WO2010093175A2 - 토마토 ｈｒ7 유전자 유래 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

토마토 ｈｒ7 유전자 유래 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8235—Fruit-specific

Definitions

  • the present invention relates to a tomato HR7 gene-derived flower and fruit specific expression promoter and its use, and more particularly to a tomato HR7 gene-derived plant flower and fruit specific expression promoter and a 5 'untranslated region (hereinafter referred to as 5'-).
  • UTR tomato HR7 gene-derived plant flower and fruit specific expression promoter and a 5 'untranslated region
  • a flower and fruit specific expression vector comprising the same
  • a plant transformed with the expression vector a method for expressing a flower and fruit specificly with a foreign gene using the expression vector, and a foreign by the method.
  • the present invention relates to a transgenic plant in which genes are specifically expressed in flower and fruit and seeds thereof.
  • the HR7 gene like the metallocarboxypeptidase inhibitor (MCPI), is a new protein containing the DUF1532 superfamily domain, which consists of about 80 amino acids.
  • the gene was first cloned from the root hairs through the root hair cDNA library of Hyoscyamus niger and specifically expressed in the basal part of the root hair roots and primitive cells.
  • MCPIs metallocarboxypeptidase inhibitors
  • the MCPI of a plant is a small peptide of about 10 KDa consisting of 90-110 amino acid residues. These MCPIs are exceptionally competitively potent in inhibiting a wide range of animal and microbial carboxypeptidases except for yeast and plant serine carboxypeptidase (Hass GM, Hermodson MA. (1981) Biochemistry, 20: 2256-2260).
  • MCPI was found to accumulate in tuber and leaf tissues during potato development, and MCPIs from other families responded to wounds and were more highly expressed in fruit than in leaves (Ryan CA. (1990)). Annu. Rev. Phytopathol, 28: 425-449).
  • HR7 gene of Capsicum annuum cv. Bukang is mainly expressed in the EST library made from seeds, so it is presumed that it is specifically expressed in seeds or is involved in seed formation during the development of pepper (http: // sol. pdrc.re.kr/), its function or role has not been revealed to date.
  • Methods of analyzing gene function at developmental stages or at specific organs can be reduced to three levels: The first is to overexpress the gene to make a mutant that can be identified at each stage of development or by observation of specific tissues. Or to find a phenotype that disappears by suppressing the gene. The second is to identify the transcriptional level of the gene.
  • the method focuses on the actual expression level of mRNA by screening cDNA libraries using real-time PCR or microarray data.
  • the third is promoter trapping. This method finds promoters of specific genes and links them with marker genes to identify their expression. In this method, genes expressed only in specific situations or in specific tissues can be more easily identified through promoters. Theoretically, any developmental stage can be applied and has the advantage of not being studied depending on mutations or natural phenotypes (Belinda et al. (1991) Molecular and General Genetics MGG, 228: 281-286).
  • the promoter region is located from 1 to 2 kb, up to 3 kb, towards the 5'-upsteam of the gene, and the promoter regulates expression by initiating transcription of the gene.
  • the promoter regulates expression by initiating transcription of the gene.
  • one promoter regulates a single gene, and thus, genes that are expressed according to specific physical and chemical conditions, or that are expressed in developmental stages or tissue-specific expression can be searched for. It is easy to develop and can use it. However, to date, since its function is not known or a few isolated genes, the mechanism of promoters with specific expression patterns in the development of the plant is difficult to understand genetically.
  • Methods for studying such promoter activity include a system for making transgenic plants through experiments with Agrobacterium-mediated transformation methods that induce stable gene expression, and a quick and easy analysis through transient expression analysis using Agroinfiltration.
  • Transgenic plants produced through the transformation method using Agrobacterium may be a waste of time and labor as well as cost and labor due to different culture conditions for each plant species.
  • the transient expression system using the agroinfiltration method saves more labor, and thus saves time in analyzing as well as cost.
  • it can be used for various plant species such as tobacco and Arabidopsis as well as tomato, and agroinfiltration method can be used to economically perform experiments on not only expression of specific genes but also promoter activity (Yang et al. (2000) The Plant J. 22 (6): 543-551).
  • Korean Patent Registration No. 0784165 discloses a promoter for controlling UDP-glucosyltransferase derived from pepper plants involved in the pathogenic infection of pepper plants and the ripening process of pepper berries, and in Korean Patent Registration No. 0574563 Arabidopsis-derived plant high efficiency expression promoter and a plant high efficiency expression vector containing the same are disclosed, but different from the promoter of the present invention.
  • the present invention has been made in accordance with the requirements as described above, after cloning the promoter and 5'-UTR of tomato HR7 gene, inserting the promoter and 5'-UTR in a binary vector and introduced into the Arabidopsis and tomato, The present invention has been completed by revealing that foreign genes are specifically expressed in flower and fruit tissues of transformed plants.
  • the present invention provides a flower and fruit specific expression promoter or 5'-UTR derived from HR7 gene of tomato.
  • the present invention also provides a flower and fruit specific expression vector and a plant transformed with the expression vector comprising the flower and fruit specific expression promoter and / or 5'-UTR.
  • the present invention provides a method for expressing a foreign gene in plant flowers and fruits using the flower and fruit specific expression promoter or 5'-UTR, if the mass production of useful substances in plant flowers and fruits.
  • the present invention also provides a transgenic plant and seeds thereof, wherein the foreign genes produced by the method are specifically expressed in flower and fruit.
  • the gene can be specifically expressed in plant flower and fruit. It was confirmed that it is a new promoter.
  • pCAM-1391HR is a Arabidopsis transformation vector and pCAM-2300HR is a transient expression vector in tomato.
  • HR7 tomato HR7 promoter
  • HYG (R) hygromycin resistance gene
  • GUSA ⁇ -glucuronidase A coding gene
  • tNOS NOS terminator
  • NPTII kanamycin resistance gene
  • CaMV 35S cauliflower mosaic virus 35s promoter
  • GFP gene green fluorescent protein coding gene
  • His tag hexa histidine tail
  • LB left border
  • RB right border.
  • Tomato genome libraries were digested with EcoR V, Dra I, Pvu II, and Stu I, respectively , and then ligated with adapter fragments to separate the 5'- flanking regions of the SlHR7 gene by genome working PCR (M, size marker: 1, tomato genomic DNA library by EcoR V: 2, Dra I: 3, Pvu II; 4, Stu I).
  • Figure 3 shows the SlHR7 promoter sequence of the 5 'flanking region of the upstream of ATG start codon. nt's were numbered starting from C (+1) of 5′-UTR. Virtual CAAT box at -112 position, TATA box at -54 position, and transcription start site at +1 position. There are cis-acting elements: GA motif (-167nt), AAGAA motif (-264nt), AT rich elements (-335nt and -590nt), ARE (-474nt), G-box (-513nt), TATCCAT / C motif (-794nt), ACE (-800nt).
  • FIG. 5 GUS expression levels for tissues of Arabidopsis plants transformed with pCAM-1391HR ( SlHR7 promoter) and pCAMBIA1301 (35S promoter). It was measured in each tissue of the transgenic Arabidopsis. GUS activity on the reporter gene of the target promoter was normalized to total protein by Bradford reagent (35S as a positive control, CaMV 35S promoter / pCAMBIA1301; H, SlHR7 promoter / pCAMBIA1391Z).
  • FIG. 6 shows a transient analysis of wild type tomato seeds, leaves and berries.
  • the transient assay was performed by agroinfiltration and the expression level of GFP was measured by ELISA using his-tag monoclonal antibody with 450 nm absorbance. Values were normalized by GUS activity (GFP, Green Fluorescent Protein; TSP, Total Soluble Protein; mg, tomato green stage).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • TSP Total Soluble Protein
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • TSP Total Soluble Protein
  • the present invention provides a plant flower and fruit specific expression comprising the nucleotide sequence of 1 to 890 (-890 to -1 site from the transcription initiation site) of the sequence (SEQ ID NO: 1) of FIG. Provide a promoter.
