CN111073875B

CN111073875B - 小麦单倍体诱导基因及其应用

Info

Publication number: CN111073875B
Application number: CN202010074738.8A
Authority: CN
Inventors: 陈绍江; 刘晨旭; 钟裕; 祁晓龙; 刘宗凯
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2022-01-25
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: WO2020156406A1; CN111073875A

Abstract

本发明公开了小麦单倍体诱导基因及其应用。本发明通过分析玉米中诱导基因ZmPLA1在小麦中的同源基因，获得了编码小麦磷脂酶的PLA基因，其在小麦A、B、D三个染色体组中存在，分别命名为PLA‑A、PLA‑B和PLA‑D，通过定点突变技术和转基因试验，获得PLA基因突变的转基因材料，并利用转基因材料进行自交或与其他材料杂交，在后代中观察到了一定比例的单倍体植株，验证了PLA突变后的小麦材料具有能够诱导产生小麦母本单倍体的功能。本发明不仅对于揭示小麦母本单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础，而且对于选育新型的诱导系，进一步提高诱导率，以及提高小麦单倍体育种效率方面具有重要的意义。

Description

小麦单倍体诱导基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及小麦单倍体诱导基因及其应用。

背景技术

小麦是世界上主要的粮食作物。保持小麦产量的稳步增加及品质的不断改良，仍然是目前小麦育种的重要工作。众所周知，小麦是典型的自花授粉作物，生产上所使用的品种亦是遗传上纯合的纯系材料。因此，小麦新品种的选育虽然不需每代授粉，但仍需逐代自交纯化，经过天然自交8代或以上，方能获得优良的纯系材料。虽不需要人工授粉，但鉴于多数小麦材料每年只能种植一代，仍耗费大量的时间与精力。区别于玉米和水稻等作物的基因组，小麦的基因组为异源六倍体，基因组相对复杂的特点显著增加了小麦育种的难度。

与传统育种方式相比较，单倍体育种方法能够显著提高育种效率，在玉米等作物中获得了广泛应用。因此，建立小麦单倍体育种技术体系具有重要意义。前人探索了多种产生小麦单倍体的方法，如配子体培养法、远缘杂交、无融合生殖等。然而，配子体培养和远缘杂交方法等，仍需大量繁琐的操作，或者使用玉米的花粉，其效率不高，且受材料背景影响较大，难于大规模利用。基于诱导基因的单倍体诱导方法在玉米中成功大规模应用，其效率能够达到10％以上，已成为目前玉米骨干自交系选育的主要方法。因此若能够将玉米体内单倍体诱导的方法应用于小麦单倍体育种，则能够大大提高小麦单倍体育种的效率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高小麦单倍体育种效率。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种小麦母本单倍体诱导系的制备方法。

本发明提供的小麦母本单倍体诱导系的制备方法包括如下步骤：沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因，得到转基因小麦，即为小麦母本单倍体诱导系；

所述PLA基因为小麦A基因组中的PLA-A基因和/或小麦B基因组中的PLA-B基因和/或小麦D基因组中的PLA-D基因。所述PLA-A基因、所述PLA-B基因和所述PLA-D基因的基因组序列分别如序列表中序列1、序列4和序列7所示。

进一步的，所述沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因为突变目的小麦基因组中PLA基因使目的小麦基因组中PLA基因表达量降低或使目的小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。

更进一步的，所述使目的小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式为CRISPR/Cas9。

在本发明的一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第905-923位和序列7第939-957位。

在本发明的另一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第699-718位。

上述小麦母本单倍体诱导系的制备方法中，所述沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因通过将敲除目的小麦基因组中PLA基因的物质导入目的小麦实现。

进一步的，所述敲除目的小麦基因组中PLA基因的物质可为CRISPR/Cas9载体。在本发明的一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9载体为CRISPR/Cas9-1载体，其为将针对PLA-A基因和PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列(序列1第905-923位)和针对PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列(序列7第939-957位)共同插入pBUN411载体后得到的载体。在本发明的另一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9载体为CRISPR/Cas9-2载体，其为将针对PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列(序列1第699-718位)插入pBUN411载体后得到的载体。

更进一步的，所述目的小麦可为野生型小麦材料CB037。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种小麦母本单倍体的制备方法。

本发明提供的小麦母本单倍体的制备方法包括如下步骤：将由上述方法制备的小麦母本单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他小麦材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述小麦母本单倍体。

进一步的，所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为小麦母本单倍体。

更进一步的，所述单倍体性状鉴定方法可按照如下方法进行：若待测植株具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株具有植株高大，叶片宽大，披散，育性正常等特征，则该植株为或候选为二倍体。

所述叶片倍性鉴定方法可按照如下方法进行：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体小麦叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位在50附近出现)。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的信号峰出现在100附近，其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，则该植株为或候选为二倍体。

所述分子标记鉴定可按照如下方法进行：采用父本(母本单倍体诱导系)和母本间多态性引物进行PCR扩增，根据PCR扩增产物判断待测植株为单倍体还是二倍体：若待测植株的扩增产物仅具有母本的带型，不存在父本的带型，则该植株为或候选为单倍体；若待测植株的扩增产物具有父本和母本的杂合带型，则该植株为或候选为二倍体。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)所示的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列3或序列6或序列9所示的蛋白质；

b)在序列3或序列6或序列9所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列3或序列6或序列9的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列3或序列6或序列9所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码上述蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1或序列2或序列4或序列5或序列7或序列8所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

如下1)-6)任一种应用也属于本发明的保护范围：

1)由上述方法制备的小麦母本单倍体诱导系在制备小麦母本单倍体中的应用；

2)沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因的物质在制备小麦母本单倍体诱导系或小麦母本单倍体中的应用；

3)由上述方法制备的小麦母本单倍体诱导系或由上述方法制备的小麦母本单倍体在小麦杂交种选育或小麦单倍体育种中的应用；

4)上述蛋白质或生物材料在调控小麦母本单倍体诱导系的诱导率中的应用；

5)上述蛋白质或生物材料在提高小麦母本单倍体诱导系的诱导率中的应用；

6)上述蛋白质或生物材料在培育小麦母本单倍体中的应用。

上述应用中，所述沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因的物质可为用于敲除PLA基因的CRISPR/Cas9载体。在本发明的一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9载体为上述CRISPR/Cas9-1载体。在本发明的另一个具体实施例中，所述CRISPR/Cas9载体为上述CRISPR/Cas9-2载体。

