CN111549055A

CN111549055A - 玉米ms2基因的应用

Info

Publication number: CN111549055A
Application number: CN202010469644.0A
Authority: CN
Inventors: 刘允军; 杨丽; 徐其隆; 康丹; 王国英
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明提供玉米MS2基因的应用。玉米MS2基因编码ABCG转运蛋白(SEQ ID NO:19)，该基因通过控制玉米花药发育，进而调控玉米雄性不育或可育性状。本发明为基于玉米雄性不育为基础的杂交育种技术提供新的基因资源。

Description

玉米MS2基因的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和遗传育种领域，具体地说，涉及玉米MS2基因的应用。

背景技术

杂种优势是指基因型不同的亲本个体相互杂交产生的杂种第一代，在增产、稳产、抗病、抗逆等方面优于亲本的现象，在农业生产实践上具有重大的应用价值与研究意义。玉米(Zea mays L.)是我国重要的粮食作物，是杂种优势利用最成功的作物之一，目前我国玉米生产主要就是利用杂交种。在玉米生产过程中，母本去雄是制约杂种制种效率和种子纯度的关键技术问题。我国现在玉米杂种生产中主要采用人工去雄的方法，并辅助采用机械去雄和化学去雄的方法。但是，人工去雄耗时费力且影响种子纯度，机械去雄容易损伤植株而降低种子产量，化学去雄容易产生化学物质残留而影响植株和环境。雄性不育在玉米杂种制种过程中的应用，能够有效的解决上述母本去雄问题。

根据植物雄性不育材料基因型的差异，将植物雄性不育分为3种类型：细胞质雄性不育型(cytoplasmic male sterility，CMS)、细胞核雄性不育型(genic male sterility，GMS)以及核质互作雄性不育型(karyoplasm interaction male sterility)。在早期玉米生产过程中，玉米T型细胞质不育系(CMS-T)被广泛应用，二十世纪七十年代美国玉米T型小斑病爆发并造成当地玉米大规模减产，从而导致CMS-T停用。因此，寻找新的玉米雄性不育系势在必行。因此，挖掘新的核不育基因，克隆并研究其功能，解析玉米的雄花发育的分子机理是玉米遗传育种应用研究和提高杂种优势利用效率的必然要求。

发明内容

本发明的目的是提供玉米MS2基因的应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供玉米MS2基因及含有该基因的生物材料的以下任一应用：

(1)控制玉米花药发育；

(2)控制玉米雄性不育或可育性状。

本发明中，玉米MS2基因来自玉米自交系B73，其为编码如下蛋白质a)或b)的基因：

a)由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成的蛋白质(ABCG转运蛋白)；或

b)SEQ ID NO:19所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由a)衍生的蛋白质。

玉米MS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，其CDS序列如SEQ ID NO:18所示。

所述应用包括利用基因工程手段，对玉米MS2基因进行定点突变，使得该基因功能缺失。

进一步地，所述应用包括敲除或降低玉米MS2基因的表达。

所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第二方面，本发明提供转基因玉米的构建方法，以玉米基因MS2为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米基因MS2的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因玉米。

优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TCGAAGTGGATCATCATCTG-3’(SEQ IDNO:20)。

第三方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因玉米在植物育种中的应用。

其中，育种目的是选育植物雄性不育材料。

育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第四方面，本发明提供玉米雄性不育系的创制方法，包括：

1)构建用于敲除玉米基因MS2的CRISPR/Cas9系统，转化玉米，收获转基因玉米植株的T₀代种子；

2)播种上述T₀代种子获得T₁代植株，于开花期调查T₁代植株育性(包括花药发育情况)，选择雄性不育株。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种新型雄性不育玉米材料及其制备方法，MS2基因突变能够使玉米雄性不育，为基于玉米雄性不育为基础的杂交育种技术提供新的基因资源。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中野生型玉米与ms2突变体表型比较。其中，A：散粉时野生型(左)与ms2突变体(右)的雄穂特征；B：散粉时野生型(左)与ms2突变体(右)的雄穂主轴特征；C：野生型(左)和ms2突变体(右)的小穂特征；D：野生型(左)和ms2突变体(右)的花药特征；E：野生型成熟花药淀粉碘化钾染色；F：ms2突变体成熟花药淀粉碘化钾染色。

