CN108795839A - 一种石斛单细胞悬浮培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。包括一种细胞培养液，及用该细胞培养液培养石斛细胞的方法。细胞培养液的组分为：1/2MS、MES、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、CaCl₂、1gBSA、土壤滤液，超纯水定容至1L；土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，并将该上清液过滤即得。

Description

一种石斛单细胞悬浮培养的方法

技术领域

本发明属于植物细胞生物工程领域，具体涉及一种石斛单细胞悬浮培养的方法。

背景技术

石斛为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)植物，其茎段为传统中药材，在《中华人民共和国药典(2015年版)》等中皆有收录。在《神农本草经》中,石斛被列为上品,具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。现代药理研究表明,其化学成分类型主要有生物碱类、酚类、多糖类等,其中生物碱类为主要成分。石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力、抗白内障和抗菌等作用。因此，现代中医药界对石斛的研究逐渐重视起来。

植物细胞的单细胞悬浮培养技术能够在短时间内获得大量的植物细胞，目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作。另一方面，大量获得的具有相同遗传背景的植物悬浮培养细胞，可以为植物次生代谢产物的获取，以及植株的再生提供大量优质的原材料。

以往对石斛细胞悬浮培养的报道，都只集中于对石斛原球茎进行悬浮培养，缺乏对石斛的单细胞悬浮培养研究。这主要是因为使用原球茎进行悬浮培养相对容易，如果直接选取石斛成体的一部分(如茎段、叶片等)分离并培养单细胞，缺乏相关文献报道支持，而不同植物的单细胞培养方法不尽相同，直接将其它植物的细胞培养方法移植过来，石斛单细胞的提取率、存活率都非常低，即使存活，后续生长效果也不理想，无法在短时间内快速获得大量细胞并加以利用。

因此，研发一种存活率和获得率高的悬浮培养石斛单细胞的方法，对石斛进一步的科学研究、次生代谢产物生产、大规模无性繁育等，具有重要的科研价值和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种悬浮培养石斛单细胞的方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种细胞培养液，按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl₂、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。

优选的，所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。

相应的，所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。

相应的，一种以所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，包括如下步骤：

(1)石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；

(2)按权利要求1的方法制备不含土壤滤液的细胞培养液，得甘露醇培养液；将所述预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液＝1～3：50，4℃暗处理1h；

(3)将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液＝0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES，149份KCl，729份甘露醇，100份纤维素酶，40份果胶酶，50份离析酶，10份牛血清白蛋白，11.1份CaCl₂；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；

(4)将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；

(5)将上述纯化石斛单细胞悬液加入所述石斛细胞培养液中，按体积比，所述纯化石斛单细胞悬液：石斛细胞培养液＝1:20，室温下100rpm摇床培养至细胞增殖即可。

优选的，步骤(1)的消毒方法为：将所述石斛置于浓度为75％的酒精中浸泡15s，再放入0.1％升汞溶液中浸泡10min。

相应的，所述细胞培养液在冻存石斛细胞中的应用。

相应的，一种利用所述细胞培养液制备的石斛细胞冻存液，由所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1组成。

相应的，一种利用所述细胞培养液冻存石斛细胞的方法，包括如下步骤：

(1)制备细胞冻存液：将所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1混匀制得；

(2)使用所述细胞冻存液将石斛细胞进行重悬，重悬后石斛细胞浓度为1～3×10⁶个/mL；

(3)将所述重悬后的石斛细胞4℃处理15min～30min，再在-80℃条件下处理24～720h，得冷冻处理后的石斛细胞；

(4)将所述冷冻处理后的石斛细胞迅速转入液氮中，封存，即冻存完成。

优选的，步骤(3)进行4℃处理后，先用棉花包裹在装有重悬后石斛细胞的容器外壁，再进行-80℃处理。

相应的，一种复苏上述所冻存的石斛细胞的方法，包括如下步骤：

(1)取出冻存的石斛细胞，快速放入37℃水浴加热环境并加热至冻存液完全融化，得初步复苏的石斛细胞；

(2)使用所述细胞培养液重悬初步复苏的石斛细胞，重悬后细胞浓度为1～3×10⁶个/mL，得石斛细胞悬液；

(3)将所述石斛细胞悬液放入所述细胞培养液中，石斛细胞悬液与细胞培养液的体积比为1:40，室温下摇床培养至细胞增殖，即完成石斛细胞的复苏工作。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明可以在没有完整植株的情况下，只使用石斛成体的一部分(如茎段、叶片、原球茎等)即可分离单细胞并进行悬浮培养，并可在短时间内获得大量具有相同遗传背景的石斛单细胞。该方法细胞获得率高、体外培养扩增快、易于长期保存、复苏后生长状况良好。

