CN107574193A - 一种石杉碱甲衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体的说是利用白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT‑HS39对石杉碱甲进行微生物转化，获得了一个结构新颖的石杉碱甲衍生物，如式(1)所示。本发明提供的石杉碱甲衍生物制备方法，是将白囊耙齿菌接种至发酵培养基，同时加入石杉碱甲作为底物，在25‑28℃、180rpm条件下发酵培养，取发酵液进行分离纯化，获得所述石杉碱甲衍生物。本发明所涉及的石杉碱甲衍生物为新化合物，结构新颖；截至目前，未见任何天然植物提取法或化学结构修饰法可制备该衍生物。本发明的制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、转化率高等优势，有助于后续的产业化开发，

Description

一种石杉碱甲衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体的说涉及一种新的石杉碱甲衍生物以及制备该衍生物的微生物转化方法。

背景技术

石杉碱甲(huperzine A)是来源于石松属植物蛇足石杉(Huperzia serrate)的一个生物碱，是一种高效、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，可用于治疗阿尔茨海默症，同时对重症肌无力、记忆障碍、血管性痴呆具有显著的疗效。近年来，石杉碱甲受到了研究人员的广泛关注，研究热点主要集中于该化合物的衍生物制备、活性评价以及构效关系等方面。

目前，石杉碱甲衍生物的制备主要有两种方法：一、从蛇足石杉植株中提取。从天然来源提取是获得天然产物及其衍生物的常用方法之一。然而，由于蛇足石杉属于高等蕨类植物，生长缓慢(自然生长周期长达10～15年)，孢子萌发率低，野生资源匮乏，属于再生困难的资源，因此严重限制这一方法的实施与开展。此外，蛇足石杉化学成分极其复杂，存在多种其他类型的石松生物碱，这为从植物中提取石杉碱甲衍生物类成分造成了另一障碍。二、化学法结构修饰。利用化学法开展结构修饰是获得天然产物衍生物另一常用方法。然而，由于石石杉碱甲分子结构存在较强的刚性，对其开展化学法结构修饰难度较大，目前已经报道的修饰也主要集中于其结构中的吡啶酮环和游离氨基，结构修饰位点较单一。而且，多数化学合成路线存在反应条件苛刻、目标产物收率低、无法实现工业化生产等技术障碍。

微生物生物转化是获得天然产物衍生物的一种新兴手段，其本质是利用微生物产生的酶(系)对外源添加物进行结构修饰的过程，具有操作简便、条件温和、选择性高、立体专一性强等优势，而且可以完成非活化饱和碳链的氧化、醚键的断裂等化学方法难以进行的反应。有关石杉碱甲的微生物转化研究鲜有报道。2010年，Zhang等首次报道了利用未知来源细菌Streptomyces griseus CACC 200300开展石杉碱甲生物转化的实验，获得5个石杉碱甲衍生物，包括3个新化合物(Zhang XY,Zou JH,Dai JG,Tetrahedron Lett.,2010,51,3840-3842.)；2014年，本专利的申请人利用蛇足石杉内生真菌Ceriporia lacerateHS-ZJUT-C13A开展了石杉碱甲生物转化，获得4个具有新颖骨架的石杉碱甲衍生物，但是转化率都较低(Ying YM,Shan WG,Zhan ZJ,J.Nat.Prod.,2014,77,2054-2059.)。

由此可见，利用微生物生物转化作用开展石杉碱甲衍生物的制备是切实可行的。在微生物转化过程中，利用微生物酶(系)功能的新颖性、多样性和高效性开展石杉碱甲的生物转化，有望以较高产率获得结构新颖多样性的石杉碱甲衍生物。

发明内容

本发明目的是克服现有石杉碱甲衍生物结构多样性不丰富、制备工艺繁琐等缺陷，提供一种新的石杉碱甲衍生物及其制备方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种式(1)所示的石杉碱甲衍生物，

所述石杉碱甲衍生物为白色无定型粉末，分子式为C₁₉H₂₄N₂O₂，分子结构中含有石杉碱甲和丁酮结构片段，两结构片段通过石杉碱甲的游离氨基和丁酮2′位形成碳氮键相连而成。

