CN117867156A

CN117867156A - 一种与湿度相关的雄性不育基因hsms1的dna分子标记及其应用

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Publication number: CN117867156A
Application number: CN202311740648.8A
Authority: CN
Inventors: 唐杰; 刘昊; 吴春瑜; 李新鹏; 安保光; 韩晓斌; 吴永忠; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Technology Co ltd
Priority date: 2023-12-18
Filing date: 2023-12-18
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种与湿度相关的雄性不育基因HSMS1的DNA分子标记及其应用。所述DNA分子标记由包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到。其中，上游引物BF1：CAACCGCCCAAATACACG；下游引物BR1：ATGGCCGACAAGGCAGGA。本发明提供的DNA分子标记可以准确鉴别植物中的雄性不育基因HSMS1的突变体，进而判断该植物的育性。本发明提供的DNA分子标记可以应用于鉴定和选育雄性不育系植株，这在植物种植资源改良领域，具有重要的应用价值。

Description

一种与湿度相关的雄性不育基因HSMS1的DNA分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种与湿度相关的雄性不育基因HSMS1的DNA分子标记及其应用。

背景技术

DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。传统的植物育种主要依赖于育种家对植株表现型的选择。但是环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素均会影响植株表型选择准确性从而降低育种效率。一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。因此如何提高选择效率，是育种工作的关键。近年来，随着分子生物学和基因组学的快速发展，分子选择育种应运而生，利用已掌握的植物表型与基因型相关信息，研究人员可以直接利用基因型数据对表型进行选择。分子选择育种包括前景选择和背景选择，前景选择建立在基因定位和QTL作图的基础之上，前景选择的可靠性取决于标记与目标基因之间的连锁程度，标记与目标基因连锁越紧密，则标记辅助育种的准确率越高，而背景选择主要指遗传背景的恢复，育种材料间遗传距离、亲缘关系分析等。

环境敏感型细胞核雄性不育是由于水稻某些适应外界环境变化的相关基因突变，导致其在某些特殊环境中无法适应环境变化而产生雄性不育。利用这种随着环境改变育性也随着改变的特性，两系法不受恢保关系的限制，相比于三系法更加简单、配组自由，是独创的水稻杂种优势利用途径。但当环境条件波动较大时，环境敏感型细胞核雄性不育系的育性易受到影响，制种存在一定的风险，在一定程度上限制了两系法的大范围应用。

由于隐性核雄性不育材料在育种中潜在的巨大商业价值及运用前景，针对基因中引起功能变异的碱基序列，设计得到的与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本领域提供一种与湿度相关的雄性不育基因HSMS1的DNA分子标记及其应用。

本发明研究发现一种水稻HSMS1基因，其能够有效调控水稻雄性生殖发育过程，进而影响水稻育性。利用水稻HSMS1基因能够获得隐性核不育类型的雄性不育系。该不育系育性只受核编码的单基因调控，并且受环境的影响可以发生育性转换。该不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性，本发明为水稻提供了新的雄性不育候选基因。本发明通过CRISPR/Cas9方法对HSMS1基因进行敲除，得到一种HSMS1基因突变体，发生该突变的植物表现出雄性不育性。

基于该基因及其突变体，本发明进一步经大量设计、摸索、筛选和验证，开发了用于该基因鉴定的共分离分子标记，因此提出如下发明内容。

第一方面，本发明提供一种水稻HSMS1基因的DNA分子标记，所述分子标记由包括如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到。

上游引物BF1：CAACCGCCCAAATACACG(SEQ ID NO.5)位于水稻基因HSMS1核酸序列起始密码子ATG前第-88bp～-71bp，下游引物BR1：ATGGCCGACAAGGCAGGA(SEQ ID NO.6)位于起始密码子ATG后第84bp～101bp。

进一步，本发明提供了用于检测水稻HSMS1基因的特异性引物组合，包括如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物。

进一步，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其中含有上述引物组合。

进一步，本发明提供了所述分子标记、所述引物组合、所述试剂或试剂盒在水稻HSMS1基因检测中的应用。

进一步，本发明提供了所述分子标记、所述引物组合、所述试剂或试剂盒在以下至少一方面中的应用：

(1)检测水稻的育性；

(2)鉴定或选育水稻普通核雄性不育种质资源；

(3)水稻杂交育种和制种；

(4)水稻不育系的种质资源改良。

所述改良包括提高作物产量、提高作物品质、提高作物抗病虫害、抗逆、抗倒伏能力。

第二方面，本发明提供了一种检测水稻HSMS1基因的方法，包括：以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，根据扩增结果判断所述待测水稻是否含有水稻HSMS1基因以及基因型。

