CN102311491A

CN102311491A - 一种植物抗热基因hsf1及其应用

Info

Publication number: CN102311491A
Application number: CN2010102228442A
Authority: CN
Inventors: 何玉科; 孙传宝
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2030-07-08
Also published as: CN102311491B; WO2012005589A1

Abstract

本发明涉及一种植物抗热基因HSF1及其应用。本发明人首次在芸苔属植物中分离到一种新的植物抗热基因，其可显著提高植物的热耐受能力。本发明还提供了所述基因编码的蛋白及其制备方法，含有所述基因的载体和宿主细胞，制备携带所述基因的转基因植物的方法。

Description

一种植物抗热基因HSF1及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物抗热基因HSF1及其应用。

背景技术

白菜类蔬菜主要包括结球类大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis)和不结球类小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis)。小白菜简称青菜，北方称油菜，其适应性强，生长快，产量高，营养好，消费量居各类蔬菜之首，是我国长江流域各省普遍栽培的一种大众化蔬菜。小白菜种类和品种繁多，生长期短，适应性广，高产，省工，易种，可周年生产供应。产品鲜嫩、营养丰富，为广大消费者所喜爱。其年产量占蔬菜总产量的30-40％，对补充蔬菜淡季、实现周年均衡供应贡献很大。大白菜和小白菜特性都为喜凉性，一年四季均可生产，生长最适温度为15～20℃。近年来，为了适应市场的需要，集约栽培是白菜类蔬菜生产的主要特点。为了保证白菜类蔬菜一年四季的均衡生产和供应，小白菜常需一年四季采用不同的方式进行生产。以往主要在春冬季生产小白菜，开始在较炎热的夏秋季采取各种栽培方式种植小白菜，无疑在其生育期内，尤其是春末、夏季和早秋往往会受到高温逆境的胁迫。高温季节栽培小白菜在20天以后即可分批上市，但高温障碍往往使小白菜植株节间拉长、生长缓慢、味苦、纤维含量明显增加等，常常导致产量低、品质差，市场价格上扬，供不应求，不能满足居民的消费需求。大白菜对炎热的高温忍耐力不强，特别在莲座期和结球期对温度要求严格，平均温度过高心叶就不能抱合，不能结球，即使勉强结球，也比较松散。夏季田间自然条件下，形成正常的叶球是耐热大白菜生产的先决条件，田间自然高温条件下的结球性是鉴定大白菜耐热性的标准。

大白菜和小白菜原产我国，国外对白菜类蔬菜的育种研究较少，从日本、韩国及我国台湾地区引进的品种耐热性差，不适宜在我国夏季生长和推广。国内所选育的品种主要为秋季抗病品种，白菜类蔬菜耐热基因库窄，耐热白菜品种选育仅局限于白菜材料之间的筛选，选出的品种耐热性、抗逆性不够理想。鉴于上述情况，我国育种家采用传统的育种方法广泛开展耐热白菜类蔬菜品种的选育工作，引进耐热基因，扩大资源来源途径，一定程度提高了白菜类蔬菜耐热能力，在生产上已经发挥了作用。然而，目前推出的是适合当地气候条件的为主要依据的评价耐热性的方法，且其依据主要是植物在高温胁迫下表现出形态结构的变化。这一方法在温带地区很难创造选择压力适宜的田间环境，即使选出耐热性单株，要将耐热性状保存到第二年春采种，需要采用一系列的较为繁杂的方法和措施，筛选周期长，且有地域性限制，不能将耐热品种广泛推广到其他地区。因此对白菜类蔬菜苗期热害症状的发生发展变化规律进行深入的研究，建立易于操作，结果稳定，效率较高的具有广泛推广性的苗期抗热性筛选方法和技术是白菜类蔬菜抗热育种工作亟需解决任务。与白菜抗热密切相关的性状属于数量性状，对其数量性状的基因型进行选择是非常困难的。针对分子育种，这种难度不仅表现在可利用于辅助选择的DNA标记不多，且QTL(Quantitative Traits Loci，数量性状位点)在数目和作用上变化较大。因此，在白菜基因组测序工作尚未完成，功能基因组研究方兴未艾的情况下，遗传育种学家需要寻找一种快速、敏感、高效的，在植株水平上各性状和DNA定性分析技术，以及植株水平上表型和基因表达变化的定量分析技术，用以白菜类蔬菜抗热育种研究。