  • the flower and fruit specific expression promoter of the present invention is a flower and fruit specific gene introduced from a transgenic plant. Can be expressed as.
  • the present invention provides a 5'-UTR comprising a nucleotide sequence of 891 to 966 (+1 to +76 sites from the transcription initiation site) of the sequence of Figure 3 (SEQ ID NO: 1). .
  • variants of such promoter sequences or 5′-UTR sequences are included within the scope of the present invention.
  • a variant is a nucleotide sequence that changes in base sequence but has similar functional properties to that of SEQ ID NO: 1.
  • the promoter sequence and the 5'-UTR sequence are at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 It may include base sequences having homology.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the present invention provides a flower and fruit specific expression vector comprising a flower and fruit specific expression promoter and / or 5'-UTR of the plant.
  • the flower and fruit specific expression vector of the present invention may contain only the promoter of the present invention or may be used in combination with a general plant expression promoter such as a CaMV 35S promoter in the 5'-UTR of the present invention, but preferably Including both the promoter and the 5'-UTR is good for the expression of flowers and fruits specific for the transgene in plants.
  • a general plant expression promoter such as a CaMV 35S promoter in the 5'-UTR of the present invention, but preferably Including both the promoter and the 5'-UTR is good for the expression of flowers and fruits specific for the transgene in plants.
  • the flower and fruit specific expression vector of the present invention can be used as a transient expression vector capable of temporarily expressing in a plant into which a foreign gene has been introduced and a plant expression vector capable of permanently expressing a foreign gene in a introduced plant. Can be.
  • Binary vectors that can be used in the present invention may be any binary vector containing the right border (RB) and left border (LB) of T-DNA capable of transforming plants in the presence of Ti plasmid of A. tumefaciens .
  • RB right border
  • LB left border
  • pBI101 Cat #: 6018-1, Clontech, USA
  • pBIN19 Genbank Accession No. U09365
  • pBI121 pCAMBIA vectors, and the like, which are frequently used in the art, may be used.
  • Flower and fruit specific expression vector according to an embodiment of the present invention may be pCAM-1391HR or pCAM-2300HR shown in Figure 1, but is not limited thereto.
  • the promoter of the present invention was inserted into a binary vector for promoter analysis (pCAMBIA 1391Z) having a reporter gene to prepare pCAM-1391HR or pCAM-2300HR (FIG. 1), and was used for plant transformation using Agrobacterium ( Agrobacterium ). It will be apparent to those skilled in the art that the reporter gene may be substituted with another desired foreign gene.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
  • Ti-plasmid vectors which, when present in a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens, can transfer part of themselves, the so-called T-region, into plant cells.
  • a suitable host such as Agrobacterium tumerfaciens
  • Another type of Ti-plasmid vector (see EP 0 116 718 B1) is used to transfer hybrid DNA sequences to protoplasts from which current plant cells or new plants can be produced which properly insert hybrid DNA into the plant genome. have.
  • a particularly preferred form of the Ti-plasmid vector is the so-called binary vector as claimed in EP 0 120 516 B1 and US Pat. No. 4,940,838.
  • viral vectors such as those which can be derived from double stranded plant viruses (eg CaMV) and single stranded viruses, gemini viruses, etc.
  • CaMV double stranded plant viruses
  • gemini viruses single stranded viruses
  • it may be selected from an incomplete plant viral vector.
  • the use of such vectors can be advantageous, especially when it is difficult to properly transform a plant host.
  • the expression vector preferably comprises one or more selectable markers.
  • the marker is typically a nucleic acid sequence having properties that can be selected by a chemical method, which corresponds to all genes capable of distinguishing transformed cells from non-transformed cells. Examples include, but are not limited to, herbicide resistance genes such as glyphosate or phosphinothricin, antibiotic resistance genes such as kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin, and chloramphenicol It doesn't happen.
  • the terminator may use a conventional terminator, such as nopalin synthase (NOS), rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agro Terminator of the octopine gene of Bacterium tumerfaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited thereto.
  • NOS nopalin synthase
  • rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator such as rice ⁇ -amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agro Terminator of the octopine gene of Bacterium tumerfaciens ( Agrobacterium tumefaciens ), but is not limited thereto.
  • the present invention provides the flower and fruit of the plant-specific E. coli transformed with the expression vector of the invention (E. coli) or Agrobacterium tyumeo Pacific Enschede (Agrobacterium tumefaciens).
  • the present invention provides plants and seeds thereof transformed with the flower and fruit specific plant expression vector of the present invention.
  • the flower and fruit specific plant expression vector of the present invention can transform any plant irrespective of dicotyledonous or monocotyledonous plants, but in the present invention, transformation was performed in Arabidopsis and tomato.
  • the plant according to an embodiment of the present invention is tomato, Arabidopsis, potato, eggplant, tobacco, pepper, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, beetroot, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage, cabbage, It may be a dicotyledonous plant, such as gat, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, or pea.
  • Plant transformation refers to any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a period of regeneration and / or tissue culture. Transformation of plant species is now common for plant species, including both dicotyledonous plants as well as monocotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Method is calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts Electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol.
  • the "plant cells” used for plant transformation may be any plant cells.
  • the plant cells may be cultured cells, cultured tissues, cultured organs or whole plants, preferably cultured cells, cultured tissues or cultured organs and more preferably any form of cultured cells.
  • Plant tissue refers to tissues of differentiated or undifferentiated plants, such as, but not limited to, fruits, stems, leaves, pollen, seeds, cancer tissues and various types of cells used in culture, ie single cells, protoplasts. (protoplast), shoots and callus tissue.
  • the plant tissue may be in planta or in an organ culture, tissue culture or cell culture.
  • the present invention comprises the steps of recombining a foreign gene to the flower and fruit specific expression vector of the present invention.
  • a method of expressing a flower and fruit specificly in a transgenic plant, wherein the foreign gene comprising the step of transforming the recombinant flower and fruit specific expression vector into a plant.
  • the foreign gene may be any gene desired to be expressed in plant flowers and fruits, and may be located after the promoter in the flower and fruit specific expression vector of the present invention and may be expressed by fusion with a reporter gene as necessary.
  • the recombinant flower and fruit specific expression vector may be transformed into a plant as described above.
  • the plant is tomato, baby pole, potato, eggplant, tobacco, pepper, burdock, garland chrysanthemum, lettuce, bellflower, spinach, chard, sweet potato, celery, carrot, buttercup, parsley, cabbage And dicotyledonous plants, such as cabbage, mustard, watermelon, melon, cucumber, pumpkin, gourd, strawberry, soybean, mung bean, kidney bean, or pea.
  • the present invention provides a transgenic plant and seeds thereof, wherein the foreign gene produced by the method is specifically expressed in flower and fruit.
  • the transgenic plant can express flower and fruit specific foreign genes by flower and fruit specific expression promoter and / or 5'-UTR.
  • tomato plants were maintained at a temperature of 24 °C in the culture chamber, Arabidopsis (Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0 ) The plant was kept constant at a temperature of 20 ° C. The daylight cycle gave 16 hours of light and 8 hours of dark.
  • the tomato leaf tissue was finely ground using liquid nitrogen, and then extracted according to the protocol of DNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany). Thereafter, 2.5 ug of genomic DNA was treated with 80 units of Dra I , EcoR V , Pvu II , Stu I for 16 hours at 37 ° C. to form blunt ends, and purified with phenol: chloroform (1: 1). After recovering with 100% ethanol was dissolved in 20ul of sterile distilled water.
  • PCR Adaptor Primer 1
  • GSP1 HR7 Gene Specific Primer 1
  • DNA Polymerase buffer 1.5 mM Mg (OAc) 2 , 2.5 mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), respectively, 10pM primers (AP1 and HR7 GSP1); 1ul ligated DNA, 0.1U DNA polymerase.
  • the first PCR reaction conditions are 25 seconds at 94 °C; After 7 cycles performed at 72 ° C.
