CN102168017A

CN102168017A - 一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法

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Publication number: CN102168017A
Application number: CN 201010296985
Authority: CN
Inventors: 禹利君; 史云峰; 刘仲华; 黄建安; 胡维新
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2010-09-29
Filing date: 2010-09-29
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2030-09-29
Also published as: CN102168017B

Abstract

本发明公开了一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法，属于生物技术领域。该石杉碱甲高产菌是胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidesisolate)YLJ-13，2010年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO.M2010181。本发明的菌种经压力筛选从皱边石杉中分离纯化得到，经分子生物学手段鉴定该菌种为胶孢炭疽菌的一新种。该菌株在改良马铃薯液体培养基进行发酵，从发酵液中得到石杉碱甲。发酵生产获得石杉碱甲可分泌到胞外，以改良马铃薯液体培养基作为生物转化的前体物，每升培养体系可获得石杉碱甲高达199.6mg/L。采用本发明的菌种生产石杉碱甲，既保护了现有珍稀药用石杉科植物资源免遭破坏，还缓解了石杉碱甲用药需求短缺的格局。

Description

一种石杉碱甲高产菌及用其发酵生产石杉碱甲的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种石杉碱甲高产内生菌——胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides isolate)YLJ-13，及该菌种的分离纯化及压力筛选，同时还涉及利用该菌种高产发酵生产石杉碱甲的方法。

背景技术

石杉碱甲是治疗早老性痴呆的特效药物，世界人口老龄化加剧，石杉碱甲的临床用药供给已呈现严重不足局面。目前石杉碱甲来源有四条途径：①从植物中提取分离，目前已知含石杉碱甲的石杉科植物为获取石杉碱甲的主要植物来源，但其自我繁殖能力低下，自然生长周期长达10～15年，人工栽培皱边石杉等石杉科植物难以成活。王俊等(2003年)测定了6种石杉科植物中石杉碱甲含量，仅为0.0481％～0.0706％，亲缘关系较近的马尾杉植物中石杉碱甲含量也只有0.0061％～0.0345％。②从石杉科植物的组织培养材料中获取。石杉科植物组织培养因其表面消毒困难，只有极少数获得了初步成功。Wojciech Szypula等研究报道，以伏贴石杉进行组织培养，其幼嫩新梢石杉碱甲为3.33mg g^-1d.w。但未见其大田培养成功，难以大规模获得石杉碱甲。③人工合成石杉碱甲。鉴于石杉碱甲及其相关化合物在治疗早老性痴呆的特效功能，意大利的科学家Kozikowski AP等(1989年)进行了石杉碱甲类似物合成、英国的Lucey C等(2007年)进行了石杉碱甲的全合成。由于石杉碱甲结构比较复杂，合成的石杉碱甲是左旋和右旋的混合物，且产率低。只有极少数石杉碱甲类似物具有明显治疗早老性痴呆活性，化学合成很难实现石杉碱甲的有效供给。这些类似物的合成大都依赖于天然石杉碱甲作为其最初的分子合成骨架，这些骨架目前也多是从稀有石杉科植物资源中直接提取获得。因此，人工合成石杉碱甲也不能形成有效供给。④石杉碱甲微生物合成。从微生物发酵途径生产石杉碱甲，我国研究起步很晚。黎万奎等(2007年)从蛇足石杉中分离出支顶孢属(Acremonium)内生真菌菌株2F09P03B，可能产生微量与宿主植物相同的活性成分石杉碱甲。寻找石杉碱甲高产菌株，发酵生产获得石杉碱甲，国内还是空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种石杉碱甲高产菌株——胶孢炭疽菌，同时还提供一种采用该菌种发酵生产高产石杉碱甲的方法，以缓解目前石杉碱甲临床用药供给严重不足的局面。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种石杉碱甲高产菌株是取新鲜皱边石杉外植体，消毒后，以改良MS培养基培养，目标菌株经分离、纯化，压力筛选获得，该皱边石杉新鲜材料取自湖南湘西自治州原始次森林小溪国家自然保护区。该菌株经形态学鉴定及ITS1-5.8Sr RNA-ITS4分子生物学鉴定，确定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)的新种，命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides isolate)YLJ-13，现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年7月16日，保藏编号为：CCTCC NO.M2010181，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