本发明通过分析玉米中诱导基因ZmPLA1在小麦中的同源基因，获得了编码小麦磷脂酶的同源基因PLA，该基因在小麦的A、B、D三个染色体组中存在，分别命名为PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因，通过CRISPR/Cas9定点突变技术和转基因试验，成功获得了PLA基因突变的转基因材料，利用转基因材料进行自交或与其他材料杂交，在后代中观察到了一定比例的单倍体植株，验证了PLA突变后的小麦材料具有能够诱导产生小麦母本单倍体的功能。本发明不仅对于揭示小麦母本单倍体产生的遗传学和生物学机理奠定了重要的基础，而且对于选育新型的诱导系，进一步提高诱导率，以及提高小麦单倍体育种效率方面具有重要的意义。

附图说明

图1为PLA基因结构示意图及利用CRISPR/Cas9技术的靶位点的设定。

图2为表型鉴定结果。左侧为二倍体；右侧为单倍体。

图3为叶片倍性鉴定结果。左侧为二倍体；右侧为单倍体。

图4为分子鉴定结果。F为父本，CS为中国春，F1为杂交1代，H为单倍体。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、小麦单倍体诱导基因的获得

根据玉米单倍体诱导基因的定位及转基因验证，确定了玉米的单倍体诱导基因ZmPLA。利用在线的生物信息平台(www.gramene.com)，分析获得ZmPLA在小麦中的同源基因，在小麦的A、B、D基因组中，分别存在一个同源基因，分别将其命名为PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因。

PLA-A基因的基因组序列如序列1所示，CDS序列如序列2所示，PLA-A基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列3所示。

PLA-B基因的基因组序列如序列4所示，CDS序列如序列5所示，PLA-B基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列6所示。

PLA-D基因的基因组序列如序列7所示，CDS序列如序列8所示，PLA-D基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列9所示。

实施例2、诱导产生小麦母本单倍体的方法

一、CRISPR/Cas9系统敲除小麦PLA基因获得突变体

本实施例利用CRISPR/Cas9系统敲除小麦A基因组中PLA-A基因和/或B基因组中PLA-B基因和/或D基因组中PLA-D基因，获得如下PLA基因突变并能够诱导单倍体的小麦突变体：同时敲除A基因组中PLA-A基因、B基因组中PLA-B基因和D基因组中PLA-D基因的小麦突变体；同时敲除A基因组中PLA-A基因和D基因组中PLA-D基因的小麦突变体；单独敲除A基因组中PLA-A基因的小麦突变体；单独敲除D基因组中PLA-A基因的小麦突变体。

突变体的具体制备方法如下：

1、sgRNA靶位点序列的选择

图1为基因结构及靶位点示意图。

小麦PLA-A基因、PLA-B基因及PLA-D基因的基因组序列分别如序列表中序列1、序列4、序列7所示。针对三个靶基因，进行了2次靶位点设计，具体如下：

1)第一次针对PLA-A基因和PLA-D基因设计两个靶位点

a、针对PLA-A基因和PLA-D基因设计的同时敲除两个基因的靶位点序列为CCAGGGACGTCAACCGCTT(该靶位点序列位于序列1第905-923位或序列7第905-923位)。针对该靶位点序列设计的sgRNA靶位点序列为CCAGGGACGUCAACCGCUU，该sgRNA靶位点的编码DNA序列为CCAGGGACGTCAACCGCTT。

b、针对PLA-D基因的靶位点序列为CCCCTACATCTTCCCGCAA(该靶位点序列位于序列7第939-957位)。针对该靶位点序列设计的sgRNA靶位点序列为CCCCUACAUCUUCCCGCAA，该sgRNA靶位点的编码DNA序列为CCCCTACATCTTCCCGCAA。

2)第二次针对PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因设计一个靶位点

c、针对PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因设计的同时敲除三个基因的靶位点序列为GACGGTGCTGACCATCGACG(该靶位点序列位于序列1第699-718位或序列4第702-721位或序列7第699-718位)。针对该靶位点序列设计的sgRNA靶位点序列为GACGGUGCUGACCAUCGACG，该sgRNA靶位点的编码DNA序列为GACGGTGCTGACCATCGACG。

2、CRISPR/Cas9载体的构建

CRISPR/Cas9-1载体为将步骤1的a中针对PLA-A基因和PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列和步骤1的b中针对PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列共同插入pBUN411载体(pBUN411记载在如下文献中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.ACRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants[J].BMC plantbiology,2014,14(1):1.)后得到的载体。

CRISPR/Cas9-2载体为将步骤1的c中针对PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因设计的sgRNA靶位点的编码DNA序列插入pBUN411载体(pBUN411记载在如下文献中：Xing H L,Dong L,Wang Z P,et al.A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing inplants[J].BMC plant biology,2014,14(1):1.)后得到的载体。

3、转基因小麦的获得

首先分别将CRISPR/Cas9-1载体和CRISPR/Cas9-2载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105(购自华越洋生物科技有限公司，公众可通过购买获得)，分别得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-1和重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-2。

然后分别将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-1和重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-2采用农杆菌侵染法(重组农杆菌进行28℃扩繁，使用扩繁后的菌液对小麦进行侵染)转化小麦受体材料CB037(CB037记载在如下文献中：叶兴国,陈明,杜丽璞,&徐惠君.(2011).小麦转基因方法及其评述(Doctoral dissertation))幼胚。

最后按照常规方法经过筛选、分化和生根后获得T0代转基因小麦植株。

4、PLA基因发生突变的转基因小麦鉴定

采集T0代转基因小麦植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用如下引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。

PLA突变序列检测引物：

PLA-A：4AF：GTCAAGATCTCCAGCCGAGAC；

4AR：GGTACTTGCCGCTGTACCT；

PLA-B：4BF：AACTCAACATGGGGCGTCCTC；

4BR：ACGTCGTATGTGGAGAAGATGATG；

PLA-D：4DF：TTCGGGTCCGGATTCTATTGTG；

4DR：GCAGGTACTTGCCGTTGTACC。

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果与野生型小麦PLA基因进行比对，鉴定T0代转基因小麦不同株系中PLA-A基因、PLA-B基因和PLA-D基因是否发生突变。将PLA基因发生突变的植株记做阳性T0代转基因小麦。