图2为本发明较佳实施例中MS2基因在玉米9号染色体上的精细定位。

图3为本发明较佳实施例中玉米MS2蛋白及其同源蛋白的系统进化树分析。

图4为本发明较佳实施例中纯合突变体靶位点突变序列与表型分析。其中，A：突变序列；B：突变表型。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的玉米ms2雄性不育突变体来自美国种质中心。

实施例1玉米MS2基因的获得

1、玉米ms2雄性不育突变体的形态学特征

通过观察发现ms2突变体在营养生长阶段与野生型没有明显区别。当发育至生殖生长阶段，除花药以外的器官包括雄穂，花序和小花的发育与野生型相比也没有明显的缺陷(图1，A～C)。但是与野生型相比，ms2突变体的花药较小且颜色为黄白色(图1，D)；到花药发育后期，野生型花药中有成熟的花粉粒散出，而此时ms2突变体的花药干瘪皱缩不能正常散粉。用淀粉碘化钾溶液分别对野生型和突变体的花药进行染色，结果突变体花药不能被染色，进一步验证突变体花药在发育后期无成熟的花粉粒产生(图1，E和F)。

2、ms2突变体的遗传分析

将ms2突变体分别与玉米自交系B73和PH4CV杂交，F₁植株均表现为可育。ms2×B73F₂分离群体中可育植株(303株)和不育植株(81株)的比例接近3:1，同样ms2×PH4CV F₂分离群体中可育植株(301株)和不育植株(83株)的比例也接近3:1，均符合孟德尔分离定律(表1)。以上结果说明，ms2突变体的不育性状是由一对主效单基因控制的，属于隐性遗传。

表1 ms2突变体与玉米自交系杂交后代F₂群体分离情况

3、MS2基因的精细定位

为了验证MS2基因的候选区间，我们分别构建了ms2×B73 F₂分离群体和ms2×PH4CV F₂分离群体。本发明从MaizeGDB数据库中已经公布的SSR分子标记中筛选出35个位于9.03bin上的标记，用来扩增玉米自交系B73,PH4CV和ms2突变体。本发明又在80Mb-105Mb的区间内设计了InDel引物，并利用PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其在亲本间的多态性。

在ms2×PH4CV F₂分离群体中共鉴定出1344个突变体表型的单株，利用6对在亲本间具有多态性的分子标记检测这些单株的基因型。结果如图2中A所示，左侧标记检测到的交换单株由9株逐渐减少至1株，右侧标记检测的交换单株由31株逐渐递减至7株。由此可知，候选基因位于标记umc1271(SEQ ID NO:1-2)和标记InDel7(SEQ ID NO:3-4)之间约6Mb的区间内。在ms2×B73F₂分离群体中共鉴定出576个突变体表型的单株，利用5对在亲本间具有多态性的分子标记检测这些单株的基因型。结果如图2中B所示，左侧标记检测到的交换单株由9株逐渐减少至7株，右侧标记检测的交换单株由27株逐渐递减至2株。由此可知，候选基因位于标记InDel4(SEQ ID NO:5-6)和标记InDel5(SEQ ID NO:7-8)之间约3Mb的区间内。综合两个F₂分离群体的定位结果，将MS2基因定位在玉米9号染色体长臂上两个分子标记umc1271和InDel5之间，两个分子标记之间的物理距离约为2.2Mb。为了进一步确定MS2基因的候选区间，构建了BC₁F₂(n＝2163)的分离群体，该分离群体是由B73为父本授粉给初步定位中右边界的两个交换单株，获得F₁，F₁自交获得的F₂就是精细定位所用的分离群体。通过扩增基因和序列比对，设计筛选获得标记InDel9(SEQ ID NO:9-10)、InDel10(SEQ IDNO:11-12)、InDel11(SEQ ID NO:13-14)和1个SNP1标记(SEQ ID NO:15-16)，首先通过2163个雄性不育突变体将MS2基因定位到umc1271(11个交换单株)和InDel5(15个交换单株)之间约2.2Mb的区间内。根据这些交换单株继续定位，最后将其定位到InDel10(1个交换单株)和SNP1(3个交换单株)两个标记之间约250kb的区间内，此区间内包含4个基因(图2，C和D)。