本发明还提供了一种所述石杉碱甲衍生物的制备方法，以蛇足石杉内生真菌为筛选对象，经过大量的创造性筛选，从中筛选得到了一株白囊耙齿菌，通过该菌株的发酵与转化，以石杉碱甲为底物制得上述石杉碱甲衍生物。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案提供了一种蛇足石杉内生真菌，是从蕨类植物蛇足石杉植株活体中采用分离纯化技术获得，其分类命名为白囊耙齿菌(Irpexlacteus ZJUT-HS39)，该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2017161，保藏日期为2017年3月31日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的白囊耙齿菌(Irpex lacteus ZJUT-HS39)，菌株的ITS区碱基序列为：

AGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTCTCACGAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTTAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAGAAAAAAAATGGTGGAAGCTTCCAGGATCTCGCGAGAGGTCTTCGGTTGAACAAGCCGTTTTTCTTTCTTATGTTTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTCAACTGTGTATAACACATTTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGTATTCTCAACCCCTAAATTTTTGTAATGAAGGTTTAGCGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCCCTTGTCGGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATGGTGTTCATGCTTCGAACCGTCTCCTTGCCGAGACAATCATTTGACAATCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG

以蛇足石杉内生真菌Irpex lacteus ZJUT-HS39为发酵菌，在发酵液中添加石杉碱甲作为底物，按常规方法培养发酵、提取分离得到，优选所述方法是将蛇足石杉内生真菌接种至发酵培养基，在25-28℃、180-200rpm条件下发酵培养，取发酵液进行分离纯化，获得所述石杉碱甲衍生物；所述发酵培养基组成为：碳源5-30g/L、氮源10-25g/L、无机盐1-5g/L，溶剂为水，pH值自然。

进一步，所述碳源为：葡萄糖、甘露醇、甘油、糊精和半乳糖中的任意一种或几种，优选葡萄糖。

进一步，所述氮源为黄豆粉、蛋白胨或马铃薯浸出粉中的一种或任几种，优选马铃薯浸出粉。

进一步，所述无机盐为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾，优选磷酸氢二钾。

进一步，所述发酵培养基组成为：葡萄糖5-30g/L，马铃薯浸出粉10-25g/L，KH₂PO₄1-5g/L，溶剂为水，pH值自然，更优选所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L，马铃薯浸出粉25g/L，KH₂PO₄ 2g/L，溶剂为水，pH值自然。

进一步，白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39发酵液制备方法为：(1)将白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39接种至斜面培养基，在25-28℃培养5-7天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，马铃薯浸出粉5-25g/L，KH₂PO₄ 0.5-2g/L，琼脂10-20g/L，溶剂为水，pH值自然；(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在25-28℃、180-200rpm、体积装液量30％条件下培养7天，获得种子液；所述种子培养基组成为：葡萄糖10-50g/L，马铃薯浸出粉5-25g/L，KH₂PO₄ 0.5-2g/L，溶剂为水，pH值自然；(3)将种子液以体积分数5-10％的接种量接种至发酵培养基，同时在发酵培养基中加入石杉碱甲(溶解于无水乙醇，并在无菌条件下经0.22μm微孔滤膜过滤除菌)，在25-28℃、180-200rpm、体积装液量30％条件下培养14天，获得发酵液；所述发酵培养基组成为：葡萄糖5-30g/L，马铃薯浸出粉10-25g/L，KH₂PO₄ 1-5g/L，溶剂为水，pH值自然。

进一步，所述发酵液分离纯化方法可以采用常规的方法进行提取分离，比如经过过滤得菌丝体，菌丝体干燥后可以用浸提、萃取、硅胶柱层析等常规方法和常用溶剂进行提取分离，具体优选方法为：(1)将发酵液过滤除去菌丝，用氨水调节发酵液pH至9-11，用氯仿萃取3次，合并有机层，减压浓缩至无液体流出，得氯仿萃取物；(2)将步骤(1)氯仿萃取物经MCI CHP20P树脂柱层析，依次用体积比5:5的甲醇-水溶液、体积比6:4的甲醇-水溶液、体积比7:3的甲醇-水溶液、体积比8:2的甲醇-水溶液和体积比9:1的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液洗脱2个柱体积，收集体积比5:5的甲醇-水溶液的流出液；(3)将步骤(2)收集的流出液浓缩至干，用ODS C8柱层析进行纯化，依次用体积比3:7的甲醇-水溶液和4:6的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液均洗脱2个柱体积，薄层层析检测各个流出液，合并含目标组分的流出液，减压浓缩即得石杉碱甲衍生物。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所涉及的石杉碱甲衍生物为新化合物，结构新颖，尚未见任何天然植物提取法或化学结构修饰法可制备该衍生物。本发明的制备方法具有发酵条件简单、菌种易培养、转化率高等优势，有助于后续的产业化开发。