5、T1代PLA基因发生突变的转基因小麦的基因型鉴定

将上述步骤4得到的阳性T0代转基因小麦，收获种子后再播种，得到T1代转基因小麦。鉴定T1代转基因小麦的PLA基因的基因型，具体如下：以T1代转基因小麦的基因组DNA作为模板，利用PLA突变序列检测引物进行扩增，将PCR产物进行Sanger测序，根据测序结果对T1代转基因小麦中PLA基因的突变情况进行描述。

1)双突和单突的T1代转基因小麦PLA基因突变株系

在重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-1侵染小麦受体材料CB037获得的T0代转基因小麦植株的自交后代中，获得了PLA-A和PLA-D基因同时发生突变的T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1、PLA-A基因单独发生突变的T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A和PLA-D基因单独发生突变的T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1的A基因组中的两条同源染色体上的PLA-A基因均为PLA-A-1突变基因，D基因组中的两条同源染色体上的PLA-D基因均为PLA-D-1突变基因。PLA-A-1突变基因为将序列1所示的PLA-A基因第909位的碱基G缺失后得到的基因序列；PLA-D-1突变基因为将序列7所示的PLA-D基因第908-909位的GG缺失后得到的基因序列。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A的A基因组中的两条同源染色体上的PLA-A基因均为PLA-A-1突变基因。PLA-A-1突变基因为将序列1所示的PLA-A基因第909位的碱基G缺失后得到的基因序列。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D的D基因组中的两条同源染色体上的PLA-D基因均为PLA-D-1突变基因。PLA-D-1突变基因为将序列7所示的PLA-D基因第908-909位的GG缺失后得到的基因序列。

2)三突的T1代转基因小麦PLA基因突变株系

在重组菌EHA105/CRISPR/Cas9-2侵染小麦受体材料CB037获得的T0代转基因小麦植株的自交后代中，获得了PLA-A、PLA-B和PLA-D基因同时发生突变的T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1的A基因组中的两条同源染色体上的PLA-A基因均为PLA-A-2突变基因，B基因组中的两条同源染色体上的PLA-B基因均为PLA-B-1突变基因，D基因组中的两条同源染色体上的PLA-D基因均为PLA-D-2突变基因。PLA-A-2突变基因为将序列1所示的PLA-A基因第713-716位的碱基TCGA缺失后得到的基因序列；PLA-B-1突变基因为在序列4所示的PLA-B基因的第718位和第719位之间插入1个碱基C后得到的基因序列；PLA-D-2突变基因为将序列7所示的PLA-D基因的第716位和第717位之间插入一个碱基G后得到的基因序列。

二、CRISPR/Cas9系统敲除小麦PLA基因所获得突变体的单倍体诱导能力鉴定

1、田间表型鉴定

将T1代转基因小麦PLA基因突变株系(T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1)材料自交，获得自交后代。

将T1代转基因小麦PLA基因突变株系(T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D、T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1)的花粉授予野生型小麦材料中国春进行杂交，获得杂交后代。同时将野生型小麦CB037(PLA基因未突变)的花粉授予野生型小麦中国春获得的后代作为对照。

将上述所得后代播种于田间，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，且上冲，株型紧凑，雄性不育等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大，披散，育性正常(图2)。

每个株系统计结果如表1所示。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1自交的154个后代中得到17个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A自交的248个后代中得到2个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D自交的225个后代中得到1个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1自交的179个后代中得到31个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1与野生型中国春杂交的140个后代中得到15个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株；

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-A与野生型中国春杂交的215个后代中得到1个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1-D与野生型中国春杂交的210个后代中得到2个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1与野生型中国春杂交的137个后代中得到24个表现为单倍体性状单株，拟定为单倍体植株。

2、流式细胞检测叶片倍性

将上述步骤1中鉴定获得的表现为单倍体性状植株进行流式细胞检测，方法如下：

提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体小麦叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为100(由于二倍体细胞内的遗传物质是单倍体细胞内遗传物质的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位理论上在50附近出现)；若待测植株的信号峰出现在100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体。若待测植株细胞核信号峰出现在50附近，则认为该待测植株为单倍体植株(图3)。流式细胞仪测定的误差较小，因此测定后能够将待测植株准确的分为单倍体和二倍体两组。

结果表明：T1代转基因小麦PLA基因突变株系自交后代或与中国春杂交后代中经表型鉴定出的拟单倍体经流式细胞仪检测后，其倍性均为单倍体植株。

3、分子标记鉴定

对上述步骤1中突变体材料与中国春杂交后代中的单倍体植株利用多态性分子标记(Xbarc284和xgwm124-1B)进行基因型鉴定。结果如图4所示，结果表明，单倍体植株只有中国春(母本)的带型。进一步证明该方法所获得的单倍体为孤雌生殖母本单倍体。多态性标记的引物序列如下：

Xbarc284-L：GCGTCAGAAATGCAAGAAAAATAGG；

Xbarc284-R：GCGGAAGAAAAGGACGAAGACAAG；

Xgwm124-1B-F：GCCATGGCTATCACCCAG；

Xgwm124-1B-R：ACTGTTCGGTGCAATTTGAG。

因此，T1代转基因小麦PLA基因突变株系自交或与杂交种杂交获得的后代单株中，若按照上述3种方法鉴定结果中任一种方法鉴定为单倍体，则该植株为或候选为小麦母本单倍体；若上述3种方法鉴定结果都不为单倍体，则该植株不为或候选不为小麦母本单倍体。

根据每个株系获得的单倍体数量计算其单倍体诱导率，单倍体诱导率(％)＝(单倍体数/测验总株数)×100％。统计结果如表1所示：可以看出，无论自交还是与其他小麦材料杂交，T1代转基因小麦PLA基因突变株系Ne147-1的单倍体诱导率最高，T1代转基因小麦PLA基因突变株系Da14-1次之。

综上所述，将小麦A基因组中的PLA-A基因和/或小麦B基因组中的PLA-B基因和/或小麦D基因组中的PLA-D基因突变后获得的PLA基因突变植株可作为小麦母本单倍体诱导系，该小麦母本单倍体诱导系自交或与其他小麦材料杂交，可在后代中获得小麦母本单倍体。