进一步地，若扩增产物只出现189bp条带，则待测水稻为纯合野生型基因型；若只出现179bp条带，则待测水稻为纯合突变型基因型；若同时出现189bp和179bp条带，则待测水稻为杂合基因型。

本发明进一步提供了一种检测水稻育性的方法，包括：以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，根据扩增结果判断水稻育性。

进一步地，若扩增产物只出现189bp条带，则待测水稻的育性正常；若只出现179bp条带，则待测水稻为雄性不育系；若同时出现189bp和179bp条带，则待测水稻的育性正常。

进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4～5min，94℃变性20～40s，54～60℃退火20～40s，72℃延伸20～30s，扩增30～40个循环，最后72℃延伸5～10min。

进一步地，所述PCR扩增的反应体系为：Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg²⁺；TaqDNAPolymerase；2.5mM dNTPs；10×PCR Buffer)5μL，1μL引物(含各0.5μL正反向引物)，1～1.5μL模板DNA，ddH₂O补足10μL。

进一步地，采用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测PCR扩增产物。

本发明中，所述水稻HSMS1基因编码得到的蛋白质的氨基酸序列为以下任意一种：

1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控水稻雄性育性活性的氨基酸序列。

进一步地，所述水稻HSMS1基因的核苷酸序列为以下任意一种：

1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有调控水稻雄性育性活性的核苷酸序列。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次利用CRISPR/Cas9方法突变水稻基因HSMS1(LOC_Os05g05920)，发现了HSMS1基因对水稻花药发育的调控功能，并且得到一种HSMS1基因突变体hsms1，其可以应用于创制水稻雄性不育系。本发明进一步开发得到一种DNA分子标记，其可以用于HSMS1基因突变体的检测，进而用于鉴定和选育雄性不育系植株，这在植物种植资源改良领域具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1提供的HSMS1基因的表达模式图。

图2是本发明实施例1提供的HSMS1基因的结构及靶标位置图。

图3是本发明实施例1提供的定点突变靶位点模式图。

图4是本发明实施例1提供的T0代水稻潮霉素检测琼脂糖凝胶电泳图。

图5是本发明实施例1提供的T0代水稻突变峰图和序列比对图；其中上图为T0代水稻突变峰图，下图为序列比对图。

图6是本发明实施例2提供的T0代水稻突变体花药形态及花粉碘染图。

图7是本发明实施例2提供的T0代和T1代水稻突变体穗子转育碘染图；其中上图为T0代的染色结果，下图为T1代的染色结果。

图8是本发明实施例2提供的T0代水稻野生型和突变体穗子图；其中左图为野生型结果，右图为突变体结果。

图9是本发明实施例3提供的分子标记检测后代分离结果图。

图10是本发明实施例4提供的杂交转育的技术路线示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验方法中若无特别提及，皆可以通过本领域常规方法进行。以下实验材料中若无特别提及，皆可以采用市售购得的材料进行实验。

实施例1

本实施例提供水稻HSMS1基因的功能及应用，具体包括如下：

1、水稻HSMS1基因序列和表达模式分析

在Ensembl Plants库(http://plants.ensembl.org/index.html)中，查询到水稻H SMS1(LOC_Os05g05920)基因，在粳稻中的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白包含320个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。

由于HSMS1基因在水稻中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因的功能，本发明首先利用基因表达数据库分析了该基因在水稻不同组织部位的表达模式(图1)，表达分析结果显示HSMS1基因在水稻花药特异表达，显示其可能参与水稻花药发育过程。

2、水稻HSMS1基因的功能验证

为了明确HSMS1基因在水稻中的功能，本发明采用CRISPR/Cas9基因编辑方法定点突变LOC_Os05g05920基因序列，敲除该基因在水稻中的功能。本发明选取水稻常规稻中花11作为基因编辑的受体材料。本发明分别选取基因编码区自起始密码子ATG开始第45位碱基至第64位碱基的核苷酸序列(SEQ ID NO.3所示)作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域1(简称B1)(见图2)。

