CN104531717A - 水稻稻瘟病抗性基因Pike及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因 Pike 及其应用，涉及一种水稻稻瘟病抗性基因 Pike 的克隆及其编码蛋白与应用，还涉及根据该基因产生的功能性分子标记及应用，属于水稻抗病育种领域。水稻稻瘟病抗性基因 Pike 包括 Pike-1 和 Pike-2 ，其基因组核苷酸序列分别如SEQ ID NO . 1和SEQ ID NO . 2所示，编码的蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO . 5和SEQ ID NO . 6所示。根据 Pike-1 和 Pike-2 的序列产生的dCAPS分子标记可用于检测是否具有 Pike 基因。本发明的基因、蛋白或分子标记可用于抗稻瘟病水稻品种育种、鉴定或提高植物对稻瘟病菌的抗性。

Description

水稻稻瘟病抗性基因Pike及其应用

技术领域

本发明属于水稻抗病育种领域，涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pike的克隆及其编码蛋白与应用，还涉及根据该基因产生的功能性分子标记及应用。

背景技术

水稻是我国乃至全世界的重要粮食作物，几乎是我国一半人口的主食，水稻在实现全球粮食安全中起着非常重要的作用。水稻产量受多种病虫害的影响，常见的水稻病害有细菌性条斑病、稻瘟病、胡麻叶斑病、纹枯病、黄矮病、白叶枯病和恶苗病等，其中稻瘟病、白叶枯病和纹枯病被称为水稻的三大重要病害。由水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae引起的水稻稻瘟病是一种真菌性病害，可以在水稻的各部位以及生育期的各阶段发病，具有爆发频率高、发生范围广、传播速度快、危害严重等特点，在我国乃至全世界各稻区常年均有发生，导致水稻各稻区大面积减产甚至绝收。利用水稻的抗病基因识别病原物、并启动自身的防御应答系统，是水稻防止稻瘟病菌侵袭的重要策略之一。因此，抗病基因的定位与克隆、抗病基因产物的结构分析与研究，对水稻病虫害的预防和控制具有指导意义。

目前，随着分子生物学的快速发展，至少有100多个水稻抗稻瘟病主效抗性基因已经被报道，除了水稻第3染色体外，其余11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且在水稻第6、11、12染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，并且抗性基因在Pita、Pi9和Pik基因位点成簇存在。迄今，至少有Pi37、Pit、Pi35、Pish、Pib、pi21、Pi36、Pi9、Pi2、Piz-t、Pi-d2、Pi-d3、Pi5、Pik、Pikm、Pik-p、Pb1、Pi1、Pikh、Pia、PiCO39、Pi-ta和Pi54等23个抗稻瘟病基因已经被克隆。

通过对已克隆的抗病基因研究发现，编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，此类抗病基因的蛋白类似于胞内受体，蛋白质N-端为核酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，蛋白质C-端为富含亮氨酸重复区(leucine-rich repeat，LRR)。根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，该类基因分为TIR(ToIl/IL-1受体)-NBS-LRR类型和CC-NBS-LRR类型。目前，TIR(ToIl/IL-1受体)-NBS-LRR类抗病基因只在双子叶植物中发现。植物中已定位的抗病基因多数属于CC-NBS-LRR类抗性基因，此类基因在单子叶植物和在双子叶植物中均有存在。

在NBS-LRR类抗病蛋白中，NBS结构域比较保守，LRR结构域变异较丰富。NBS结构域包含3个高度保守的功能基序(激酶1a、激酶2a和激酶3a基序)，它们与ATP或GTP结合后获得能量用于抵抗病原菌。不同抗病基因的LRR结构域在重复序列的长度、数目和位置上有较大差别。Kajava认为LRR结构域与稻瘟病菌的识别有关，LRR被推测为抗病基因产物直接或间接与病原菌无毒基因编码产物相互作用的部位。Jia等证明了Avr-Pita蛋白与Pita蛋白的LRR结构域能特异性结合。近期研究证明，马铃薯的Rx基因的CC结构域和NBS结构域决定其抗病特异性。马铃薯的Rb基因的CC结构域参与病原菌的特异性识别。Kanzaki等证明了Avr-Pik蛋白与Pik-1蛋白的CC结构域能特异性结合，Zhai等报道了Pikh-1蛋白的CC结构域可以与Pikh-2蛋白和无毒基因蛋白AvrPik-h直接进行互作，说明Pikh-1蛋白的CC结构域参与了对病原菌的特异性识别。因此，在不同的抗病基因中，对病原菌特异性识别起决定性的作用结构域可能不同。