表1、T1代转基因小麦PLA基因突变株系自交及与中国春杂交后代中的单倍体植株

转化事件	母本	后代数量	单倍体数量	诱导率
					Da14-1	中国春	140	15	10.71％
Da14-1-A	中国春	215	1	0.47％
					Da14-1-D	中国春	210	2	0.95％
Ne147-1	中国春	137	24	17.52％
					Da14-1	自交	154	17	11.03％
Da14-1-A	自交	248	2	0.81％
					Da14-1-D	自交	225	1	0.44％
Ne147-1	自交	179	31	17.32％
					野生型对照	野生型CB037	485	0	0

序列表

<110>中国农业大学

<120>小麦单倍体诱导基因及其应用

<160>9

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2733

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>1

aaagaaaaac acaaaaaaga gaagaaagac gaaatccgat gaaaaccgga ccagtccaag 60

caacaggcag aaacaagaaa aagattccct caaaaaaaca agaaaaagaa ccaacgaaac 120

tctacagcga gctagctagc gaacgaacca aaaaaaaacc cggtcaagat ctccagccga 180

gacttcactt acgcttcgtc atgagcgata catagaatag tttgcagtga actcagcttg 240

ggccgtcttc agtttggtca gagtgaacgc gctctcgcac tgtgtgcgcc acgacataag 300

accgaccggt tccttcttct tccactgcat gtctgcatgt cttcagttaa ccacacccgc 360

aaactgttta ctgtttactg tgccctctct cactccaaaa atagaccagc gcgcgctacg 420

gcatgaacca tggcagccac tcgctcgccg ctagcaaacc caccaattac cgccatcggt 480

ctgcctaccc tctcgtgcgg cgatcgatcc cgtcttcttc ctcctgattc tcgaccgagg 540

tgtcgtacgt cggtttgcaa cgtcggctga tcgatcggac gcgtggccgc cgggtcgatg 600

atggcaagct actggtgccg gcggccctgc gagtcgtgca gcacgcgggc gatggcgggc 660

agcgtggtcg gccagccggt ggcgccgggg cagcgggtga cggtgctgac catcgacggg 720

ggcggcatcc gcggcatcat cccgggcacc atcctcgact tcctcgaggc caagctgcag 780

gagctggacg gcccgggcgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 840

accggcggcc tcatcaccgc catgatcacc gcgcccggca aggacggccg cccgctcttc 900

gccgccaggg acgtcaaccg cttctacctc gacaacgggc cctacatctt ccctcaaagg 960

cgagagcacg aacgatctca tctcatggac atggatcatg cgagctgaac tggtggttga 1020

tgtgtggatt gtgttgagct gtgccaggag gtgcgcgctc gccgcggtga ccgcatcgct 1080

gaggcggccg aggtacagcg gcaagtacct gcacggcaag atcaggagca tgctcggcga 1140

gacgaggctg tgcgacgcgc tcaccgacgt cgtcatcccc accttcgacg tcaagcttct 1200

ccagcccatc atcttctcca catacgacgt atatatgcta attttatact tggatcatgg 1260

atcagacaga catggggcta aaaacgtgat ggatcatgtg tgcgtgcgtg caggccaaga 1320

gcatgcccct gaagaacgcg cggctcgccg acatctgcat cggcacctcc gccgccccga 1380

cctacctccc cgcgcaccac ttccacaccc acgacggcaa cggcaaggag cgcgagtaca 1440

acctcatcga cggcggcgtc gccgccaaca atccggtaac caatcaagcg tctgtccgtc 1500

tgtcagatgt tcagacacgc ttgcccgacc cgatcacact gatgaactga gctgtgacaa 1560

acgcagacga tggtggcgat gacgcagatc accaagaaga tgatgggcaa ggacagggag 1620

gagctgtacc cggtgaagcc gtcggactgc ggcaagttcc tggtgatgtc cgtcggcacc 1680

ggctcgacgt ccgaccaggg gctgtacacg gcgaagcagt gctcccagtg gggcatcatc 1740

agctggctcc gcaacaaggg catggcgccc atcatcgaca tcttcatggc agccagctcc 1800

gacctcgtcg acatccacgc cgccgtgctc ttccagtcgc tgcacagcga cggcgactac 1860

ctccgcatcc aggacaactc gctccacggc ccggcggcca cggtggacgc tgccacgccc 1920

gagaacatgg cggagctcct caggatcggc gagcggatgc tggcgcagag ggtgtccagg 1980

gtgaacgtcg agaccgggag gtacgaggag gtaaaggggg ccgggagcaa cgccgacgcg 2040

ctcgccgggt tcgccaggca gctctccgac gagaggagga caaggctcga gcgccggcgt 2100

ggtggcgccg gccgtctgaa atccagacgc tgaccttgta gcttagcgtg gcttagtttc 2160

atttattttc tatataaatt tttggcgggg atagatagag aaagcttttc acatggataa 2220

tgaaaggaaa tgatgagctc aagaaaaata acaacacttt tttttgcgta gtcaagaaaa 2280

aataacaaga cttgatgaaa ccaaaatgcc tctcaattgg tcaccatggc aattgtatat 2340

ccctttcgac atcatcatca tgaataaatc aacagtgaac aagagagcaa acgaccaaca 2400

aaaatttaca caaagcctcc tacctatttc ggcaagcttc aaaataaatg aatggattgc 2460

agcatagaaa gaaaagaaaa acctgaccta tacaacagaa cactgggaac atcggttaga 2520

cgatcatcgg gactctgcct gcttgccggc ttcagtccgc ggatcatcgc aaacagtaac 2580

ttgcacaggc aaggctgcaa atgtgctcac cttacagtga ctgtatcctt gcttccactg 2640