附图说明

图1为本发明白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39的菌落形态。

图2为采用本发明方法制得的石杉碱甲衍生物的¹H-NMR谱图。

图3为采用本发明制得的石杉碱甲衍生物的¹³C-NMR谱图。

图4为采用本发明制得的石杉碱甲衍生物的HMQC谱图

图5为采用本发明制得的石杉碱甲衍生物的COSY谱图

图6为采用本发明制得的石杉碱甲衍生物的HMBC谱图

图7为采用本发明制得的石杉碱甲衍生物的高分辨质谱

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39的分离

1.样品的采集

样品为2016年8月自浙江省金华市磐安县高二乡采集的蛇足石杉(Huperziaserrata)植株。

2.菌株的分离

用自来水将采集的植株洗净，浸入装有75％乙醇的容器中，2分钟后取出，以无菌水冲洗3-5次；再浸入装有0.1％升汞溶液的容器中，维持1分钟后取出，用大量无菌水冲洗除去残留的升汞溶液；在无菌操作条件下，将蛇足石杉茎的外表皮剥去，再切成0.3cm×0.3cm大小的组织片，种植于PDA(葡萄糖3g，马铃薯浸出粉0.5g，KH₂PO₄ 0.2g，琼脂1.5g，加水到100mL，pH值自然)平板上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态，颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA平板上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，接入PDA培养基斜面，28℃暗培养4～7天后，转至4℃冰箱内保存备用。

实施例2白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39的分子生物学鉴定

1.DNA的提取

取培养6天的发酵液，离心收集菌丝体，将菌丝用液氮冷冻研磨后，用SK1375基因组DNA提取试剂盒(上海生物工程(上海)有限公司)提取基因组DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。

2.序列的PCR扩增

引物序列为：

ITS1：5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG3’；

ITS4：5’TCCTCCGCTTATTGATATGC3’.

PCR体系(50μL)构成为：Template(基因组)10pmol，primer 1(10μM)1μL，primer 2(10μM)1μL，dNTP mix(10Mm each)1μL，10×Taq reaction Buffer 5μL，Taq(5U/μL)0.25μL，加水至50μL。

PCR程序设定为：98℃预变性5分钟，95℃变性35秒，55℃复性35秒，72℃延伸40秒，35个循环，最后72℃延伸8分钟。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带，经UNIO-10柱式DNA凝胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)有限公司)纯化。

纯化产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，测得ITS区碱基序列为：

AGGATCATTATCGAGTTTTGAACGGGTTGTAGCTGGCCTCTCACGAGGCATGTGCACGCCTGGCTCATCCACTCTTAACCTCTGTGCACTTTATGTAAGAGAAAAAAAATGGTGGAAGCTTCCAGGATCTCGCGAGAGGTCTTCGGTTGAACAAGCCGTTTTTCTTTCTTATGTTTTACTACAAACGCTTCAGTTATAGAATGTCAACTGTGTATAACACATTTATATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCACTCCTTGGTATTCCGAGGAGTATGCCTGTTTGAGTCTCATGGTATTCTCAACCCCTAAATTTTTGTAATGAAGGTTTAGCGGGCTTGGACTTGGAGGTTGTGTCGGCCCTTGTCGGTCGACTCCTCTGAAATGCATTAGCGTGAATCTTACGGATCGCCTTCAGTGTGATAATTATCTGCGCTGTGGTGTTGAAGTATTTATGGTGTTCATGCTTCGAACCGTCTCCTTGCCGAGACAATCATTTGACAATCTGAGCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTG

