CN101889552B

CN101889552B - 芒的快速繁殖方法

Info

Publication number: CN101889552B
Application number: CN2010102595441A
Authority: CN
Inventors: 易自力; 肖亮; 蒋建雄; 陈智勇; 覃静萍; 黄丽芳
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2010-08-23
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2030-08-23
Also published as: CN101889552A

Abstract

本发明公开了一种芒的快速繁殖方法，选取芒的幼穗，升汞消毒清洗后切成穗段，接种在MS+2，4-D2.0～5.0mg/L+6-BA0.5～2.0mg/L+椰子汁100～500ml/L的培养基上，诱导形成愈伤组织；将愈伤组织转入MS+6-BA0～2.0mg/L+1-5％蔗糖的培养基上，形成分化出根的分化苗；将获得的分化苗转入MS+6-BA1.0～4.0mg/L+IAA0～0.5mg/L+NAA0～0.5mg/L培养基上增殖，最后移栽。本发明的方法增殖生根同步化，从外植体接种至完整植株形成只需30～35天，建立了一种高频稳定再生体系。本发明为芒的大规模种植提供了一种周期短、繁殖率高、成本低廉，操作简单的育苗方法。

Description

芒的快速繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种芒属植物芒的组织培养方法。

背景技术

因矿物能源短缺和全球气候变暖是世界各国所面临的严峻问题，研究和开发清洁能源就成为当今国际社会的主要课题之一。生物质能是一类既有助于减轻温室效应，又可替代部分石油、煤炭等化石燃料的绿色能源。利用生物质制取液体燃料是可再生能源的重要发展方向，以玉米、木薯、甘蔗、甜高梁、能源禾草等为原料制取的乙醇和生物柴油，可作为交通替代燃料。在石油资源逐渐减少，石油消费日益增长的当今世界，一些国家已把发展生物质替代燃料作为减少石油消费，增强能源安全的重要措施。

能源禾草通常是指那些植株高大、生长速度快、目具有高生物质产量的多年生根茎禾草(PRG)，特别是C4禾草。欧美国家对上千种植物进行比较研究，结果认为芒属植物是最有潜力的能源作物之一，是第二代生物燃料——纤维素乙醇的首选原料。芒属为高光效的C4植物，生物质产量高，干物质产量可达30～60t/ha；生长过程中消耗的CO₂多，有利于缓解大气温室效应；干物质中纤维素和半纤维素含量68％以上，灰分含量5％以下；燃烧热值高，达18MJ/kg以上，1吨干物质相当于4桶原油。根据我国建设节约型社会，发展循环经济和建设现代化生态农业的要求，以可再生能源代替传统能源，以生物有机肥代替化学肥料是今后发展的必然趋势。

芒(M.sinensis)属于芒属(M iscanthus spp.)植物，为禾本科的多年生高大草本，栽培成本低，适合于利用各种边际土地种植。据调查，我国具有丰富的芒属种质资源，在我国除了新疆、西藏、青海之外的其它省市均有分布，这些种质资源中蕴藏有高产、优质、抗盐碱、抗涝、抗旱、抗寒等优良的基因资源。丹麦从上世纪60年代就开始了以芒属能源禾草作为能源作物的研究。目前欧美国家政府或生物技术公司均投入大量人力和经费选育芒属植物的新品种、高产栽培和加工技术等开展研究，并逐步实现了产业化开发；对这类植物的研究、开发和利用正进行得如火如荼，倍受瞩目的草种有柳枝稷(Panicum virgatum L.)、芒类(M iscanthusspp.)、芦竹(A rundo donax L.)等(生态学报，2008，28(5))。

