CN103509752A - 湖北白猪胎儿成纤维细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，利用妊娠35天的湖北白猪胎儿，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.C201331。本发明得到的湖北白猪胎儿成纤维细胞系纯度高，形态一致，无上皮细胞、肝脏细胞、心肌细胞等的混杂。本发明所建细胞系可为基因工程、细胞工程、胚胎工程、免疫学和分子生物学提供高品质的细胞素材；可作为猪体细胞核移植的供体细胞；是重要的基因资源库，可作为优良地方品种的保种手段之一。

Description

湖北白猪胎儿成纤维细胞系

技术领域

本发明涉及一种湖北白猪胎儿成纤维细胞系与相关生物学特性，属于细胞生物学领域。 

背景技术

生物基因资源是人类社会存在与发展的根本和基础，是实现社会持续发展，维护国家粮食、生态安全和社会稳定的战略性资源。近年来，由于地球生态环境的不断恶化，生物基因资源面临严重危机，有的甚至濒临衰竭、消亡。生物基因资源的保护、开发和利用已经引起世界各国政府的高度重视。挽救濒危物种、保存基因资源、加强开发利用已成为当务之急。 

我国幅员辽阔，地大物博，具有多彩多姿的生态、地理、气候条件，加之拥有较多的民族及风格迥异的生活习惯，在长期的社会发展和民族融合过程中，广大劳动人民驯化、培养、选育了数目众多的优良畜禽品种。如产于关中平原一带的秦川牛、华北平原的鲁西黄牛，是我国发展肉牛养殖业的优秀基因资源；滩羊和中卫山羊是裘皮中的上品；太湖猪的高繁殖力举世闻名；五指山猪、广西巴马猪、贵州小香猪等则是典型的小型猪的代表，对生物医学研究具有重要意义。 

尽管我国拥有大量的优良畜禽品种，但是受到人们认识的限制和现代社会消费需求的影响，大多数品种的生产力较低，产品的数量和质量难以满足人们的需求。因此在农业发展的过程中，一些地方优良品种逐渐为外来品种、杂交品种所取代，地方品种的种群数量减少，基因资源流失。另外，由于大量引进外国品种、生态环境恶化、人类过度利用等，优良畜禽基因资源状况堪忧。这将严重影响和制约我国农业的发展和竞争力。因此在世界各国展开基因资源抢夺和保护生物多样性的今天，通过现代生物技术的运用，妥善保存优良品种的基因资源，具有重大战略意义。 

湖北白猪是我国培育成功的肉猪品种之一,湖北白猪原产于湖北武汉市，后引种推广至邻近几省，该品种是选用英国大白猪，丹麦、英国、瑞典和法国的长白猪与地方猪种湖北通城猪杂交，经多年的群体继代选育而成。主要分布于华中地区。湖北白猪体格较大，全身被毛全白，头稍轻、直长，两耳前倾或稍下垂，背 腰平直，中躯较长，腹小，腿臂丰满，肢蹄结实，有效乳头12个以上。成年公猪体重250～300公斤，母猪体重200～250公斤。该品种具有瘦肉率高、肉质好、生长发育快、繁殖性能优良等特点。6月龄公猪体重达90公斤；25～90公斤阶段平均日增重0.6～0.65公斤，料肉比3.5：1以下，达90公斤体重为180日龄，产仔数初产母猪为9.5～10.5头，经产母猪12头以上，以湖北白猪为母本与杜洛克和汉普夏猪杂交均有较好的配合力，特别与杜洛克猪杂交效果明显。杜×湖杂交种一代肥育猪20～90公斤体重阶段，日增重0.65～0.75公斤，杂交种优势率10%，料肉比3.1～3.3：1，胴体瘦肉率62%以上，是开展杂交利用的优良母本。 

然而，在多年的生产中，由于对湖北白猪的过度使用和忽视原种培育等因素，湖北白猪自身的优异基因资源未能得到有效推广，近年来甚至出现萎缩势头，这直接影响到该品种的生存，对我国畜牧业将造成不能估量的损失。因此，对该品种基因资源进行有效保藏，将是延续其优良性能的有力手段。 