4、玉米MS2基因的克隆

为了确定候选基因以及突变位点，我们扩增了此区间内的4个基因(Zm00001d046534,Zm00001d046535,Zm00001d046536和Zm00001d046537)，并进行测序分析。结果发现只有Zm00001d046537在其编码区有差异，在Zm00001d046537的第五个外显子上有1547bp的插入(图2，E)；跨第五个外显子设计特异性引物，扩增93个自交系的基因3，没有发现基因序列的变化；以上结果表明，ms2突变体基因3的第五个外显子上1547bp的插入是特异的，此基因就是候选基因MS2。

进一步地，从玉米自交系B73中克隆得到基因MS2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，CDS序列如SEQ ID NO:18所示，其编码的ABCG转运蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

通过检索MaizeGDB数据库，我们发现MS2基因可能属于ABCG型转运蛋白家族。同时通过蛋白质功能域预测软件(InterPro:protein sequence analysis&classification)预测，发现在MS2蛋白上分别存在一个ABC转运蛋白结构域和一个ABC-2型转运蛋白结构域。为了进一步探究MS2蛋白在进化上的亲缘关系，我们又结合NCBI数据库，使用plaza软件BLASTP筛选获得了MS2在玉米、水稻和拟南芥中的同源蛋白。包括10个拟南芥蛋白，6个水稻蛋白和5个玉米蛋白，我们以这些蛋白的氨基酸序列构建了系统进化树(图3)。分析进化树发现，水稻LOC_Os06g40550蛋白是MS2进化上最近的分支。并且我们发现，在MS2蛋白同一个进化分支上的拟南芥AT3G13220基因编码的是拟南芥ABCG26/WBC27蛋白。根据以上分析，表明MS2与LOC_Os06g40550和AT3G13220属于同一进化分支，同属于ABCG型转运蛋白家族。

实施例2玉米MS2基因功能的验证

利用CRISPR/Cas9技术创制了MS2基因敲除的转基因玉米。

1、gRNA设计：登录到网站http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/或http://www.e-crisp.org/E-CRISP/设计CRISPR/Cas9打靶位点，要求打靶位点离PAM/NGG 3bp且位于Bsa酶切位点中。为保证打靶效率，一般设计两个靶位点，两个靶位点之间片段大小约为250bp，且靶位点最好设计在靶基因第一个外显子上，打靶后易引起蛋白翻译异常，从而造成功能缺失。

2、引物设计结构示意如下：

MT1T2-BsF:AATAATGGTCTCAGGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

MT1T2-F0:GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC

MT1T2-R0:NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGCTTCTTGGTGCC

MT1T2-BsR:ATTATTGGTCTCTAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

将引物F0/BsF中CAGGCG后的20-nt N替换为由网站设计的第一个20-nt靶点序列(TCGAAGTGGATCATCATCTG)；将引物R0/BsR中TCTAAAC后的20-nt N替换为由网站设计的第二个20-nt靶点序列的反向互补序列(TGCTGCTTGGACATGCAAGC)。

3、构建打靶载体

(1)使用MT1T2-F0、MT1T2-R0进行第一轮PCR(KOD FX)扩增，模板为pCBC-MT1T2质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳验证；