cacaggcttg aattggccag gcactcgtgg gggttagcgt agaaataatc ctcctctttc 2700

ggcttgtttt cgagttttcg ccgacaggac ggt 2733

<210>2

<211>1269

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>2

atggcaagct actggtgccg gcggccctgc gagtcgtgca gcacgcgggc gatggcgggc 60

agcgtggtcg gccagccggt ggcgccgggg cagcgggtga cggtgctgac catcgacggg 120

ggcggcatcc gcggcatcat cccgggcacc atcctcgact tcctcgaggc caagctgcag 180

gagctggacg gcccgggcgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 240

accggcggcc tcatcaccgc catgatcacc gcgcccggca aggacggccg cccgctcttc 300

gccgccaggg acgtcaaccg cttctacctc gacaacgggc cctacatctt ccctcaaagg 360

aggtgcgcgc tcgccgcggt gaccgcatcg ctgaggcggc cgaggtacag cggcaagtac 420

ctgcacggca agatcaggag catgctcggc gagacgaggc tgtgcgacgc gctcaccgac 480

gtcgtcatcc ccaccttcga cgtcaagctt ctccagccca tcatcttctc cacatacgac 540

gccaagagca tgcccctgaa gaacgcgcgg ctcgccgaca tctgcatcgg cacctccgcc 600

gccccgacct acctccccgc gcaccacttc cacacccacg acggcaacgg caaggagcgc 660

gagtacaacc tcatcgacgg cggcgtcgcc gccaacaatc cgacgatggt ggcgatgacg 720

cagatcacca agaagatgat gggcaaggac agggaggagc tgtacccggt gaagccgtcg 780

gactgcggca agttcctggt gatgtccgtc ggcaccggct cgacgtccga ccaggggctg 840

tacacggcga agcagtgctc ccagtggggc atcatcagct ggctccgcaa caagggcatg 900

gcgcccatca tcgacatctt catggcagcc agctccgacc tcgtcgacat ccacgccgcc 960

gtgctcttcc agtcgctgca cagcgacggc gactacctcc gcatccagga caactcgctc 1020

cacggcccgg cggccacggt ggacgctgcc acgcccgaga acatggcgga gctcctcagg 1080

atcggcgagc ggatgctggc gcagagggtg tccagggtga acgtcgagac cgggaggtac 1140

gaggaggtaa agggggccgg gagcaacgcc gacgcgctcg ccgggttcgc caggcagctc 1200

tccgacgaga ggaggacaag gctcgagcgc cggcgtggtg gcgccggccg tctgaaatcc 1260

agacgctga 1269

<210>3

<211>422

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>3

Met Ala Ser Tyr Trp Cys Arg Arg Pro Cys Glu Ser Cys Ser Thr Arg

1 5 10 15

Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Gln Pro Val Ala Pro Gly Gln Arg

20 25 30

Val Thr Val Leu Thr Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro

35 40 45

Gly Thr Ile Leu Asp Phe Leu Glu Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp Gly

50 55 60

Pro Gly Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Cys Ile Ala Gly Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Ile Thr Ala Pro Gly Lys Asp Gly

85 90 95

Arg Pro Leu Phe Ala Ala Arg Asp Val Asn Arg Phe Tyr Leu Asp Asn

100 105 110

Gly Pro Tyr Ile Phe Pro Gln Arg Arg Cys Ala Leu Ala Ala Val Thr

115 120 125

Ala Ser Leu Arg Arg Pro Arg Tyr Ser Gly Lys Tyr Leu His Gly Lys

130 135 140

Ile Arg Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Leu Cys Asp Ala Leu Thr Asp

145 150 155 160

Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Val Lys Leu Leu Gln Pro Ile Ile Phe

165 170 175

Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Arg Leu Ala

180 185 190

Asp Ile Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala His

195 200 205

His Phe His Thr His Asp Gly Asn Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Asn Leu

210 215 220

Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Thr

225 230 235 240

Gln Ile Thr Lys Lys Met Met Gly Lys Asp Arg Glu Glu Leu Tyr Pro

245 250 255

Val Lys Pro Ser Asp Cys Gly Lys Phe Leu Val Met Ser Val Gly Thr

260 265 270

Gly Ser Thr Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Cys Ser Gln

275 280 285

Trp Gly Ile Ile Ser Trp Leu Arg Asn Lys Gly Met Ala Pro Ile Ile

290 295 300

Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp Ile His Ala Ala

305 310 315 320

Val Leu Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asp Tyr Leu Arg Ile Gln