  • the primary PCR product was diluted 1/50 to perform nested secondary PCR with AP2 and GSP2, and the reaction composition was performed with the primary PCR reaction composition. After 5 cycles at 72 ° C. for 3 minutes, 94 ° C., 25 seconds; 20 cycles were performed at 67 ° C. for 3 minutes, and further 67 ° C. was performed once for 7 minutes to lower the reaction to 4 ° C. to terminate the reaction.
  • Primer sequences used in the above PCR are shown in Table 1. Electrophoresis was performed on 1% agarose gel to confirm the PCR result.
  • E. coli strain DH5 ⁇ was inoculated in 3 ml of LB medium (peptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, NaCl 10 g / L, pH7.2) and shake-cultured at 37 ° C. for 18 hours or more, and then passaged in 100 ml LB liquid medium.
  • the culture was incubated with an OD value of 0.4 to 0.45 at 600 nm.
  • the culture was left on ice for 15 minutes, and then recovered by centrifugation at 4000 rpm for 20 minutes at 4 ° C.
  • the recovered E. coli was treated with ice-cold 80 mM MgCl 2 -20 mM CaCl 2 solution.
  • Agrobacterium was inoculated in 5 ml of YEP (10 g / L yeast extract, 10 g / L peptone, 5 g / L NaCl, pH7.2) liquid medium and shake-cultured at 28 ° C., and the cultured 1 ml was transferred to 50 ml YEP liquid medium. Incubated at 600 nm until the OD value is 0.6 ⁇ 1.0. This was placed on ice for 30 minutes, centrifuged at 4000 rpm / 4 ° C. for 20 minutes, resuspended in ice-cold 0.15M NaCl, and then placed on ice for 10 minutes. Thereafter, the pellets recovered by centrifugation at 4000 rpm / 4 ° C. for 20 minutes were resuspended in 1 ml of 20 mM CaCl 2 and dispensed in 50ul portions. It was quenched in liquid nitrogen and stored at -70 ° C.
  • the SlHR7 promoter site identified 1 kb region by genomic walking PCR, which was then PCR with HR7 F primer and HR7 R primer, cut with HindIII and BamHI enzymes for recombination into pCAMBIA1391Z, followed by T4 ligase 3 at 24 ° C.
  • Time ligated, DH5 ⁇ / E. coli eligible cells were transformed, selected from LB + Km 50 mg / L agar plate and confirmed by cutting with Hind III and BamH I enzyme, plasmid was extracted.
  • the extracted plasmids were transformed into Agrobacterium C58C1 strain qualified cells and selected from YEP + Rif 50mg / L + Km 50mg / L agar plates, which were used for plant transformation using Arabidopsis.
  • the SlHR7 promoter region was recombined to the vector fused to pCAMBIA2300 with GFP and transformed into Agrobacterium strain LBA4404 qualified cells.
  • the SlHR7 promoter region was recombined into -700 / -1 region and -350 / -1 region, respectively.
  • each site was PCR-recombined with H7 F primer and H700 F primer and H350 F primer at full length, cut with Hind III and BamH I enzymes, and recombined into pCAMBIA2300-GFP vector, which was then subjected to Agrobacterium strain LBA4404 qualified cells.
  • Primer sequences used for cloning are shown in Table 1.
  • Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0 was used in Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0 and was grown for about 4-6 weeks in soils with vermiculite: pearlite: pitmos (2: 2: 1).
  • Agrobacterium Floating Prepared Arabidopsis Plants Turn the flower organ down on the beaker containing the cell solution and turn it upside down so that it can be locked. Thereafter, the vacuum was quickly released, sealed in a bag, and then purified for about a day, and water was supplied.
  • the transformed Arabidopsis seeds were disinfected with 70% ethanol and 10% sodium hypochlorite solution and washed with sterile distilled water to remove 1/2 MS agar containing 200 mg / L of cytotaxic and 35 mg / L of hygromycin. Screened on plates (MS 2.2 g / L, 2% sucrose, pH5.8, 0.8% agar powder) (Bechtold, Ellis and Pelletier (1993) CR Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194-1199).
  • Histochemical GUS assay was performed to confirm the expression pattern in the transformed Arabidopsis.
  • the leaves, flowers, stems, roots and seed tissues of the transformed Arabidopsis plants were GUS stained [100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.2) 10 mM EDTA (pH 8.0), 0.5 mM K 2 Fe (CN) 6 , 3 % x-Glc A (Duchefa biochemie, USA)], and placed at 37 °C for about 24 hours, and fixed with 100% ethanol.
  • GUS can hydrolyze a fluorescent substrate called 4-MUG (4-methylumbeliferryl- ⁇ -D-glucuronide) with 4-MU (Methylumbeliferone). GUS activity was measured based on 4-MU hydrolyzed during the reaction. .
  • GUS To measure activity, each plant tissue was first frozen in liquid nitrogen and ground finely with a pestle, followed by GUS extraction buffer [50 mM KPO (pH 7.0), 0.1 M EDTA (pH8.0), 1% Triton X-100, After mixing in ⁇ -mercaptoethanol], 190ul GUS assay buffer [100mM KPO pre-warming 10ul of the sample] 4 (pH 7.2), 0.1 M EDTA (pH 8.0), 1% Triton X-100, ⁇ -mercaptoethanol, MUG 22 mg / 25 ml), and placed at 37 ° C. for exactly 30 minutes before stopping buffer (0.2 M NaCl) 800 ul was added to terminate the reaction.
  • GUS extraction buffer 50 mM KPO (pH 7.0), 0.1 M EDTA (pH8.0), 1% Triton X-100, After mixing in ⁇ -mercaptoethanol
  • 190ul GUS assay buffer [100mM KPO pre-warming 10ul of the sample
  • the sample was ground with protein coating buffer (PCB, 3.3 g / L Na 2 CO 3 , 6.0 g / L NaHCO 3 , pH9.6), and then centrifuged at 15000 rpm at 4 ° C. to supernatant the 96-well microplate. 100ul was dispensed into and placed at room temperature for 2 hours. Then, washed with protein extraction buffer (PEB, 1.16g / L Na 2 HPO 4 , 0.1g / L KCl, 0.1g / LK 3 PO 4 , 4.0g / L NaCl, pH7.4), blocking buffer (5 % skim milk) 200ul was dispensed and placed at room temperature for 2 hours.
  • PCB protein coating buffer
  • the N-terminal region of the SlHR7 gene 76 bp 5'-untranslated region (UTR), about 1 kb promoter region was confirmed.
  • the nucleotide sequence of the SlHR7 promoter region was analyzed by the PLANTCARE (www.plantcare.com) system. As a result, the nontranslated region (UTR) was present 76nt before the translational start site ATG as the 5'-upstream of the SlHR7 gene.
  • the starting cytidine (C) base was marked with +1 nt and various cis-acting regulatory elements were found (FIG. 3).
  • the minimal promoter site is estimated to be the CAAT box and TATA box at -112nt and -54nt, respectively.
  • a GA motif was found at -167nt and an AAGAA motif at -178nt. It is confirmed to exist. It was also confirmed that AT rich elements were found in -335nt and -590nt, ARE was found in -474nt, and G-box was found in -513nt.
  • TATCCAT / C motif was identified in -794nt of the SlHR7 promoter region, and ACE was found in -800nt (Fig. 3).
  • the 5 'flanking region of the SlHR7 gene determined by genome working PCR was PCR amplified with HR7 F / R primer set to identify the nucleotide sequence, using only the SlHR7 promoter region including the 5' UTR region, and then the BamH I and PCMA-1391HR was prepared by recombination with the plant promoter analysis binary vector pCAMBIA1391Z (http://www.cambia.org) cut into Hind III (FIG. 1).
  • Recombinant pCAM-1391HR was transformed into Agrobacterium tumefacience C58C1, and then transformed using a vacuum-infiltration test method to induce stable gene expression in Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0 , and recovered T 1 Arabidopsis seeds of the generation were screened with 35 mg / L of hygromycin and subjected to histochemical GUS analysis to confirm expression of the SlHR7 promoter.