(1)HSMS1的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为pEGCas9Pubi-B-HSMS1(载体图谱见图3)，该载体的基础载体为pEGCas9Pubi-B。本发明通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过一步克隆法连接到基础载体中，具体的构建流程如下：

i)靶标gRNA的设计。将HSMS1(LOC_Os05g05920)的基因序列输入htt ps://zlab.bio/guide-design-resources进行靶标设计，PAM序列设定为NGG。本发明选择的靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。

ii)通过重叠PCR和巢式PCR扩增sgRNA表达盒。合成包含上述sgRNA靶点序列的引物对，并将上述引物对退火，然后与经过Bsa I酶切的双元载体p EGCas9Pubi-B(参见Ma X，Zhang Q，Zhu Q.et al.ARobust CRISPR/Cas9 S ystem for Convenient，HighEfficiency Multiplex Genome Editing in Monocotan d Dicot Plants，MolPlant.2015，8(8):1274 1284，载体pEGCas9Pubi-B由海南大学龙湍老师惠赠)连接，得到重组载体pEGCas9Pubi-HSMS1。将重组载体pEG Cas9Pubi-HSMS1转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献“Xing，H.L.，Dong，L.，Wang，Z.P.，Zhang，H.Y.，Han，C.Y.，Liu，B.，Wa ng，X.C.，and Chen，Q.J.(2014).ACRISPR/Cas9toolkit for multiplex genome editing in plants.BMC plant biology 14:327.”中的方法。

iii)测序验证。

通过测序验证pEGCas9Pubi-HSMS1构建成功。

(2)农杆菌介导的水稻遗传转化

将上述构建的pEGCas9Pubi-HSMS1载体通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的水稻杂交种中花11的幼胚作为受体材料，将剥离的水稻胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2mg/LBialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

(3)T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测

为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行检测：

本发明首先采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：DNA提取方法参照传统CTAB法(Rogers and Bendich，1985)进行。取3cm水稻叶片放入已灭菌2mL的离心管中，加入6mm钢珠，使用细胞破碎仪进行组织破碎，之后进行CTAB法提取，提取样品最后加入200μL的灭菌水(ddH₂O)，溶解风干的样品DNA，待用。待DNA完全溶解之后，吸取2μL样品使用紫外分光光度计(Nanodrop 2000)进行核酸OD值(A260/A280)及核酸浓度测定，将DNA样品稀释至50ng/μL备用。

阳性检测引物：Hn；产物大小：561bp；引物序列如下：

Hn-F(SEQ ID NO.7):5’CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC 3’；

Hn-R(SEQ ID NO.8):5’GCTTCTGCGGGCGATTTGT 3’。

阳性检测结果如图4所示，阴性对照H₂O和ZH11无带，阳性质粒对照扩增出561bp片段，T0代植株检测结果均为阳性，为突变体hsms1，因此可以进一步检测基因型。按照以下PCR参数扩增并检测突变体基因型：

PCR使用Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg2+；Taq DNAPolymerase；2.5mM dNTPs；10×PCR Buffer)5μL，1μL引物(含各0.5μL正反向引物)，1μL模板DNA，ddH₂O补足10μL。PCR扩增程序为常规SSR程序(94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环，最后72℃延伸5min)。扩增产物使用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，0.1％AgNO3染色，甲醛和NaOH显色拍照。

对突变体hsms1核苷酸序列进行比对分析发现(图5)，与未编辑的WT相比，突变后的HSMS1自起始密码子ATG开始第62位碱基至第71位TCACGGCCTC碱基的缺失，序列如SEQ IDNO.4所示。突变体编码的核苷酸缺失使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止。

实施例2

本实施例对实施例1得到的突变体hsms1进行表型分析，具体如下：

1、突变体hsms1的雄穗、花药和花粉活力的观察

在营养生长和雌穗的发育方面，突变体hsms1与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而突变体hsms1虽能正常抽雄，也能正常开花，但是花药干瘪瘦小偏白(图6)；进一步对野生型和突变体hsms1的花粉进行I2-KI染色，野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，而突变体hsms1的花粉粒完全败育。这表明HSMS1基因可以通过影响花药的雄配子发育来控制水稻的雄性发育，因而得到的突变体hsms1为HSMS1不育系。

2、HSMS1不育系育性转换鉴定

在对突变体hsms1的花粉活力检验过程中，本发明发现经过编辑后，花粉受环境影响而育性发生转换，在海南海口2023年3月17日取突变体花粉碘染发现为完全典败(图7上，左1)，2023年3月30日再次取样同个单株碘染发现部分花粉粒疑似转育(图7上，左2)，2023年4月12日取样碘染发现该单株花粉几乎完全转育(图7上，左3)。随后，本发明还收到了突变体hsms1的自交种。