发明内容

本发明的首要目的在于提供水稻稻瘟病抗性基因Pike-1和Pike-2。

本发明的另一目的在于提供上述水稻稻瘟病抗性基因Pike-1和Pike-2编码的蛋白。

本发明的再一目的在于提供根据上述基因Pike-1和Pike-2的DNA序列开发的功能性分子标记。

本发明的目的还在于提供上述基因、蛋白或分子标记的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明从水稻品种湘早143中分离得到Pike基因的DNA片段，该片段赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性(专化性)的抗病反应，适用于所有对该病原菌敏感的植物(包括单子叶植物和双子叶植物)。Pike基因包括2个编码CC-NBS-LRR类蛋白的基因Pike-1和Pike-2，其基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，其全长cDNA序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，它们分别编码氨基酸序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示的蛋白，结构如图8和图9所示。Pike-1和Pike-2蛋白都包含3个主要的结构域：CC、NBS和LRR结构域。其中，Pike-1蛋白的NBS结构域含有4个保守的基序，分别是kinase 1a：GLPGGGKTTIAR，kinase 2a：NKKYLIVIDDIW，kinase 3a：DLGGRIMTTGLNSI和motif 3(GLPI)：EDNSCYDIVNMCYGMPLALIW，在Pike-1蛋白的C端区域为16个不规则的LRR重复，紧随其后存在一个103碱基长度的C末端非LRR区域(CtNL)(图8)；Pike-2蛋白的NBS结构域含有6个保守的基序，分别是kinase 1a：VLSIVGFGGVGKTTIA，kinase 2a：LEQLLAEKSYILLIDDIW，kinase 3a：GGRIIVTTRFQAV，motif 3(GLPI)：EQVPEEIWKICGGLPLAIV，RNBS-D：CLLYLSIFPKGWK，MHDV：KTFQVHDMVLEYI，在Pike-2蛋白的C端区域为13个不完善的LRR重复(图9)。Pike-1和Pike-2基因的DNA片段在水稻的叶片组织呈组成型表达。

根据本发明提供的Pike基因序列信息(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)，可以通过下列方法获得与Pike等同的基因：根据Pike基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻的基因组、mRNA和cDNA中获取。

本发明提供的稻瘟病抗性基因Pike基因具有重要的应用价值，Pike基因对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。应用之一是将所述的Pike基因序列连接到任何一种植物表达载体，通过农杆菌转化方法将Pike基因导入水稻细胞，从而获得表达所述基因的转基因抗病品种，进而应用与生产。将本发明所述的Pike基因构建到植物表达载体中，可以对所述基因或其调控序列进行适当的修饰，或者使用其他启动子取代所述基因原有的启动子，达到增强或拓宽该基因的转基因植物对病原菌的抗性。

在本发明中，发明人根据所述基因序列信息产生特异性的SNP位点设计dCAPS分子标记，对水稻所提取的DNA进行PCR扩增，并通过酶切反应，检测是否具有Pike基因，能将Pike基因与等位基因Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1相区分，其检测的准确性高，可以用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。其中，根据Pike-1基因产生的dCAPS分子标记设计的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。根据Pike-2基因产生的dCAPS分子标记设计的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。这2对dCAPS分子标记可以将Pike与Pik基因位点上已鉴定的6个等位基因区分开，证明Pike是Pik基因位点上的一个新等位基因。

本发明具有如下优点及效果：将克隆的抗病基因Pike转入感病的植物，有助于培育出新的抗病植物，特别是可以用转化技术将多个抗病基因转入同一植物中，可以克服传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆可以克服传统育种中不能在不同物种间转移抗病基因的问题。

另外本发明可以进一步提供或利用含有Pike基因的抗病转基因植株和相应的种子，并且可以通过有性杂交的方式将Pike基因转入其他的植株中。同时，本发明的Pike功能性分子标记以PCR技术为基础，不仅能区分水稻品种的基因型，而且能够快捷、直接、方便地实现在水稻种植资源中以及育种后代中的鉴定，避免了传统育种中人为因素及环境因素的影响，降低劳动成本，并能提高育种工作的效率。因此，Pike功能性分子标记能够得到广泛的使用。

附图说明

图1是水稻稻瘟病抗性基因Pike的图位克隆技术路线图。

图2是水稻稻瘟病抗性基因Pike遗传图谱和电子物理图谱的构建及候选基因的预测。其中，图2A：Pike基因位点的遗传图谱。长横线表示染色体，横线上面的数字为标记之间的遗传距离(用厘摩cM表示)，括号内的数字是用该标记检测出的重组配子数/总配子数。图2B：Pike基因位点的物理图谱。短横线表示BAC克隆，长横线表示染色体，标记间的数字表示物理距离(用kb表示)。Pike基因被定位在分子标记ID1159与ID6726之间，存在4个BAC克隆。图2C：Pike基因位点在日本晴基因组上存在6个具有NBS-LRR保守结构的候选基因。图2D：Pike基因位点最可能的2个候选基因。

图3是候选基因在日本晴与湘早143基因组中的检测。其中，图3A：候选基因在日本晴与湘早143基因组中的扩增流程图。两对引物E1a F/R和E1b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike1-N；两对引物E2a F/R和E2b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike2-N；两对引物E3a F/R和E3b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike3-N；两对引物E4a F/R和E4b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike4-N；两对引物E5aF/R和E5b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike5-N；两对引物E6a F/R和E6b F/R用来扩增日本晴与湘早143中的候选基因Pike6-N。图3B：候选基因在日本晴(Nip)与湘早143(XZ143)基因组中的扩增图。候选基因Pike1-N、Pike2-N、Pike3-N和Pike4-N的目标片段在日本晴中被扩增，在湘早143中无法被扩增；候选基因Pike5-N和Pike6-N在日本晴和湘早143中均能被扩增。推测候选基因候选基因Pike1-N、Pike2-N、Pike3-N和Pike4-N可能在湘早143中缺失，候选基因Pike5-N和Pike6-N为可能的候选基因，并用于进行后续的分析，被重新命名为Pike-1和Pike-2(如图2D)。