2、本发明并非是只针对某种特定石斛的获取和培养方法，而是对石斛属植物都具有普遍适用性，可实际应用到生产中。

3、本发明通过短期内快速获得大量石斛体细胞的方法，为石斛的进一步科学研究、此生代谢产物生产、大规模无性繁育等提供了有力支撑。

附图说明

图1为金钗石斛单细胞悬浮培养照片；

图2为金钗石斛细胞悬浮培养生长曲线；

图3为铁皮石斛单细胞悬浮培养照片；

图4为铁皮石斛细胞悬浮培养生长曲线；

图5为迭鞘石斛单细胞悬浮培养照片；

图6为迭鞘石斛细胞悬浮培养生长曲线。

具体实施方式

一、本发明涉及的试剂：

1、酶液：先将0.2mol/L MES 1mL，0.8mol/L KCl 2.5mL，0.8mol/L甘露醇5mL，100mg纤维素酶，40mg果胶酶，50mg离析酶，置于烧杯中混匀并完全溶解,加蒸馏水定容至10mL，55℃水浴10min；冷却后加入10mg/mL牛血清白蛋白1mL(下述简称BSA)，0.25mol/LCaCl₂ 400μL，再次混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤器将混合液过滤至无菌离心管中，即得酶液约11mL。

2、清洗液：1.1g MES，5.94g KCl，1.48g CaCl₂ 2H₂O，101mg KNO₃，50g甘露醇，加入超纯水充分溶解后定容至1L，采用NaOH溶液或稀盐酸调节溶液pH为5.8～6.0，121℃、0.1MPa高温高压湿热灭菌20min，冷却即得。

3、培养液：90mL 1/2MS(由常规MS培养基的大量元素减半得到，也可直接购买固体1/2MS溶解后获得，因市购或自配的1/2MS成分略有不同，所以密度不尽相同，最终90mL约为100～120g)、1.1g MES、30g蔗糖、100g葡萄糖、100g甘露醇、1.48g CaCl₂、1g BSA、土壤滤液20mL，加入超纯水充分溶解后定容至1L，用0.22μm无菌滤膜过滤器将混合液过滤至无菌离心管中储存。其中，所述土壤滤液为：取普通土壤30g置于50mL离心管中，往离心管中加入蒸馏水并震荡，使土壤悬浊液总体积为50mL,静置浸泡24h；浸泡后将其用滤纸过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液；将上清液分装至1.5mL离心管中，再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，并将该上清液用0.45μm无菌滤膜过滤器过滤至无菌离心管中，即得土壤滤液40mL。因不同地区土壤制备的土壤滤液密度不尽相同，所以40mL土壤滤液约为45～50g。

4、甘露醇培养液：将90mL 1/2MS，1.1g MES，1.48g CaCl₂，1g BSA，30g蔗糖，100g葡萄糖，100g甘露醇溶于蒸馏水中并定容至1L，之后采用0.22μm滤器过滤，即得甘露醇培养液。

5、冻存液：取培养液9mL,加入1mL甘油，混匀后使用0.22μm无菌滤膜过滤器过滤即得。

二、石斛单细胞的获取及悬浮培养方法

1、根据截取部分不同，分别对石斛做预处理：将石斛茎段切成0.5cm左右的小段；将叶片切成2mm左右的小块；将原球茎切成2mm左右的碎块。将处理好的材料置于浓度为75％的酒精中浸泡15s，再放入0.1％升汞溶液中浸泡10min，随后取出用无菌水冲洗2～3次。

2、将上述表面消毒过的石斛材料置于0.95mol/L的甘露醇培养液中(按重量比，石斛材料：甘露醇培养液＝1～3：50)，之后放置于完全黑暗环境中4℃暗处理1h。

3、暗处理结束后，继续在黑暗环境中，将石斛样品置于10mL酶液中，100rpm摇床黑暗震动酶解4h，释放石斛细胞。其中，针对不同来源和用量的样品，对应的酶液用量不同，此处10mL酶液对应石斛样品较理想用量为：2片叶片或2块0.5cm长的石斛茎段或直径0.5cm～1cm原球茎1个；上述石斛样品对应的重量约为1～1.5g。经试验发现，10mL酶液最多处理2g石斛样品，更多则会酶解不完全。