(2)使用MT1T2-F0、MT1T2-R0进行第二轮PCR(KOD FX)扩增，模板为第一轮PCR产物，琼脂糖凝胶电泳验证；

(3)使用限制性核酸内切酶Bsa酶切第二轮PCR产物和质粒pBUE411，37℃水浴酶切1h；

(4)使用T4DNA连接酶连接酶切质粒和目的基因片段，25℃连接1h或4℃过夜连接；

(5)大肠杆菌转化，挑单克隆鉴定，摇菌，提质粒。

4、玉米转化

挑取单菌落接种到5-10mL含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡培养8h；再以1:100的比例将震荡培养后的菌液接种到新鲜的含相应抗生素的YEB液体培养基中，于200rpm、28℃振荡过夜。次日，将震荡培养过夜的菌液分装到2mL离心管中，5000rpm离心5min；用含200μM乙酰丁香酮的侵染培养基重悬，调整OD₆₀₀＝0.3，备用。

将受体材料玉米的未成熟幼胚(1.0-1.2mm)放到含1mL侵染培养基溶液的1.5mL离心管中，1h后用移液器吸去侵染培养基并加入1mL新的侵染培养基，颠倒混匀1min，充分清洗玉米幼胚表面的胚乳，再用移液器吸去侵染培养基溶液，加入0.2mL新的侵染培养基溶液。将装有玉米幼胚的离心管放置在加热器(杭州博日科技有限公司,型号CHB-100)上，45℃热激5min；用移液器吸去侵染培养基溶液，加入1mL含40mg/L乙酰丁香酮的农杆菌菌液EHA105，并放置5min；取出用灭菌滤纸吸干，放到添加300mg/L半胱氨酸的共培养培养基上，在23℃黑暗条件下共培养3天。共培养完后的幼胚转移到恢复培养基中，黑暗条件下培养7天。

筛选两轮后，获得抗性愈伤，将此愈伤转移到再生培养基，强光照下使植株再生。培养条件为28℃，光照16h，很快就会有再生小苗出现。再生的幼苗长到3片叶时，可将幼苗移植到生根培养基中，并在室内培养。待幼苗长出新叶及根后，将幼苗从罐头瓶中取出，自来水冲净培养基，移栽于混有营养土和蛭石(1:3，体积比)的小花盆中。当幼苗又长出2-3片新叶时，可将其移入大田或大花盆中。

本实施例中使用的侵染培养基、共培养培养基、再生培养基、生根培养基可参见CN106922525A。

转化玉米自交系综31，获得了基因靶位点发生编辑的杂合T₀代植株，其表型为可育。将T₀代植株种植于中国农业科学院北圃场实验基地，自交得到T₁代种子，种植于实验基地。根据T₁代转基因植株表型，取不育表型单株叶片，分析T₁代转基因植株。利用引物(MS2-F:GCTTCCTCTCTGAGCCATCT；MS2-R:AGCAGCTTGTCGAACATGTG)进行PCR扩增T₁代转基因植株的目的基因，PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增得到的PCR产物测序，鉴定T₁代基因编辑突变类型，在靶位点存在双峰的材料，进行PCR扩增产物纯化，连接pMD18-T载体，获得单克隆测序，最终分析测序结果得到3种不同基因编辑类型的纯合突变体，分别用mut1、mut2和mut3表示，具体突变类型如图4中A所示，均显示雄性不育表型(图4，B)。上述结果表明MS2基因控制玉米花药发育。野生型花药正常散粉，然而突变体花药不能从颖壳中散开，花药更小，枯萎，泛白，不能形成成熟的花粉。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 玉米MS2基因的应用

<130> KHP201112521.5

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctctcctcgt ccggtaatta agc 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttcttctt cttgcgcttc tct 23

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggggcaga tgatcagagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtttcgtc tttggtgcaa 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tacaccaagt cattagaaag gcaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gataacttgg ttttgatcat ttag 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctatcgttt ctaccgtcgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtttgcactc ctccaacctg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgatgccatg ccatgcgg 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggacggaaa agcctggtaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggctgttt ggtttactcg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttgctggaaa agactgggga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttgctcgcca agaagaacac 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgcgacataa gaagcagctg 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

taggagatga gccgatgacc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taggagatga gccgatgacc 20