近年来分子生物学研究发展迅速，尤其是基因芯片技术在作物分子育种上的应用也越来越广泛。基因芯片技术是20世纪90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。基因芯片是将大量特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，形成DNA微阵列。样品DNA或RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，然后探针再与已经标记过的样品分子进行杂交，最后通过荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号做出比较和检测，通过检测到的每个探针分子的杂交信号强弱，进而快速的获取样品分子在数量和序列方面的信息。目前，基因芯片技术已广泛应用于药物筛选、农业、疾病诊断和治疗、中药物种鉴定、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。关于基因芯片技术在植物中应用的报道并不多，主要集中在拟南芥、草莓、牵牛花等方面。在基因芯片应用上，基因表达水平的分析与检测是目前研究最多、最为成熟的领域。由于芯片上可以固定成千上万的探针，使众多基因同时检测成为可能，不仅可以比较在不同条件一个基因组大量基因的转录水平差异，而且可以对比不同基因组中对应基因的转录水平差异，从根本上突破了以前研究中一次只能关注1个或几个基因的瓶颈。因此，本领域需要探索利用芯片技术来开发植物抗热相关的基因的方法，以期获得一些有用的植物抗热相关基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物抗热基因HSF1。

本发明的另一目的在于提供所述基因的应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的蛋白，该蛋白是：

(a)SEQ ID NO：3氨基酸序列的蛋白；或

(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个，最佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与SEQ ID NO：3氨基酸序列有至少90％相同性，且具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相同功能的由(a)衍生的蛋白。

在一个优选例中，所述的植物是十字花科植物。

在另一优选例中，所述的十字花科植物选自：芸苔属植物；鼠耳芥属植物。

在另一优选例中，所述的芸苔属植物是白菜(Brassica campestris)。

在另一优选例中，所述的鼠耳芥属植物是拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.)。

在另一优选例中，所述的蛋白来源于芸苔属植物。较佳地，来源于大白菜。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸选自下组：

(i)编码所述的蛋白的多核苷酸；或

(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种植物，其包含前面任一所述的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种所述的蛋白的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的蛋白。

在本发明的另一方面，提供所述的蛋白或其编码基因的用途，用于提高植物的抗能力；或用于提高植物中HSP70基因的表达。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物的抗热能力的方法，该方法包括：提高植物中所述的蛋白的表达或活性。

在一个优选例中，所述方法包括：将编码所述的蛋白的多核苷酸转入到植物基因组中。

在另一优选例中，所述方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的蛋白的编码序列；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述蛋白的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(3)选择出转入所述蛋白的编码序列的植物细胞、组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。

在本发明的另一方面，提供一种由前述方法制备获得的转基因植物。

在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗热能力的分子标记物，所述的分子标记物是引物对，具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、RT-PCR分别分析BcpHSF1和其下游基因AtHSP70表达模式。WT-野生型拟南芥；OE-line1和OE-line2表示BcpHSF1过表达转基因植株。培养14天的拟南芥植株在42℃热处理30分钟，提取植株总RNA，电泳检测。ACTIN为对照。gDNA表示基因组DNA。28c表示PCR进行了28个循环；26c表示PCR进行了26个循环；20c表示PCR进行了20个循环。

图2、BcpHSF1过表达转基因植株35S::BcpHSF1的提高了抗热能力。

A，BcpHSF1过表达转基因植株35S::BcpHSF1(OE-line1和OE-line2)的热处理条件生长状态，7天苗龄幼苗的野生型和转基因植株44℃处理1小时，然后恢复22℃生长，7天后拍照。