325 330 335

Asp Asn Ser Leu His Gly Pro Ala Ala Thr Val Asp Ala Ala Thr Pro

340 345 350

Glu Asn Met Ala Glu Leu Leu Arg Ile Gly Glu Arg Met Leu Ala Gln

355 360 365

Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Val Lys

370 375 380

Gly Ala Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Phe Ala Arg Gln Leu

385 390 395 400

Ser Asp Glu Arg Arg Thr Arg Leu Glu Arg Arg Arg Gly Gly Ala Gly

405 410 415

Arg Leu Lys Ser Arg Arg

420

<210>4

<211>2768

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>4

ttccaccatg caaaccaatg caacctctta tgtggcatca tcaccctaca aaaaacgaga 60

taccgcatct gtaattcctt ttgcaaactt ttttaagtat aacttgagca atggacttaa 120

ttagaacctc tatctccgga agacatgcat ttctccttcc aaccagtaag tttaagaatt 180

aagatctgcc tcctaccaca gtcgatatgg gatttaagca actattcggg aaccatttgc 240

agtgaactca acatggggcg tcctcagttt ggtgagagag tggaccgcgc tctcgcactg 300

tctacgccaa gaccgaccgg ttccttcttc cactgcatgt cttcagttaa ccacacccgc 360

atctgtttac tgtaccctct ctcagtccaa aaatagacga gcgcgcgcta cggcacaagc 420

cattgcagcc actcgctcgc cgctagcaaa tccaccaatt actaccatcg atctgggtac 480

cctcttgtgc ggcgaccgat ctcgtcttct tcttcctctt gattgtcaac cgaggtgccg 540

tcagtttgca acggcggctg atcgatcaga cgcgcgcgcg cgtgcgtggc cgccgggtcg 600

atgatggcaa gctactggtg ccggcgcccc tgcgagtcgt gcagcacgag ggcgatggcg 660

ggcagcgtgg tgggccagcc ggtggctccg gggcagcggg tgacggtgct gaccatcgac 720

gggggcggca tccgcggcct catcccgggc accatcctcg ccttcctcga ggccaagctg 780

caggagctgg acgggccggg cgcgcgcctg gccgactact tcgactgcat cgccggcacc 840

agcaccggcg gcctcatcac cgccatgatc accgcgcccg gcaaggacgg ccgcccgctc 900

ttcgccgcca aggacgtcaa ccgcttctac ctcgacaacg ggccctacat cttcccgcaa 960

aggtgagagc acgaacgatc tcatctcatg gacatggatc atgcgcgctg aactggtgat 1020

tgatgtatga attgcattga gttgtgccag gaggtgcgcg ctcgccgcgg tgaccgcgtc 1080

gctgaggcgg ccgaggtaca acggcaagta cctgcacggc aagatcagga gcatgctcgg 1140

cgagacgagg ctgtgcgacg cgctcaccga cgtcgtcatc cccaccttcg acgtcaagct 1200

tctccagccc atcatcttct ccacatacga cgtatgctaa ttttatacga ggactaatgt 1260

gatgatcaga tcgatccatc cttggatcat ggatcagaca gacatggggc taaaaacgtg 1320

atggatcatg cgtgcgtcgt ccgtgcaggc caggtgcatg cccctgaaga acgcgcggct 1380

cgccgacgtc tgcatcggca cctcggccgc tccgacctgc ctccccgcgc accacttcca 1440

cacccacgac ggcaacggca aggagcgtga gtacaacctc atcgacggtg gcgtcgccgc 1500

caacaatccg gtaaccaatc aagcgtctgc ccgtcggtca gatgttcaga cacgcttgcc 1560

cgacccgagc acactgacca actgagctgt gagaaatgca gacgatggtg gcgatgacgc 1620

agatcaccaa gaagatgatg ggcaaggaca gggaggagct gtacccggtg gagccgtcgg 1680

actgcggcaa gttcctggtg ctgtccgtcg ggaccggctc gacgtccgac caggggctgt 1740

acacggcgaa gcagtgctcc cagtggggca tcatcagctg gctgcgcaac aagggcatgg 1800

cgcccatcat cgacatcttc atggcggcca gctccgacct cgtcgacatc cacgccgccg 1860

tgctcttcca gtcgctgcac agcgacgcca actacctccg catccaggac aactcgctcc 1920

acggcccggc ggccacggtg gacgccgcca cgcccgagaa catggcggag ctcctcagga 1980

tcggcgagcg gatgctggcg cagagggtgt ccagggtgaa cgtggagacc gggaggtacg 2040

aggagataaa gggggccggg agcaacgccg acgcgctcgc cggcttcgcc aggcagctct 2100

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gccgctgatc ttgtagctta gtgtggctta gtttcattca ttttctatat acagtatatc 2220

tttttggctg ggataggtag agaaagcttc acatggataa tgacaggaaa tgaggagttc 2280

tggaaaaata acaacacttg atggaaccaa aatgtctctc aattggtcac cgtggcaatt 2340

gtatatccct tccgatatca tcatgaattt aatcaccggt gaacaatagc gcaaacgacc 2400

aacaaaaatt tacacacagc atccctactt tggctagctt gaaaataaat gaatggattg 2460

cagcatagaa agaaaaaaga aaaacctggc ctatacaaca gaacactggg aacgccagtt 2520

aaacgatcgt ggcgactctg cctgcttgcc ggcttcagtc cgcggatcat cacaaacagt 2580

aacttgcaca ggcgaggctg caaatgtgct caccttacag tgactgtatc cttgcttcca 2640

ctgcacaggc ttgaattggc caggcactcg tgggggttag cgtagaaata atcctcctct 2700

tttggcttgt tttcgagttt tcgccgacaa gatggttgga ctacacggcc tctatgaact 2760

tcttggac 2768

<210>5

<211>1272

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>5

atgatggcaa gctactggtg ccggcgcccc tgcgagtcgt gcagcacgag ggcgatggcg 60

ggcagcgtgg tgggccagcc ggtggctccg gggcagcggg tgacggtgct gaccatcgac 120

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aggaggtgcg cgctcgccgc ggtgaccgcg tcgctgaggc ggccgaggta caacggcaag 420

tacctgcacg gcaagatcag gagcatgctc ggcgagacga ggctgtgcga cgcgctcacc 480

gacgtcgtca tccccacctt cgacgtcaag cttctccagc ccatcatctt ctccacatac 540

gacgccaggt gcatgcccct gaagaacgcg cggctcgccg acgtctgcat cggcacctcg 600

gccgctccga cctgcctccc cgcgcaccac ttccacaccc acgacggcaa cggcaaggag 660

cgtgagtaca acctcatcga cggtggcgtc gccgccaaca atccgacgat ggtggcgatg 720

acgcagatca ccaagaagat gatgggcaag gacagggagg agctgtaccc ggtggagccg 780

tcggactgcg gcaagttcct ggtgctgtcc gtcgggaccg gctcgacgtc cgaccagggg 840

ctgtacacgg cgaagcagtg ctcccagtgg ggcatcatca gctggctgcg caacaagggc 900

atggcgccca tcatcgacat cttcatggcg gccagctccg acctcgtcga catccacgcc 960

gccgtgctct tccagtcgct gcacagcgac gccaactacc tccgcatcca ggacaactcg 1020

ctccacggcc cggcggccac ggtggacgcc gccacgcccg agaacatggc ggagctcctc 1080

aggatcggcg agcggatgct ggcgcagagg gtgtccaggg tgaacgtgga gaccgggagg 1140

tacgaggaga taaagggggc cgggagcaac gccgacgcgc tcgccggctt cgccaggcag 1200

ctctccgacg agaggaggac aaggctcggc cgccggcgcg gtggcgccgg ccgcctgaaa 1260

tccagccgct ga 1272

<210>6

<211>423

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>6

Met Met Ala Ser Tyr Trp Cys Arg Arg Pro Cys Glu Ser Cys Ser Thr

1 5 10 15

Arg Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Gln Pro Val Ala Pro Gly Gln

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Thr Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

35 40 45

Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp

50 55 60

Gly Pro Gly Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Cys Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Ile Thr Ala Pro Gly Lys Asp

85 90 95

Gly Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp Val Asn Arg Phe Tyr Leu Asp

100 105 110

Asn Gly Pro Tyr Ile Phe Pro Gln Arg Arg Cys Ala Leu Ala Ala Val

115 120 125

Thr Ala Ser Leu Arg Arg Pro Arg Tyr Asn Gly Lys Tyr Leu His Gly

130 135 140

Lys Ile Arg Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Leu Cys Asp Ala Leu Thr

145 150 155 160

Asp Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Val Lys Leu Leu Gln Pro Ile Ile

165 170 175

Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Arg Cys Met Pro Leu Lys Asn Ala Arg Leu

180 185 190

Ala Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Cys Leu Pro Ala

195 200 205

His His Phe His Thr His Asp Gly Asn Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Asn

210 215 220

Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met

225 230 235 240

Thr Gln Ile Thr Lys Lys Met Met Gly Lys Asp Arg Glu Glu Leu Tyr

245 250 255

Pro Val Glu Pro Ser Asp Cys Gly Lys Phe Leu Val Leu Ser Val Gly

260 265 270

Thr Gly Ser Thr Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Cys Ser

275 280 285

Gln Trp Gly Ile Ile Ser Trp Leu Arg Asn Lys Gly Met Ala Pro Ile

290 295 300

Ile Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp Ile His Ala

305 310 315 320

Ala Val Leu Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Ala Asn Tyr Leu Arg Ile

