CN102577982A - 五节芒多倍体诱导方法 - Google Patents

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易自力
肖亮
陈智勇
蒋建雄
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Abstract

本发明公开了一种五节芒多倍体诱导方法，以五节芒的种子为外植体，诱导获得胚性愈伤组织之后，对带芽点的愈伤组织进行多倍体诱变，0.1％秋水仙素处理愈伤组织72h左右，可诱导获得四倍体再生植株，低浓度的秋水仙素不能产生加倍效应，高浓度会导致愈伤组织死亡或严重抑制愈伤组织再生能力。本发明提出的五节芒多倍体诱导方法，利用五节芒种子为外植体，取材不受季节限制，通过愈伤诱导，秋水仙素诱变，愈伤组织分化成苗，经过鉴定，最终得到多倍体材料，周期2-3个月，与常规育种相比，诱变时间大大缩短，为五节芒新品种选育提供了一条新途径。

Description

五节芒多倍体诱导方法
技术领域
本发明属于植物细胞工程领域，涉及植物组织工程技术，具体地说是一种五节芒的多倍体诱导方法。
背景技术
五节芒(Miscan thusfloridulus)属于禾本科(Poaceae)芒属(Miscan thus Andersson)(陈守良，1997)，是一种高光效的C4植物，具有生物质产量高、抗逆性强、纤维素含量高、燃烧充分等特点，被认为是一种开发潜力巨大的生物质能源植物，在我国主要分布在热带和亚热带地区。目前，五节芒多倍体诱导方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种五节芒的多倍体诱导方法。
五节芒多倍体诱导方法，包括如下步骤：
1)外植体的选择与灭菌：选用五节芒种子，在无菌操作台上用70％酒精处理，再用0.1％的升汞消毒，最后用无菌水冲洗备用；
2)胚性愈伤组织的诱导和分化：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2-5mg/L 2，4-D；暗培养，保持温度24±2℃诱导愈伤组织(7天左右产生愈伤组织)，然后将愈伤组织接种在分化培养基MS+1-2mg/L6-BA中，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux；
3)秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比0.05％-0.2％的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h；(在试验的几个处理中，以秋水仙素0.1％处理72h诱导率最高)
4)丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，无菌水清洗，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
多倍体鉴定：在植株根长达1-2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
步骤1)中选用五节芒种子，在无菌操作台上用70％酒精处理15-30秒，再用0.1％的升汞消毒10～15分钟，用无菌水冲洗6～7次备用。
步骤2)中50ml三角瓶内每瓶接种15-20颗种子。
步骤2)中，当愈伤组织长至直径为0.5-0.8cm后进行分化，分化获得带芽点的愈伤组织或丛生芽；选取带芽点的愈伤组织进行秋水仙素的处理。
步骤2)中挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基中。
步骤3)中所述的基本培养基为MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂。步骤3)中优选将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为0.1％-0.2％的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h。
步骤4)中将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，无菌水清洗3次，每次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分。
本发明提出的五节芒多倍体诱导方法，利用五节芒种子为外植体，取材不受季节限制，通过愈伤诱导，秋水仙素诱变，愈伤组织分化成苗，多倍体鉴定，最终得到多倍体材料，周期2-3个月，与常规育种相比，诱变时间大大缩短，为五节芒新品种选育提供了一条新途径。
附图说明
图1为实施例1五节芒(M.floridulus)02117(2n)的核型图；
图2为实施例1五节芒(M.floridulus)02117(4n)的核型图。
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1
取材：五节芒(M.floridulus)02117，采集自湖南郴州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒(M.floridulus)饱满完整种子，在无菌操作台上用70％酒精处理15秒左右，再用0.1％的升汞消毒10分钟，用无菌水冲洗6次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2mg/L2，4-D；50ml接种瓶内每瓶接种20颗种子，暗培养，保持温度24±2℃，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为0.5-0.8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在分化培养基为MS+1mg/L6-BA，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux。
3、秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加0.05％秋水仙素的基本培养基(MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3次重复。
4、丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，1次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
5、多倍体鉴定：在植株根长达1-2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高，嵌合体数目下降。
表102117带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
实施例2
取材：五节芒(M.floridulus)04036，采集自陕西勉县，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒(M.floridulus)饱满完整种子，在无菌操作台上用70％酒精处理20秒左右，再用0.1％的升汞消毒12分钟，用无菌水冲洗7次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+4mg/L2，4-D；50ml接种瓶内每瓶接种15颗种子，暗培养，保持温度24±2℃，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为0.5-0.8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在分化培养基为MS+1.5mg/L6-BA，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux。
3、秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加0.1％秋水仙素的基本培养基(MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3次重复。
4、丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，1次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
5、多倍体鉴定：在植株根长达1-2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高。
表204036带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
Figure BDA0000146500970000041
实施例3
取材：五节芒(M.floridulus)06023，采集自广西贺州，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒(M.floridulus)饱满完整种子，在无菌操作台上用70％酒精处理30秒左右，再用0.1％的升汞消毒12分钟，用无菌水冲洗7次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+3mg/L2，4-D；50ml接种瓶内每瓶接种15颗种子，暗培养，保持温度24±2℃，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为0.5-0.8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在分化培养基为MS+2mg/L6-BA，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux。
3、秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加0.15％秋水仙素的基本培养基(MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3次重复。
4、丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，1次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
5、多倍体鉴定：在植株根长达1-2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率提高。
表306023带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
Figure BDA0000146500970000051
实施例4
取材：五节芒(M.floridulus)04405，采集自安徽马鞍山，保存于湖南农业大学芒属植物资源圃。
1、外植体的选择与灭菌：选用五节芒(M.floridulus)饱满完整种子，在无菌操作台上用70％酒精处理30秒左右，再用0.1％的升汞消毒15分钟，用无菌水冲洗7次备用；
2、胚性愈伤组织的诱导：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+5mg/L2，4-D；50ml接种瓶内每瓶接种15颗种子，暗培养，保持温度24±2℃，7天左右产生愈伤组织；愈伤组织生长至直径为0.5-0.8cm，挑选淡黄色并较为致密的愈伤组织，接种在分化培养基为MS+2mg/L6-BA，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux。
3、秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将带芽点的愈伤组织接种于添加0.2％秋水仙素的基本培养基(MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂)中，处理24h、48h、72h，各设3次重复。
4、丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，转入灭了菌的三角瓶，加入无菌水，清洗3次，1次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；将带芽点的愈伤组织转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
5、多倍体鉴定：在植株根长达1-2cm左右时，切取6-10mm根尖，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。
结果表明，随着处理时间的延长愈伤组织死亡率提高，多倍体诱导率下降。
表406023带芽点愈伤组织秋水仙素诱变效果
Figure BDA0000146500970000052

