CN102660556A - 小麦生长素合成基因TaYUCCA1序列及其应用和植物表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一小麦生长素合成基因TaYUCCA1，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。将该基因的全长cDNA序列置于CaMV 35S启动子之后，构建植物表达载体pROK2-TaYUCCA1，转化拟南芥，使该基因在拟南芥中过量表达。实验证实，与野生型拟南芥相比，转基因拟南芥表现下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状。如将该基因转化小麦、水稻、玉米等农作物、需要改变株型的花卉植物或其它植物，改变其株型，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会效益。

Description

小麦生长素合成基因TaYUCCA1序列及其应用和植物表达载体

技术领域

本发明涉及一种来源于小麦(Triticum aestivum L.)的新型生长素合成基因TaYUCCA1的序列、含有这个基因的载体和利用这个基因改变植物株型的方法，属于分子生物学和生物技术领域。

背景技术

高等植物株型形成，包括植物整个生长发育过程中与植株形态相关器官的发生，尤其是指分枝、叶片和花器官的形成、形状与着生位置等。生长素和细胞分裂素等植物激素是调控高等植物株型的重要因素(Wang and Li，2008)。小麦、水稻等农作物的育种目标是要“构想”出优质超高产的理想株型。YUCCA基因编码类黄素单加氧酶(flavinmonooxygenase-like enzyme，FMO)，该酶催化色胺转化为羟基色胺，是植物依赖于色氨酸的生长素IAA(indole-3-acetic acid)合成途径中的限速酶，它的过量表达可导致生长素的过量合成(Zhao et al.，2001)。Zhao等(2001)分离的拟南芥生长素合成显性突变体yucca表现出顶端优势增强、下胚轴和叶柄伸长、子叶着生偏上及叶片细长等形态特征。突变体中YUCCA1基因表达升高，气谱-质谱(GC-MS)联用分析表明突变体植株游离态IAA含量相应地升高。在YUCCA基因家族中，YUCCA2、YUCCA4和YUCCA6与YUCCA1同源性较高，过量表达YUCCA2、YUCCA4或YUCCA6的转基因植物表型与yucca1(35S::YUCCA1)类似，而单基因功能缺失突变体均未表现出发育异常。在yuc1yuc4、yuc2yuc6双突变体、所有的三突变体以及四突变体中均出现严重的发育缺陷，表现为顶端优势丧失、株高下降、叶片扭曲、育性下降、花器官和维管束发育异常，四突变体表型尤为明显。结果表明YUCCA基因功能丧失带来生长素合成下降，从而对植物株型发育产生重要影响(Cheng et al.，2006)。

YUCCA基因家族的直接同源体在众多物种上都有发现。拟南芥基因组中，YUCCA家族包括11个成员(Zhao et al.，2001；Cheng et al.，2006)。在水稻基因组中鉴定出7个OsYUCCA基因(OsYUCCA1-7)，其中OsYUCCA1主要在茎尖生长点部位表达，对水稻生长素IAA的合成起主要作用(Yamamoto et al.，2007)。Gallavotti et al.(2008)克隆到玉米YUCCA类基因spil，该基因的缺失可以出现明显的表型异常，导致玉米雄穗分枝少、雌穗小、籽粒少。不同物种的YUCCA基因功能的缺失，都可产生分枝、叶发育、花发育等的变异。

小麦是世界上重要粮食作物之一，人口的增长迫切需要通过小麦改良来提高产量。小麦育种的主攻目标是培育出优质超高产的理想株型。目前尚无小麦生长素合成基因的报道。

该基因以及其转基因策略的应用，对于培育更加合理株型的优良小麦品种具有重要的理论和实践意义。对于调节其他植物的株型也具有重要的现实意义。

经检索，国内外文献和专利中尚没有关于该小麦生长素合成基因TaYUCCA1的报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种小麦生长素合成基因TaYUCCA1，同时提供一种该基因在获得株型改变的转基因拟南芥中的应用，并应用于生产其它具有明显株型改变的转基因植物。

本发明提供的核苷酸序列及氨基酸序列来自小麦。

本发明根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCA1-7)和小麦的EST序列设计引物，利用聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因克隆等技术，从小麦(Triticum aestivum L.)中分离出编码合成生长素的TaYUCCA1基因序列，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。具体方法如下：

