CN117512170A - 水稻雄性不育基因OsGSL2的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及水稻雄性不育基因OsGSL2的分子标记及其应用。水稻雄性不育基因OsGSL2的分子标记由如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到。本发明针对水稻雄性不育基因OsGSL2设计了与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及水稻雄性不育基因OsGSL2的分子标记及其应用。
背景技术
雄性不育系是杂交水稻育制种技术的关键节点。雄性不育系是指雄配子发育异常而丧失生育能力，雌配子发育正常的植物株系。它只能作为母本接受父本的花粉，自交不能结实。目前杂交水稻生产上应用的雄性不育系有核质互作型和光温敏型两种。核质互作型雄性不育系的不育基因在细胞质中，细胞核中没有育性恢复基因。当细胞核中有育性恢复基因的恢复系与其配组杂交时可以生产可育的子一代杂交种，当细胞核中没有育性恢复基因而细胞质中也没有不育基因的保持系与其杂交时可以繁殖不育系种子。由于需要不育系、保持系和恢复系三系配套，这种杂交水稻育制种技术常被称为“三系法”。一些控制核质互作型不育及相应育性恢复的基因已经被克隆(Chen and Liu，2014，Male sterility andfertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65：579-606)。核质互作型不育系是杂交水稻育制种中第一种大规模应用的不育系，为杂交水稻产业的建立和发展奠定了材料基础。然而由于核质互作型不育系的组配受到恢复系基因型的限制，导致只有约5％的种质资源能被利用。而细胞质的不育基因有导致米质差、特定病虫害流行的潜在风险。
光温敏型雄性不育系是一种育性受光温环境调控的不育系。在一定的光温条件下这种不育系保持不育，可用于组配杂交。当条件改变时不育系恢复育性，可用于不育系繁殖。由于光温敏雄性不育系实现了不育系和保持系的合二为一，只需要父本与其配组生产子一代杂交种，因此相应的育制种技术常被称为“两系法”。调控光温敏雄性不育的基因在细胞核中，目前已经克隆的基因包括PMS3、TMS5、CSA和TMS10(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:579-606；Zhou H，et al，2014，RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controlsthermosensitive genic male sterility in rice，Nature Communications，5:4884-4892)。与核质互作型不育系相比，光温敏型不育系繁殖程序简单，配组因恢复基因广泛存在而更自由。光温敏不育系的大规模应用极大地巩固和推动了杂交水稻产业发展。然而，由于该型不育系的育性受光温环境影响，也导致制种风险高，制种地域受到限制。
为了克服目前杂交水稻育制种技术中存在的关键性缺陷，创造和利用新类型的不育系将是重要的突破口。细胞核雄性不育由细胞核基因突变产生，有显性突变和隐性突变，有孢子体基因突变和配子体基因突变。显性突变和配子体基因突变只能通过雌配子遗传，隐性突变既可通过雌配子也可通过雄配子进行遗传，而且遵循孟德尔定律。
目前，水稻中已克隆和鉴定的普通核雄性不育基因和创制的雄性不育材料均相对较少。挖掘鉴定水稻雄性不育候选基因、以及针对候选基因设计与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明发现，水稻胼胝质合成酶基因OsGSL2能够有效调控水稻雄性生殖发育过程，通过对水稻花药发育的调控影响水稻育性。利用OsGSL2突变体能够获得隐性核不育类型的雄性不育系。该不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性，本发明为水稻提供了新的雄性不育候选基因。
OsGSL2突变体包括水稻OsGSL2基因突变体osgsl2-1(其核苷酸序列为SEQ IDNO.4所示)、水稻OsGSL2基因突变体osgsl2-2(其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示)、水稻OsGSL2基因突变体osgsl2-3(其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示)。
基于该基因及其突变体，发明人进一步经大量设计、摸索、筛选和验证，开发了用于该基因鉴定的共分离分子标记，因此提出如下发明内容。
首先，本发明提供了一种水稻OsGSL2基因的分子标记，由如SEQ ID NO.11和SEQID NO.12所示的引物扩增得到。
上游引物GSL2-F1：AGGTTGGTAAAGGAAGGGAT(SEQ ID NO.11)位于水稻基因OsGSL2核酸序列起始密码子ATG前第-41bp～-22bp，下游引物GSL2-R1：ACTCAGTGCGAGATAAAAGC(SEQ ID NO.12)位于起始密码子ATG后第176bp～195bp。