以改良PDA平板培养基进行本发明的胶孢炭疽菌YLJ-13的保存及活化，以改良马铃薯液体培养基发酵培养获得石杉碱甲。对液体发酵培养碳源种类及其用量、pH值、培养温度、摇床转速、培养时间等进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，获得相对优化的发酵条件。在该优化的发酵条件下，每升培养体系可获得石杉碱甲高达199.6mg/L。比收获自然生长的石杉科植物及运用组织培养收获新梢提取石杉碱甲更加便利，周期短、效率高、生产成本低。以此菌株进行放大发酵培养，每升培养体系可获得石杉碱甲高纯品产品(纯度＞98％)至少可达178.4mg，证明该菌株具备放大生产的实际应用能力。使用该菌进行发酵生产获得石杉碱甲，既保护了现有珍稀石杉科植物资源，也为促进石杉碱甲在抗老年痴呆药物及开发记忆力保健品等方面的产业化提供了物质保障。

结合图1，对本发明进行细化说明：

1胶孢炭疽菌YLJ-13的分离纯化

1.1皱边石杉外植体内生菌的初步培养

将新鲜皱边石杉材料小心刷净表面杂物后用流动自来水冲洗4～6h，先用0.01M HCl、5％NaOCl、2.4mM柠檬酸依次洗涤约1min，再用70％乙醇消毒1min，然后依次用5％NaOCl消毒10～15min，7％H₂O₂消毒10～15min，最后用灭菌蒸馏水洗涤4～5次。取茎段，叶片、不定根分别接种于改良MS培养基。于黑暗条件下，24～28℃进行培养。取培养2～4周后仍保持鲜绿的菌团，转接于改良PDA平板培养，以备后续各菌株分离纯化之用。

本说明书中提及的改良MS培养基的配方及制备为：每1000mL培养体系中，加入有蔗糖20～30g、琼脂5～15g、磷酸二氢钠0.2～2.0g、及活性炭1.5～5.0g，再按照下表1加入1/10MS培养基母液，加入蒸馏水补充体积至1000mL，调整pH值至5.0～6.5，最后121℃灭菌20～30min，取出冷却至室温备用。

本说明书中提及的改良PDA培养基的配方及制备为：每1000～10000mL培养体系，是取200～2000g去皮土豆煮沸30～60min，3层纱布过滤获滤液，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15～150g，及琼脂粉7～70g，再加蒸馏水补充体积至1000～10000mL，调整pH值至4.0～7.5；于121℃灭菌20～30min，取出冷却至60～70℃，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0.1g/L，混匀。倒PDA平板，每一平板约20mL培养基为宜。

本说明书中发酵培养本发明菌株所使用的培养基为改良马铃薯液体培养基，则是改良PDA培养基中仅不添加琼脂粉；其制备为：每1000～10000mL培养体系，是取200～2000g去皮土豆煮沸30～60min，3层纱布过滤获滤液，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15～150g，再加蒸馏水补充体积至1000～10000mL，调整pH值至4.0～7.5；于121℃灭菌20～30min，取出冷却至60～70℃，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0.1g/L，混匀。

表11/10MS培养基母液配方

1.2新鲜材料组织破碎法内生菌的初步培养

新鲜皱边石杉用自来水冲洗干净，75％乙醇漂洗1～2min，灭菌蒸馏水冲洗3～5次；0.1％升汞消毒10～15min，灭菌蒸馏水冲洗6～8次，取茎段，叶片、不定根分别在无菌研钵中轻轻研碎成匀浆，加入无菌生理盐水，低速离心，吸取上层细胞悬浊液，涂布于改良PDA培养基上，28℃恒温培养箱中培养3～5天，将长菌团转接于一新的改良PDA平板培养，以备后续各菌株分离纯化之用。

1.3皱边石杉氯仿提取物压力筛选菌株

将前述1.1和1.2步骤初步培养获得的内生菌，从菌团周边挑取少量菌丝或孢子，在新的改良PDA平板上反复划线分离，直至得到单菌落。将分离纯化获得的各菌株，进行压力筛选培养，28℃恒温培养，挑取生长状态良好的菌株，保存做发酵培养及发酵产物的薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)鉴定及含量检测，获得本发明的高产石杉碱甲的胶孢炭疽菌YLJ-13。

其中，压力筛选培养用培养基的配方及制备如下：

(1)称取50～500g皱边石杉磨碎干样，加入50～500mL分析纯氯仿，超声浸提10～60min，收集浸提液；于浸提液中加入等体积分析纯氯仿超声浸提10～60min，再重复2次，合并3次浸提的滤液。