本发明根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCA1-7)和小麦的EST序列，设计一对引物；从小麦幼苗中提取小麦基因组DNA；从小麦幼苗中提取总RNA，然后反转录成cDNA；分别用小麦基因组DNA和cDNA为模板进行常规聚合酶链式反应(PCR)，PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选重组子，进行序列测定。获得了小麦生长素合成基因TaYUCCA1的基因序列和cDNA序列。

该基因TaYUCCA1的基因序列为1448bp，含4个外显子序列，分别为612bp、234bp、123bp和180bp；cDNA序列为1149bp，编码382个氨基酸残基。将TaYUCCA1编码的氨基酸序列与已知的来自拟南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPI1)的YUCCA基因编码的氨基酸序列进行聚类分析表明，TaYUCCA1与拟南芥的YUCCA10和YUCCA11有较高的同源性。该结果表明这个基因为生长素合成基因YUCCA在小麦中的同源基因。

除了提供TaYUCCA1基因序列外，本发明的另一个目的是提供一种改变植株形态的方法，但也包括与生长素参与调控的其它生物学性状的改变。该方法包括用本发明的TaYUCCA1基因的表达载体转化植物。所述转化是通过农杆菌介导的方法进行。所用表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、微注射、电穿孔等导入植物细胞。

该基因的DNA序列如下：

CGCTACGAGT TGTGATGGAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC     60

TCGCAACTGC AGCATGCGTT AGCCAATTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA    120

ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCAACCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA    180

GGGAATTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCAA    240

AGAACACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT    300

ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCAATGG AAAATATTGG TCCATCATGG    360

CGCACGACAT GGCAAAGTGC AAAATAGTTA ATTACAGGGC AAAGTTTCTT GTTGTGGCAA    420

GTGGTAAGAA TAGTGTTGAG AATATTCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAAAC TTTCCGGGTG    480

TGGCCATCCA TTCATCATGT TACAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG AACGTGTTGG    540

TCATCGGATC TGGTAACTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA    600

ATACTTCTAT AATTATACGA AGTCCGGTAT GTATACTATA TGTGACTTTA ACTGCAAATC    660

TCTTTTATAG ATCTTATTTT ATCTTGCATA TTGTAAAAGA TGGTGACCCT TTTGTGACTG    720

CAGATTCATG TAATGACAAA GGAATTAATC CGACTAGGGA TGACACTAGT CCATTATCTT     780

CCACTAAAGA TGATAGATGG TCTCCTTTTG ATGATGGCAA ATGCCGTATT CGGGGACCTC     840

TCTAGGCATG GCATCACAAG ACCAGAAAAG GGTCCATTTG TGCTGAAGTC GGAAACTGGT     900

CGATCCGCAG TGATTGATGT TGGCACCATA GGGTTAATCA AGAAAGACAA AATTAAAGTG     960

AGCATATCCT CGGTCAAACA TACATAGTAT AAGAAATTTA GTTTCATATA TGACAAGTTA    1020

TAGTTTTTAA CCTGCTGTAG GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG    1080

AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA    1140

GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGGTAATAA GATAAACTGA GATTTGAATT TCATGCACTG    1200

TAACTTCTCT AGATGCAAGA CTTGTTATAT GTTCTTAATC GAGTAAGATT TGCAAGTGCA    1260

GAATGATGAG GACATGCTTA ATAGCGATGG CGTGCCCAAG AGGGAATTCC CTAATCATTG    1320

GAAAGGGGCA AATGGGCTCT ACTGTGCCGG GTTAGGGAGA AGGGGATTGG CCGGTATTGC    1380

CATGGATGCT AAGAACATCG CCAATGACAT TAAACGCAGC ATAGACTCTA TGTGCAGCTA    1440

AAATAGCA                                                             1448

该基因的cDNA序列如下：

CGCTACGAGT TGTGGAG GAGGTCGTAG TTTTGATTGT TGGCGCAGGG CCTGCGGGAC                           60

TCGCAACTGC AGCATGCGTT AGCCAATTCT CCATCCCATA TGTCATCGTT GAGCGTGAGA    120

ATTGCAGCGC ATCACTATGG CGCAACCGCA CGTATGACCG TCTGAAGCTA CATCTAGCGA    180

GGGAATTTTG TGAGTTGCCA CACATGCCAT ACCCTGCAGA TACCCCAACA TACATACCAA    240

AGAACACTTT CGTCAAGTAC GTGGATGACT ACATTGAGTG TTTCGCTATC CATACGAGGT    300

ATCTCACTGT TGTTGAGTCA TCCACATATG ACTTCAATGG AAAATATTGG TCCATCATGG    360

CGCACGACAT GGCAAAGTGC AAAATAGTTA ATTACAGGGC AAAGTTTCTT GTTGTGGCAA    420

GTGGTGAGAA TAGTGTTGAG AATATCCCAG TGGTCCCTGG CCTGGAAAAC TTTCCGGGTG    480

TGGCCATCCA TTCATCATGT TATAAGTCAG GCATCGACTA CTCCGGGAGG AACGTGTTGG    540

TCATCGGATC TGGTAACTCT GGGATGGAGA TCGCCTACGA CCTTGCTTCT CATGGTGCCA    600

ATACTTCTAT AATTATACGA AGTCCGATTC ATGTAATGAC AAAGGAATTA ATCCGACTAG    660

GGATGACACT AGTCCATTAT CTTCCACTAA AGATGATAGA TGGTCTCCTT TTGATGATGG    720

CAAATGCCGT ATTCGGGGAC CTCTCTAGGC ATGGCATCAC AAGACCAGAA AAGGGTCCAT    780

TTGTGCTGAA GTCGGAAACT GGTCGATCCG CAGTGATTGA TGTTGGCACC ATAGGGTTAA    840

TCAAGAAAGA CAAAATTAAA GTTCATGGAA GGATTACTAA GATCAAAGGA AAAACAATTG    900

AATTTGAAGG TGGGAAGGAA GCCTCCTTTG ATGCCATTGT GTTTGCAACC GGATACAAAA    960

GCACAACAAA TTCGTGGCTC AAGAATGATG AGGACATGCT TAATAGCGAT GGCGTGCCCA   1020

AGAAGGAATT CCCTAATCAT TGGAAAGGGG CAAATGGGCT CTACTGTGCC GGGTTAGGGA   1080

GAAGGGGATT GGCCGGTATT GCCATGGATG CTAAGAACAT CGCCAATGAC ATTAAACGCA   1140

GCATAGACTC TATGTGCAGC TAAAATAGCA                                    1170

其中透明方框内的为起始密码子，下划线为终止密码子。

该基因编码的氨基酸序列如下：

Met Glu Glu Val Val Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu

1               5                   10                  15

Ala Thr Ala Ala Cys Val Ser Gln Phe Ser Ile Pro Tyr Val Ile Val

            20                  25                  30

Glu Arg Glu Asn Cys Ser Ala Ser Leu Trp Arg Asn Arg Thr Tyr Asp

        35                  40                  45

Arg Leu Lys Leu His Leu Ala Arg Glu Phe Cys Glu Leu Pro His Met

    50                  55                  60

Pro Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Thr Tyr Ile Pro Lys Asn Thr Phe Val