325 330 335

Gln Asp Asn Ser Leu His Gly Pro Ala Ala Thr Val Asp Ala Ala Thr

340 345 350

Pro Glu Asn Met Ala Glu Leu Leu Arg Ile Gly Glu Arg Met Leu Ala

355 360 365

Gln Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Ile

370 375 380

Lys Gly Ala Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Phe Ala Arg Gln

385 390 395 400

Leu Ser Asp Glu Arg Arg Thr Arg Leu Gly Arg Arg Arg Gly Gly Ala

405 410 415

Gly Arg Leu Lys Ser Ser Arg

420

<210>7

<211>2768

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>7

acttgttgag gagatccgac ggatgatggc agatgactcg agggagattt cttttactca 60

tattagtcgt ttgcagaata aagttagtca cgagctcacc gcgtacggcc gcggcacatc 120

tcggacagcg gtctggctgt tttcgggtcc ggattctatt gtgaacttgt gtaaggctga 180

gaagcctcct tgagtaatga aatctctctt ccccccgcaa aaaggaagaa ctcagcttgg 240

gccttggggc gtcttcagtt tggtcagagt gaacgcgctc tcgcactgtc tgcgccacga 300

cacaataccg accgcttcct tcttcttcca ctgcatgtct gcatgtcttc agttaaccac 360

acccgcaact gtttactgtg ccctctctca ctccaaaaat agaccagcgc gcgctacggc 420

acaagccata gcagccactc gctcgccgct agcaaaccca ccaattaccg ccatcgatct 480

gcctaccctc tcgtgcggcg accgatctcg tcgtcttcct cttgattttc ggccgaggtg 540

tcgtacgttg gtttgcgtcg gcggctgatc gatcggacgc gtggccgccg ggttcaatcg 600

atggcaagct actggggccg gcgaccctgc gagtcgtgca gcacgagggc gatggcgggc 660

agcgtggtgg gccagccggt ggcgccgggg cagcgggtga cggtgctgac catcgacggg 720

ggcggcatcc gcggcatcat cccgggcacc atcctcgcct tcctcgaggc caagctgcag 780

gagctggacg ggccgggcgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 840

accggcggcc tcatcaccgc catgatcacc gcgcccggca aggacggctg cccgctcttc 900

gccgccaggg acgtcaaccg cttctacctc gacaatggcc cctacatctt cccgcaaagg 960

tgagagcgcg aacgatctca tctcatggac atggatcgtg cgagctgaac tggtgattga 1020

tgtatgtatt gcattgagtt gtgccaggag gtgcgcgctg gccgcggtga ccgcgtcgct 1080

gaggcggccg aggtacaacg gcaagtacct gcacgggaag atcaggagca tgctcggcga 1140

gacgaggctg tccgacgcgc tcaccgacgt ggtcatcccc accttcgacg tcaagcttct 1200

ccagcccatc atcttctcca catacgacgt atgccaattt tatatgtata agagaactaa 1260

tgtgatgatc agatagatcc atccttggat catggatcag acagacatgg ggctaaaaat 1320

gtgatggatc acgcgtgcgt gcgtgcaggc caagagcatg cccctgaaga acgcgcgact 1380

cgccgacgtg tgcatcggca cctccgccgc tccgacctac ctccccgcgc accacttcca 1440

cacccacgac ggcaacggca aggagcgcga gtacaacctc atcgacggcg gcgtcgccgc 1500

caacaatccg gtaacgaatc aagcctctgt ccgtcggtca gatgttcaga cacgcttgcc 1560

cgacccgagc acactgatga actgagccgt gagaaatgca gacgatggtg gcgatgacgc 1620

agatcaccaa gaagatgatg ggcaaggaca gggaggagct gtacccggtg gagccgtcgg 1680

actgcggcaa gttcctggtg ctgtccgtcg ggaccggctc gacgtccgac caggggctgt 1740

acacggcgaa gcagtgctcc cagtggggca tcatcagctg gctgcgcaac aagggcatgg 1800

cgcccatcat cgacatcttc atggccgcca gctccgacct cgtcgacatc cacgccgccg 1860

tgctcttcca gtcgctgcac agcgacgcca actacctccg catccaggac aactcgctcc 1920

acggcccggc ggccacggtg gacgccgcca cgcccgagaa catggcggag ctcctcagga 1980

tcggcgagcg gatgctggcg cagagggtgt ccagggtgaa cgtcgagacc gggaggtacg 2040

aggaggtaaa gggggccggg aacaacgccg acgcgctcgc cggcttcgcc aggcagctct 2100

ccgacgagag gaggacaagg ctcgggagcc ggcgcggtgg cgccggccgc ctgaaatcca 2160

gccgctgatc ttgtagctta gtgtggctta gtttcattta ttttctatat acagtatatt 2220

tttttggctg ggataggtag agaaagcttc acatggataa tggatggaaa tgaggagttt 2280

aggaaaaata acaacactta atgaaaccaa aatgtctctc ggttgttcac cgtggcaatt 2340

gcatatccct tccgatataa tcatgaattt aatcaacagt gaacaatagc gcaaacgacg 2400

aacaaaaatt tacacaaagc ctcctcccta ttttggcaag cttcaaaata aatgaatgga 2460

ttgcagaata gaaagaagaa gaaaaacctg ggctatacaa cagaacactg ccaacatcgg 2520

ttaaacgatc atcggggact ctgcctgctt gccggcttca gtccgcggat catcacaaac 2580

agtaacttgc acaggcgagg ctgcaaatgt gctcacctta cagtgactgt atccttgctt 2640

ccactgcaca ggcttgaatt ggccaggcac tcgtgggggt tagcgtagaa gtaatcctcc 2700

tccttcggct tgttttcgag tttccgacga caggacggtt ggaccacacg gcctctatga 2760

acttcttg 2768

<210>8

<211>1269

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<400>8

atggcaagct actggggccg gcgaccctgc gagtcgtgca gcacgagggc gatggcgggc 60

agcgtggtgg gccagccggt ggcgccgggg cagcgggtga cggtgctgac catcgacggg 120

ggcggcatcc gcggcatcat cccgggcacc atcctcgcct tcctcgaggc caagctgcag 180

gagctggacg ggccgggcgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 240

accggcggcc tcatcaccgc catgatcacc gcgcccggca aggacggctg cccgctcttc 300

gccgccaggg acgtcaaccg cttctacctc gacaatggcc cctacatctt cccgcaaagg 360

aggtgcgcgc tggccgcggt gaccgcgtcg ctgaggcggc cgaggtacaa cggcaagtac 420