进一步，本发明提供了用于检测水稻OsGSL2基因的特异性引物组合物，包括如SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物。
进一步，本发明提供了一种试剂或试剂盒，其中含有上述引物组合物。
进一步，本发明提供了上述分子标记、引物组合物、试剂或试剂盒在水稻OsGSL2基因检测中的应用。
进一步，本发明提供了上述分子标记、引物组合物、试剂或试剂盒在以下至少一方面中的应用：
(1)鉴定或选育水稻普通核雄性不育种质资源；
(2)水稻杂交育种和制种；
(3)水稻不育系的种质资源改良。
所述改良包括提高作物产量、提高作物品质、提高作物抗病虫害、抗逆、抗倒伏能力。
进一步，本发明提供了上述分子标记、引物组合物、试剂或试剂盒在水稻育性检测中的应用。
更进一步，本发明提供了一种检测水稻OsGSL2基因的方法，包括：以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物带型判断水稻是否含有OsGSL2基因以及基因型。
本发明还提供了一种检测水稻育性的方法，包括：以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物带型判断水稻育性。
优选地，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4～5min，94℃变性20～40s，54～60℃退火20～40s，72℃延伸20～30s，扩增30～40个循环，最后72℃延伸5～10min。
优选地，所述PCR扩增的反应体系为：Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg2+；TaqDNAPolymerase；2.5mM dNTPs；10×PCR Buffer)5μL，1μL引物(含各0.5μL正反向引物)，1～1.5μL模板DNA，ddH2O补足10μL。
优选地，采用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳检测PCR扩增产物。
以上所述的方法中，若扩增产物只出现236bp条带，则待测样品为纯合野生型基因型，水稻的育性正常；若只出现233bp条带，则待测样品为纯合突变型基因型，水稻为雄性不育；若同时出现236bp和233bp条带，则待测样品为杂合基因型，水稻的育性正常。
本发明中，所述OsGSL2基因编码蛋白的氨基酸序列为以下任一：
1)所述氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
2)所述氨基酸序列为将SEQ ID NO.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控水稻雄性育性活性的氨基酸序列。
优选地，所述OsGSL2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9方法突变水稻基因OsGSL2(LOC_Os01g48200)，发现了OsGSL2(LOC_Os01g48200)基因对水稻花药发育的调控功能。并且鉴于隐性核雄性不育材料在育种中潜在的巨大商业价值及运用前景，针对水稻基因OsGSL2中引起功能变异的碱基序列，设计了与隐性核雄性不育、雌性可育表型完全一致且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将成为广大育种者不可或缺的辅助育种工具。
附图说明
图1为OsGSL2基因的结构图。
图2为OsGSL2基因的表达模式图。
图3为定点突变靶位点模式图。
图4为T0代水稻潮霉素检测琼脂糖凝胶电泳图。
图5为T0代水稻突变类型图。
图6为T0代水稻突变体测序峰图。
图7为T0代水稻突变体花药形态及花粉碘染图。
图8为T0代水稻突变体穗子图。
图9为分子标记检测osgsl2-1后代分离图。
图10为杂交转育的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1水稻OsGSL2基因序列和表达模式分析
在Ensembl Plants库(http://plants.ensembl.org/index.html)中，查询到水稻OsGSL2(LOC_Os01g48200)基因，在粳稻中的核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示，基因功能注释为胼胝质合成酶(callose synthase)，其编码蛋白包含469个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2所示。
由于OsGSL2基因在水稻中的实际功能还没有公开的研究资料，为了研究该基因与水稻雄性生殖发育的关系，本发明首先利用基因表达数据库分析了该基因在水稻不同组织部位的表达模式(图2)，表达分析结果显示OsGSL2基因在水稻穗期中高表达。
实施例2水稻OsGSL2基因的功能以及利用CRISPR/Cas9方法创制水稻雄性不育系