65                  70                  75                  80

Lys Tyr Val Asp Asp Tyr Ile Glu Cys Phe Ala Ile His Thr Arg Tyr

                85                  90                  95

Leu Thr Val Val Glu Ser Ser Thr Tyr Asp Phe Asn Gly Lys Tyr Trp

            100                 105                 110

Ser Ile Met Ala His Asp Met Ala Lys Cys Lys Ile Val Asn Tyr Arg

        115                 120                 125

Ala Lys Phe Leu Val Val Ala Ser Gly Glu Asn Ser Val Glu Asn Ile

    130                 135                 140

Pro Val Val Pro Gly Leu Glu Asn Phe Pro Gly Val Ala Ile His Ser

145                 150                 155                 160

Ser Cys Tyr Lys Ser Gly Ile Asp Tyr Ser Gly Arg Asn Val Leu Val

                165                 170                 175

Ile Gly Ser Gly Asn Ser Gly Met Glu Ile Ala Tyr Asp Leu Ala Ser

            180                 185                 190

His Gly Ala Asn Thr Ser Ile Ile Ile Arg Ser Pro Ile His Val Met

        195                 200                 205

Thr Lys Glu Leu Ile Arg Leu Gly Met Thr Leu Val His Tyr Leu Pro

    210                 215                 220

Leu Lys Met Ile Asp Gly Leu Leu Leu Met Met Ala Asn Ala Val Phe

225                 230                 235                 240

Gly Asp Leu Ser Arg His Gly Ile Thr Arg Pro Glu Lys Gly Pro Phe

                245                 250                 255

Val Leu Lys Ser Glu Thr Gly Arg Ser Ala Val Ile Asp Val Gly Thr

            260                 265                 270

Ile Gly Leu Ile Lys Lys Asp Lys Ile Lys Val His Gly Arg Ile Thr

        275                 280                 285

Lys Ile Lys Gly Lys Thr Ile Glu Phe Glu Gly Gly Lys Glu Ala Ser

    290                 295                 300

Phe Asp AlaIle Val Phe Ala Thr Gly Tyr Lys Ser Thr Thr Asn Ser

305                 310                 315                 320

Trp Leu Lys Asn Asp Glu Asp Met Leu Asn Ser Asp Gly Val Pro Lys

                325                 330                 335

Lys Glu Phe Pro Asn His Trp Lys Gly Ala Asn Gly Leu Tyr Cys Ala

            340                 345                 350

Gly Leu Gly Arg Arg Gly Leu Ala Gly Ile Ala Met Asp Ala Lys Asn

        355                 360                 365

Ile Ala Asn Asp Ile Lys Arg Ser Ile Asp Ser Met Cys Ser

    370                 380

本发明提供了小麦新型生长素合成基因TaYUCCA1在其它植物中应用的方法，可以改变转基因植物株型。步骤为：

(a)利用如上述的TaYUCCA1基因，将其cDNA序列置于pROK2载体的CaMV 35S启动子之后，构建植物表达载体pROK2-TaYUCCA1。对于单子叶植物如小麦、水稻、玉米等的转化用的载体的构建，可以采用类似的方法将cDNA序列置于本领域人员熟知的Ubi等组成型启动子或组织特异型启动子之后，构建植物表达载体。

(b)采用本领域熟知的方法如农杆菌介导的方法将构建的表达载体导入植物细胞，得到转基因植株。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ.ID.NO.2，用于改变植物株型，尤其是株高、叶型等。

本发明涉及将上述植物表达载体导入植物细胞中，导入方法都是本领域人员熟知的，这些方法包括但不仅限于：农杆菌介导的转化法、基因枪法、电击法、显微注射法、脂质体介导法、PEG介导的转化法、花粉管通道法等，得到株型改变的转基因植物。

本发明人根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCA1-7)和小麦的EST序列设计引物，利用聚合酶链式反应(PCR)、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因克隆等技术，从小麦(Triticum aestivum)中分离出编码合成生长素的TaYUCCA1基因序列。进一步构建植物表达载体，转化模式植物拟南芥。与野生型植物相比，转基因植物株型改变，表现下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状。

本发明所用选择标记基因为新霉素磷酸转移酶基因，可进一步包括其它选择标记基因和报告基因。

基于拟南芥生长速度快、生长周期短、遗传转化效率高、基因组已经测序、已经作为生物学研究的模式植物等优点，在下述实施例中以拟南芥为例对本发明进行了详细的说明，但本发明中TaYUCCA1基因及含有该基因的植物表达载体也可以用于生产其它株型改变的转基因植物，包括用于形态改变的植物的器官、组织、细胞及其种子和后代。

本发明对采用浸花法获得的T2代转基因拟南芥进行形态分析发现，转基因拟南芥中TaYUCCA1的过量表达能显著改变其株型。可将该基因转化小麦、水稻、玉米、棉花等农作物、需要改变株型的花卉植物或其它植物，改变其株型，提高其产量和品质，具有重大的经济价值和社会效益。

附图说明

图1.小麦TaYUCCA1的基因组DNA扩增电泳图。M，Marker DL2000；A，TaYUCCA1的基因全长片段。

图2.小麦TaYUCCA1的cDNA扩增电泳图。M，Marker DL2000；B，TaYUCCA1的cDNA全长片段。

图3.小麦中TaYUCCA1氨基酸序列与几种其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚类结果。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为：OsYUCCA1(水稻，BAD68007)、OsYUCCA2(水稻，AAU43964)、OsYUCCA3(水稻，BAD87432)、OsYUCCA4(水稻，BAB32703)、OsYUCCA5(水稻，ABA99096)、OsYUCCA6(水稻，BAC80117)、OsYUCCA7(水稻，CAE76085)、YUCCA1(拟南芥，At4g32540)、YUCCA2(拟南芥，At4g13260)、YUCCA3(拟南芥，At1g04610)、YUCCA4(拟南芥，At5g11320)、YUCCA5(拟南芥，At5g43890)、YUCCA6(拟南芥，At5g25620)、YUCCA7(拟南芥，At2g33230)、YUCCA8(拟南芥，At4g04610)、YUCCA9(拟南芥，At1g04180)、YUCCA10(拟南芥，At1g48910)、YUCCA11(拟南芥，At1g21430)、ZmSPI1(玉米，ACI43575)。