图4是Pike和Pik基因位点上的等位基因之间的抗病频率及抗谱比较结果图。其中，图4A：Pike和Pik基因位点上的等位基因之间对来自中国主要稻区的215个稻瘟病菌测试菌株的抗病频率比较。纵坐标为7个Pik基因位点上的等位基因(IRBLks-S，Piks；IRBLk-Ka，Pik；IRBLkh-K3，Pikh；IRBLkm-Ts，Pikm；IRBLkp-K60，Pikp；C101LAC，Pi1；湘早143，Pike)，横坐标为抗病基因对于215个稻瘟病菌测试菌株的抗病频率。图4B：Pike和Pik基因位点上的其他6个等位基因对来自中国主要稻区的215个稻瘟病菌测试菌株的抗谱比较，Pike的抗谱大于并完全覆盖Pik基因位点上的其他6个等位基因的抗谱。

图5是水稻稻瘟病抗性基因Pike表达特性的实时定量RT-PCR检测图。其中，左图和中图为组成型基因Pike-1和Pike-2在不同的接种时间点(0h、24h、48h、72h)的相对表达水平，由此可以看出Pike-1和Pike-2在接种后表达量迅速升高，接种后24h表达量达到最高水平，接种后24h至72h，表达量逐渐减少到稳定的趋势，Pike-1和Pike-2接种后的表达量相对于未接种时都有明显的提高；Pike-1总体表达水平比Pike-2低。右图为病原菌诱导表达基因PBZ1(pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作为阳性对照的表达水平，由此可以看出，该基因在接种对照(H₂O)和接种病原菌之间表现明显不同的诱导型表达。由于在接种前、后都能检测到2个组成基因(Pike-1和Pike-2)的表达，说明这2个组成基因都是组成型表达基因。

图6是水稻稻瘟病抗性基因Pike的候选基因Pike-1和Pike-2的克隆方法示意图。其中，图6A：候选基因Pike-1和Pike-2的结构。灰色矩形代表外显子，实线代表内含子；图6B：候选基因Pike-1和Pike-2的克隆方法。短横线代表基因的分段扩增，片段KE1、KE2和KE3，分别经过双酶切，并依次连接入改造后的表达载体pCAMBIA1300Asc1中，获得导入候选基因Pike-1全长基因组片段的表达载体。片段KE3和KE4，分别经过双酶切，并依次连接入改造后的表达载体pCAMBIA1300Asc1中，获得导入候选基因Pike-2全长基因组片段的表达载体。深灰色矩形代表克隆的候选基因。

图7是水稻稻瘟病抗性基因Pike(由Pike-1和Pike-2组成)的T₀代基因组DNA转基因植株的表型及基因型检测。其中，图7A：选择对抗源品种湘早143表现为非亲和反应、而对受体品种日本晴表现为亲和反应的稻瘟病菌株，去接种水稻稻瘟病抗性基因Pike(由Pike-1和Pike-2组成)的T₀代转基因植株的表型检测图。R：抗病；S感病。图7B：水稻稻瘟病抗性基因Pike(由Pike-1和Pike-2组成)的T₀代转基因植株的基因特异性引物RT-KE1和RT-KE2的PCR检测图。图中由左至右，泳道1：分子量标记DL5000(M)；泳道2：Pike克隆载体(Vector，M)，作为阳性对照；泳道3：H₂O，阴性对照；泳道4-16：T₀代转基因植株。结果表明所有抗病的T₀代转基因植株同时检测到Pike-1和Pike-2两个基因的PCR扩增产物，而感病的T₀代转基因植株都只检测Pike-1或Pike-2其中一个基因的PCR扩增产物，说明抗病的T₀代转基因植株是由于同时转化两个基因的构建体(Pike-1和Pike-2)已经整合到高感的受体品种日本晴中获得了表达而恢复了抗性，抗病基因Pike需要Pike-1和Pike-2共同存在才能表达抗性。

图8是水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-1的基因结构及其编码氨基酸序列图。其中，图8A：水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-1的基因结构图。图中黑色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及内含子和外显子的大小(bp)均标示于图中。图8B：水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-1编码的氨基酸序列图。图中CC结构域中的斜体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域带下划线的加粗字表示NBS结构域中保守的氨基酸残基序列。LRR区域中带下划线的加粗字表示LRR区域的xLDL保守基序；LRR区域后面存在一小段CtNL(C端非LRR区域)氨基酸序列。星号标示的氨基酸残基为Pike区别于Pik基因位点上的其他6个等位基因(Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)的特异性的氨基酸替换。

图9是水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-2的基因结构及其编码氨基酸序列图。其中，图9A：水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-2的基因结构图。图中黑色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及内含子和外显子的大小(bp)均标示于图中。图9B：水稻稻瘟病抗性基因Pike之组成基因Pike-2编码的氨基酸序列图。图中CC结构域中的斜体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域带下划线的加粗字表示NBS结构域中保守的氨基酸残基序列。LRR区域中带下划线的加粗字表示LRR区域的xLDL保守基序。星号标示的氨基酸残基为Pike区别于Pik基因位点上的其他6个等位基因(Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)的特异性的氨基酸替换。