(2)减压浓缩回收氯仿，用分析纯甲醇洗出浓缩物(少量多次)，全部转入培养皿中，在通风橱下挥发至干，冷冻干燥24h。收集干燥物，4℃封存待用。

(3)称取0.1～1.0g皱边石杉提取物，装入试管，加入分析纯乙醇，振荡溶解。与此同时，称取0.1～0.5g酵母粉、及5～15g琼脂溶解在800mL沸水中。趁热加入事先溶解好的皱边石杉提取物，振荡混匀，定容至1000mL。121℃灭菌20min，取出冷却至60-70℃，加入无菌链霉素，使链霉素终浓度为0.1g/L，混匀，倒制压力筛选平板，每一平板约20mL培养基为宜。

2分子生物学方法确认胶孢炭疽菌YLJ-13的种属

2.1ITS区(ITS1-5.8S rRNA-ITS2)基因序列PCR扩增

对已分离纯化的本发明菌株YLJ-13，通过平板培养、斜插法制片观察其形态学特征，扫描电镜观察其菌丝体、孢子体结构。其特征可归纳为：培养初期，菌落菌丝体呈白色，菌落不规则圆形，菌丝体蔓延生长，呈棉絮状，生长速度较快。培养5-7天后，菌落正面略带灰色，反面略带黄色。周围有白色气生菌丝，气生菌丝较为发达，长绒毛状。镜鉴菌丝体无隔膜、无菌核，菌丝呈丝状体、不对称分支；扫描电镜下观察偶见菌丝体膨大，内有圆形孢子器，但未见孢子释放。参考魏景超的《真菌鉴定手册》、戴芳澜的《真菌的形态和分类》、齐祖同的《中国真菌志(第五卷)》等，可确定该菌为炭疽菌属的真菌。

在此基础上，选择真菌ITS1、ITS4引物进行本发明菌株YLJ-13菌丝体DNA的PCR扩增，获得本发明菌株YLJ-13核糖体内转录间区ITS区(ITS1-5.8SrRNA-ITS2)基因序列。ITS1位于18S rRNA和5.8S rRNA之间，ITS2位于5.8SrRNA和28S rRNA之间。在生物进化过程中，其进化速度快，种内具有高度保守性，而在不同种间又有不同程度的变异。以ITS1、ITS4为上下游引物扩增该段基因序列，对可产石杉碱甲的目标菌株进行种的快速鉴定。

本发明菌株YLJ-13的ITS1、ITS4引物序列为：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)；ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。PCR扩增基本条件为：总体积25μL，内含无菌ddH₂O 17μL；10×PCR buffer(含Mg²⁺)2.5μL；dNTP(10mM)0.5μL；引物(10pmol/μL)1.25μL；Taq E(1U/μL)1.25μL；DNA模板(10ng/μL)2.5μL。反应热循环程序设定为预变性94℃，5min；变性94℃，45S；适宜温度下退火，时间为45S；延伸72℃，60S；循环30次；后延伸72℃，5min。在PTC-100TM PCR仪上进行扩增反应。

扩增产物回收，测序分析。序列为： TGGATTGGGGCATTCTACATGATCGAGGTCAACCTTTGGAAAATTGGGGGTTTTACGGCAAGAGTCCCTCCGGATCCCAGTGCGAGTACGTAAAGTTA C T ACGCAAAGGAGGCTCCGGGAGGGTCCGCCACTACCTTTGAGGGCCTACATCAGCTGTAGGGCCCCAACACCAAGCAGAGCTTGAGGGTTGAAATGA CG CT CGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCA TTT CGC TGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTAAAAGTTTTGATTATTTGCTTGTACCACTCAGAAGAAACGTCGTTAAATCAG AGTT TGGT TATCCTCCGGCGGGCGCCGACCCGCCCGGGGGCGGGAGGCCGGGAGGGTCACGGAGACCCTGCCCGCCGAAGCAACAGTTATAGGTATGT

2.2ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列分析

将本发明菌株YLJ-13进行ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列分析，在GenBank中进行同源序列搜索；Clustal X软件对所得到的ITS1-5.8S rRNA-ITS2基因序列进行多重对位排列；MEGA等软件包进行系统发育分析和进化树的构建；用p-distance模式计算遗传距离，邻位相连法进行进化距离分析，确定本发明菌株YLJ-13为胶孢炭疽菌一新种，为新发现的真菌资源。