图4.小麦中TaYUCCA1氨基酸序列与几种其它植物的YUCCA氨基酸序列的聚类结果。它们在GenBank中的注册号及其物种来源分别为：OsYUCCA4(水稻，BAB32703)、YUCCA10(拟南芥，At1g48910)、YUCCA11(拟南芥，At1g21430)、ZmSPI1(玉米，ACI43575)。

图5.构建的植物表达载体示意图。

图6.部分转基因植株的PCR鉴定结果。M：Marker DL2000；CK+：pROK2-TaYUCCA1质粒作为阳性对照；CK-：非转基因对照；1-5：转基因拟南芥各株系。

图7：过量表达TaYUCCA1的转基因拟南芥可以提高株高，叶片细长卷曲。A：示转基因拟南芥生长50天时株高可达60厘米；B：示生长20天时的野生型拟南芥，叶片椭圆形；C：示生长20天的转基因拟南芥，叶片细长卷曲。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施方式(一)：小麦新型生长素合成基因TaYUCCA1基因序列

1.小麦基因组DNA的提取：利用CTAB法从小麦三叶期幼苗中提取小麦DNA；

2.TaYUCCA1基因序列的获得

根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCA1-7)和小麦的EST序列，设计一对引物：

正向引物TaYUCCA1F2：5’-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’；

反向引物TaYUCCAR2：5’-TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’。

以小麦基因组DNA为模板进行PCR反应获得TaYUCCA1基因。50μl反应体系中含第一链cDNA产物4μl、25μl的LA GC Taq DNA聚合酶缓冲液GC buffer I、1μl 10mmol/L的dNTP、分别加1μl 50μmol/L的上游引物和下游引物、0.5μl LA GC Taq DNA聚合酶，其余用灭菌双蒸水补齐。

反应程序为：

95℃ 3min；然后运行35个循环：94℃ 1min，50℃ 1min，72℃℃ 2min；最后于72℃延伸5min。

反应完毕后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，得到约1.5kb的条带(图1)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝胶回收试剂盒说明纯化回收该片段。取回收的PCR产物4μl与克隆载体pMD18-T连接，操作步骤按照TaRaKa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(60mg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。

3.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长TaYUCCA1序列与GenBank中的序列进行比较。

实施方式(二)：小麦新型生长素合成基因TaYUCCA1基因cDNA序列的克隆

1.RNA的提取：用Roche Applied Science公司Tripure Isolation Reagent总RNA提取试剂盒提取小麦三叶期幼苗总RNA

2.cDNA第一链的合成

按照EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明书进行。在0.2ml离心管中加入试剂：

轻轻混匀，稍离心后，42℃保温50min，70℃加热15min。然后-20℃保存备用。

3.cDNA全长序列的获得

根据拟南芥(YUCCA1-11)、水稻(OsYUCCA1-7)和小麦的EST序列，设计一对引物：

正向引物TaYUCCA1F2：5’-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’；

反向引物TaYUCCAR2：5’-TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’。

以上述的cDNA为模板进行PCR反应获得TaYUCCA1基因cDNA序列。50μl反应体系中含第一链cDNA产物4μl、25μl的LA GC Taq DNA聚合酶缓冲液GC buffer I、1μl 10mmol/L的dNTP、分别加1μl 50μmol/L的上游引物和下游引物、0.5μl LA GCTaq DNA聚合酶，其余用灭菌双蒸水补齐。

反应程序为：

95℃ 3min；然后运行35个循环：94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min30sec；最后于72℃延伸5min。

反应完毕后，过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，得到约1.2kb的条带(图2)，按照TaKaRa公司的DNA片段凝胶回收试剂盒说明纯化回收该片段。取回收的PCR产物4μl与克隆载体pMD18-T连接，操作步骤按照TaRaKa公司产品pMD18-T Vector说明书进行。然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(60mg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。