  • Histochemical GUS analysis showed insoluble blue color by reacting with X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-glucuronide), a substrate in tissues expressing ⁇ - glucuronidase (GUS).
  • X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ⁇ -D-glucuronide
  • GUS ⁇ - glucuronidase
  • GUS gene was expressed nonspecifically in leaves, roots, stems, and flower organs, and similar expression was observed in stem tissue, leaf tissues, and root tissues compared to positive control 35S promoter, but only in the surgical part in flower organs.
  • the SlHR7 promoter was confirmed to be expressed higher in the pistil and calyx parts as well as the surgery (FIG. 4).
  • Agrobacterium -Infiltration method (Agroinfiltration) was used.
  • the GFP gene region of the pCAMBIA1302 vector was PCR-cut into BamH I and EcoR I, and then recombined into the pCAMBIA2300 vector to make a pCAMBIA-GFP vector, and the SlHR7 promoter region was PCR to Hind III and BamH I After cleavage, the vector was recombined into pCAMBIA2300-GFP vector to generate a vector pCMA-2300HR for transient expression analysis (FIG. 1).
  • Agrobacterium tumefecience LBA4404 was transformed into Agrobacterium tumefecience LBA4404 and used for tomato transient analysis. Agro-infiltration tissues were collected after 2.5 days, and their expression was confirmed by ELISA using his tag monoclonal antibody. In addition, since the GUS gene is expressed in Agrobacterium bacteria itself, it was used to quantify it.
  • construct FL (-890 / + 76)
  • construct Hd1 and construct Hd2 gradually decreased
  • construct FL and Hd1 showed a 61% decrease
  • Construct FL (-890 / + 76) of the SlHR7 promoter showed higher promoter activity (FIG. 7), indicating that the cis-acting element affecting promoter activity was included in the -890 ⁇ 619 region of the SlHR7 promoter. do.

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Abstract

본 발명은 토마토 (Solanum lycopersicum)의 HR7 유전자 유래 식물 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 5' 비번역 영역 (untranslated region; 5'-UTR), 이를 포함하는 식물 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 꽃 및 열매 특이적으로 발현시키는 방법, 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV 35S 프로모터가 전 조직에서 외래 유전자의 발현을 유도하는 것에 비해 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 꽃 및 열매 조직 특이적으로 발현시킬 수 있다. 또한 본 발명은 유용물질을 꽃 및 열매에서 생산하고자 하는 형질전환 식물체 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

토마토 ＨＲ7 유전자 유래 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도
본 발명은 토마토 HR7 유전자 유래 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 토마토 HR7 유전자 유래 식물체 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 5' 비번역 영역 (untranslated region; 이하 5'-UTR라 약칭함), 이를 포함하는 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물체, 상기 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 꽃 및 열매 특이적으로 발현시키는 방법 및 상기 방법에 의해 외래 유전자가 꽃 및 열매 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.
HR7 유전자는 metallocarboxypeptidase inhibitor (MCPI)와 마찬가지로 약 80 아미노산으로 이루어진 DUF1532 superfamily domain을 포함하고 있는 새로운 단백질이다. 이 유전자는 분꽃 (Hyoscyamus niger)의 뿌리털 cDNA 라이브러리를 통해 뿌리털에서 처음 클로닝되었고, 뿌리털 측근의 기반 부분과 원시 세포에서 특이적으로 발현하였다. Metallocarboxypeptidase에 결합하는 metallocarboxypeptidase inhibitor (MCPI)는 토마토와 감자 등의 가지과 식물에서 발견되었고 (Liu et al. (2000). Mol. Biol. Rep., 27: 241-246), 의료용 거머리(Hirudo medicinalis), 돼지회충(Ascaris suum), Rhipicephalus bursa, 래트, 인간 조직에서도 발견되었다. 식물의 MCPI는 90-110 아미노산 잔기로 구성된 약 10 KDa의 작은 펩타이드이다. 이러한 MCPI는 예외적으로 효모와 식물의 serine carboxypeptidase를 제외한 넓은 범위의 동물과 미생물의 carboxypeptidase를 보다 경쟁적으로 강력하게 억제한다고 알려져 있다 (Hass GM, Hermodson MA. (1981) Biochemistry, 20: 2256-2260). MCPI는 감자의 성장 발달 동안 덩이줄기 조직과 잎 조직에 축적되어짐을 발견하였고, 다른 패밀리의 MCPI들은 wound에 반응하였으며, 토마토에서는 잎보다는 열매에 보다 높게 발현되어졌다고 알려져 있다 (Ryan CA. (1990) Annu. Rev. Phytopathol, 28: 425-449). 또한 고추 (Capsicum annuum cv. Bukang)의 HR7 유전자는 종자에서 만든 EST 라이브러리에서 주로 발현되는 것으로 보아 종자 특이적으로 발현되거나 고추의 발달단계에서 종자 형성에 관여하는 것으로 추정되나(http://sol.pdrc.re.kr/), 그 기능이나 역할에 대해서는 현재까지 밝혀진 바 없다.
발달 단계나 특정 기관에 있어 유전자의 기능을 분석하는 방법은 다음과 같이 세가지 정도로 축약될 수 있다. 첫 번째는 그 유전자를 과발현시켜 돌연변이체를 만들어, 발달 단계마다 혹은 특정 조직의 관찰을 통해 확인하는 방법이다. 또는 그 유전자를 억제시킴으로써 없어지는 표현형을 찾는 것이다. 두 번째는 그 유전자의 전사 수준을 확인하는 것인데, 현재는 실시간 PCR이나 마이크로어레이 데이타를 이용한 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 통해 확인하는 방법으로 mRNA의 실질적인 발현 수준에 초점을 맞추는 방법이다. 세 번째는 프로모터 trapping이다. 이 방법은 특정 유전자의 프로모터를 찾아 표지 유전자와 연결시켜 그 발현 양상을 확인하는 것이다. 이 방법의 경우, 특정 상황이나 특정 조직에서만 발현하는 유전자의 경우에도 프로모터를 통해 보다 쉽게 확인 가능하다. 이론적으로, 어느 발달 단계든지 응용이 가능하고, 돌연변이나 자연적인 표현 형질에 의존하여 연구하지 않아도 되는 장점이 있다 (Belinda et al. (1991) Molecular and General Genetics MGG, 228:281-286).
식물에 있어 프로모터 부위는 그 유전자의 5'-upsteam 쪽으로 1~2kb까지 크게는 3kb까지도 위치하고 있으며, 프로모터는 그 유전자의 전사를 개시함으로써 발현을 조절한다. 또한 원핵 세포와는 달리 진핵 세포에서는 하나의 프로모터가 하나의 유전자를 조절하는 양상을 띠고 있기 때문에 특정 물리적·화학적 상황에 따라 발현되거나, 발달 단계나 조직 특이적으로 발현하는 유전자들을 검색하여 무수한 프로모터의 개발이 용이하고, 이를 이용할 수 있다. 하지만 현재까지도 그 기능이 밝혀지거나 분리된 유전자들도 적지 않기 때문에, 식물의 발달과정에서 특이적인 발현 양상을 띠는 프로모터의 기작은 유전학적으로 이해하는데 많은 어려움이 따른다.
이러한 프로모터 활성을 연구하는 방법으로는 안정된 유전자 발현을 유도하는 아그로박테리움 매개 형질전환 방법 실험을 통한 형질전환 식물체를 만드는 시스템과 Agroinfiltration을 이용한 일시적 발현 분석을 통해 빠르고 손쉽게 분석하는 방법 등이 있다. 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법을 통해 만들어지는 형질전환 식물체는 식물종마다 배양 조건이 각기 달라 비용과 노동력뿐만 아니라 시간도 다소 낭비일 수 있다. 그러나 Agroinfiltration 방법을 이용한 일시적 발현 시스템은 보다 노동력이 절감되며, 그에 따른 비용 절감과 더불어 분석하는 데에 있어 시간 절약도 꾀할 수 있다. 또한 담배, 애기장대뿐만 아니라 토마토 등 다양한 식물 종에 이용이 가능하며, agroinfiltration 방법을 통해 특정 유전자의 발현뿐만 아니라 프로모터 활성 증명 실험도 보다 경제적으로 수행될 수 있다 (Yang et al. (2000) The Plant J. 22(6): 543-551).