图10是水稻稻瘟病抗性基因Pike与其它6个等位基因的预测蛋白氨基酸序列比较。其中，图10A：Pike-1与其它6个等位基因的氨基酸序列比较。图10B，Pike-2与其它6个等位基因的氨基酸序列比较。垂直的数值代表Pike-1和Pike-2的氨基酸残基位置，等位基因与Pike-1或Pike-2相同的氨基酸残基用圆点表示，不同的氨基酸残基分别在Pike-1和Pike-2的氨基酸残基下方列出，短横线表示该位置氨基酸残基缺失。在Pike-1第443位氨基酸残基与Pike-2第1006位氨基酸残基处各存在一个特异性SNP位点W443S和D1006V。

图11是水稻稻瘟病抗性基因Pike特异性dCPAS分子标记d-G1328C和d-A3017T的基因型鉴定图。其中，图11A：水稻稻瘟病抗性基因Pike特异性分子标记d-G1328C的基因型鉴定图。由此可以看出，利用该分子标记可以把抗性品种湘早143的基因型(Pike/Pike)；含有与Pike等位的抗性品种IRBLk-Ka的基因型(Pik/Pik)、抗性品种IRBLkh-K3的基因型(Pikh/Pikh)、抗病品种IRBLkm-Ts的基因型(Pikm/Pikm)、抗病品种IRBLkp-K60的基因型(Pikp/Pikp)；抗病品种IRBLks-S的基因型(Piks/Piks)、抗病品种C101LAC的基因型(Pi1/Pi1)鉴别出来。图11B：水稻稻瘟病抗性基因Pike特异性分子标记d-A3017T的基因型鉴定图。由此可以看出，利用该分子标记可以把抗性品种湘早143的基因型(Pike/Pike)；含有与Pike等位的抗性品种IRBLk-Ka的基因型(Pik/Pik)、抗性品种IRBLkh-K3的基因型(Pikh/Pikh)、抗病品种IRBLkm-Ts的基因型(Pikm/Pikm)、抗病品种IRBLkp-K60的基因型(Pikp/Pikp)；抗病品种IRBLks-S的基因型(Piks/Piks)、抗病品种C101LAC的基因型(Pi1/Pi1)鉴别出来。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。若为特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。在本发明的实施例部分，阐述了Pike基因的分离过程(图1)和该基因的特点，分离的Pike基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。

实施例1抗稻瘟病基因Pike遗传图谱和电子物理图谱的构建及其候选基因的预测

如图1，本发明利用图位克隆方法克隆了抗性基因Pike。首先，为了发掘和鉴定新的稻瘟病抗性基因。对籼稻抗病品种湘早143与籼稻感病品种粤泰B、金23B、9311共3个杂交组合由来的F₂群体(D445、BR18和BR2)，分别接种对双亲品种表现分明的非亲和性和亲和性反应的稻瘟病菌菌株。遗传学分析结果表明，这3个F₂群体中抗病植株与感病植株的分离比符合3:1(表1)。由此推断，湘早143所表现的抗性是由一对显性基因控制的。

表13个F2群体对稻瘟病菌株抗性的遗传分析

R，抗病；S，感病。

为了快速地确定主效抗性基因的染色体位置，构建了由50个抗病单株和764个极端感病单株组成的F₂代作图群体，并利用SSR(Simple Sequence Repeat，SSR)标记技术和InDel(Insert/Delete，InDel)标记技术，结合基于混合群体分离分析法(bulked-segregat analysis，BSA)的隐性群体分析法(recessive-class analysis，RCA)，共筛选了220个SSR或InDel标记，得到5个多态性好的标记：RM4112、RM1223、RM224、ID6726和RM7443(表2)，利用764株极端感病的F₂个体进行了连锁分析。结果显示，在分子标记RM4112、RM1223和RM224所处位置分别鉴定到51、26和4个重组配子体，在分子标记ID6726和RM7443所处位置分别鉴定到7和22个重组配子体；由于分子标记RM4112、RM1223和RM224所鉴定到的重组配子体与分子标记ID6726和RM7443所鉴定到的重组配子体完全不同，因此初步认为标记RM4112、RM1223和RM224位于抗病基因一侧，标记ID6726和RM7443位于抗病基因的另一侧，将抗病基因被初步定位在水稻第11号染色体的长臂上，位于分子标记RM1223与ID6726之间2.16cM的区域(图2A)。由于在这个区间存在一个基因簇，包含Pik基因位点的6个等位基因，因此，本发明将抗源材料湘早143中的抗病基因暂时命名为Pike。

表2多态性DNA分子标记

为了精细地确定Pike位点的位置，通过在线软件BLASTn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对初定位目标区段内的粳稻品种日本晴(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AP008217)与籼稻品种9311(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CM000136)的基因组序列。开发了4个多态性的标记：ID6946、ID1159、ID7711和ID6697(表2)，并对764株极端感病的F₂个体进行了连锁分析。结果表明，Pike位点被精细定位在ID1159-ID6697之间0.26cM的区域，并且与ID771完全共分离。为了构建该位点的物理图谱，本发明利用参考品种日本晴的细菌人工染色体(bacterialartificial chromosme，BAC)，通过生物信息学分析(bioinformatics analysis，BIA)，构建了该位点的电子物理图谱。结果表明Pike位点被定位在大约306kb的物理区域内(图2B)。

