatcatctc 180

ccaattggct tgtattagct t 201

<210> 8

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accaatttat tatctatgtg acccgcctga caaaatacat cttttctttt ggtgatacca 60

taagaagttc caacgacatc aagctcatga ggacgacctg ctagattatg tgttcatgag 120

gatatgatgt tgtatatata tatacaaata tatagtaaat tcaaagataa agagtagatg 180

atgatgagac acttacattg t 201

<210> 9

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccgccgcccc tagcccccct ctccctcccc gcattcccaa cctctcacat ttgtgaatag 60

gcgaaaccag gaaattataa actttgaaga caaacttctc ccggggttag gattagaaat 120

gagtaataat gaaatcggag tgctgaagag tgattttctt gctattagtt gctcaattaa 180

tgcggataag tttgagagct a 201

<210> 10

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atactatggt ttgtttccct tctgcagtga gttactacgc ctactacggg aagaagctgg 60

acccggagcc gtggcggtgc cgccgcaccg acggcaagaa gtggcggtgc tccaaggagg 120

cgcaccccga ctccaagtac tgcgagcgcc acatgcaccg tggccgcaac cgttcaagaa 180

agcctgtgga atccaagacc g 201

<210> 11

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgacaaagc aacgacatgc actgccgaaa tcgacttctt tgccgagtgc ctcaatcgtg 60

ttgcaatgat ctatcacaca cgcacagcta ataaacctac cggccgatgt gcgttgtcta 120

acaatactta aaagatgaaa taattttaaa ctaaaagaat tacatacata ttatgatata 180

gtgacaaatc tagtaatttt a 201

<210> 12

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tttttaatca ttttgtttgt tattttagga ggtgggaaca aaacacccat gttctcgcgt 60

gaaagccact attcatgagc tcactcaaat cagagagtgg tttccacggg aattacctcc 120

gatgtttttg cacatgtgct gattgttcta gtcccaaaaa aaatgttcac aaacattttt 180

tttgggtgca ccgtccgatc c 201

<210> 13

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgacggtgcg gcgcgcggag gaggcccgcg cgacggtcgc gagcaggggg cggcgacgcc 60

tgcagggaag tggcggctga agagaaggga gggaggaaac cgtagctcga tgataccatg 120

ttagagacag tagattgatt attaggctaa ctctagaggg tagctatata gtcttacata 180

aatctagcca catgggccta a 201

<210> 14

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgtttacac gcgatacggg gcccggtggt cgccaatagc cagcataact ctctttgttt 60

acacgcgata cggggtcggg ccggaaaccc actgcacgta cccgcttacc tctaatcgaa 120

tctaaatcgc gaaccgaaaa ccgaaacgat acgaacgcgc gattagacac aacattagac 180

aaaagaaata tacttcgata t 201

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacctcctgt gcgaggcgat ggg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgtggtggta gaggattgcg tgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aatgggagaa gggctgcgcg agg 23

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

attaatcacg ctcacggctc a 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tatgcaggga aaggttacag cc 22

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aaacgcacta gtatcccggg atggaggagc acggagcgga 40

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggcgcgcctt cccggatgtc tactccctgg atagaag 37

<210> 22

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cacgtcatgc cagttccc 18

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caccatcgtc aaccactaca tc 22

Claims

1.Zm00001d045529基因在调控玉米籽粒发育中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：通过在玉米植株中过表达Zm00001d045529基因调控玉米籽粒发育。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述玉米籽粒发育包括籽粒粒长和/或粒厚。

4.一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：通过基因工程技术手段在玉米植株中过表达Zm00001d045529基因。

5.根据权利要求4所述的一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：所述Zm00001d045529基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：将SEQ ID NO.1所示的基因序列与线性化载体连接，之后采用农杆菌介导的遗传转化方法转入玉米受体材料中，培养，获得转基因植株。

7.根据权利要求6所述的一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：所述线性化载体为Sma1酶切载体PZZ01523-UBI-EGFP。

8.根据权利要求6所述的一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：SEQ ID NO.1所示的基因序列的扩增引物为：1F：AAACGCACTAGTATCCCGGGATGGAGGAGCACGGAGCGGA；1R：GGCGCGCCTTCCCGGATGTCTACTCCCTGGATAGAAG。

9.根据权利要求6所述的一种调控玉米籽粒发育的方法，其特征在于：所述农杆菌为农杆菌EHA105。

10.如权利要求4-9任一所述的一种调控玉米籽粒发育的方法在调控玉米籽粒发育中的应用。