한국특허등록 제0784165호에는 고추식물의 병원체 감염에 대한 저항성과 고추열매의 숙성과정에 관여하는 고추식물 유래의 UDP-글루코실트랜스퍼라제를 조절하는 프로모터가 개시되어 있으며, 한국특허등록 제0574563호에는 애기장대 유래 식물체 고효율 발현 프로모터 및 이를 함유하는 식물체 고효율 발현 벡터가 개시되어 있으나, 본 발명의 프로모터와는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 토마토 HR7 유전자의 프로모터 및 5'-UTR을 클로닝한 후, 프로모터 및 5'-UTR을 바이너리 벡터에 삽입하여 애기장대와 토마토에 도입한 결과, 형질전환 식물의 꽃 및 열매 조직에서 외래 유전자가 특이적으로 발현됨을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 토마토의 HR7 유전자에서 유래된 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 또는 5'-UTR을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및/또는 5'-UTR을 포함하는 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 식물체 꽃 및 열매에서 유용 물질을 대량 생산하고자 하는 경우, 상기 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 또는 5'-UTR을 이용하여 외래 유전자를 식물체 꽃 및 열매에서 발현시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 꽃 및 열매 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명에 따르면, 토마토의 HR7 유전자에서 유래된 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및 5'-UTR을 이용하여 외래 유전자를 식물체에서 발현시킨 결과, 식물체 꽃 및 열매에서 특이적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 신규 프로모터임을 확인하였다.
도 1은 애기장대 형질전환 및 토마토 일시적 분석용 프로모터 분석 벡터의 모식도이다. pCAM-1391HR은 애기장대 형질전환용 벡터이며, pCAM-2300HR은 토마토에서 일시적 발현용 벡터이다. HR7, 토마토 HR7 프로모터; HYG(R), 하이그로마이신 저항성 유전자; GUSA, β-glucuronidase A 코딩 유전자; tNOS, NOS terminator; NPTⅡ, 카나마이신 저항성 유전자; CaMV 35S, cauliflower mosaic virus 35s 프로모터; GFP 유전자, 녹색형광단백질 코딩 유전자; His tag, hexa histidine tail; LB, left border; RB, right border.
도 2는 SlHR7 프로모터 영역을 분리하기 위한 게놈 워킹 PCR을 보여준다. 토마토 게놈 라이브러리를 각각 EcoRV, DraI, PvuII, StuI으로 절단한 후, 어댑터 단편과 라이게이션하여 게놈 워킹 PCR을 통해 SlHR7 유전자의 5'-플랭킹 영역을 분리하였다 (M, size marker: 1, 토마토 게놈 DNA 라이브러리 by EcoRV: 2, DraI: 3, PvuII; 4, StuI).
도 3은 ATG start codon의 upstream의 5' 플랭킹 영역의 SlHR7 프로모터 서열을 보여준다. nt's는 5'-UTR의 C(+1)로부터 시작하여 넘버링하였다. -112 위치에 가상적인 CAAT box, -54 위치에 TATA box, +1 위치에 전사개시부위. cis-acting elements 이 존재한다: GA motif(-167nt), AAGAA motif(-264nt), AT rich element(-335nt 및 -590nt), ARE(-474nt), G-box(-513nt), TATCCAT/C motif(-794nt),　ACE(-800nt).
도 4는 pCAM-1391HR 및 pCAMBIA1301로 형질전환된 애기장대 식물의 조직에 대한 조직화학적 염색 결과이다 (WT, 야생형; 35S, CaMV 35S 프로모터; SlHR7, HR7 프로모터).
도 5는 pCAM-1391HR (SlHR7 프로모터) 및 pCAMBIA1301 (35S 프로모터)로 형질전환된 애기장대 식물의 조직에 대한 GUS 발현 수준이다. 형질전환 애기장대의 각 조직에서 측정되었다. 표적 프로모터의 리포터 유전자에 대한 GUS 활성을 Bradford 시약에 의해 총 단백질로 표준화하였다(normalized) (양성대조구로서 35S, CaMV 35S 프로모터/pCAMBIA1301; H, SlHR7 프로모터/pCAMBIA1391Z).
도 6은 야생형 토마토 종자, 잎 및 열매에 대한 일시적 분석을 보여준다. 일시적 분석을 agroinfiltration으로 수행하고, 450nm 흡광도로 his-tag 단클론 항체를 이용하여 ELISA를 통해 GFP의 발현 수준을 측정하였다. 값을 GUS 활성에 의해 표준화하였다 (GFP, 녹색형광단백질; TSP, 총 가용성 단백질; mg, 토마토 열매의 녹수기(mature green stage)).
도 7은 토마토에서 SlHR7 프로모터의 전장 및 결실에 대한 일시적 GFP 발현을 보여준다. 결실 분석을 agro-infiltration으로 수행하고, 450nm 흡광도로 his-tag 단클론 항체를 이용하여 ELISA를 통해 GFP의 발현 수준을 측정하였다. 값을 GUS 활성에 의해 표준화하였다 (GFP, 녹색형광단백질; TSP, 총 가용성 단백질; mg, 토마토 열매의 녹수기(mature green stage)).
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 도 3의 서열(서열번호 1)의 1 내지 890 (전사 개시 부위로부터 -890 내지 -1 부위)의 염기서열을 포함하는 식물 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터를 제공한다.
기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 전 조직에서 도입된 유전자를 발현시키는데 비해, 상기 본 발명의 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 꽃 및 열매 특이적으로 발현시킬 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 도 3의 서열(서열번호 1)의 891 내지 966 (전사 개시 부위로부터 +1 내지 +76 부위)의 염기서열을 포함하는 5'-UTR을 제공한다.
또한, 상기 프로모터 서열 또는 5'-UTR 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열 및 5'-UTR 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물체의 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및/또는 5'-UTR을 포함하는 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터는 상기 본 발명의 프로모터만을 함유하거나 본 발명의 5'-UTR에 CaMV 35S 프로모터와 같은 일반 식물체 발현 프로모터를 조합하여 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 본 발명의 프로모터와 5'-UTR을 모두 포함하는 것이 식물체에서 도입 유전자를 꽃 및 열매 특이적으로 발현시키기에 좋다.
본 발명의 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적 (transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 A. tumefaciens의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB (right border)과 LB (left border)을 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 일 구현예에 따른 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터는 도 1에 도시된 pCAM-1391HR 또는 pCAM-2300HR 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 프로모터를 리포터 유전자가 있는 프로모터 분석용 바이너리 벡터(pCAMBIA 1391Z)에 삽입하여 pCAM-1391HR 또는 pCAM-2300HR (도 1)를 제조하여 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용한 식물 형질전환에 이용하였다. 상기 리포터 유전자를 다른 목적 외래 유전자로 치환할 수 있음은 당업자에게 자명하다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 꽃 및 열매 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 본 발명의 꽃 및 열매 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.
본 발명의 꽃 및 열매 특이적 식물 발현 벡터는 쌍자엽 혹은 단자엽 식물에 상관없이 어떤 식물체도 형질전환시킬 수 있으나, 본 발명에서는 애기장대 및 토마토에서 형질전환을 실시하였다. 본 발명의 일 구현예에 따른 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.
"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
상기 재조합된 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 꽃 및 열매 특이적으로 발현시키는 방법을 제공한다.