为了明确水稻OsGSL2在水稻中的功能，本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑方法定点突变LOC_Os01g48200基因序列，敲除该基因在水稻中的功能。本实施例选取水稻常规稻中花11作为基因编辑的受体材料。分别选取基因编码区自起始密码子ATG开始第45位碱基至第64位碱基的SEQ ID NO.3所示序列作为CRISPR/Cas9基因编辑的靶标区域1(简称B1)(见图1)。
1、OsGSL2的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建
本实施例的基因编辑载体为pEGCas9Pubi-B-OsGSL2(载体图谱见图3)，该载体的基础载体为pEGCas9Pubi-B。本实施例通过在引物上设计靶点然后通过PCR获得MT-sgRNA进而通过一步克隆法连接到基础载体中，具体的构建流程如下：
(1)靶标gRNA的设计。将OsGSL2(LOC_Os01g48200)的基因序列输入https://zlab.bio/guide-design-resources进行靶标设计，PAM序列设定为NGG。本实施例选择的靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
(2)通过重叠PCR和巢式PCR扩增sgRNA表达盒。合成包含上述sgRNA靶点序列的引物对，并将上述引物对退火，然后与经过Bsa I酶切的双元载体pEGCas9Pubi-B连接，得到重组载体pEGCas9Pubi-OsGSL2。将重组载体pEGCas9Pubi-OsGSL2转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆测序，具体步骤参考文献《Xing,H.L.,Dong,L.,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.(2014).ACRISPR/Cas9 toolkit for multiplexgenome editing in plants.BMC plant biology 14:327.》中的方法。
(3)测序验证。
2、农杆菌介导的水稻遗传转化
将上述构建的pEGCas9Pubi-OsGSL2载体通过热激法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定后加甘油于-80℃保存菌液。以新鲜剥离的1.5mm左右的水稻杂交种中花11的幼胚作为受体材料，将剥离的水稻胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，放置时间不超过1小时，每个离心管中大约放入100个幼胚；吸去悬浮液，并用新的悬浮液将幼胚清洗2遍，管底保留少量可没过幼胚的悬浮液，然后43℃热激2分钟，之后再冰浴1分钟，用移液枪吸尽管底残留的洗液，并加入1.0mL的农杆菌侵染液，轻摇30秒，然后黑暗静置8分钟。接下来将离心管中的幼胚和侵染液倒入共培养基上，晃匀后用移液枪吸出多余的侵染液，所有幼胚的盾片朝上，于23℃黑暗共培养3天。共培养结束后，用无菌的镊子将幼胚转移至恢复培养基，于28℃培养7-14天，中间过程需留意及时去掉幼胚上长出的幼芽。恢复培养结束后将幼胚放至含1.5mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养3轮，每轮筛选2周，然后转到2mg/LBialaphos筛选培养基上筛选培养2轮，每轮筛选2周。将抗性愈伤组织转至扩繁培养基，28℃，暗培养2周。随后将扩繁好的抗性愈伤组织转移至诱导培养基，于28℃黑暗环境下培养2周。然后转到分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养2周。培养结束后将分化出的苗簇分离出单个幼苗放置于生根培养基中，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小营养钵中生长，生长成活后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
3、T0代植株CRISPR/Cas9突变结果检测
为确定T0代植株CRISPR/Cas9突变结果，采取如下步骤进行：
首先采用CTAB法提取水稻叶片DNA，具体方法如下：DNA提取方法参照传统CTAB法(Rogers and Bendich,1985)进行。取3cm水稻叶片放入已灭菌2mL的离心管中，加入6mm钢珠，使用细胞破碎仪进行组织破碎，之后进行CTAB法提取，提取样品最后加入200μL的灭菌水(ddH2O)，溶解风干的样品DNA，待用。待DNA完全溶解之后，吸取2μL样品使用紫外分光光度计(Nanodrop 2000)进行核酸OD值(A260/A280)及核酸浓度测定，将DNA样品稀释至50ng/μL备用。
阳性检测引物：Hn；产物大小：561bp；引物序列如下：
Hn-F(SEQ ID NO.9):5’CTTAGCCAGACGAGCGGGTTC 3’；
Hn-R(SEQ ID NO.10):5’GCTTCTGCGGGCGATTTGT 3’；