芒属植物作为纤维素乙醇的首选材料，在我国的资源十分丰富，但基本上处于野生状态，我国虽然已经开始进行能源植物的开发和应用研究，但与西方发达国家相比，还有较大的差距，要逐步实现产业化，才能真正满足市场的需求。但工厂化生产往往是百万计、甚至以千万计，显然，常规的繁殖技术无法在很短的时间内提供数量如此庞大的种苗，繁殖系数甚高是植物组织培养的主要优势。目前，植物组织培养通常要经过3个阶段，即外植体建立阶段、增殖培养价段、生根培养阶段，在这3个阶段中所用培养基不相同，需要通过继代转苗培养，不同阶段以及不同基因型要求不同配比的生长调节素，不仅生产成本高，而且在大批量生产过程中，往往因操作失误导致污染，提高了生产成本。中国从事植物组培的人数和实验室面积均居全世界之首，但经济效益不理想，其中试管苗成本偏高是重要原因之一。那么，如何降低成本，生产大量廉价的优良植株是人们所期望的、成本的高低直接关系再生产和扩大再生产的顺利进行。降低生产成本是提高产业化经济效益的根本途径，但降低生产成本的实质就是要提高工厂化组培技术水平。本发明方法基于上述问题，以期得到芒属植物芒的一次性成苗的最佳培养方法，减少移苗次数，缩短培养周期，简化操作程序，为工厂化生产奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的芒的植物组织培养方法，该方法培养的愈伤组织诱导率高，分化率高，增殖系数高，稳定性好，能在较短的时间内获得大量生长健壮的试管苗，而且该方法，操作简便、生产成本低，非常适合工业化生产。

本发明的目的是通过下述方式实现的：

一种芒的快速繁殖方法，包括以下步骤：

1)外植体消毒

选取芒的幼穗，用0.1％升汞消毒12～18分钟，无菌水清洗4～6次备用；

2)愈伤组织诱导

将消毒处理后的幼穗切成穗段，接种在MS+2，4-D2.0～5.0mg/L+6-BA0.5～2.0mg/L+椰子汁100～500ml/L(优选MS+2，4-D5.0mg/L+6-BA1.0mg/L+椰子汁200ml/L)的愈伤组织诱导培养基上，培养3～7天开始形成愈伤组织，诱导率高达92％以上，培养18～25天形成直径0.8-1.2cm大小的愈伤组织；

3)愈伤组织分化

将愈伤组织转入MS+6-BA0～2.0mg/L+1-5％蔗糖的培养基(优选MS+3％蔗糖)上，3～5天开始分化芽点，分化率最高达到100％；当芽长至2cm左右高时，同步分化出根，10～15天形成完整植株，得到分化苗；

4)增殖与生根

将获得的分化苗转入MS+6-BA1.0～4.0mg/L+IAA0～0.5mg/L+NAA0～0.5mg/L增殖培养基上，25-35天为一个增殖周期；能保持高速度递增，增殖倍数达到4.5以上，同步生根率达到85％以上；

5)移栽：将试管苗移栽到基质中，移栽1个月后，移栽成活率达到90％以上。

步骤(1)所述的外植体消毒过程中，外植体选取是在芒的孕穗初期，叶枕距为2～4cm长时，选取芒的生长健壮的幼穗。

步骤(2)所述的愈伤组织诱导过程中，将消毒处理后的幼穗切成0.8-1.2cm长的穗段接种，培养的条件为200-350lux光照，温度24±2℃。

步骤(3)所述的愈伤组织分化过程中培养的条件为1000-2000lux光照，温度24±2℃；

步骤(4)所述的增殖与生根过程中培养的条件为1000-2000lux光照，温度24±2℃，湿度80％：

步骤(5)所述的移栽是将试管苗移栽到土∶灰＝4∶1基质中，保水保湿。

本发明提出的芒的植物组织培养方法，利用其幼穗为外植体，使得外植体取材容易，数量大，仅需1～2个幼穗，就能获得大量的愈伤组织；在愈伤组织诱导培养基中添加天然椰子汁，对愈伤组织诱导有促进作用，仅需培养18～25天形成1cm左右大小的愈伤组织，愈伤组织转入到无激素的MS基本培养基上，分化率更高，方法简单。从外植体接种至完整植株形成仅需30～35天；在增殖过程中能同步增殖和生根，试管苗移栽到天然泥土与灰混合基质中，营养成分高，方法简单，移栽成活率高。用本发明方法建立的芒高效再生系统为芒属植物的大规模种植提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。