<210> 17

<211> 2728

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 17

atatcaacaa cattacaaca aagtaagcat gctcttggtt ggcagtagtt accacttgat 60

aaaaagaaga gggagaccat gtgctttggc ttcctctctg agccatcttt cttgctctag 120

ccttaggcct tagcaatgga gatcagcgac gagcagagga tgcaagtgga gtgccagcgc 180

cttccgcctt cctggcaagg caacggatca gacgccgatg tcgaagtgga tcatcatctg 240

tggccgtcaa aagatggccc tcttccaata ttccttaagg tgttagttgt gctacctcac 300

tcctgttttt tttcttttag gctgacgtgt gcaatgactt gctgaactcc aaaacccagt 360

ttgagaacgt ggagtacagg gtgaagatga ccttgaagaa ccccctcaca gcggcgagag 420

tggcgtttgc gtcccagacg agggcagacc agggcagcag ctgcaagcac atcctcaagg 480

gcatcgctgg gagtgtggac cctggcgaga tcctggcgct gatgggtcca tctggcagcg 540

gcaagaccac cttgctcaag atcctggggg gcaggcttgg tggcggcgtc aagggccaca 600

taacctacaa cgacactccc tacagcccct gcctcaaaag gaggtactga aactgtaata 660

gctagcaaac aagaattttt cacttcactt aataatgaag attttttcac taatctgtgc 720

tgtgcgctgc aggatcggat ttgtgactca ggacgacgtc ctcttcccac agctgacggt 780

ggaggagacc ctcgtgttcg ccgccttctt gaggctccct gcttgcatgt ccaagcagca 840

gaagcgcgac agggtagacg ccatcatcgc cgagttgaat ctagagaggt tgcctttcat 900

tccatttctt gtatttatcg gggaatttga gttttcgcct gtatgcaaat gcaagcatgc 960

atgcatacat gttgtgtgga tcatcatttg aattggttta ggtgccggca caccaagatc 1020

gggggagcgt tcgtgagggg ggtgtcagga ggcgagagga agaggaccag catcgggaac 1080

gagatcctcg tcgacccgtc gctgctcctc ctcgacgagc ccacctccgg cctcgactcc 1140

acgtcggcga gcaagctcat ctttatcctc cagcgcctgg ccaaggtaca ttaatttgcg 1200

cgcagctagc aacgccaccg acgagacgac gatcatgcac gttgctaatt ccatcgatgc 1260

tggacgcatg gtcgcagacg cggaggacga tcatcacgac gatccaccag ccgtcgagcc 1320

ggatgttcca catgttcgac aagctgctgc tcatctccga cgggcacgcc atctaccacg 1380

gcaaggcccg ggactgcatg caccacttct cctcgctggg cttcgtcccg gagatcccca 1440

tgaacccggc cgagttcctg ctggacctcg ccaccggcaa cctcgacgac atcagcgtcc 1500

ccgaggcgct gcgcggctcg ccggacccgc aggagttcag gtcccaggtc atcaggcacc 1560

tgcagctcaa gtaccgggcg ggcgccgagg ctcccgcggg gagaaggacg cccactgagc 1620

agctgcgtct ggcggtgcgg gcgcataaca aggaccgccg ccggcggagc atcggctggc 1680

tccagcagtt cgccgtgctg tcccggcgca cgttccggga gcgcgcatcc gactacctgg 1740

acaagatgcg gctcgcgcag gccgtcggcg tggcgctcct gctgggtctc ctctggtgga 1800

agtcccagac cgggaacgag gcccagctgc gggaccaggt cggtctcatc ttctacatct 1860

gcatcttctg gacgtcgtcg tcgctcttcg gctccgtcta cgtgttcccc ttcgagaagc 1920