目前保存生物基因资源的最佳手段是体细胞冻存。这是因为该方法简单易行，稳定可靠，且在多个物种基因资源的保藏中得到广泛运用。而且，该方法获得的体细胞适合体外大规模培养，便于开展各类研究。本发明即是采用通行的体细胞冻存法，获得了形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学。保藏编号为CCTCC No：C201331，保藏日为2013年3月26日，命名为猪属家猪种（Sus Scrofa domesticus）湖北白猪胎儿成纤维细胞系。 

本发明还提供上述细胞系的分离、培养、传代和冻存方法及相关生物学特性。 

为实现上述目的，本发明采取了如下技术方案： 

(1)湖北白猪胎儿成纤维细胞的分离 

将发育至35天的湖北白猪胎儿从母体内取出，在灭菌的超净工作台上，首先用加1%青链双抗的DPBS（杜氏磷酸缓冲液）洗涤6-8遍，尽可能去除外源污染物质；用消毒的镊子取出背部及臀部的肌肉组织，用剪刀剪成体积约1mm³细小碎块，尽可能去除内脏及头部组织以防止混杂其它类型的细胞。用胰酶消化液消化组织碎块，培养于39℃、饱和湿度、5%CO₂的培养箱内。培养基配方为DMEM+10%胎牛血清。 

(2)湖北白猪胎儿成纤维细胞的原代培养 

密切观察上述步骤中培养的细胞。开始培养的3-5天后，即可观察到成纤维细胞从组织块的边缘向四周扩散。此时每隔3天左右更换新鲜培养基，直到成纤维细胞铺满整个培养板底部。 

(3)湖北白猪胎儿成纤维细胞的传代培养 

待步骤(2)中的原代细胞汇合度达到100%时，将废弃的液体培养基倒掉，用预热至39℃的加1%青链双抗的DPBS（杜氏磷酸缓冲液）洗涤2次，以彻底去除残留培养基。加入胰蛋白酶消化细胞，再加入等体积完全培养基中和胰蛋白酶，吸打细胞成为单细胞悬液，平均分到2-3个培养瓶内，培养于39℃、饱和湿度、5%CO₂的培养箱内。 

(4)湖北白猪胎儿成纤维细胞的冻存 

待传代细胞的汇合度达到100%时，去除废弃培养基，DPBS洗涤，胰酶消化为单细胞悬液，转移到新鲜灭菌的1.5ml离心管内，在台式离心机上以6000rpm、2min将细胞聚集于管底，彻底去除上清，加入细胞冻存液。冻存液的配方为DMEM：胎牛血清：DMSO=6:3:1。仍然将细胞混匀，用棉花包裹，先在-80℃超低温冰箱内冻存过夜，第二天将细胞转移到液氮内长期保存。注意标明日期和样品名称。 

(5)湖北白猪胎儿成纤维细胞的复苏与存活率测定 

从液氮内取出1管冻存的细胞，迅速置于39℃温水浴内不断摇晃使其融化。吸出细胞后加到培养瓶内，在补加适当体积的完全培养基，轻轻摇晃混匀，培养于39℃、饱和湿度、5%CO₂的培养箱内。采用台盼蓝斥染法计算细胞存活率。取出适量细胞加到台盼蓝染液内，光学显微镜下计数蓝色细胞数，细胞存活率的计算公式为：存活率=(1-蓝色细胞数/总细胞数)×100%。 

(6)湖北白猪胎儿成纤维细胞的倍增时间测定 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml的密度铺到24孔板内，从第二天开始以血球计数板每隔24小时计数细胞总数，至第五天停止。按照细胞数量绘制其生长曲线，得到其倍增时间。 

(7)湖北白猪胎儿成纤维细胞的核型分析 

用秋水仙素处理生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞使其停在分裂中期，经 固定、Giemsa染色、镜检等，获取100个分裂相的染色体照片，统计整二倍体细胞的出现比例。湖北白猪细胞二倍体的染色体数目为2n=38。 

(8)湖北白猪胎儿成纤维细胞的G418耐受性测试 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml密度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照下列G418浓度加药：200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，放回到培养箱内继续培养。定期观察细胞的死亡情况。当在第7天时引起细胞全部死亡的G418浓度，作为该细胞系的最佳筛选浓度。 

(9)湖北白猪胎儿成纤维细胞摄取外源基因的能力测试 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml密度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照Lipofectamine2000说明书进行转染，报告载体为pEGFP-N1。48小时后计数绿色荧光蛋白的细胞比例，计算该细胞系的转染效率，作为评价其摄取外源基因能力的指标。 