附图说明

图1：幼穗诱导愈伤组织；

图2：愈伤组织分化得到绿芽；

图3：绿芽增殖；

图4：生根培养。

具体实施方式

表1不同实施例愈伤组织诱导培养基配方

表2不同实施例愈伤组织分化培养基配方

表3不同实施例分化苗增殖生根培养基配方

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1

取材：芒(M.sinensis)幼穗为外植体。

1、材料：孕穗初期，叶枕距2～4cm长时，选取生长健壮的芒(M.sinensis)幼穗，用0.1％升汞消毒12～18分钟，清洗4～6次后备用；

2、愈伤组织诱导：将消毒处理后的幼穗切成1cm左右长，接种在MS+2，4-D5.0mg/L+6-BA1.0mg/L+椰子汁200ml/L愈伤组织诱导培养基上，在培养室弱光培养，保持温度24±2℃；培养3天左右开始形成愈伤组织，18天左右形成1cm左右大的愈伤组织，愈伤组织诱导率最高达到100％；

3、愈伤组织分化：将愈伤组织转入MS+3％蔗糖无激素培养基上，接种量为8-11个/瓶，3天后开始分化芽点，分化率最高达到100％；当芽长至2cm左右高时，同步分化出根，10天左右形成完整植株；

4、增殖生根：将获得的分化苗转入MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.1mg/L+NAA0.2mg/L增殖培养基上，接种量为4-6个/瓶，30天为一个增殖周期，能保持高速度递增，增殖倍数达到4.5以上，同步生根率达到85％以上；

5、移栽：选取根系生长良好的试管苗，移栽到土∶灰＝4∶1基质中，注意保水保湿，移栽1个月后，移栽成活率达到90％以上。

本发明所提供的芒、五节芒组织培养繁殖方法，幼穗为外植体，相对芽、种子取材容易，数量大，出苗快，分化率高，稳定性高，生长良好，移栽基质实惠，移栽方法简单等优势，能在最短的时间内实现产业化。

实施例2

芒、幼穗为外植体，基本操作方法同实施例1一致，但其愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+椰子汁200ml/L，愈伤组织诱导率达到92％以上，分化培养基为MS+6-BA 1.0mg/L培养基，5天后开始分化芽点，分化率达到90％以上；当芽长至2cm左右高时，同步分化出根，从接种至完整植株形成需35天左右；将所获得的不定芽切下接种在增殖培养基为MS+6-BA4.0mg/L+IAA0.2mg/L+NAA0.2mg/L上，30天为一个增殖周期，保持高速度递增，增殖系数达到4.5以上。

Claims

1.一种芒的快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)外植体消毒

选取芒的幼穗，用0.1％升汞消毒12～18分钟，无菌水清洗4-6次后备用；

2)愈伤组织诱导

将消毒处理后的幼穗切成穗段，接种在MS+2，4-D2.0～5.0mg/L+6-BA0.5～2.0mg/L+椰子汁100～500ml/L的愈伤组织诱导培养基上，培养的条件为200-350lux光照，培养18～25天形成直径0.8-1.2cm的愈伤组织；

3)愈伤组织分化

将愈伤组织转入MS+6-BA0～2.0mg/L+1-5％蔗糖的培养基上，培养10～15天形成分化出根的分化苗；

4)增殖与生根

将获得的分化苗转入MS+6-BA1.0～4.0mg/L+IAA0.1～0.5mg/L+NAA0.2～0.5mg/L增殖培养基上，25-35天为一个增殖周期；

5)移栽：将试管苗移栽到基质中。

2.根据权利要求1所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)所述的外植体消毒过程中，外植体选取是在芒的孕穗初期，叶枕距为2～4cm长时，选取芒的生长健壮的幼穗。

3.根据权利要求1所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)所述的愈伤组织诱导过程中，将消毒处理后的幼穗切成0.8-1.2cm长的穗段接种。

4.根据权利要求1或3所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)所述的愈伤组织诱导培养基为MS+2，4-D5.0mg/L+6-BA1.0mg/L+椰子汁200ml/L。

5.根据权利要求1或3所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(2)所述的愈伤组织诱导过程中，温度24±2℃。

6.根据权利要求1所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)所述的愈伤组织分化的培养基为MS+3％蔗糖的培养基。

7.根据权利要求1或6所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(3)所述的愈伤组织分化过程中培养的条件为1000-2000lux光照，温度24±2℃。

8.根据权利要求1所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(4)所述的增殖与生根过程中培养的条件为1000-2000lux光照，温度24±2℃，湿度80％。

9.根据权利要求1所述的芒的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(5)所述的移栽是将试管苗移栽到土∶灰＝4∶1基质中，保水保湿。