B，与野生型相比，两个转基因株系植株(OE-line1和OE-line2)存活率都明显上升。热处理条件同A。数据为五组试验的平均值。

图3、BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)的结构域分析。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，利用芯片技术来开发植物抗热相关的基因，首次在芸苔属植物中分离到一种新的植物抗热基因，其可使得植物具有更好的热耐受能力。本发明人将该基因命名为“BcpHSF1”。基于该基因，可制备抗热能力增强的转基因植物。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、棉花、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜，十字花科鼠耳芥属植物，禾本科的水稻，此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的植物抗热蛋白(多肽)”、“分离的提高植物抗热能力的多肽”、“分离的BcpHSF1蛋白”或“分离的BcpHSF 1多肽”是指BcpHSF1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化BcpHSF1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括BcpHSF1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的BcpHS F1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“BcpHSF1蛋白”指具有提高植物抗热能力的功能的SEQID NO：3序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗热能力的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括BcpHSF1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与BcpHSF1蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗BcpHSF1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含BcpHSF1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了BcpHSF1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有BcpHSF1蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供BcpHSF1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然BcpHSF1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“BcpHSF1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多20个，较佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明BcpHSF 1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码BcpHSF1蛋白的多聚核苷酸。

本发明的BcpHSF 1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或BcpHSF 1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的BcpHSF1蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码BcpHSF1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，BcpHSF1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BcpHSF1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的BcpHSF1蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗BcpHSF1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组BcpHSF1蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激BcpHSF1蛋白功能的多肽分子。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用BcpHSF1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测BcpHSF1蛋白的转录产物。

本发明还涉及一种改良植物(提高植物的抗热能力)的方法，该方法包括提高所述植物中BcpHSF1基因的表达或蛋白活性。

增加BcpHSF1基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带BcpHSF1编码基因的表达构建物使植株过表达BcpHSF1；或可通过用强启动子驱动从而增强BcpHSF1基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该BcpHSF1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。

作为本发明的一种优选方式，获得BcpHSF 1蛋白高表达的植株的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有BcpHSF1蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该BcpHSF1蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述BcpHSF1蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

本发明还包括BcpHSF1蛋白或其编码基因的激动剂。由于BcpHSF1的激动剂可调节BcpHSF1的活性或表达，因此，所述的BcpHSF1的激动剂也可通过对BcpHSF1的影响来提高植物的抗热能力，从而达到性状改良的目的。

所述的BcpHSF1的激动剂是指任何可提高BcpHSF1的活性、维持BcpHSF1的稳定性、促进BcpHSF1表达、延长BcpHSF1有效作用时间、或促进BcpHSF1的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物的抗热能力，或提高植物中HSP70基因的表达有用的物质。

在本发明的一个实例中，提供了一种BcpHSF1基因，其基因组序列如SEQID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：2所示，编码一个含有435个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：3)。所述的BcpHSF1基因可以为植物的抗逆境改良提供新的途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

I、材料与方法

材料

大白菜99Bre(即：B热大白菜)种子，热敏小白菜HS种子获自上海农业科技种子有限公司。Col为拟南芥野生型，获自中国科学院遗传发育研究所。

植物组织总RNA提取

试剂：TaKaRa RNAiso Reagent抽提试剂盒。

步骤：

a)将材料于液氮中充分研磨，以100mg材料/ml抽提缓冲液的量加入样品中，充分混匀，室温静置10分钟。

b)13000rpm离心5分钟，将上清转入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温静置10分钟使其分层。

c)13000rpm离心5分钟，小心吸取上清于新的离心管中。

d)加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10分钟。

e)13000rpm离心5分钟，弃上清后用1ml 75％(v/v)乙醇洗一次。

f)7800rpm离心5分钟，弃上清后低速离心，用枪头吸去残留液体，室温晾干，待RNA刚刚干燥后加入适量的无RNase的水，65℃10分钟充分溶解后存于-70℃。