为了确定Pike的候选基因，本发明利用日本晴的基因组序列，通过3种基因预测软件TheMSU Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)、ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)对目的基因区域进行基因预测和注释分析，初步预测了Pike1-N、Pike2-N、Pike3-N、Pike4-N、Pike5-N、Pike6-N为Pike目标区域内的候选基因(图2C)。根据日本晴中这6个候选基因的基因组序列设计特异性引物(表3)，对日本晴和抗源材料湘早143的基因组DNA进行PCR扩增检测，结果显示，其中4个候选基因，Pike1-N、Pike2-N、Pike3-N和Pike4-N，在日本晴中能扩增出条带，在湘早143中均扩增不出条带；Pike5-N和Pike6-N在日本晴和湘早143中均能扩增出条带(图3B)。因此，湘早143中的候选基因Pike5-N和Pike6-N被重新命名为Pike-1和Pike-2(图2D)，并通过以下的基因功能互补实验确认其功能。

表3检测候选基因的PCR引物

实施例2抗稻瘟病基因Pike的抗性特征

首先，为了比较和明确在Pike位点上的7个等位基因(Pike、Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)的抗谱，选用从湖北省(HB，60个)、黑龙江省(HLJ，34个)、安徽省(AH，4个)、四川省(SC，37个)、江西省(JC，27个)、湖南省(HN，29个)和福建省(FJ，4个)、鉴别菌株(DI，20个)共8个菌群的215个稻瘟病菌菌株，对上述7个等位基因所对应的的抗源材料(湘早143、IRBLk-Ka、IRBLkh-K3、IRBLkm-Ts、IRBLkp-K60、IRBLks-S、C101LAC)进行了抗病频率及抗谱的比较分析。上述215个稻瘟病菌菌株分别是从湖北宜昌远安、赤壁、团风、监利、钟祥、烯水、天门、恩施、谷城和崇阳；安徽黄山；福建；四川；黑龙江；江西南昌和丰城等地区稻田采集穗颈瘟病样，通过稻瘟病菌的分离、保存获得。其中四川省的稻瘟病菌菌样由四川省农科院的谢戎研究员提供；湖北恩施地区的稻瘟病菌菌样由湖北省农科院的喻大昭研究员提供；黑龙江省的稻瘟病菌穗颈瘟病样由黑龙江省农科院五常所张广柱研究员提供；福建省稻瘟病菌菌样由福建省农科院陈福如研究员提供。抗病频率＝表现为抗病反应的稻瘟病菌株数/总测试菌株数；抗谱指抗病基因对稻瘟病菌菌株的抗、感反应表达谱。接种结果分析表明，Pike对除了黑龙江和湖南省的6个稻瘟病菌群体表现高度的抗性，并且Pike的抗病频率远远高于Pike位点上的其它6个等位基因(Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)的抗病频率(图4A)；Pike的抗谱大于并完全覆盖Pike位点上的其它6个等位基因(Pik、Pikh、Pikm、Pikp、Piks、Pi1)的抗谱(图4B)。

实施例3稻瘟病抗性基因Pike候选基因Pike-1和Pike-2的表达特性分析

利用实时定量RT-PCR技术对稻瘟病抗性基因Pike的候选基因Pike-1和Pike-2的表达模式进行了分析。抗病品种湘早143接种稻瘟病菌株或水后(水作为对照)，在不同时间点(0h、24h、48h、72h)采集叶片并提取其总RNA，利用反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TaKaRa，大连)进行反转录合成cDNA的第一条链。Actin(肌动蛋白)基因作为实时定量RT-PCR反应的内参基因，水稻PR10家族蛋白抗逆基因PBZ1作为阳性对照，分别从NCBI下载Actin基因和PBZ1基因的序列，设计特异性引物。同时，根据候选基因序列设计具有特异性的反转录引物。实时定量RT-PCR的引物如表4所示。

表4实时定量PCR引物

实时定量RT-PCR使用Roche 480Light Cycler检测系统和480SYBR Green IMaster(Roche公司)，操作按照试剂盒说明进行。图5中左图和中图为组成型基因Pike-1和Pike-2在不同的接种时间点(0h、24h、48h、72h)的相对表达水平。Pike-1和Pike-2在接种后表达量迅速升高，接种后24h表达量达到最高水平，接种后24小时至72小时，表达量逐渐减少到稳定的趋势，Pike-1和Pike-2接种后的表达量相对于未接种时都有明显的提高；Pike-1总体表达水平比Pike-2低。右图为病原菌诱导表达基因PBZ1(pathogenesis-relatedprobenazole-inducible gene)作为阳性对照的表达水平，由此可以看出，PBZ1基因在接种对照(H₂O)和接种病原菌之间表现明显不同的诱导型表达。由于在接种前、后都能检测到2个组成基因(Pike-1和Pike-2)的表达，说明这2个组成基因都是组成型表达基因。