상기 외래 유전자는 식물체 꽃 및 열매에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 꽃 및 열매 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 식물체는 토마토, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 또는 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 꽃 및 열매 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터 및/또는 5'-UTR에 의해 외래 유전자를 꽃 및 열매 특이적으로 발현시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
재료 및 방법
1. 식물 재료 및 배양 조건
토마토 (Solanum lycopersicum cv. Micro-Tom) 식물체는 배양실에서 24℃의 온도를 유지하였고, 애기장대(Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0) 식물체는 20℃의 온도로 일정하게 유지하였다. 일광주기는 16시간 광(光)을 주었고, 8시간 암(暗)을 주었다.
2. 토마토 게놈(genomic) DNA 분리 및 5'-upstream 지역을 알아내기 위한 게놈 워킹 PCR 수행
토마토 게놈 DNA를 추출하기 위해 토마토 잎 조직을 액체 질소를 이용하여 곱게 간 후, DNeasy plant mini kit (Qiagen, Germany)의 프로토콜을 따라 추출하였다. 이후, 2.5ug의 게놈 DNA를 80 unit의 DraI, EcoRV, PvuII, StuI을 이용하여 블런트 말단이 생기도록 37℃에서 16시간 이상 처리하였고, 페놀:클로로포름 (1:1)로 정제한 후 100% 에탄올을 이용하여 회수하여 20ul의 멸균 증류수에 녹였다. 이 중 4ul를 Genome walker Adaptor fragment (clontech, USA)와 라이게이션하였으며, Adaptor 프라이머 1(AP1)와 HR7 유전자 특이적 프라이머 1(GSP1)로 1차 PCR을 수행하였으며, 반응 조성은 다음과 같다 : DNA 중합효소 버퍼, 1.5mM Mg(OAc)2, 각각 2.5mM dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), 각각 10pM 프라이머 (AP1 및 HR7 GSP1); 1ul ligated DNA, 0.1U DNA 중합효소. 또한 1차 PCR 반응 조건은 94℃에서 25초; 72℃, 3 분 조건으로 7 사이클 수행 후, 94℃, 25초; 67℃, 3분 조건으로 32 사이클 수행하였으며, 추가적으로 67℃, 7 분 1회 수행한 후, 4℃로 저하시켜 반응을 종결시켰다. 1차 PCR 생산물을 1/50 희석하여 AP2와 GSP2로 nested 2차 PCR을 수행하였으며, 반응 조성은 1차 PCR 반응 조성과 같이 수행하였으며, nested 2차 PCR의 반응은 94℃, 25초; 72℃, 3 분 조건으로 5 사이클 수행 후, 94℃, 25초; 67℃, 3 분에서 20 사이클 수행하고, 추가적으로 67℃, 7 분 1회 수행하여 4℃ 저하시켜 반응 종결하였다. 이상의 PCR에 이용된 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다. PCR 결과를 확인하고자 1% 아가로스 겔에 전기영동을 수행하였다.
표 1. SlHR7 프로모터 영역의 클로닝을 위한 프라이머 디자인. HR7 GSP1, nested HR7 GSP2, AP1, nested AP2 프라이머를 게놈 워킹 PCR에 의해 SlHR7 유전자의 5'-플랭킹 영역을 분리하기 위해 사용하였으며, HR7 F, HR7 R, H700F, H350F 프라이머를 형질전환 애기장대 및 야생형 토마토에서 일시적 발현 분석을 위한 구축물 제조에 이용하였다 (GSP, 유전자 특이적 프라이머; AP, 어댑터 프라이머).
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* 밑줄친 부분은 제한효소 자리를 나타낸다.
3. DH5α/ E.coli 적격 세포 (competent cell; CP cell) 제조 및 형질전환
E. coli 균주 DH5α를 LB 배지 (펩톤 10g/L, 효모 추출액 5g/L, NaCl 10g/L, pH7.2) 3ml에 접종하여 37℃에서 18시간 이상 진탕 배양한 후, 100ml LB 액체 배지에 계대배양하여 600 nm에서 O.D 값이 0.4~0.45까지 배양하였다. 배양액을 얼음에 15분간 방치한 후, 4℃에서 4000rpm으로 20분간 원심분리하여 회수하였다. 회수한 E. coli을 ice-cold 80mM MgCl2-20mM CaCl2 용액에 처리하였다. 이를 얼음에 15분간 둔 후, 4000rpm/4℃으로 20분간 원심분리하여 ice-cold 0.1M CaCl2 용액 2ml에 처리한 후 형질전환에 이용하였다. 즉시 사용할 경우에는 30분간 얼음에 둔 후 사용하였고, 그렇지 않은 경우는 15~20% 글리세롤을 첨가하여 -70℃에 보관하였다.
적격 세포에 DNA를 섞은 후, 얼음에 30분 이상 둔 후, 42℃에서 90초간 둠으로써 열 충격을 가한 후, 항생제가 함유되어 있지 않은 LB 액체 배지 1ml을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 항생제가 함유된 LB 배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니는 배양하여 Accup prep. mini kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 플라스미드를 분리한 후, 제한효소를 이용하여 확인하였다.
4. 아그로박테리움( Agrobacterium ) 적격 세포 제조 및 형질전환
아그로박테리움을 YEP (효모 추출액 10g/L, 펩톤 10g/L, NaCl 5g/L, pH7.2) 액체 배지 5ml에 접종하여 28℃에서 진탕 배양한 후, 배양한 1ml을 50ml YEP 액체 배지에 계대하여 600 nm에서 O.D 값이 0.6~1.0이 될 때까지 배양하였다. 이를 30분간 얼음에 둔 후, 4000rpm/4℃으로 20분간 원심분리하여 ice-cold 0.15M NaCl에 재부유킨 후, 얼음에 10분간 두었다. 그 후, 4000rpm/4℃으로 20분간 원심분리하여 재회수된 펠렛은 1ml의 20mM CaCl2에 재부유시켜 50ul씩 분주하였다. 이를 액체 질소에 급냉동하여 -70℃에 보관하였다.
보관되어 있던 적격 세포에 DNA 1ug을 섞은 후 액체질소에 2분간 얼린 후, 5분간 37℃에서 열 충격을 주었고, 가볍게 섞어준 후, 앞 과정을 1회 반복하였다. 그 후, 얼음에 30분간 둔 후, YEP 액체 배지 1ml을 넣어주고, 28℃에서 2시간 동안 배양한 후 Rif 50mg/L, Km 50mg/L 가 포함된 YEP 고체배지에 도말하여 형질전환된 콜로니를 선별하였다.
5. SlHR7 프로모터 부위의 재조합 벡터
SlHR7 프로모터 부위는 게놈 워킹 PCR에 의해 1kb 지역을 밝혀내었고, 이를 HR7 F 프라이머와 HR7 R 프라이머로 PCR하여, 이를 pCAMBIA1391Z에 재조합하기 위해 HindⅢ과 BamHⅠ 효소로 자른 후, T4 ligase에 의해 24℃에서 3시간 라이게이션하였고, DH5α/E.coli 적격 세포에 형질전환하여, LB+Km 50mg/L 아가 플레이트에서 선별하여 이를 HindⅢ과 BamHⅠ 효소로 잘라 확인하였으며, 플라스미드를 추출하였다. 추출된 플라스미드는 Agrobacterium C58C1 균주 적격 세포에 형질전환하여, YEP + Rif 50mg/L + Km 50mg/L 아가 플레이트에서 선별하여, 이를 애기장대를 이용한 식물 형질전환에 이용하였다.
토마토 일시적 발현 분석(transient expression assay)을 수행하기 위해, pCAMBIA2300에 GFP가 융합된 벡터에 SlHR7 프로모터 부위를 위와 같은 방법으로 재조합하였고, Agrobacterium 균주 LBA4404 적격 세포에 형질전환하였다. 또한, cis-acting element의 역할과 발현 수준을 확인하기 위해, deletion test를 수행하고자, SlHR7 프로모터 부위를 -700/-1 부위와 -350/-1 부위로 각각 재조합하였다. 먼저, 각각의 부위를 전장(full length)에서 H700 F 프라이머와 H350 F 프라이머를 HR7 R 프라이머와 함께 PCR하여, HindⅢ과 BamHⅠ 효소로 잘라 pCAMBIA2300-GFP 벡터에 재조합하였고, 이를 Agrobacterium 균주 LBA4404 적격 세포에 형질전환하였다. 클로닝에 이용한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
6. 진공-침윤 방법 실험에 따른 애기장대 형질전환
애기장대 식물은 Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0를 사용하였고, 버미큘라이트:펄라이트:피트모스 (2:2:1) 조건의 토양에서 약 4~6주간 키웠다.