半定量RT-PCR

RT-PCR引物如下：

BcpHSF1：

正向：5’CCACGTTACTTCAAGCATAGCA 3’(SEQ ID NO：4)；

反向：5’AGCTACAAGCACACCATGATCC 3’(SEQ ID NO：5)。

AtHSP70：

正向：5’GGTTGAGTTGGAAGGCCCTAA 3’(SEQ ID NO：6)；

反向：5’TTGCCTTGATAGGTGCTGATA 3’(SEQ ID NO：7)。

ACTIN：

正向：5’TGGCATCAYACTTTCTACAA 3’(SEQ ID NO：8)；

反向：5’CCACCACTDAGCACAATGTT 3’(SEQ ID NO：9)。

试剂如下：

AMV反转录酶(TAKARA)；

RNase抑制剂(TAKARA)；

DNase I(RNase free)(TAKARA)。

步骤如下：

a)分别提取不同热处理的大白菜叶片的总RNA，用DNase I(RNase free)处理30分钟之后酚氯仿抽提，沉淀，吹干，用无RNase的水溶解。

b)测OD260及电泳定量后，取1μg总RNA，按说明书操作，42℃反应1小时，94℃5分钟以使反转录酶失活。

c)一倍稀释反转录产物后各取1μl做PCR。PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，25-28个循环；72℃5min。为校正用于RT-PCR反应的模板量，以Actin的引物进行平行PCR反应作为内对照。

CTAB法植物组织总DNA的提取

试剂如下：

2×CTAB缓冲液(100ml)：10ml 1M Tris pH 8.0；4ml 0.5M EDTApH8.0；8.19g NaCl；2g CTAB；1g PVP K30定容至100ml。

1×CTAB缓冲液(100ml)：5ml 1M Tris pH 8.0；2ml 0.5M EDTApH8.0；1g CTAB定容至100ml。

高盐TE(100ml)：1ml1M Tris pH 8.0；200μl 0.5M EDTA pH8.0；5.844g NaCl定容至100ml。

10％(w/v)CTAB(50ml)：5g CTAB；2.045g NaCl定容至50ml。

步骤如下：

a)取5g植物材料液氮中研磨粉末后转入40ml离心管中。

b)加入15ml 65℃预热的2×CTAB缓冲液(1∶1)，上下混匀后于65℃温育10min，其间不断上下颠倒几次。

c)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后11000rpm离心5min。

d)吸取上清至新的离心管中，补入1/10体积10％CTAB，然后加入1倍体积的氯仿∶异戊醇，混匀后离心5min。

e)取上清，重复d)步骤2-3次，最后一次离心后将上清转入新的离心管，加入大于2倍体积的沉淀缓冲液(1×CTAB)，温和的混匀，于室温下放置30min。

f)离心并收集沉淀，将沉淀重悬于65℃的5ml高盐TE中，此时可加一些Rnase，37℃温育30min。

g)11000rpm离心10min后将上清转移至新的1.5ml离心管中。

h)加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，离心，弃上清，用70％乙醇洗涤后晾干，溶于100μl TE中。

35S::BcpHSF1基因组DNA载体构建

从基因组扩增BcpHSF1DNA的引物如下：

正向：5’CGACCCACACACAAGTAGTATATAA 3’(SEQ ID NO：10)；

反向：5’TCACAGTTGCTTTGTCTCTGAAG 3’(SEQ ID NO：11)。

步骤如下：

a)用PCR的方法从B热大白菜基因组总DNA中分离BcpHSF1基因组片段。

b)用Kpn I单酶切出该片断，克隆到pCAMBIA1300载体(pCAMBIA1300初始载体获自CAMBIA公司)上(PCR片段连在35S和Nos中间)，因是单酶切，存在两种方向(正向和反向)的连接，测序验证。

c)利用冻融转化方法将pCAMBIA1300-HSF 1正向基因载体导入农杆菌GV3101(购自Invitrogen)中，并PCR鉴定。

冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

a)从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取GV3101单菌落，转到20ml LB液体培养基(rif 50mg/l，GM 5050mg/l)中，于28℃250rpm振荡培养过夜(不可太浓)。(下面全部操作均在无菌条件下进行)。

b)冰浴20分钟后，将菌液分装5ml的离心管(每管4ml)中，冰浴10分钟。

c)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃菌液。

d)每管加入1ml充分预冷的20mM CaCl₂以重悬菌体。冰浴10分钟。

e)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清。

f)每管加入300μl 20mM CaCl₂(视菌体浓度而定)，合并后分管于1.5ml的离心管中。

g)每管加入1μl质粒或所有连接产物，冰浴5分钟，再放入液氮中4-5分钟。

h)37℃放5分钟，每管加入400μl LB培养基于28℃温育2小时使细菌复苏，并表达相应的抗生素抗性基因。

i)各取200μl体积涂板，室温放置一会儿，于28℃培养。

浸花法转化拟南芥及筛选

试剂：

转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl2(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；Silwet L-77：400μl(真空抽滤则用200μl)；用KOH调至pH5.8，定容1L。