(10)湖北白猪胎儿成纤维细胞的转基因细胞系的筛选 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照50%汇合度铺板于24孔板，第二天更换为新鲜完全培养基后，按照Lipofectamine2000说明书进行转染，报告载体为pEGFP-N1。48小时后，按照测定的浓度加入G418，筛选7天，此时可见发出均匀绿色荧光的单克隆。采用胰酶点消化法分离单克隆后，在培养板内扩大培养，得到足量的带有外源报告基因的转基因单克隆细胞。 

(11)湖北白猪胎儿成纤维细胞的重编程能力 

将步骤(10)分离到的转基因单克隆细胞通过核移植的方法，注射到去核的体外成熟猪卵母细胞内，经过融合、激活、体外培养，在荧光显微镜下观察重构胚的卵裂、荧光表达等，评价其发育能力，即重编程能力。 

本发明所提供的湖北白猪胎儿成纤维细胞系，可以作为猪体细胞核移植的供体细胞使用。 

本发明利用妊娠35天的湖北白猪的胎儿，取出背部及臀部的肌肉组织，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。本发明对其培养、传代、冻存等体系进行了标准化和规范化，并对其生物学特性进行了研究。该细胞系可为 基因工程、细胞工程、胚胎工程、免疫学和分子生物学提供高品质的细胞素材；可作为猪体细胞核移植的供体细胞；在畜牧业上能为丰富并改良地方品种提供优异的实验材料；是重要的基因资源库，可作为优良地方品种的保种手段之一；可为基因功能解析、信号转导等基础研究提供优良的细胞模型；是建立猪诱导干细胞和转分化细胞的重要原始素材。 

附图说明

图1湖北白猪胎儿成纤维细胞原代培养照片 

将妊娠35天的湖北白猪胎儿用剪刀剪成细小碎片，用胰酶消化后接种到培养板内，添加完全培养基于培养箱内培养。在第5天左右，可在光学显微镜下观察到有成纤维细胞从组织块周围溢出，并向四周扩散。图中视野的放大倍数为20×。 

图2湖北白猪胎儿成纤维细胞生长曲线 

湖北白猪胎儿成纤维细胞的生长呈现“S”形，即在一定密度接种后，其生长密度以“慢-快-慢”的形式递增。第1天为适应期，此后进入快速增值期，在第4天后进入平台期。平均倍增时间为24小时，属于生长旺盛的细胞类型。图中数据点表示三个生物学重复的均数(Mean)，误差棒表示标准差(SEM)。 

图3湖北白猪胎儿成纤维细胞核型 

猪的染色体数目为2×19=38条。采用DAPI染色法分析处于分裂中期的染色体形态特征，采用LSM510META共聚焦显微镜成像，LSM Image Examiner分析图像。图中显示所分离的湖北白猪胎儿成纤维细胞具有19对清晰染色体，表明核型正常。 

图4湖北白猪胎儿成纤维细胞G418耐受性 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照一定密度接种后加入G418浓度梯度进行耐药实验，以在第7天全部死亡的细胞作为该细胞系的最佳筛选浓度。图中显示在600μg/ml的G418作用下，该细胞系在第7天的时候全部死亡。低于此浓度，细胞仍然存活；高于此浓度，细胞提前开始全部死亡。灰色三角为该浓度的作用曲线。图中数据点表示三个生物学重复的均数(Mean)，误差棒表示标准差(SEM)。 

图5湖北白猪胎儿成纤维细胞的转染效率 

以红色荧光蛋白表达载体pDsred-monomer为报告基因，按照脂质体 Lipofectamine2000的标准步骤转染湖北白猪胎儿成纤维细胞，48小时后观察红色荧光蛋白的表达并计算转染效率。左图为亮视野，右图为红色荧光视野。转染效率为75%。 