Claims (8)

1.五节芒多倍体诱导方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
1)外植体的选择与灭菌：选用五节芒种子，在无菌操作台上用70％酒精处理，再用0.1％的升汞消毒，最后用无菌水冲洗备用；
2)胚性愈伤组织的诱导和分化：将灭菌处理后种子，在超净台接种在愈伤组织诱导培养基：MS+2-5mg/L2，4-D；暗培养，保持温度24±2℃诱导愈伤组织，然后将愈伤组织接种在分化培养基MS+1-2mg/L6-BA中，分化条件为温度24±2℃，光照2000lux；
3)秋水仙素的处理：将秋水仙素过滤灭菌，将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为0.05％-0.2％的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h；
4)丛生芽诱导或增殖：将材料从秋水仙素处理培养基中取出，无菌水清洗，用灭菌过的滤纸吸干残留水分；转入分化增殖生根培养基MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA中，使其分化增殖成苗。
2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤1)中选用五节芒种子，在无菌操作台上用70％酒精处理15-30秒，再用0.1％的升汞消毒10～15分钟，用无菌水冲洗6～7次备用。
3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤2)中50ml三角瓶内每瓶接种15-20颗种子。
4.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤2)中，当愈伤组织长至直径为0.5-0.8cm后进行分化，分化获得带芽点的愈伤组织或丛生芽；选取带芽点的愈伤组织进行秋水仙素的处理。
5.根据权利要求1或4所述的诱导方法，其特征在于，
步骤2)中挑选淡黄色并致密的愈伤组织，接种在分化培养基中。
6.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤3)中所述的基本培养基为MS+0.3％蔗糖+0.7％琼脂。
7.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤3)中将分化后带芽点的愈伤组织接种于添加质量百分比为0.1％-0.2％的秋水仙素的基本培养基中，处理24h-72h。
8.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，
步骤4)中将材料从秋水仙素处理培养基中取出，用灭菌过的滤纸吸干残留液后，无菌水清洗3次，每次1-3分钟；清洗后，用灭菌过的滤纸吸干残留水分。
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