tgtacctggt caaggagcgc aaggcggaca tgtaccggct gagcgcctac tacgccagca 1980

gcacgctgtg cgacgccgtg ccgcacgtcg tgtacccggt gctcttcatg gccatcctct 2040

acttcatggc cggcctccgc cgcaccgtgc cgtgcttctt cctcacgctc ctcgccacgc 2100

tgctcatcgt gttcaccagc cagggcaccg gggagctgct gggcgccgcc atcctcagcg 2160

tcaagagggc gggggtcatg gcgtcgctcg tgctcatgct cttcctcctc accggcggct 2220

actacgtcca gcacatcccc aagttcatcc gctggctcaa gtacgtctcc ttcatgcact 2280

acggcttcaa cctgctgctc aaagcgcagt accacggcca cctcacgtac aactgtgcca 2340

gccggggcgg ctgccagcgc ctgcagtcgt cgccgtcgtt cggcaccgtg gacctcgacg 2400

gcggcatgcg cgaggtctgg atcctgctcg ccatggcgct cgcataccga ctcctcgcct 2460

acttctgcct cctcaagcgg atcagcctca cgcccttgtg atcatccacc taattaaatt 2520

ggggcgcaat ttcgcatgcc tgtgtgaatg attattcatg ggaaatgcct gcatggcgat 2580

gtgtatcagg ctatcagcta tactttgcag actgctgggc ctaatttacg aggtgtattt 2640

gtctgacaca agttttagaa gaagagtgaa caatgacata gcatttttag attatataag 2700

tgtttatgct agccgttcct agttataa 2728

<210> 18

<211> 2031

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 18

atggagatca gcgacgagca gaggatgcaa gtggagtgcc agcgccttcc gccttcctgg 60

caaggcaacg gatcagacgc cgatgtcgaa gtggatcatc atctgtggcc gtcaaaagat 120

ggccctcttc caatattcct taaggctgac gtgtgcaatg acttgctgaa ctccaaaacc 180

cagtttgaga acgtggagta cagggtgaag atgaccttga agaaccccct cacagcggcg 240

agagtggcgt ttgcgtccca gacgagggca gaccagggca gcagctgcaa gcacatcctc 300

aagggcatcg ctgggagtgt ggaccctggc gagatcctgg cgctgatggg tccatctggc 360

agcggcaaga ccaccttgct caagatcctg gggggcaggc ttggtggcgg cgtcaagggc 420

cacataacct acaacgacac tccctacagc ccctgcctca aaaggaggat cggatttgtg 480

actcaggacg acgtcctctt cccacagctg acggtggagg agaccctcgt gttcgccgcc 540

ttcttgaggc tccctgcttg catgtccaag cagcagaagc gcgacagggt agacgccatc 600

atcgccgagt tgaatctaga gaggtgccgg cacaccaaga tcgggggagc gttcgtgagg 660

ggggtgtcag gaggcgagag gaagaggacc agcatcggga acgagatcct cgtcgacccg 720

tcgctgctcc tcctcgacga gcccacctcc ggcctcgact ccacgtcggc gagcaagctc 780

atctttatcc tccagcgcct ggccaagacg cggaggacga tcatcacgac gatccaccag 840

ccgtcgagcc ggatgttcca catgttcgac aagctgctgc tcatctccga cgggcacgcc 900

atctaccacg gcaaggcccg ggactgcatg caccacttct cctcgctggg cttcgtcccg 960

gagatcccca tgaacccggc cgagttcctg ctggacctcg ccaccggcaa cctcgacgac 1020

atcagcgtcc ccgaggcgct gcgcggctcg ccggacccgc aggagttcag gtcccaggtc 1080

atcaggcacc tgcagctcaa gtaccgggcg ggcgccgagg ctcccgcggg gagaaggacg 1140