3本发明胶孢炭疽菌YLJ-13的保存

将上述分离纯化得到的胶孢炭疽菌YLJ-13接种于改良PDA培养基，25～34℃培养2～6天，无菌石蜡油封存。

4本发明胶孢炭疽菌YLJ-13的活化

将上述保存的胶孢炭疽菌YLJ-13以改良PDA培养基，25～34℃培养3～5天，活化培养2～4次，4℃短期保存。

5将本发明菌株进行发酵培养，发酵产物的结构确认分析

参照《中国药典》2000版(第二部)附录，于200-400nm范围内进行紫外光谱扫描，确定目标发酵产物与石杉碱甲标准品的最大吸收波长一致。

5.1发酵产物的薄层色谱(TLC)快速分析

对做好处理的发酵液、菌丝体样品，配成系列上样浓度的醇液(甲醇溶解)、水液(无菌双蒸水溶解)。采用硅胶薄层板进行薄层分析，展开剂参照《中国药典》石杉碱甲检测方法的配方配制，正丁醇∶冰醋酸∶水＝7∶1∶2，展开完成后，于石杉碱甲标准品最大吸收波长处进行观察。胶孢炭疽菌YLJ-13浓缩液对应标准品处的展开点，做好标记，硅胶薄层板于50℃烘干，刮下，以蒸馏水溶解、氯仿萃取，减压蒸干，取少量进行熔点试验、紫外扫描，检测与石杉碱甲标准品是否相符，相符的样品，作为HPLC-MS分析试样。

5.2发酵产物的HPLC-MS分析

对“5.1TLC快速分析”得到的目标样品进行HPLC-MS分析，精确分析主产物结构，确定为石杉碱甲。

6本发明胶孢炭疽菌YLJ-13发酵条件优化

6.1胶孢炭疽菌YLJ-13单因素工艺参数优化筛选

通过对改良马铃薯液体培养基的碳源种类及用量、pH值、培养温度、摇床转速、培养时间进行单因素逐步筛选，结果发现蔗糖为相对最佳碳源，相对优化用量为每升培养体系添加20g；发酵培养条件为：按重量接种0.01～0.02％的菌丝体于发酵培养液中，pH值4.0～7.5，温度25～34℃，时间为60～168小时，转速为100～160转/分钟；以发酵罐培养时，通气量1∶0.3～0.7，罐压0.03～0.05MPa。

6.2胶孢炭疽菌YLJ-13发酵培养正交试验

通过单因素工艺参数优化筛选，对影响发酵液、菌丝体中石杉碱甲产率的碳源用量、培养温度、转速、培养时间，4个因素各取3个水平进行进一步优选，按L₉(3⁴)正交表设计试验，设置重复、考察各因素的交互影响，并进行极差分析和方差分析，确定优选的发酵培养条件，为：按重量接种0.01％的菌丝体于发酵培养液中，pH值为5.80，转速为130转/分钟，温度为30℃，时间为96小时，以发酵罐培养时，通气量优选为1∶0.4，罐压优选为0.04MPa。

附图说明

图1是本发明的具体工艺路线流程图。

具体实施方式

本发明的实施例表示如下。构建这些实施例并非用来限制本发明的范围。实施例1，正交法确定胶孢炭疽菌YLJ-13发酵生产石杉碱甲的最佳培养条件

在初始培养基的基础上，每升马铃薯液体培养体系中分别加入10-30g的蔗糖、摇床转速100～150r/min，24～34℃恒温振荡培养3～7d，测定发酵液中石杉碱甲积累量。

表2正交试验表头

表3正交试验设计表及结果

表4正交试验结果分析表

正交试验分析结果表明：

(1)该菌株发酵的最好配比为A₂B₂C₃D₂，即蔗糖用量20g/L，培养温度30℃，摇床转速130r/min，发酵时间96h。

(2)各因素对石杉碱甲生成产生影响，从主到次依次为D(发酵时间)＞C(转速)＞B(温度)＞A(碳量)。

实施例2，摇瓶发酵生产石杉碱甲：

1.培养基和菌种

菌种：本发明的胶孢炭疽菌YLJ-13；

斜面保存、活化培养基：改良PDA培养基；

发酵培养基：改良马铃薯液体培养基；

2.发酵培养

发酵培养条件：将本发明活化的菌种取菌丝体，按重量接种0.01％的菌丝体于5L发酵瓶中，pH值为自然值(5.80)，在以下条件下发酵：

蔗糖用量：100g

摇床温度：29℃±1℃

转速：130转/分钟

发酵周期：96小时

发酵结果如下：过滤菌丝体、获滤液，抽真空减压浓缩得发酵浓缩液，紫外扫描、薄层色谱分析、高效液相色谱-质谱分析发酵液中目标物质与石杉碱甲标准品为同一物质；高效液相色谱检测石杉碱甲含量达187.2mg/L。