图6湖北白猪胎儿成纤维细胞的转基因细胞系单克隆 

将报告载体pEGFP-N1转染于湖北白猪胎儿成纤维细胞，G418筛选，胰酶点消化法挑取单克隆。图中为正在生长的转基因单克隆细胞系，可见所有细胞发出均匀绿色荧光。 

图7湖北白猪胎儿成纤维细胞的重编程能力 

将表达EGFP的单克隆转基因细胞作为核供体，以体外成熟的猪卵母细胞作为受体，采用盲吸法去核、移植、融合、激活，体外培养，观察重构胚的卵裂和EGFP的表达水平。以无供体细胞的猪孤雌胚作为对照。左上图为孤雌胚的亮视野，右上图为孤雌胚的荧光视野，左下图为重构胚的亮视野，右下图为重构胚的荧光视野。图中显示孤雌胚在荧光激发下无荧光细胞，证明孤雌胚本身的背景荧光极低；而重构胚在荧光激发下发出明亮的绿色荧光，证明重构胚卵裂球的荧光是来自表达EGFP的供体细胞，说明湖北白猪胎儿成纤维细胞具有重编程能力，可以用于体细胞核移植以及相关研究。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件和方法者，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等著，黄培堂等译，科学出版社，2002，分子克隆实验指南第三版所建议的条件。 

实施例1湖北白猪胎儿成纤维细胞的分离与原代培养。 

(1)材料 

(2)方法 

手术取出妊娠35天湖北白猪的胎儿，用生理盐水洗涤6-8次，尽可能将残留的血液、体液等冲洗干净，防止细菌、病毒等的污染。 

在超净工作台内用镊子和剪刀将胎儿躯体剪碎，内脏、头部、眼等组织器官丢弃，只保留背部和臀部的组织，将其剪成细小碎组织块。 

将组织碎块转移到新鲜的离心管内，加入适量生理盐水，一边洗涤，一边用镊子将其尽可能研磨成为碎片。重复3次。 

加入胰蛋白酶溶液，于4℃静置过夜，使胰酶消化结缔组织等。 

第二天离心去除胰酶，将组织碎片转移到6孔板内，每个孔放10-15块碎片，加入完全培养基，放到培养箱内培养。 

每3天更换新鲜培养基，并随时观察污染情况。如有污染，及时将其用70%乙醇擦洗、清除。 

培养到第5天时，可见组织碎片周围有成纤维细胞溢出，并向四周扩散。此即为原代成纤维细胞。 

待原代细胞长满整合培养板后，用消毒的镊子将残余组织碎片去除丢弃，更换新鲜培养基。此时的成纤维细胞即可用于传代、冻存等。 

实施例2湖北白猪胎儿成纤维细胞的传代、冻存与复苏及存活率测定。 

(1)材料 

(2)方法 

待原代细胞长满整合培养板后，用胰酶溶液消化后按照10⁴个细胞/ml的密度接种到相应的细胞培养板上，放回到培养箱内培养。此即传代。 

待细胞长满培养板底部之后，用胰酶溶液消化为单细胞悬液，转移到新鲜灭 菌的1.5ml离心管内，在台式离心机上以6000rpm、2min将细胞聚集于管底，彻底去除上清，加入细胞冻存液。冻存液的配方为DMEM：胎牛血清：DMSO=6:3:1。仍然将细胞混匀，用棉花包裹，先在-80℃超低温冰箱内冻存过夜，第二天将细胞转移到液氮内长期保存。注意标明日期和样品名称。 

从液氮内取出1管冻存的细胞，迅速置于39℃温水浴内不断摇晃使其融化。吸出细胞后加到培养瓶内，在补加适当体积的完全培养基，轻轻摇晃混匀，培养于39℃、饱和湿度、5%CO₂的培养箱内。 

采用台盼蓝斥染法计算细胞存活率。取出适量细胞加到台盼蓝染液内，光学显微镜下计数蓝色细胞数。细胞存活率的计算公式为：存活率=(1-蓝色细胞数/总细胞数)×100%。该细胞系的存活率达到90%。 

实施例3湖北白猪胎儿成纤维细胞的倍增时间测定 

(1)材料 

(2)方法 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml的密度接种到24孔板上，共接种3×6=21孔，放回到培养箱内培养。 