cccactgagc agctgcgtct ggcggtgcgg gcgcataaca aggaccgccg ccggcggagc 1200

atcggctggc tccagcagtt cgccgtgctg tcccggcgca cgttccggga gcgcgcatcc 1260

gactacctgg acaagatgcg gctcgcgcag gccgtcggcg tggcgctcct gctgggtctc 1320

ctctggtgga agtcccagac cgggaacgag gcccagctgc gggaccaggt cggtctcatc 1380

ttctacatct gcatcttctg gacgtcgtcg tcgctcttcg gctccgtcta cgtgttcccc 1440

ttcgagaagc tgtacctggt caaggagcgc aaggcggaca tgtaccggct gagcgcctac 1500

tacgccagca gcacgctgtg cgacgccgtg ccgcacgtcg tgtacccggt gctcttcatg 1560

gccatcctct acttcatggc cggcctccgc cgcaccgtgc cgtgcttctt cctcacgctc 1620

ctcgccacgc tgctcatcgt gttcaccagc cagggcaccg gggagctgct gggcgccgcc 1680

atcctcagcg tcaagagggc gggggtcatg gcgtcgctcg tgctcatgct cttcctcctc 1740

accggcggct actacgtcca gcacatcccc aagttcatcc gctggctcaa gtacgtctcc 1800

ttcatgcact acggcttcaa cctgctgctc aaagcgcagt accacggcca cctcacgtac 1860

aactgtgcca gccggggcgg ctgccagcgc ctgcagtcgt cgccgtcgtt cggcaccgtg 1920

gacctcgacg gcggcatgcg cgaggtctgg atcctgctcg ccatggcgct cgcataccga 1980

ctcctcgcct acttctgcct cctcaagcgg atcagcctca cgcccttgtg a 2031

<210> 19

<211> 676

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays)

<400> 19

Met Glu Ile Ser Asp Glu Gln Arg Met Gln Val Glu Cys Gln Arg Leu

1 5 10 15

Pro Pro Ser Trp Gln Gly Asn Gly Ser Asp Ala Asp Val Glu Val Asp

20 25 30

His His Leu Trp Pro Ser Lys Asp Gly Pro Leu Pro Ile Phe Leu Lys

35 40 45

Ala Asp Val Cys Asn Asp Leu Leu Asn Ser Lys Thr Gln Phe Glu Asn

50 55 60

Val Glu Tyr Arg Val Lys Met Thr Leu Lys Asn Pro Leu Thr Ala Ala

65 70 75 80

Arg Val Ala Phe Ala Ser Gln Thr Arg Ala Asp Gln Gly Ser Ser Cys

85 90 95

Lys His Ile Leu Lys Gly Ile Ala Gly Ser Val Asp Pro Gly Glu Ile

100 105 110

Leu Ala Leu Met Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Lys

115 120 125

Ile Leu Gly Gly Arg Leu Gly Gly Gly Val Lys Gly His Ile Thr Tyr

130 135 140

Asn Asp Thr Pro Tyr Ser Pro Cys Leu Lys Arg Arg Ile Gly Phe Val

145 150 155 160

Thr Gln Asp Asp Val Leu Phe Pro Gln Leu Thr Val Glu Glu Thr Leu

165 170 175

Val Phe Ala Ala Phe Leu Arg Leu Pro Ala Cys Met Ser Lys Gln Gln

180 185 190

Lys Arg Asp Arg Val Asp Ala Ile Ile Ala Glu Leu Asn Leu Glu Arg

195 200 205

Cys Arg His Thr Lys Ile Gly Gly Ala Phe Val Arg Gly Val Ser Gly

210 215 220

Gly Glu Arg Lys Arg Thr Ser Ile Gly Asn Glu Ile Leu Val Asp Pro

225 230 235 240

Ser Leu Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr Ser Gly Leu Asp Ser Thr Ser