ctgcacggga agatcaggag catgctcggc gagacgaggc tgtccgacgc gctcaccgac 480

gtggtcatcc ccaccttcga cgtcaagctt ctccagccca tcatcttctc cacatacgac 540

gccaagagca tgcccctgaa gaacgcgcga ctcgccgacg tgtgcatcgg cacctccgcc 600

gctccgacct acctccccgc gcaccacttc cacacccacg acggcaacgg caaggagcgc 660

gagtacaacc tcatcgacgg cggcgtcgcc gccaacaatc cgacgatggt ggcgatgacg 720

cagatcacca agaagatgat gggcaaggac agggaggagc tgtacccggt ggagccgtcg 780

gactgcggca agttcctggt gctgtccgtc gggaccggct cgacgtccga ccaggggctg 840

tacacggcga agcagtgctc ccagtggggc atcatcagct ggctgcgcaa caagggcatg 900

gcgcccatca tcgacatctt catggccgcc agctccgacc tcgtcgacat ccacgccgcc 960

gtgctcttcc agtcgctgca cagcgacgcc aactacctcc gcatccagga caactcgctc 1020

cacggcccgg cggccacggt ggacgccgcc acgcccgaga acatggcgga gctcctcagg 1080

atcggcgagc ggatgctggc gcagagggtg tccagggtga acgtcgagac cgggaggtac 1140

gaggaggtaa agggggccgg gaacaacgcc gacgcgctcg ccggcttcgc caggcagctc 1200

tccgacgaga ggaggacaag gctcgggagc cggcgcggtg gcgccggccg cctgaaatcc 1260

agccgctga 1269

<210>9

<211>422

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<400>9

Met Ala Ser Tyr Trp Gly Arg Arg Pro Cys Glu Ser Cys Ser Thr Arg

1 5 10 15

Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Gln Pro Val Ala Pro Gly Gln Arg

20 25 30

Val Thr Val Leu Thr Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Ile Ile Pro

35 40 45

Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Lys Leu Gln Glu Leu Asp Gly

50 55 60

Pro Gly Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Cys Ile Ala Gly Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Ile Thr Ala Pro Gly Lys Asp Gly

85 90 95

Cys Pro Leu Phe Ala Ala Arg Asp Val Asn Arg Phe Tyr Leu Asp Asn

100 105 110

Gly Pro Tyr Ile Phe Pro Gln Arg Arg Cys Ala Leu Ala Ala Val Thr

115 120 125

Ala Ser Leu Arg Arg Pro Arg Tyr Asn Gly Lys Tyr Leu His Gly Lys

130 135 140

Ile Arg Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Leu Ser Asp Ala Leu Thr Asp

145 150 155 160

Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Val Lys Leu Leu Gln Pro Ile Ile Phe

165 170 175

Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Arg Leu Ala

180 185 190

Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala His

195 200 205

His Phe His Thr His Asp Gly Asn Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Asn Leu

210 215 220

Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala Met Thr

225 230 235 240

Gln Ile Thr Lys Lys Met Met Gly Lys Asp Arg Glu Glu Leu Tyr Pro

245 250 255

Val Glu Pro Ser Asp Cys Gly Lys Phe Leu Val Leu Ser Val Gly Thr

260 265 270

Gly Ser Thr Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Cys Ser Gln

275 280 285

Trp Gly Ile Ile Ser Trp Leu Arg Asn Lys Gly Met Ala Pro Ile Ile

290 295 300

Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp Ile His Ala Ala

305 310 315 320

Val Leu Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Ala Asn Tyr Leu Arg Ile Gln

325 330 335

Asp Asn Ser Leu His Gly Pro Ala Ala Thr Val Asp Ala Ala Thr Pro

340 345 350

Glu Asn Met Ala Glu Leu Leu Arg Ile Gly Glu Arg Met Leu Ala Gln

355 360 365

Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Val Lys

370 375 380

Gly Ala Gly Asn Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Phe Ala Arg Gln Leu

385 390 395 400

Ser Asp Glu Arg Arg Thr Arg Leu Gly Ser Arg Arg Gly Gly Ala Gly

405 410 415

Arg Leu Lys Ser Ser Arg

420

Claims

1.一种小麦母本单倍体诱导系的制备方法，包括如下步骤：沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因，得到转基因小麦，即为小麦母本单倍体诱导系；

所述PLA基因为小麦A基因组中的PLA-A基因和小麦D基因组中的PLA-D基因；

或，所述PLA基因为小麦A基因组中的PLA-A基因和小麦B基因组中的PLA-B基因和小麦D基因组中的PLA-D基因；

所述PLA-A基因、所述PLA-B基因和所述PLA-D基因的基因组序列分别如序列表中序列1、序列4和序列7所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述沉默或抑制目的小麦基因组中PLA基因的表达和/或活性或敲除PLA基因为突变目的小麦基因组中PLA基因使目的小麦基因组中PLA基因表达量降低或使目的小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述使目的小麦基因组中PLA基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的方式为CRISPR/Cas9。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第905-923位和序列7第939-957位；

或，所述CRISPR/Cas9的靶序列为序列1第699-718位。

5.一种小麦母本单倍体的制备方法，包括如下步骤：将由权利要求1-4任一所述的方法制备的小麦母本单倍体诱导系或其后代进行自交或者作为父本与其他小麦材料杂交，得到自交后代或杂交后代，即为所述小麦母本单倍体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述自交后代或所述杂交后代单株进行单倍体性状鉴定和/或叶片倍性鉴定和/或分子鉴定，选取至少一种方法鉴定为单倍体的后代单株为小麦母本单倍体。

7.如下1)-3)任一种应用：

1)由权利要求1-4任一所述的方法制备的小麦母本单倍体诱导系在制备小麦母本单倍体中的应用；

3)由权利要求1-4任一所述的方法制备的小麦母本单倍体诱导系或由权利要求5或6所述的方法制备的小麦母本单倍体在小麦杂交种选育或小麦单倍体育种中的应用。