实施例4稻瘟病抗性基因Pike的候选基因Pike-1和Pike-2全长基因组表达载体的构建

pCAMBIA1300-AscI载体是根据pCAMBIA1300改造得到的。方法如下：首先，利用限制性内切酶BamHI和HindIII对载体pCAMBIA1300进行双酶切；然后，回收酶切产物；设计1对引物(AscI F：5’-GATCCAAGGGCCCAGGCGCGCCGA-3’；AscI R：5’-AGCTTCGGCGCGCCTGGGCCCTTG-3’)，各取AscI F与AscI R 10μL，65℃退火30min后，加入1μL pCAMBIA1300双酶切回收片段、1μL 10×T4DNA Ligase Reaction Buffer、1μL T4DNA Ligase，16℃连接6h；随后，热击转化大肠杆菌并选取阳性克隆；最后，提取质粒，并用40％甘油保存菌种。

如图6所示，用4对引物KE1F/R、KE2F/R、KE3F/R和KE4F/R分别去扩增湘早143的基因组DNA，得到4个扩增片段KE1、KE2、KE3和KE4，大小分别为3.8kb、5kb、6kb和4.7kb。扩增引物如下：

KE1F：5’-TTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCG-3’，

KE1R：5’-TTTGGCGCGCCCCGAAGGCGTCTGCGAAGCTCT-3’；

KE2F：5’-TTTGGCGCGCCAGTGGTCTTTGATCATCTTCGGGATACGC-3’，

KE2R：5’-TTTGGCGCGCCATAATTGAATCCATTGGGAGCCGTAGCA-3’；

KE3F：5’-TTTGGCGCGCCGGGAAGCCGGATTAAGGACAAGCTAG-3’，

KE3R：5’-TTTGGCGCGCCATCCAGCACCTGTATTATCCCATAGTTGAA-3’；

KE4F：5’-TTTGGCGCGCCGGCGATGGATAGCTGAAGGTTTTG-3’

KE4R：5’-TTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG-3’。

分别用重叠区域合适的限制性内切酶双酶切目标片段KE1、KE2和KE3，获得2.5kb大小的双酶切片段KpnI-KE1-MluI-、4.7kb大小的双酶切片段MluI-KE2-ApaI-和5.3kb大小的双酶切片段ApaI-KE3-AscI-，并依次连接入改造后含有Asc1酶切位点的的表达载体pCAMBIA1300Asc1中，获得导入候选基因Pike-1全长基因组片段的的双元表达载体pCAMBIA1300IAscI-Pike-1。同样选用重叠区域合适的限制性内切酶双酶切目标片段KE3和KE4，获得5.9kb大小的双酶切片段AscI-KE3-BspHI-和4.6kb大小的双酶切片段BspHI-KE4-AscI-，并依次连接入改造后含有Asc1酶切位点的表达载体pCAMBIA1300Asc1中，获得导入候选基因Pike-2全长基因组片段的的双元表达载体pCAMBIA1300AscI-Pike-2。

实施例5稻瘟病新抗性基因Pike的转化与转基因植株的抗性鉴定

将感病品种日本晴的成熟种子在诱导培养基上诱导愈伤组织，并将2个双元表达载体pCAMBIA1300AscI-Pike-1和pCAMBIA1300AscI-Pike-2分别导入到农杆菌菌株EHA105。把两个含有目的基因转化载体的EHA105菌株分别在LB固体琼脂培养基28℃培养36h，分别收集在100μmol/L的乙酰丁香酮的悬浮培养基中，28℃振荡培养至OD₆₀₀值为0.5-0.6。取OD₆₀₀值均达到0.5-0.6的已导入表达载体pCAMBIA1300AscI-Pike-1和pCAMBIA1300AscI-Pike-2的2种农杆菌菌液，按照1:1体积比混匀。将水稻愈伤组织浸入菌液30分钟，吸干愈伤组织表面的菌液并转移到共培养培养基上培养，19-22℃黑暗培养2-3天。取出共培养的愈伤组织，用大量已灭菌的去离子水洗涤直至愈伤组织表面看不到农杆菌，将愈伤组织转移到含有400ppm羧苄青霉素(CN)的无菌水中，浸泡30min，每隔5min，轻轻摇晃1min。将愈伤组织转移到已灭菌的滤纸上吸水，再转移到新的已灭菌的滤纸上风干。将表面风干的愈伤组织转移到含有潮霉素、卡那霉素和羧苄青霉素的选择培养基上进行筛选，26-28℃黑暗培养，筛选2次。第一次筛选羧苄青霉素浓度为500ppm，第二次为400ppm。潮霉素和卡那青霉素的浓度均为50mg/L。第一次筛选培养时间为10天左右，第二次筛选培养至长出新的阳性愈伤。转移新的阳性愈伤组织至含有潮霉素浓度为50mg/L的分化培养基中进行分化出转基因苗，获得了85株转基因苗，其中，14株表现为抗稻瘟病，71株表现为感病。