该实施例表明，本发明的发酵工艺在实验室是成功的。

实施例3，石杉碱甲的放大发酵生产：

1.培养基和菌种

菌种：本发明的胶孢炭疽菌YLJ-13；

斜面保存、活化培养基：改良PDA培养基；

发酵培养基：改良马铃薯液体培养基；

2.发酵培养

发酵培养条件：将本发明活化的菌种取菌丝，按重量添加0.01％的菌丝体到100L发酵液中，于发酵罐中，pH值为自然值(5.80)，在以下条件发酵：

蔗糖用量：2000g

罐温：29℃±1℃

风量：1∶0.4

转速：100转/分钟

罐压：0.04Mpa

发酵周期：115小时±5小时

发酵结果如下：过滤菌丝体、获滤液，抽真空减压浓缩得发酵浓缩液，紫外扫描、薄层色谱分析、高效液相色谱-质谱分析发酵液中目标物质与石杉碱甲标准品为同一物质。每升培养体系得石杉碱甲178.4mg/L。

该实施例表明，本发明的发酵工艺已具备放大生产能力。

参考文献：

1.Wojciech Szyputa，Agnieszka Pietrosiuk，Piotr Suchocki，Olga Olszowska，Mirostawa Furmanowa and Olga Kazimierska.Somatic embryogenesis and in vitroculture of Huperzia selago shoots as a potential source of huperzine A，Plant Science，2005，168(6)：1443-1452。

Claims

1.一种石杉碱甲高产菌，其分类命名为胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides isolate)YLJ-13，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2010年7月16日，保藏编号为：CCTCC NO.M2010181，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。

2.如权利要求1所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于：所述胶孢炭疽菌是取皱边石杉外植体消毒后接种于改良MS培养基，培养2～4周后外植体仍保持鲜绿的菌团，及取新鲜材料组织破碎法获得的长菌团，一并转接于改良PDA平板培养基，经反复分离、纯化；经压力筛选得到。

3.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于：所述改良MS培养基是：每1000mL培养体系中，加入有蔗糖20～30g、琼脂5～15g、磷酸二氢钠0.2～2.0g、及活性炭1.5～5.0g，再加入1/10MS培养基母液，加入蒸馏水补充体积至1000mL，调整pH值至5.0～6.5，最后121℃灭菌20～30min，冷却至室温而成。

4.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于：所述改良PDA培养基的制备为：每1000～10000mL培养体系，是取200～2000g去皮土豆，煮沸30～60min过滤，于滤液中加葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15～150g，琼脂粉7～70g，加入蒸馏水补充体积至1000～10000mL，调整pH值至4.0～7.5；于121℃灭菌20～30min，取出冷却至60～70℃，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0.1g/L，混匀而成。

5.如权利要求2所述的一种石杉碱甲高产菌，其特征在于：所述压力筛选用的压力筛选培养基的制备方法如下：

(1)称取50～500g皱边石杉磨碎干样，加入50～500mL分析纯氯仿，超声浸提10～60min，收集浸提液；于浸提液中加入等体积分析纯氯仿超声浸提10～60min，再重复2次，合并滤液；

(2)减压浓缩回收氯仿，用分析纯甲醇洗出浓缩物，该浓缩物转入培养皿中，在通风橱中挥发至干，冷冻干燥24h，收集干燥物，4℃封存待用；

(3)称取0.1～1.0g上述提取的皱边石杉干燥物，装入试管，加入分析纯乙醇，振荡溶解，并称取0.1～0.5g酵母粉、及5～15g琼脂溶解在800mL沸水中，趁热加入该已溶解的皱边石杉提取物，振荡混匀，定容至1000mL，121℃灭菌20min，取出冷却至60-70℃，加入无菌链霉素，使链霉素终浓度为0.1g/L，混匀。

6.一种发酵生产石杉碱甲的方法，其特征在于：发酵所用培养基为改良马铃薯液体培养基；发酵所用菌株为权利要求1所述的菌株；发酵培养条件为：按重量接种0.01～0.02％的菌丝体于发酵培养液中，pH值4.0～7.5，温度25～34℃，时间为60～168小时，转速为100～160转/分钟；发酵罐培养时，通气量1∶0.3～0.7，罐压0.03～0.05MPa。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述发酵培养条件为：按重量接种0.01％的菌丝体于发酵培养液中，pH值为5.80，转速为130转/分钟，温度为30℃，时间为96小时，发酵罐培养时，通气量1∶0.4，罐压0.04MPa。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述改良马铃薯液体培养基是：每1000～10000mL培养体系，是取200～2000g去皮土豆煮沸30～60min，过滤，于滤液中加入葡萄糖、蔗糖、淀粉或蜂蜜15～150g，加入蒸馏水补充体积至1000～10000mL，调整pH值至4.0～7.5；于121℃灭菌20～30min，取出冷却至60～70℃，加入无菌链霉素至链霉素终浓度为0.1g/L，混匀。