阳性检测结果如图4所示，阴性对照H2O和ZH11无带，阳性质粒对照扩增出561bp片段，T0代植株检测结果均为阳性，因此可以进一步检测基因型。按照以下PCR参数扩增并检测突变体基因型：
PCR使用Biomiga的2×PCR预混合液(含Mg2+；Taq DNA Polymerase；2.5mM dNTPs；10×PCR Buffer)5μL，1μL引物(含各0.5μL正反向引物，10μmol/L)，1μL模板DNA，ddH2O补足10μL。PCR扩增程序为常规SSR程序(94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增35个循环，最后72℃延伸5min)。扩增产物使用6％的非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳，0.1％ AgNO3染色，甲醛和NaOH显色拍照后统计基因型，最终发现3个T0转化事件靶标区域序列发生了变化，且表型各异，编辑前后的序列如图5所示，对应3个OsGSL2突变体：osgsl2-1、osgsl2-2和osgsl2-3。
对3个OsGSL2突变体中核苷酸序列进行比对分析发现(图5和图6)，与未编辑的WT相比，突变后的品系osgsl2-1、osgsl2-2和osgsl2-3其编码的核苷酸在靶标处均发生了缺失，osgsl2-1自起始密码子ATG开始第59位碱基至第61位ATA碱基的缺失，序列如SEQ IDNO.4所示；osgsl2-2自起始密码子ATG开始第59位碱基至第63位碱基ATAGA的缺失，并且互补链55至64位碱基GTTTATAGAC缺失，序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；osgsl2-3自起始密码子ATG开始第42位碱基至第60位碱基TTTGAGCAGAGACGTTTAT的缺失，并且互补链62位碱基A缺失，序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
突变后的品系osgsl2-1、osgsl2-2和osgsl2-3中编码的核苷酸缺失使得氨基酸发生移码并导致氨基酸翻译提前终止。因此这些转化体中LOC_Os01g48200蛋白的功能均表现缺失。
实施例3OsGSL2不育系的表型分析
OsGSL2不育系的雄穗、花药和花粉活力的观察
在营养生长和雌穗的发育方面，OsGSL2不育系(osgsl2-1、osgsl2-2和osgsl2-3)的植株与野生型相比基本无差异；在雄穗发育方面，野生型能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，自交后可正常结实，而OsGSL2不育系虽能正常抽雄，也能正常开花，但是osgsl2-1花药干瘪瘦小偏白绿、osgsl2-2和osgsl2-3花药干瘪瘦小偏白(图7)；进一步对野生型和突变体的花粉进行I2-KI染色，野生型花粉发育正常，花粉粒染色后呈黑色，而突变体osgsl2-1花粉粒99％不能染色，osgsl2-2花粉粒100％不能染色，osgsl2-3无花粉粒(图7)。成熟期取穗子统计结实率，野生型ZH11结实正常，结实率在90％以上；突变体osgsl2-1自交结实率约为1％；突变体osgsl2-2和osgsl2-3自交结实率约为0％(图8)。这表明OsGSL2(LOC_Os01g48200)基因通过影响花药的雄配子发育来控制水稻的雄性发育。
实施例4OsGSL2不育系鉴定的共分离分子标记开发和应用
1、共分离分子标记的开发
针对获得的三种OsGSL2不育系的突变位点，开发出一对共分离分子标记：GSL2-F1(SEQ ID NO.11)和GSL2-R1(SEQ ID NO.12)，结合PCR与琼脂糖及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、琼脂糖凝胶电泳检测的方法，根据获得的条带及大小即可分离出突变体的基因型。
2、共分离分子标记的应用验证
(1)选择野生型水稻植株ZH11、突变体植株osgsl2-1做母本和ZH11杂交得到F1，F1自交得到F2，种植F2得到分离群体为材料，采用实施例2中的CTAB法提取水稻叶片DNA。
(2)PCR扩增
利用上述共分离分子标记对上述水稻材料的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系、PCR扩增程序、扩增产物检测条件与实施例2检测突变体基因型的PCR参数相同。
(3)结果分析
如图9所示，结果表明，设计的功能性分子标记对分离群体的检测结果完全符合预期，共分离分子标记GSL2-F1/R1能够特异性检测水稻osgsl2-1纯合突变体及由其转育的水稻不育材料中的突变基因OsGSL2，并能同时区分野生型OsGSL2基因和突变型OsGSL2基因；GSL2-F1/R1在OsGSL2/OsGSL2纯合野生型(AA)DNA中能扩增出236bp的条带，在osgsl2-1/osgsl2-1纯合突变型材料(aa)DNA中能扩增出233bp的条带，在OsGSL2/osgsl2-1杂合型(Aa)材料中，则能分别同时扩增出对应的两条条带，而且不同带型与osgsl2-1后代分离群体个体植株的育性表型相对应，只出现236bp条带的水稻育性正常，只出现233bp条带的水稻雄性不育，同时出现236bp和233bp条带的水稻育性正常；证明该分子标记可以作为OsGSL2等位基因检测以及水稻育性预测的理想标记。