245 250 255

Ala Ser Lys Leu Ile Phe Ile Leu Gln Arg Leu Ala Lys Thr Arg Arg

260 265 270

Thr Ile Ile Thr Thr Ile His Gln Pro Ser Ser Arg Met Phe His Met

275 280 285

Phe Asp Lys Leu Leu Leu Ile Ser Asp Gly His Ala Ile Tyr His Gly

290 295 300

Lys Ala Arg Asp Cys Met His His Phe Ser Ser Leu Gly Phe Val Pro

305 310 315 320

Glu Ile Pro Met Asn Pro Ala Glu Phe Leu Leu Asp Leu Ala Thr Gly

325 330 335

Asn Leu Asp Asp Ile Ser Val Pro Glu Ala Leu Arg Gly Ser Pro Asp

340 345 350

Pro Gln Glu Phe Arg Ser Gln Val Ile Arg His Leu Gln Leu Lys Tyr

355 360 365

Arg Ala Gly Ala Glu Ala Pro Ala Gly Arg Arg Thr Pro Thr Glu Gln

370 375 380

Leu Arg Leu Ala Val Arg Ala His Asn Lys Asp Arg Arg Arg Arg Ser

385 390 395 400

Ile Gly Trp Leu Gln Gln Phe Ala Val Leu Ser Arg Arg Thr Phe Arg

405 410 415

Glu Arg Ala Ser Asp Tyr Leu Asp Lys Met Arg Leu Ala Gln Ala Val

420 425 430

Gly Val Ala Leu Leu Leu Gly Leu Leu Trp Trp Lys Ser Gln Thr Gly

435 440 445

Asn Glu Ala Gln Leu Arg Asp Gln Val Gly Leu Ile Phe Tyr Ile Cys

450 455 460

Ile Phe Trp Thr Ser Ser Ser Leu Phe Gly Ser Val Tyr Val Phe Pro

465 470 475 480

Phe Glu Lys Leu Tyr Leu Val Lys Glu Arg Lys Ala Asp Met Tyr Arg

485 490 495

Leu Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Ser Thr Leu Cys Asp Ala Val Pro His

500 505 510

Val Val Tyr Pro Val Leu Phe Met Ala Ile Leu Tyr Phe Met Ala Gly

515 520 525

Leu Arg Arg Thr Val Pro Cys Phe Phe Leu Thr Leu Leu Ala Thr Leu

530 535 540

Leu Ile Val Phe Thr Ser Gln Gly Thr Gly Glu Leu Leu Gly Ala Ala

545 550 555 560

Ile Leu Ser Val Lys Arg Ala Gly Val Met Ala Ser Leu Val Leu Met

565 570 575

Leu Phe Leu Leu Thr Gly Gly Tyr Tyr Val Gln His Ile Pro Lys Phe

580 585 590

Ile Arg Trp Leu Lys Tyr Val Ser Phe Met His Tyr Gly Phe Asn Leu

595 600 605

Leu Leu Lys Ala Gln Tyr His Gly His Leu Thr Tyr Asn Cys Ala Ser

610 615 620

Arg Gly Gly Cys Gln Arg Leu Gln Ser Ser Pro Ser Phe Gly Thr Val

625 630 635 640

Asp Leu Asp Gly Gly Met Arg Glu Val Trp Ile Leu Leu Ala Met Ala

645 650 655

Leu Ala Tyr Arg Leu Leu Ala Tyr Phe Cys Leu Leu Lys Arg Ile Ser

660 665 670

Leu Thr Pro Leu

675

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcgaagtgga tcatcatctg 20

Claims

1.玉米MS2基因及含有该基因的生物材料的以下任一应用：

(1)控制玉米花药发育；

(2)控制玉米雄性不育或可育性状；

其中玉米MS2基因为编码如下蛋白质a)或b)的基因：

a)由SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，利用基因工程手段，对玉米MS2基因进行定点突变，使得该基因功能缺失。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括敲除或降低玉米MS2基因的表达。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述生物材料选自重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

5.转基因玉米的构建方法，其特征在于，以玉米基因MS2为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化玉米，实现对玉米基因MS2的定点突变，进而获得该基因功能缺失的转基因玉米；

其中，玉米基因MS2同权利要求1中所述。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TCGAAGTGGATCATCATCTG-3’。

7.根据权利要求5或6所述方法获得的转基因玉米在植物育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，育种目的是选育植物雄性不育材料。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

10.玉米雄性不育系的创制方法，其特征在于，包括：

2)播种上述T₀代种子获得T₁代植株，于开花期调查T₁代植株育性，选择雄性不育株；

其中，玉米基因MS2同权利要求1中所述；

优选地，所述靶向玉米基因MS2的CRISPR/Cas9系统，其中sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-TCGAAGTGGATCATCATCTG-3’。