筛选培养基平板：3％(w/v)蔗糖MS0固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l(用于Nossen背景拟南芥的筛选)。

步骤：

a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时可以进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

c)将已培养过夜的农杆菌1∶100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

d)拟南芥的地上部分完全浸入菌液中30秒，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化两天后移到组培室，卡那抗性苗移到土中继续生长。

f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

真空抽滤法转化白菜及筛选

(1)大白菜的转化

a)将大白菜种子放在浸湿水的滤纸上4℃春化2个月(经过春化的大白菜可在小苗期抽薹开花，便于转化)，然后把下胚轴已伸长的大白菜小苗移入土中，待其抽薹并开第一朵花时可以进行转化。转化前要将土壤浸湿过夜。

b)含农杆菌的转化液的准备同拟南芥转化方法。

c)将大白菜的地上部分倒置并完全浸入菌液中，放在带真空泵的干燥器中，真空抽5分钟两次(2分钟间隔)至大白菜的叶片透明化，放气后取出植株平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日将大白菜移栽入大盆中，正常培养。开花期于蕾期人工授粉，套袋。收种子后干燥2周。

d)经无菌消毒的大白菜种子于无菌滤纸上吸干水，用镊子转入含Kan 50mg/l培养基的三角瓶中。4℃春化2到3天，移入恒温室培养。

e)大白菜的转化子要等到真叶长出才能鉴别出来：绿色的真叶，根正常发育。而非转化子的大白菜真叶为白色，无根。待转化子长出3-4片真叶后，经过3天炼苗后可以移入土中。

(2)小白菜的转化

同样地，也采用真空抽滤法转化小白菜，转化方法以及转化条件与大白菜的转化相同。

II、实施例

实施例1、基因的获得

植物体基因表达具有时空特异性，即在不同的时间、空间条件下，有不同的功能基因表达。本发明人通过从不同热处理的白菜植株提取mRNA并与含有代表白菜所有功能基因的芯片进行杂交，测知不同热处理条件下白菜样品中功能基因的表达情况。常规检测基因表达的方法需要大规模测序，一次仅能检测少量基因表达而且检测灵敏度较低，采用基因芯片技术不仅可以高敏感定量、定性检测基因表达水平，而且能同时研究同一样品中成千上万个基因的表达情况。利用基因芯片技术不仅可以缩短筛选周期，且获得试验结果稳定性好，筛选目的性强，具有普遍推广和应用的价值。

另外，AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)技术是一种选择性扩增限制性片段的新型分子标记，这种方法已广泛应用于蔬菜作物的遗传图谱构建、遗传多样性和物种亲缘关系分析、重要基因的定位、基因的表达调控研究、蔬菜作物品种的指纹图谱构建及杂种纯度鉴定、分子标记辅助选择等研究领域。

为了满足夏秋季抗热白菜栽培需要，本发明人通过基因芯片技术对白菜抗热基因进行了筛选，结合cDNA-AFLP技术，筛选到一个白菜类蔬菜抗热基因，并获得过表达该基因的转基因株系。

本发明获得的基因“BcpHSF1”来源于大白菜，其基因组序列如SEQ ID NO：1所示，其CDS序列如SEQ ID NO：2所示；编码一个435aa的蛋白“BcpHSF1”(SEQ ID NO：3)。

实施例2、RT-PCR检测候选抗热基因在热处理后的表达

为了鉴定抗热基因功能，本发明人构建了35S启动的过表达植物载体35S::BcpHSF1(pCAMBIA1300-HSF1)，并转化到拟南芥，获得转基因植株OE-line 1和OE-line2。