分别用Pike-1和Pike-2的基因特异性引物TR-KE1F/R和TR-KE2F/R对转基因苗进行PCR检测。引物序列如下：

TR-KE1F：5’-GCATGGATTATCCTCTCCAGTTCCG-3’，

TR-KE1R：5’-GGTTGCAATCGCCGGTGACC-3’；

TR-KE2F：5’-AACAAAGTAGACGAGCAAGTCCCTG-3’，

TR-KE2R：5’-CTTGGAGATGGAGTGATGAGGGTAG-3’。

检测结果证明，14株表现为抗病的T₀代转基因苗均导入候选基因Pike-1和Pike-2，在71株表现为感病的T₀代转基因苗中，有30株含导入候选基因Pike-1，41株导入候选基因Pike-2，见表5和图7。

表5Pike基因的遗传互补实验

^a，T₀代转基因苗接种了对Pike用为非亲和性、对受体品种为亲和性的稻瘟病菌菌株。R，抗稻瘟病；S，感稻瘟病。

上述遗传互补的实验结果表明，抗性基因Pike与Pik基因簇的等位基因一样，有2个基因Pike-1和Pike-2组成才能表现功能。

实施例6Pike的2个组成基因Pike-1和Pike-2的基因结构及其预测蛋白结构

对Pike的2个组成基因Pike-1和Pike-2的DNA序列进行了测序，并利用反转录PCR技术获得了Pike-1和Pike-2的全长cDNA序列并对其进行了测序。Pike基因组DNA长度为17.9kb(包含Pike-1和Pike-2)，Pike-1的基因组核苷酸序列长度为13406bp(SEQ ID NO.1)，Pike-2的基因组核苷酸序列长度为10475bp(SEQ ID NO.2)。Pike-1的全长cDNA序列长度为3683bp(SEQ ID NO.3)，第63-3494核苷酸序列为Pike-1的编码区序列；Pike-2的全长cDNA序列长度为3458bp(SEQ ID NO.4)，第110-3175核苷酸序列为Pike-2的编码区序列。

其中Pike-1的全长cDNA序列含有一个3432bp的开放阅读框。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因由2个内含子和3个外显子组成(图8A)。Pike-1编码一个长度为1143个氨基酸残基组成的多肽，分子量为126.86kDa，等电点为5.8。利用Paircoil2分析表明在该蛋白氨基酸残基146-177处存在1个CC(coiled-coli)结构域。Pike-1蛋白属于CC-NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GLPGGGKTTIAR)位于该多肽291-302的氨基酸残基处，另外在第376-387的氨基酸残基序列(NKKYLIVIDDIW)、第403-417的氨基酸残基序列(DLGGRIMTTGLNSI)和第462-482的氨基酸残基序列(EDNSCYDIVNMCYGMPLALIW)存在激酶2a(kinase 2a)、激酶3a(kinase 3a)和motif 3(GLPI)3个基序。在多肽的C端区域处(634-1040氨基酸残基序列)包含了16个不规则的LRR重复，紧随其后存在一个103碱基长度的C末端非LRR区域(CtNL)(图8B)。Pike-1编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

另一个组成基因Pike-2的全长cDNA序列含有一个3066bp的开放阅读框，通过比较基因组DNA和cDNA序列，Pike-2由2个长度为992bp、2074bp的外显子和1个长度为163bp的内含子组成(图9A)。推断出Pike-2编码一个长度为1021个氨基酸残基组成的多肽，分子量为114.59kDa，等电点为8.58。在其N端的第184-609的氨基酸残基序列为NBS结构域，结构域中包含6个经常在NBS结构域存在的基序，在第206-221的氨基酸残基序列(VLSIVGFGGVGKTTIA)、第323-340的氨基酸残基序列(LEQLLAEKSYILLIDDIW)和第358-370的氨基酸残基序列(GGRIIVTTRFQAV)分别构成了激酶kinase 1a、激酶kinase 2a和激酶kinase 3a，在第415-433的氨基酸残基序列(EQVPEEIWKICGGLPLAIV)、第488-500的氨基酸残基序列(CLLYLSIFPKGWK)和第553-565的氨基酸残基序列(KTFQVHDMVLEYI)构成motif 3(GLPI)、RNBS-D和MHDV 3个基序。在多肽的C端区域处存在13个不完善的LRR重复。用生物软件Paircoil2分析Pike-2的多肽结构，发现在氨基酸碱基27-53处存在1个CC结构域，抗病基因Pike-2属于CC-NBS-LRR类抗病基因(图9B)。Pike-2编码多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

实施例7转化Pike基因产生的抗性植株的应用

将Pike-1和Pike-2基因分别克隆到植物转化载体pCAMIBIA1300Asc1，并分别导入农杆菌菌株EHA105中，转化后菌液混合后，用于转化感病的水稻品种日本晴，获得了85株转化植株，其中14株同时转入Pike-1和Pike-2基因的转基因植株表现抗性反应，见表5和图7。这说明可以用Pike基因转化水稻品种，经过自交、纯化选择等一系列育种程序之后，即可产生抗病品种而应用于生产。