4、酶解出的石斛细胞经200目筛过筛后，加入2～3mL清洗液，800rpm离心5min，倒掉清洗液；再加入清洗液2～3mL重悬，800rpm离心5min，之后弃去清洗液。重复清洗和重悬3～5次，得到纯化的石斛单细胞悬液。

5、将上述处理后的纯化石斛单细胞悬液2mL加入40mL培养液中，置于100ml锥形瓶中，室温下(25℃)100rpm摇床培养。24h后出现增殖现象。

三、石斛单细胞的传代培养

1、步骤二培养的细胞，培养液呈白色浑浊状时，说明石斛单细胞浓度较高，此时对其进行传代培养。将细胞倒入离心管，800rpm离心5min，弃上清液，离心管底部即为石斛单细胞。

2、在离心管中加入新的培养液，将石斛单细胞重悬,使重悬后的细胞浓度约为1～5×10⁶个/mL。

3、取上述重悬的细胞500μL加入新的100mL锥形瓶中，每个锥形瓶含40mL无菌培养液，室温下(25℃)100rpm摇床培养约7天，至培养瓶内液体为乳白色，作为一个母瓶。若按照1：2比例(即将来自于1个母瓶的重悬细胞按重量份数分成2份，分别加入2个含有40mL培养液的锥形瓶中)进行传代，则3～5天进行一次传代培养即可。若细胞传代培养的比例降低至1：4～1：6，可适当延长传代时间，摇床震荡培养8～10天后再行传代。

四、石斛细胞的冻存与复苏

1、细胞冻存

(1)将悬浮培养的传代细胞800rpm,离心5min，弃上清液，用冻存液将细胞重悬，重悬后的细胞密度约为1～3×10⁶个/mL。

(3)将重悬后的细胞加入冻存管中，置于4℃冰箱15min～30min，之后用棉花包裹住冻存管，放入-80℃冰箱。

(4)冻存管在-80℃冰箱放置1天后即可进行液氮速冻，可在-80℃冰箱放置1天后的1个月内的任意时间将冻存管快速转移入液氮中进行冻存。

2、冻存细胞的复苏

(1)将冻存管从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中水浴加热至冻存管中细胞冻存液完全融化。

(2)将水浴加热后的冻存管放入离心机，800rpm离心5min，弃上清液，加入培养液，将冻存管中的所有细胞用1mL培养液进行重悬，重悬后密度为1～3×10⁶个/mL。

(3)将重悬的细胞置于40mL培养液中，室温下(25℃)100rpm摇床培养5～10天，待培养液变浑浊后，可按上述步骤三的方法进行传代扩增培养。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步阐释。

实施例一：金钗石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏

1、按照上述步骤二～四的方法，截取金钗石斛茎段，进行金钗石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏。金钗石斛单细胞悬浮培养7天的照片如图1所示。

2、按上述步骤三传代的细胞，细胞培养20天，每天取三个相同的细胞瓶进行称重，得到干重并计算平均值。以细胞干重为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制金钗石斛悬浮细胞生长曲线。金钗石斛细胞的生长曲线如图2所示。

图2显示：在此方法的悬浮培养下，金钗石斛细胞在12天左右生长至最大生物量。

3、将悬浮培养的传代金钗石斛单细胞按照上述步骤四的方法进行冻存和复苏，复苏后转移入含有40mL培养液的锥形瓶中培养。细胞存活率约为95％，细胞生长状况良好，12天后可达最大生物量。

实施例二：铁皮石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏

1、按照上述步骤二～四的方法，截取铁皮石斛茎段，进行铁皮石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏。铁皮石斛细胞悬浮培养7天的照片如图3所示。

2、按上述步骤三传代的细胞，细胞培养20天，每天取三个相同的细胞瓶进行称重，得到干重并计算平均值。以细胞干重为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制铁皮石斛悬浮细胞生长曲线。铁皮石斛细胞的生长曲线如图4所示。

图4显示：在此方法的悬浮培养下，铁皮石斛细胞在15天左右生长至最大生物量。

3、将悬浮培养的传代铁皮石斛单细胞按照上述步骤四的方法进行冻存和复苏，复苏后转移入含有40mL培养液的锥形瓶中培养。细胞存活率约为90％，细胞生长状况良好，15天后可达最大生物量。