재조합 벡터 pCAM-1391HR이 형질전환된 Agrobacterium C58C1 균주는 28℃에서 전배양하여, 120ml의 항생제가 들어간 YEP 액체 배지에서 ~24시간 배양하였고, 세포를 회수하기 위해 4500rpm/4℃으로 20분간 원심분리하여 VIF [vacuum infiltraion medium, MS salts with B5 비타민 2.2g/L (Duchefa biochemie, USA), 5% 수크로스, MES 0.5g/L, pH5.7 with KOH, BAP 0.044uM, silwet L-77 200ul/L)에 재부유시켰고, 이때의 세포 O.D > 2.0으로 맞추었다. 준비된 애기장대 식물체를 부유시킨 아그로박테리움 세포 용액이 담긴 비커에 꽃 기관이 아래로 가도록 하여 모두 잠길 수 있도록 거꾸로 뒤집어준 후, 4~10pa의 진공 상태를 15~20분간 유지시켜준다. 이후, 진공 상태는 재빨리 해제하여 주고, 봉지에 밀봉하여 순화 과정을 하루 정도 시켜주고, 물을 공급하였다. 형질전환된 애기장대 종자는 70% 에탄올과 10% 소듐 하이포클로라이트 용액으로 소독한 후, 멸균한 증류수로 세척하여 세포탁심 200mg/L와 하이그로마이신 35mg/L이 포함되어 있는 1/2 MS 아가 플레이트 (MS 2.2g/L, 2% 수크로스, pH5.8, 0.8% 아가 분말) 상에서 선별하였다 (Bechtold, Ellis and Pelletier (1993) C.R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316: 1194-1199).
7. 조직화학적(Histochemical) GUS 분석과 GUS 활성 측정
형질전환된 애기장대에서의 발현 양상을 확인하기 위해 조직화학적 GUS assay를 수행하였다. 형질전환된 애기장대 식물체의 잎, 꽃, 줄기, 뿌리, 씨 조직을 GUS 염색액 [100mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH7.2) 10mM EDTA(pH8.0), 0.5mM K2Fe(CN)6, 3% x-Glc A (Duchefa biochemie, USA)]에 침지시켜, 37℃에 24시간 정도 둔 후, 100% 에탄올로 고정하였다.
GUS는 4-MUG (4-methylumbeliferryl-β-D-glucuronide)라고 하는 형광 기질을 4-MU (Methylumbeliferone)으로 가수분해할 수가 있는데, 반응시 가수분해되는 4-MU를 기준으로 GUS 활성을 측정하였다. GUS 활성을 측정하기 위해, 먼저 각각의 식물 조직을 액체질소에 얼려 막자로 곱게 분쇄한 후, GUS 추출 버퍼 [50mM KPO(pH 7.0), 0.1M EDTA(pH8.0), 1% Triton X-100, β-mercaptoethanol]에 혼합한 후, 그 시료의 10ul를 pre-warming한 190ul GUS 분석 버퍼 [100mM KPO4(pH 7.2), 0.1M EDTA(pH8.0), 1% Triton X-100, β-mercaptoethanol, MUG 22mg/25ml)]에 혼입하여 37℃에서 정확히 30분간 둔 후, stop 버퍼 (0.2M NaCl) 800ul를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이를 360/460nm의 형광을 측정하였고. 측정값은 5ｘ Bradford 시약(95% 에탄올 50ml, 85% H3PO4 100ml, Briliant blue 0.1g, 물 50ml)을 1/5로 희석하여 BSA (albumin serum bovine, sigma, USA)로 정량하고, 총 가용성 단백질로 nomalization하였다. GUS 활성은 nmol4-MU·min-1ug-1 단백질 단위로 나타낼 수 있다.
8. 일시적 발현 분석
일시적 발현 분석을 수행하기 위해 Agrobacterium LBA4404 균주을 전배양하여, 200uM 아세토시린곤이 들어간 20ml의 YEP 액체 배지에 계대 배양하여 O.D=~0.7까지 키운 후, 4500rpm/4℃에서 20분간 원심 분리하여 회수한 세포를 200uM 아세토시린곤이 첨가된 1/2MS 배지(MS 2.2g, 2% 수크로스, pH5.7) 20ml에 재부유시켜 이를 토마토의 종자에 주사기를 이용하여 Agrobacterium 감염시키고, 잎과 열매 조직에 침윤(Agroinfiltration)하였다. 시료는 2.5일 뒤에 채취하였고, 이를 단백질 추출 버퍼 (PEB)와 함께 간 후, 15000rpm/4℃에서 30분간 원심분리하여 준비하여, His tag 단클론 항체를 이용한 ELISA 방법을 통해 발현량을 확인하였으며, Agrobacterium 균 자체에서 발현되는 GUS 발현량을 기준으로 nomalization하였다.
9. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
먼저 시료를 단백질 코팅 버퍼(PCB, 3.3g/L Na2CO3, 6.0g/L NaHCO3, pH9.6)와 함께 분쇄한 후, 4℃에서 15000rpm으로 원심분리하여 상층액을 96 웰 마이크로플레이트에 100ul 분주하여 이를 상온에 2시간 두었다. 이후, 단백질 추출 버퍼 (PEB, 1.16g/L Na2HPO4, 0.1g/L KCl, 0.1g/L K3PO4, 4.0g/L NaCl, pH7.4)로 세정하여주고, 블록킹 버퍼(5% skim milk) 200ul를 분주하여 상온에 2시간 두었다. 이후, 이를 2차례 PEB로 세정한 후, 10-7으로 희석한 1차 항체 (novagen, Germeny)를 50ul씩 분주하여 상온에 2시간 동안 두어 원하고자 하는 단백질간의 상호 작용이 잘 일어날 수 있도록 하였다. 이후, 4차례 이상 PEB로 세정한 후, 2차 His tag 단클론 항체 (sigma, USA)를 1:2000 PEB로 희석하여 50ul씩 분주하였다. 반응은 1시간 동안 실온에 두었으며, 이를 4차례 PEB로 세정한 후, 기질 용액 (BD bioscience, USA) 50ul를 분주하고, 30분간 상온에 둔 후, stop solution (2.5M H2SO4) 50ul를 분주하여 반응을 종결시켰다. 이를 450nm의 흡광으로 그 값을 측정하였다 (Engvall E, Perlman P (1971) Immunochemistry 8(9): 871-4).
실시예 1. SlHR7 유전자의 5'-upstream 부위 찾기
토마토 HR7 유전자 (SlHR7)의 프로모터를 찾아내기 위해서 토마토 게놈 DNA를 추출한 후, 블런트 말단이 생성될 수 있도록 각각의 EcoRV, DraⅠ, PvuⅡ, StuⅠ 제한 효소를 이용하여 자른 후, genome walker adaptor를 라이게이션하여 토마토 게놈 DNA 라이브러리를 제작하였다. AP1과 SlHR7의 엑손 부분에 위치한 HR7 GSP1과 GSP2 프라이머를 이용하여 게놈 워킹 PCR를 수행한 결과, EcoRV 제한 효소로 만든 토마토 게놈 DNA 라이브러리에서 1.2kb의 DNA 밴드를 확인하였다 (도 2).