实施例5OsGSL2突变基因的不育系转育
用OsGSL2突变体与育性正常的受体，如博II B和野香B，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行OsGSL2基因和遗传背景选择，最终获得博II B和野香B背景下带有纯合OsGSL2突变基因的隐性核不育系。杂交转育的技术路线如图10所示，具体实施步骤如下：
1、以受体亲本，如博II B和野香B为父本与母本OsGSL2杂交获得F1。
2、以F1为母本与受体亲本，如博II B和野香B，回交获得BC1F1。
3、种植BC1F1，分别使用引物序列如SEQ ID No.11-12引物对检测OsGSL2基因型，选择OsGSL2杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现233bp和236bp条带。
4、使用一组基因型(例如200个)在OsGSL2突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。
5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如博II B和野香B，回交获得BC2F1。
6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出OsGSL2基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。
7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出OsGSL2基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的OsGSL2纯合株即OsGSL2基因的不育系。
以上仅以博II B和野香B作为转育实施例，但并不限于博II B和野香B，可以为任何水稻材料。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种水稻OsGSL2基因的分子标记，其特征在于，由如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物扩增得到。
2.用于检测水稻OsGSL2基因的特异性引物组合物，其特征在于，包括如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物。
3.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求2所述的引物组合物。
4.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3所述的试剂或试剂盒在水稻OsGSL2基因检测中的应用。
5.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3所述的试剂或试剂盒在以下至少一方面中的应用：
(1)鉴定或选育水稻普通核雄性不育种质资源；
(2)水稻杂交育种和制种；
(3)水稻不育系的种质资源改良。
6.权利要求1所述的分子标记或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3所述的试剂或试剂盒在水稻育性检测中的应用。
7.一种检测水稻OsGSL2基因的方法，其特征在于，包括：以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物带型判断水稻是否含有OsGSL2基因以及基因型。
8.一种检测水稻育性的方法，其特征在于，包括：以水稻基因组DNA为模板，利用如SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的引物进行PCR扩增，根据扩增产物带型判断水稻育性。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4～5min，94℃变性20～40s，54～60℃退火20～40s，72℃延伸20～30s，扩增30～40个循环，最后72℃延伸5～10min。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，若扩增产物只出现236bp条带，则待测样品为纯合野生型基因型，水稻的育性正常；若只出现233bp条带，则待测样品为纯合突变型基因型，水稻为雄性不育；若同时出现236bp和233bp条带，则待测样品为杂合基因型，水稻的育性正常。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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