4.同源检索：利用BLAST软件将分离出的全长TaYUCCA1的cDNA序列与GenBank中的序列进行比较。将TaYUCCA1编码的氨基酸序列与已知的来自拟南芥、水稻、玉米(Maize ZmSPI1)的YUCCA基因编码的氨基酸序列进行聚类分析表明，TaYUCCA1与拟南芥的YUCCA10和YUCCA11有较高的同源性(图3)。该结果表明这个基因为生长素合成基因YUCCA在小麦中的同源基因。TaYUCCA1的氨基酸序列与水稻OsYUCCA4(BAB32703)、拟南芥YUCCA10(At1g48910)、YUCCA11(At1g21430)和玉米ZmSPI1(ACI43575)序列类比分析表明，这几个序列见有多个保守的位点(图4)。

5.TaYUCCA1基因内含子分析：根据实施方式(一)和实施方式(二)中分别获得的基因序列以及cDNA序列进行比较，分析内含子的信息。

实施方式(三)：小麦新型生长素合成基因TaYUCCA1的序列见SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3。

实施方式(四)：表达载体pROK2-TaYUCCA1的构建

(1)根据分离出的TaYUCCA1基因的cDNA核苷酸序列，设计引物：

正向引物TaYUCCA1F1：5’-CGGGGATCCTGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’(下划线为BamHI切点)；

反向引物TaYUCCA1R1：5’-CGGGGTACCTTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’(下划线为KpnI切点)。

以小麦三叶期幼苗的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应。

(2)取PCR产物4μl与pMD19-T Simple载体连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品pMD19-T Simple Vector说明书进行，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(60mg/L)、X-gal和IPTG的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落至含有氨苄青霉素的LB液体培养液中培养8h，进行菌液PCR鉴定。将正确的菌样碱法小量提取质粒DNA，质粒PCR和酶切鉴定正确后进行序列测定。

(3)以步骤(2)所得的质粒用限制性内切酶BamH I和Kpa I进行双酶切，回收酶切片段，与用相同酶切并回收的pROK2表达载体连接。连接体系如下：

混匀后于16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。对生长的菌落进行PCR鉴定和测序鉴定。构建成功植物表达载体pROK2-TaYUCCA1(图5)。

(4)将构建好的表达载体pROK2-TaYUCCA1转化农杆菌GV3101感受态细胞，本发明采用的是冻融法转化农杆菌。

实施方式(五)：转基因植物的获得

(1)野生型拟南芥(Columbia生态型)种子播种于浸透1/2MS培养液的育苗基质中，4℃下春花2-3天。然后转入光照培养箱中23℃下光照培养，16h光照/8h黑暗。

(2)挑取携带重组质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48小时，至对数生长后期。

(3)离心收集菌体，沉淀用渗透液(1/2 MS培养液中含5％蔗糖，0.02％ Silwet L-77)悬浮，菌液OD₆₀₀在0.8左右。

(4)将未授粉的拟南芥花序浸入渗透液中，浸泡50sec，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。收获种子。

(5)将收获的种子在筛选培养基(1/2MS盐，1％蔗糖，pH5.7，0.8％琼脂，卡那霉素50mg/L)上筛选，培养得到抗性植株。

(6)根据TaYUCCA1序列设计一对引物：

正向引物TaYUCCA1F2：5’-TGATGGAGGAGGTCGTAGTT-3’；

反向引物TaYUCCAR2：5’-TTTTAGCTGCACATAGAGTC-3’。

提取野生型及抗性植株的基因组DNA，进行常规聚合酶链式反应鉴定(图6)。

(7)将T3代纯合株系种子于浇透1/2MS培养液的育苗基质钵上培养。观察植株表型变化。

实验证实，转基因拟南芥表现下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状(图7)。可将该基因转化小麦、玉米、棉花、花卉等农作物，改变植物的株型，提高产量和品质，具有重大的经济价值和社会价值。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种小麦生长素合成基因TaYUCCA1，其特征在于，其基因核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；其cDNA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的小麦生长素合成基因TaYUCCA1，其特征在于，该基因选自小麦。

3.根据权利要求1所述的一种小麦生长素合成基因TaYUCCA1的应用，其特征在于，该基因在拟南芥中过量表达，能改变转基因拟南芥的株型，如下胚轴加长、株高提高、顶端优势增强、叶柄伸长和叶片细长卷曲等生长素含量提高的症状。

4.一种植物表达载体，包含有权利要求1所述的核苷酸序列SEQ.ID.NO.2。

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