为了检测抗热基因在热处理条件下的表达模式，本发明人用RT-PCR测定基因表达水平。见图1，结果发现，转基因植株35S::BcpHSF1的BcpHSF1其下游靶基因HSP70在热处理后均强烈表达。

实施例3、抗热基因转基因拟南芥植株表型

本发明人使用一个热处理系统来验证转基因拟南芥植株表型。用7天苗龄幼苗在44℃处理1个小时，45℃处理3个小时以及46℃处理2.5个小时。与野生型相比，转基因植株35S::BcpHSF1更能忍受热压力，见图2。

实施例4、热处理后转基因大白菜及小白菜植株表型

本发明人使用一个热处理系统来验证转基因大白菜及转基因小白菜植株表型。转基因植株种子经催芽后，播种于塑料培养钵中，在25℃适宜温度下培养幼苗。当4-5片真叶展开时，选取生长状态一致的幼苗置于生长箱内进行高温处理，温度设定为32℃，处理10天，然后恢复25℃生长2天，计算热害指数并对数据进行分析。确定以叶片皱缩反卷程度、叶片失绿程度、植株生长滞缓程度、植株萎蔫死亡程度等作为热害的代表症状。

叶片皱缩反卷：轻度A、中度A+、严重A++；

叶片失绿程度：轻度B、中度B+、严重B++；

植株生长滞缓：轻度C、中度C+、严重C++；

植株萎蔫死亡：轻度D、中度D+、严重D++。

试验结果表明，转基因大白菜植株热害症状均在轻度范围，即ABCD，对照植株(野生型大白菜，B热大白菜)热害症状均为严重，即A++B++C++D++。

试验结果表明，转基因小白菜植株热害症状均在轻度范围，即ABCD，对照植株(野生型小白菜，热敏小白菜HS)热害症状均为严重，即A++B++C++D++。

可见，与野生型大白菜或小白菜相比，转基因大白菜或小白菜植株更能忍受热压力。

实施例5、BcpHSF1蛋白的结构域分析、其变体及功能

本发明人分析了BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)的结构域，如图3所示。结果发现，其中第38-132位为保守的HSF DNA结合结构域，该结构域是蛋白发挥抗热作用的关键性位点。

基于以上分析，本发明人建立了多个BcpHSF1蛋白的变异体序列，依次如下：

基于BcpHSF 1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中第7位氨基酸由A变异为V，获得BcpHSF1-M1变体。

基于BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中第428位氨基酸由L变异为I，获得BcpHSF1-M2变体。

基于BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中第292位氨基酸由S变异为T，获得BcpHSF1-M3变体。

基于BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中第422-435位氨基酸缺失，获得BcpHSF1-M4变体。

基于BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中第2-3位氨基酸缺失，获得BcpHSF1-M5变体。

基于BcpHSF1蛋白(SEQ ID NO：3)序列，其中C末端添加4个氨基酸ATAA，获得BcpHSF1-M6变体。

首先将SEQ ID NO：2所示的BcpHSF1基因的CDS序列克隆入pCAMBIA1300载体的Kpn I位点中，获得含有该CDS的重组载体。然后根据以上设计的蛋白变体序列，利用常规的定点突变技术，分别对重组载体中编码相应位点氨基酸的碱基进行碱基突变或碱基缺失或碱基添加，获得含有相应的变体的重组载体。

将以上构建的重组载体转入农杆菌中，并转化拟南芥，分别获得拟南芥转基因植株M1-Line1、M1-Line2；M2-Line1、M2-Line2；M3-Line1、M3-Line2；M4-Line 1、M4-Line2；M5-Line 1、M5-Line2；M6-Line 1、M6-Line2。

采用热处理系统来验证这些转基因拟南芥植株表型。用7天苗龄幼苗在44℃处理1个小时，45℃处理3个小时以及46℃处理2.5个小时。与野生型相比，这些转基因植株显著地更能忍受热压力。

综上，大白菜BcpHSF1或其变体是非常有效的抗热基因，可以用于改进作物抗热能力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。