从第二天开始(即24小时后)，每隔1天用胰蛋白酶溶液消化3孔细胞成为单细胞悬液，用红细胞计数板计数细胞密度。每次计数相当于有3个生物学重复。 

将6次实验的数据输入到Prism5软件内，绘制该细胞的生长曲线。 

实施例4湖北白猪胎儿成纤维细胞核型分析 

(1)材料 

(2)方法 

在培养终止前加秋水仙素，处理2h。 

胰酶处理细胞，收获细胞，1000转/分离心5分钟。 

用2-5ml的0.56%KCl溶液悬浮细胞，37℃水浴20分钟。这些处理步骤的目的是使细胞成为悬浮的单细胞。 

加0.8-2ml的固定液（3∶1，甲醇∶冰醋酸）至细胞低渗液中，轻轻混匀。 

1000转/分离心悬液5分钟，用1ml新的固定液重新悬浮细胞； 

制片前根据悬浮细胞数调整悬液的体积； 

直接滴加细胞悬液至1-2片玻片上，每片2个杂交区（每个区域15-25μL细胞悬液）； 

晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片； 

在DAPI/PI中进行复染。 

使用LSM510META共聚焦显微镜观察核型。 

使用LSM Image Examiner分析图像。 

实施例5湖北白猪胎儿成纤维细胞G418耐受性测试 

(1)材料 

(2)方法 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml的密度接种到24孔板上，共接种3×11=33孔，放回到培养箱内培养。 

从第二天开始(即24小时后)，按照下列G418浓度加药耐药性测试：200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml。 

每3天更换新鲜培养基但保持各自G418的浓度不变。 

筛选到第7天时，引起细胞全部死亡的G418浓度作为该细胞系进行单克隆筛选的最佳药物作用浓度。 

实施例6湖北白猪胎儿成纤维细胞对外源核酸摄取能力检测 

(1)材料 

(2)方法 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml的密度接种到24孔板上，接种3孔，放回到培养箱内培养。 

24小时后进行细胞转染，体系如下： 

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Opti-MEM	-	47μl	-
pDsRed-mpnomer	500ng/μl	1μl	10ng/μl
				Lipofectamine2000	10mg/ml	2μl	400ng/μl
总体积		50μl

将上述成分混匀后室温放置20分钟，然后逐滴加到培养板内，放回到培养箱内培养。 

48小时后再荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达水平。根据荧光细胞的数目计算转染效率，公式为转染效率=荧光细胞数/视野内总细胞数×100%。 

实施例7湖北白猪胎儿成纤维细胞的转基因细胞系的筛选 

(1)材料 

(2)方法 

将生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞按照10⁴个细胞/ml的密度接种到24孔板上，接种3孔，放回到培养箱内培养。 

24小时后进行细胞转染，体系如下： 

成分	初始浓度	用量	终浓度
				Opti-MEM	-	47μl	-
pEGFP-N1	500ng/μl	1μl	10ng/μl
				Lipofectamine2000	10mg/ml	2μl	400ng/μl
总体积		50μl

将上述成分混匀后室温放置20分钟，然后逐滴加到培养板内，放回到培养箱内培养。 

转染24小时后开始加药，G418浓度为600μg/ml。持续筛选7天。 

第7天后，单克隆细胞出现在培养板底部，此时更换新鲜培养基，G418浓度降至300μg/ml。 

待单克隆细胞长到肉眼可辨，即用胰酶点消化法将克隆点挑出，转移到6孔板上继续培养。待长到一定数量后，可进行冻存及分子生物学分析。 

实施例8湖北白猪胎儿成纤维细胞的重编程能力 

(1)材料 

(2)方法 

猪卵巢从当地屠宰场采集，摘取新鲜卵巢立即置于盛有26～37℃生理盐水（含青、链霉素各20万IU/L和15万IU/L）的保温瓶内，2小时内送回实验室，用适量生理盐水（26～37℃）冲洗3～5遍，盛于500ml烧杯中，放在水浴锅（37℃）里。用镊子夹取卵巢，再用生理盐水润湿灭菌纱布包裹，采用10ml注射器（16号针头）抽吸直径为3～8mm的卵泡，吸取的卵泡液汇集到置于37℃水浴保温的尖底灭菌试管中，静置15～20min，弃上清液，取试管底部卵泡液于表面皿中，实体显微镜下观察，捡取卵丘卵母细胞复合体（COCs），转移到DPBS液滴中，冲洗3遍，将COCs分成两份在TCM199培养基中洗2遍。最后将COCs分为A、B、C（A级：包裹5层以上卵丘颗粒细胞，B级：包裹3-5层卵丘颗粒细胞的卵母细胞，C：包裹3层以下卵丘颗粒细胞的卵母细胞）三级分别培养。 