实施例8Pike等位基因氨基酸序列的比对及SNP的鉴定

通过常规的PCR扩增、测序(上海英骏生物技术有限公司)，从7个抗病品种湘早143(Pike)、IRBLk-Ka(Pik)、IRBLkh-K3(Pikh)、IRBLkm-Ts(Pikm)、IRBLkp-K60(Pikp)、IRBLks-S(Piks)、C101LAC(Pi1)中获得相应的Pike等位基因编码区DNA序列，并推测出其氨基酸序列，利用多序列比对软件序列进行比对分析，鉴定到存在于Pike-1的cDNA序列第1328位点的功能特异性SNP和存在于Pike-2的cDNA序列第3017位点的功能特异性SNP。在1328位点处，Pike-1编码443位氨基酸为色氨酸(W)，而其他等位基因在该位点则编码丝氨酸(S)，因此，此位点可以将Pike与其它等位基因区分开(图10A)。同样的，在3017位点处，Pike-2编码443位氨基酸为天冬氨酸(D)，而其他等位基因在该位点则编码缬氨酸(V)，因此，该位点可以将Pike与其它等位基因区分开(图10B)。同时，日本晴中的候选基因Pike5-N和Pike6-N被重新命名为Pike-1-NP和Pike-2-NP，通过氨基酸序列比较发现，湘早143的候选基因Pike-1与感病材料日本晴中的等位基因Pike-1-NP同源性相对较低，相似度分别为61.8％。湘早143的候选基因Pike-2与感病材料日本晴中的等位基因Pike-2-NP进行氨基酸序列比较，同源性相对较高，达到99.9％。

实施例9Pike基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用

利用本发明提供的Pike基因的2个SNP位点，再根据dCAPS标记的原理(Neff et al.,2002.Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.Trends Genet 18:613-615)，在Pike-1的基因组DNA序列的SNP位点上游100-250bp处设计功能性上游引物d-G1328C F，如SEQ ID NO.7所示；在上述SNP位点处设计带有错配碱基的功能性引物d-G1328C R，如SEQ ID NO.8所示。在Pike-2的基因组DNA序列的SNP位点处设计带有错配碱基的功能性引物d-A3017T F，如SEQ ID NO.9所示；在该SNP位点下游100-250bp处设计功能性下游引物d-A3017T R，如SEQ ID NO.10所示。利用这2组引物对携带有Pike基因以及其他等位基因的品种基因组DNA模板进行扩增。

引物如下：

d-G1328C-F：5’-CGATGACATTTGGCATTGGGAAGA-3’(SEQ ID NO.7)，

d-G1328C-R：5’-CTTTGTTGCTATCCCCCAAGACATC-3’(SEQ ID NO.8)；

d-A3017T-F：5’-AAGTTCCTTGTAAATGATTTGAACG-3’(SEQ ID NO.9)，

d-A3017T-R：5’-ATGGTACGTTGTAGCAATATGC-3’(SEQ ID NO.10)。

dCAPS标记d-G1328C与d-A3017T的PCR扩增反应体系如下：

PCR扩增反应温度循环如下：95℃预变性，5分钟；95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸45秒，32个循环；72℃延伸10分钟；4℃保存。

PCR反应结束后，利用限制性内切酶TaqαI对利用引物d-G1328C F/R所获得的PCR扩增产物进行酶切，利用限制性内切酶AclI对利用引物d-A3017T F/R所获得的PCR扩增产物进行酶切。反应体系如下：

限制性内切酶TaqαI在65℃、限制性内切酶AclI在37℃条件下分别酶切相应的PCR产物30分钟，取适量酶切样品在4％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为130伏、40-60分钟。引物d-G1328C F/R和d-A3017T F/R扩增得到的PCR扩增产物大小分别为205bp和218bp，酶切后所得到的产物大小为181bp(图11A)和195bp(图11B)，不能被酶切的即为抗性基因Pike-1和Pike-2的功能性分子标记扩增产物。这2对等位基因特异性的分子标记也可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用，以提高育种的目的性和效率(图11)。

Claims (9)

1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pike，其特征在于：包括Pike-1和Pike-2，Pike-1和Pike-2的基因组核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pike编码的蛋白，其特征在于：Pike-1和Pike-2的全长cDNA序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pike编码的蛋白，其特征在于：Pike-1和Pike-2编码的蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

4.权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pike产生的dCAPS分子标记，其特征在于：扩增Pike-1基因产生的dCAPS分子标记的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，扩增Pike-2基因产生的dCAPS分子标记的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

5.权利要求1所述的基因Pike、权利要求2所述的蛋白或权利要求3所述的分子标记在抗稻瘟病水稻品种育种或鉴定中的应用。

6.权利要求1或2所述的基因Pike或权利要求2所述的蛋白在提高植物对稻瘟病菌的抗性中的应用。

7.一种提高植物对稻瘟病菌的抗性的方法，其特征在于：所述的方法为将权利要求1所述的基因Pike转入到植物中。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：通过将权利要求1所述的基因Pike连接到植物表达载体上，通过农杆菌转化方法将Pike导入到植物中；或将含有权利要求1所述的基因Pike的植株或种子通过有性杂交的方式将Pike转入到植物中。

9.一种利用权利要求4所述的分子标记鉴定水稻是否含有权利要求1所述的基因Pike的方法，其特征在于包括如下步骤：利用权利要求3中所述的2组引物对水稻DNA模板进行PCR扩增；序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的引物扩增的产物用TaqαI进行酶切，序列SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的引物扩增的产物用AclI进行酶切；扩增产物不能被酶切的即含有权利要求1所述的基因Pike。