为了验证种子真实性，本发明在T1代继续种植突变体hsms1的自交种，基因型检测发现其为纯合突变型，抽穗期2023年8月25日左右取样碘染发现突变体完全败育(图7下，左1)，2023年9月12日取样碘染发现部分花粉已经转育(图7下，左2)，并且也收到了自交种(图8)。基于此，可以确认水稻基因HSMS1为湿度相关的雄性不育基因。

实施例3

本实施例提供一种鉴定突变体hsms1的共分离分子标记及其应用，具体包括如下流程：

1、共分离分子标记的开发

本发明中针对不育系的突变位点，利用Primer5.0软件进行引物设计，开发出一对共分离分子标记：BF1(SEQ ID NO.5)和BR1(SEQ ID NO.6)，结合PCR与琼脂糖及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。

如图9所示，共分离分子标记BF1/BR1能够特异性检测水稻hsms1纯合突变体及由其转育的水稻不育材料中的突变基因HSMS1，并能同时区分野生型HSMS1基因和突变型HSMS1基因；针对突变基因HSMS1中扩增出179bp的条带，而对野生型HSMS1基因扩增出189bp的条带：

2、共分离分子标记的应用

理论上，BF1/BR1在HSMS1/HSMS1纯合野生型(AA)DNA中能扩增出189bp的条带，在hsms1/hsms1纯合突变型材料(aa)DNA中能扩增出179bp的条带，而在HSMS1/hsms1杂合型(Aa)材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带。BF1/R1分子标记的T克隆验证结果如图9所示，结果显示设计的功能性分子标记对分离群体的检测结果完全符合预期，在HSMS1/HSMS1纯合野生型(AA)、HSMS1/hsms1杂合型(Aa)和hsms1/hsms1纯合突变型材料(aa)中分别扩增出对应大小的条带，可以作为HSMS1等位基因检测的理想标记。

实施例4

本实施例进行HSMS1突变基因的不育系转育实验，用突变体hsms1与育性正常的受体，如博II B和野香B，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行HSMS1基因和遗传前景选择，最终获得博II B或野香B背景下带有纯合突变基因的隐性核不育系。杂交转育的技术路线如图10所示，具体实施步骤如下：

1、以受体亲本，如博II B或野香B为父本与母本突变体hsms1杂交获得F₁。

2、以F1为母本与受体亲本，如博II B或野香B，回交获得BC₁F₁。

3、种植BC₁F₁，分别使用引物序列如SEQ ID No.5-6引物对检测HSMS1基因型，选择HSMS1杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现179bp和189bp条带。

4、使用一组基因型(例如200个)在HSMS1突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如博II B或野香B，回交获得BC₂F₁。

6、种植BC₂F₁，重复步骤3和步骤4，选出HSMS1基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC₂F₂。

7、种植BC₂F₂，重复步骤3和步骤4，选出HSMS1基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC₂F₃。BC₂F₃后代中分离的HSMS1纯合株即博II B或野香B背景下HSMS1基因的不育系。

以上仅以博II B和野香B作为转育实施例，但并不限于博II B和野香B，可以为任何水稻材料。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种水稻HSMS1基因的DNA分子标记，其特征在于，所述DNA分子标记由包括如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的引物扩增得到。

2.一种用于检测水稻HSMS1基因的引物组合，其特征在于，包括如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的引物。

3.一种试剂或试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物组合。

4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂或试剂盒在水稻HSMS1基因检测中的应用。

5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂或试剂盒在检测水稻的育性中的应用。

6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合或权利要求3所述的试剂或试剂盒在以下任意一种或多种方面中的应用：

(1)鉴定或选育水稻普通核雄性不育种质资源；

(2)水稻杂交育种和制种；

(3)水稻不育系的种质资源改良。

7.一种检测水稻HSMS1基因的方法，其特征在于，包括：以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，根据扩增结果判断所述待测水稻是否含有水稻HSMS1基因以及基因型。

8.一种检测水稻育性的方法，其特征在于，包括：以待测水稻的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR扩增，根据扩增结果判断水稻育性。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4～5min，94℃变性20～40s，54～60℃退火20～40s，72℃延伸20～30s，扩增30～40个循环，最后72℃延伸5～10min。

10.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，若扩增产物只出现189bp条带，则待测水稻为纯合野生型基因型，育性正常；若只出现179bp条带，则待测水稻为纯合突变型基因型，为雄性不育系；若同时出现189bp和179bp条带，则待测水稻为杂合基因型，育性正常。