卵母细胞的成熟培养采用微滴法培养。微滴法是将35mm的培养皿平均分成4个扇形，每个扇形作成50μL微滴并覆盖矿物油，在CO₂培养箱内平衡2h以上，滴10～15枚COCs，在39℃，100％湿度，5％CO₂培养箱中培养。在0～22h添加10IU/mlPMSG和hCG，后22～44h不加激素。间隔24h调换约1/2～2/3的培养液，并于倒置显微镜下观察卵丘细胞扩散状态。 

COCs培养44h，在4×10倍实体显微镜下观察，将卵丘扩散良好，胞质发育均匀的COCs转移到0.1％透明质酸酶溶液中，用移液器轻轻吹打脱去颗粒细胞，以第一极体排出作为卵母细胞成熟的主要标准。 

成熟的卵母细胞移入装有去卵丘培养液的1.5mL离心管。剧烈的涡旋卵母细胞4～5min，把卵母细胞转入含有操作培养基的35mm平皿中。选择形态正常、具完整质膜、圆形和明显的卵周隙且排出第一极体的卵母细胞，在TCM199+10%FBS的培养液中洗涤3次，保存于胚胎操作液，放入CO₂培养箱中待用。 

以前述步骤得到的表达EGFP的单克隆转基因细胞系为核供体，将冷冻保存的供体细胞在39℃水浴快速复苏，离心去除上清液，把细胞传到含有细胞培养基的培养皿中。待细胞长至70～80%汇合时，用胰酶消化细胞，离心收集细胞，加入200μL胚胎操作液重悬细胞，室温下放置细胞30min，备用。 

成熟的猪卵母细胞采用盲吸法吸出卵母细胞的第一极体，卵母细胞的细胞核位于第一极体的附近，不要破坏卵母细胞的细胞膜。去核后拔出移核管即完成，把细胞质连同染色体和极体推出移核管。把去核卵母细胞和供体细胞放入同一去核培养液滴中，放入100mm平皿中，上面覆盖有轻质矿物油的显微操作培养基的液滴。5分钟后用显微操作仪进行去核操作。在显微镜下用持卵管从极体对侧固定卵母细胞，用外径20-25μm的斜口去核管吸出极体及附近少许胞质，完成去核操作。 

采用胞质内直接注射法，注射完整的供体细胞到卵母细胞卵黄周的（perivitelline）位置。通过显微操作用移核管吸取单个供体细胞后注入卵母细胞透明带的裂口处。当移核管拔出时，膜的刺破部位应立即自动封闭。注射完成后培养30min，检测卵母细胞质膜完整性，弃去裂解卵，对完整的存活卵进行激活操作。注射时尽可能少注射培养基到卵母细胞，并确定卵母细胞膜被穿透和供体核留在卵母细胞内。 

注射完后通过电脉冲使供体细胞和受体卵母细胞融合。在融合和激活前注射后的卵母细胞保持在含有BSA的PZM-3中。移植结束后，应立即融合激活。激活于进行胞质注射后进行，采用电激活方法激活重组卵。BTX Electro-Cell Manipulator200（BTX，San Diego，CA）激活参数为：2次间隔1s的110V/mm直流脉冲，时程20μs。融合的胚胎在500mL含有BSA的PZM-3中培养，上覆盖矿物油。胚胎保持30min后计算融合率。 

重构胚激活后，用胚胎培养液洗3次，移入含有500μL胚胎培养液的四孔板中培养，上面覆盖轻质矿物油，培养条件为39℃、5%CO₂和饱和湿度。培养40h统计卵裂率，荧光显微镜下观察卵裂球的EGFP表达水平。 

Claims (3)

1.湖北白猪胎儿成纤维细胞系，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.201331。

2.权利要求1所述的湖北白猪胎儿成纤维细胞系的制备方法，其特征在于，利用妊娠35天的湖北白猪的胎儿，取出背部及臀部的肌肉组织，经机械剪切和胰酶消化，通过原代培养、传代培养、液氮冻存、细胞复苏，最终获得形态均一、生长旺盛的湖北白猪胎儿成纤维细胞系。

3.权利要求1所述的湖北白猪胎儿成纤维细胞系作为猪体细胞核移植的供体细胞的用途。

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