이를 pGEM-T easy 벡터(Promega, USA)에 클로닝한 후 염기서열을 확인한 결과, SlHR7 유전자의 N 말단 부위와 76 bp 5'-비번역 영역 (UTR), 약 1 kb 프로모터 부위를 확인할 수 있었다. 그리고 PLANTCARE (www.plantcare.com) 시스템을 통해 SlHR7 프로모터 부위의 염기서열을 분석한 결과, SlHR7 유전자의 5'-upstream으로 translational start site ATG로부터 76nt 앞에 비번역 영역 (UTR)이 존재하였고, UTR이 시작되는 cytidine(C) 염기를 +1 nt로 표기하였으며, 다양한 cis-acting regulatory element들을 찾아내었다 (도 3).
Minimal 프로모터 부위는 -112nt와 -54nt에 각각 CAAT box와 TATA box가 존재함으로서 추정되며, SlHR7 프로모터의 염기서열상의 cis-acting element들은 이외에도, -167nt에 GA motif가 발견되었으며, -178nt에 AAGAA motif가 존재함이 확인되었다. 또한 -335nt와 -590nt에 AT rich element가 있음을 확인하였고, -474nt에는 ARE가 발견되었으며, -513nt에는 G-box가 있음을 확인하였다. SlHR7 프로모터 영역의 -794nt에는 TATCCAT/C motif가 확인되었으며, -800nt에는 ACE가 발견되었다 (도 3).
실시예 2. 형질전환 애기장대 식물을 이용한 SlHR7 프로모터의 발현 양상과 활성 분석
게놈 워킹 PCR을 통해 알아낸 SlHR7 유전자의 5'플랭킹 부위는 5' UTR 지역을 포함한 SlHR7 프로모터 부위만을 이용하기 위해, HR7 F/R 프라이머 세트로 PCR 증폭하여 염기 서열을 확인한 후, 이를 BamHⅠ과 HindⅢ로 잘라 식물 프로모터 분석 바이너리 벡터인 pCAMBIA1391Z(http://www.cambia.org)에 재조합하여 pCMA-1391HR을 제작하였다 (도 1).
재조합된 pCAM-1391HR은 Agrobacterium tumefacience C58C1에 형질전환한 후, 애기장대 식물 (Arabidopsis thaliana ecotype columbia-0)에 안정적인 유전자 발현을 유도하기 위해 진공-침윤 실험 방법을 이용하여 형질전환하였고, 회수된 T1 세대의 애기장대 종자는 하이그로마이신 35mg/L으로 선별하여, SlHR7 프로모터의 발현양상을 확인하기 위해 조직화학적 GUS 분석을 수행하였다.
조직화학적 GUS 분석은 β-glucuronidase (GUS)가 발현된 조직에 기질인 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide)과 반응시키게 되면, insoluble blue 색을 띰으로써 GUS 유전자의 발현으로 프로모터의 발현 양상을 육안으로 쉽게 확인할 수 있다. 먼저 각각의 조직을 채취한 후, GUS 염색액에 조직을 침지시켜 37℃에 overnight한 후, 100% 에탄올로 고정하였다.
그 결과, 잎, 뿌리, 줄기, 꽃 기관에서 비특이적으로 GUS 유전자가 발현되었으며, 양성대조구인 35S 프로모터와 비교해 줄기 조직과 잎 조직, 뿌리 조직에서는 유사한 발현 양상을 띄었으나, 꽃 기관에서는 수술 부분에만 발현되는 35S 프로모터와 달리 SlHR7 프로모터는 수술뿐 아니라 암술 부분과 꽃 받침 부분에서 보다 높게 발현됨을 확인하였다 (도 4).
또한 각 조직에서의 실질적인 발현량을 확인하기 위해, GUS 활성을 확인하였다. 그 결과 잎, 종자, 줄기 조직에서는 발현량이 35S 프로모터와 비슷하였으나, 꽃 조직에서는 35S보다 2.5배 이상의 발현량을 보였고 특히 다른 조직에 비해 꽃에서 발현량이 현저히 높았다 (도 5).
실시예 3. 토마토에서의 SlHR7 프로모터의 활성 분석
토마토에서의 SlHR7 프로모터 발현 양상을 확인하기 위해, Agrobacterium- 침윤 방법(Agroinfiltration)을 이용하였다. 먼저 표지 GFP를 이용하기 위해, pCAMBIA1302 벡터의 GFP 유전자 부위를 PCR하여 BamHⅠ과 EcoRⅠ으로 자른 후, pCAMBIA2300 벡터에 재조합하여, pCAMBIA-GFP 벡터를 만들었고, SlHR7 프로모터 부위를 PCR하여 HindⅢ와 BamHⅠ으로 자른 후, 이를 pCAMBIA2300-GFP 벡터에 재조합하여 일시적 발현 분석용 벡터 pCMA-2300HR를 만들었다 (도 1). 이를 Agrobacterium tumefecience LBA4404에 형질전환한 후, 토마토 일시적 분석에 이용하였다. Agro-infiltration한 조직은 2.5일 뒤에 채취하였고, his tag 단클론 항체를 이용한 ELISA를 수행하여 그 발현량을 확인하였다. 또한, Agrobacterium 균 자체에서 GUS 유전자는 발현되기 때문에 이를 정량하는데 이용하였다.
일시적 발현 분석 수행결과, 토마토 종자와 잎 조직에서는 35S 프로모터보다 낮은 발현량을 보였으나, 토마토 녹수기 열매에서는 35S 프로모터보다 약 2배 가량 높은 발현량을 보였으며, 이는 잎 조직보다 약 1.3배 높은 결과를 나타내었다. 따라서 SlHR7 프로모터의 보다 열매 특이적인 발현 양상을 보여줌을 확인하였다 (도 6).
실시예 4. 결실 분석을 이용한 프로모터 활성 부위 조사
프로모터 염기서열상의 활성 부위를 확인하고, 발현에 필수적인 cis-acting element를 검색 하고자, SlHR7 프로모터의 5'-deletion analysis test를 수행하였다. 먼저 SlHR7 프로모터 약 1kb 크기의 전장 프로모터 부위(-890/+76, FL)를 HR7 F/R 프라이머로 증폭하였고, 전체 프로모터 중 5'upstream 부위가 약 270bp가 제거된 construct Hd1(-619/+76)을 Hd1 F/HR7 R 프라이머로, 5'upstream 부위가 약 630bp가 제거된 construct Hd2(-262/+76)를 Hd2 프라이머로, 각각 PCR하여 pCAMBIA2300-GFP 벡터에 재조합하였다. 이를 Agrobacterium 균주 LBA4404에 각각 형질전환한 후, 토마토의 잎 조직에 일시적 발현 분석을 수행하였다.
그 결과 프로모터 활성은 construct FL(-890/+76)에서 가장 높게 나타났으며, construct Hd1과 construct Hd2는 점차 낮아지는 발현량을 보였는데, construct FL과 Hd1은 61% 감소 차이를 보였고, construct Hd2와는 73% 발현률 감소차이를 보였다. SlHR7 프로모터의 construct FL(-890/+76)이 보다 프로모터 활성이 높게 나타남으로써 (도 7), SlHR7 프로모터의 -890~619 부위에 프로모터 활성에 영향을 미치는 cis-acting element가 포함되어 있을 것으로 판단된다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 1 내지 890 (-890 내지 -1 부위)의 염기서열을 포함하는 식물 꽃 및 열매 특이적 발현 프로모터.
  2. 서열번호 1의 891 내지 966 (+1 내지 +76 부위)의 염기서열을 포함하는 5'-UTR.
  3. 제1항의 프로모터, 제2항의 5'-UTR, 또는 제1항의 프로모터 및 제2항의 5'-UTR을 포함하는 식물 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 도 1에 도시된 pCAM-1391HR 또는 pCAM-2300HR인 것을 특징으로 하는 식물 발현 벡터.
  5. 제3항 또는 제4항의 식물 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens).
  6. 제3항 또는 제4항의 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물체.
  8. 제3항 또는 제4항의 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
    상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자를 형질전환 식물체에서 꽃 및 열매 특이적으로 발현시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물체는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 꽃 및 열매 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
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