实施例三：迭鞘石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏

1、按照上述步骤二～四的方法，截取迭鞘石斛茎段，进行迭鞘石斛细胞的获取、培养、冻存和复苏。迭鞘石斛细胞悬浮培养7天的照片如图5所示。

2、按上述步骤三传代的细胞，细胞培养20天，每天取三个相同的细胞瓶进行称重，得到干重并计算平均值。以细胞干重为纵坐标，培养天数为横坐标，绘制迭鞘石斛悬浮细胞生长曲线。迭鞘石斛细胞的生长曲线如图6所示。

图6显示：在此方法的悬浮培养下，迭鞘石斛细胞在15天左右生长至最大生物量。

3、将悬浮培养的传代迭鞘石斛单细胞按照上述步骤四的方法进行冻存和复苏，复苏后转移入含有40mL培养液的锥形瓶中培养，细胞存活率约为80％，细胞生长状况良好，15天后可达最大生物量。

Claims (10)

1.一种细胞培养液，其特征在于：按重量份数，总量为1000份，包括如下组分：100～120份1/2MS、1.1份MES、30份蔗糖、100份葡萄糖、100份甘露醇、1.48份CaCl₂、1份BSA、土壤滤液20～25份，余量为超纯水；所述土壤滤液制备方法为：取普通土壤浸泡于蒸馏水中24h，浸泡后过滤，将滤液以3000rpm离心5min，取上清液，将上清液再以10000rpm离心5min，再次提取上清液，过滤，即得。

2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于：所述土壤滤液的上清液过滤时，过滤孔径为0.45μm。

3.权利要求1或2所述细胞培养液在培养石斛细胞中的应用。

4.一种以权利要求1或2所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)石斛预处理：破碎石斛，消毒、洗净；

(2)按权利要求1的方法制备不含土壤滤液的细胞培养液，得甘露醇培养液；将所述预处理后的石斛置于甘露醇培养液中，按重量比，石斛：甘露醇培养液＝1～3：50，4℃暗处理1h；

(3)将暗处理后的石斛取出置于酶液中，黑暗震动酶解4h，按质量比，所述石斛：酶液＝0.1～2:11；所述酶液的组分按重量份数为：39份MES、149份KCl、729份甘露醇、100份纤维素酶、40份果胶酶、50份离析酶、10份牛血清白蛋白、11.1份CaCl₂；将所述酶液各组分完全溶解于水中，混匀并经0.22μm过滤后，即得酶液；

(4)将酶解出的石斛细胞清洗和重悬3～5次，得纯化石斛单细胞悬液；

(5)将上述纯化石斛单细胞悬液加入所述石斛细胞培养液中，按体积比，所述纯化石斛单细胞悬液：石斛细胞培养液＝1:20，室温下100rpm摇床培养至细胞增殖即可。

5.根据权利要求4所述细胞培养液培养石斛细胞的方法，其特征在于：步骤(1)的消毒方法为：将所述石斛置于浓度为75％的酒精中浸泡15s，再放入0.1％升汞溶液中浸泡10min。

6.权利要求1或2所述细胞培养液在冻存石斛细胞中的应用。

7.一种利用权利要求1或2所述细胞培养液制备的石斛细胞冻存液，其特征在于：由所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1组成。

8.一种利用权利要求1或2所述细胞培养液冻存石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备细胞冻存液：将所述细胞培养液和甘油按体积比为9:1混匀制得；

(2)使用所述细胞冻存液将石斛细胞进行重悬，重悬后石斛细胞浓度为1～3×10⁶个/mL；

(3)将所述重悬后的石斛细胞4℃处理15min～30min，再在-80℃条件下处理24～720h，得冷冻处理后的石斛细胞；

(4)将所述冷冻处理后的石斛细胞迅速转入液氮中，封存，即冻存完成。

9.根据权利要求8所述冻存石斛细胞的方法，其特征在于：步骤(3)进行4℃处理后，先用棉花包裹在装有重悬后石斛细胞的容器外壁，再进行-80℃处理。

10.一种复苏权利要求8或9所冻存的石斛细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取出冻存的石斛细胞，快速放入37℃水浴加热环境并加热至冻存液完全融化，得初步复苏的石斛细胞；

(2)使用所述细胞培养液重悬初步复苏的石斛细胞，重悬后细胞浓度为1～3×10⁶个/mL，得石斛细胞悬液；

(3)将所述石斛细胞悬液放入所述细胞培养液中，石斛细胞悬液与细胞培养液的体积比为1:40，室温下摇床培养至细胞增殖，即完成石斛细胞的复苏工作。