3.数据处理

序列数据在美国国立生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation USA NCBI)的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将上述序列与Genbank中的序列比较，鉴定该菌株为白囊耙齿菌(Irpex lacteus)。

实施例3利用白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39转化制备石杉碱甲衍生物的方法

1、发酵培养制备Irpex lacteus ZJUT-HS39发酵物

1)菌种：白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017161，保藏日期为2017年3月31日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学

2)斜面培养及保存

固体培养基：葡萄糖3g，马铃薯浸出粉0.5g，KH₂PO₄ 0.2g，琼脂1.5g，加水到100mL，pH值自然。

固体培养方法：白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39菌株接种于固体培养基斜面上，28℃培养5-7天。固体培养结束后，斜面放置4-10℃冷藏备用。30％的甘油冷冻管的制备：在无菌状态下，将试管斜面用6ml灭菌的30％甘油洗下，分装至甘油管中(3ml/支)，放置-20℃冷藏备用。

3)摇瓶种子培养

培养基：葡萄糖3g，马铃薯浸出粉1g，KH₂PO₄ 0.2g，加水到100mL，pH值自然。

装液量：500mL三角瓶里装150mL培养基

接种量：30％的甘油冷冻菌丝3mL

培养温度：28℃

培养时间：7天

摇床转速：150rpm

将30％的甘油冷冻菌丝按以上接种量接入摇瓶种子培养基中，培养后，镜检菌丝粗壮，染色深，无染菌，菌浓≥15％。

4)摇瓶发酵培养

培养基：葡萄糖2g，马铃薯浸出粉2.5g，KH₂PO₄ 0.2g，加水到100mL，pH值自然。

装量：250mL三角瓶里装100mL培养基，共使用350个三角瓶。

接种量：培养基体积的10％；

底物溶液(石杉碱甲无水乙醇溶液，10mg/mL)加入量：0.3mL

发酵液中底物终浓度：0.03mg/mL

培养温度：28℃；

培养时间：15天；

摇床转速：180rpm；

2、提取分离获得石杉碱甲衍生物

发酵结束后，将发酵液过滤除去菌丝，并在室温下减压浓缩至约5L，用氨水调节发酵液pH至9-11，用等体积氯仿萃取3次，合并有机层，减压浓缩至无液体流出，得氯仿萃取物(17.3g)；(2)将步骤(1)氯仿萃取物经MCI CHP20P树脂柱层析，依次用体积比5:5的甲醇-水溶液，体积比6:4的甲醇-水溶液，体积比7:3的甲醇-水溶液，体积比8:2的甲醇-水溶液，体积比9:1的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液洗脱2个柱体积，收集体积比5:5的甲醇-水溶液的流出液；(3)将步骤(2)收集的流出液浓缩至干，用ODS C8柱层析进行纯化，依次用体积比3:7的甲醇-水溶液、体积比4:6的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液均洗脱2个柱体积，以氯仿:甲醇:二乙胺＝15:1:0.01为展开剂进行薄层层析检测，合并比移值(Rf值)为0.4左右的部分，减压浓缩即得化合物1(18mg)。

实施例4石杉碱甲衍生物的理化性质及波谱数据

化合物1：白色无定型粉末；分子式为C₁₉H₂₄N₂O₂；旋光-57.7(c0.05,MeOH)；红外v_max 3377,1571,1413,1745,1153,1081,1025,936cm^-1；氢谱及碳谱见表1；高分辨质谱(ESI)m/z:313.1914[M+H]⁺。

表1石杉碱甲衍生物核磁数据(溶剂为氘代氯仿)

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种石杉碱甲衍生物及其制备方法

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 627

<212> DNA

<213> 白囊耙齿菌Irpex lacteus ZJUT-HS39

<400> 1

aggatcatta tcgagttttg aacgggttgt agctggcctc tcacgaggca tgtgcacgcc 60

tggctcatcc actcttaacc tctgtgcact ttatgtaaga gaaaaaaaat ggtggaagct 120

tccaggatct cgcgagaggt cttcggttga acaagccgtt tttctttctt atgttttact 180

acaaacgctt cagttataga atgtcaactg tgtataacac atttatatac aactttcagc 240

aacggatctc ttggctctcg catcgatgaa gaacgcagcg aaatgcgata agtaatgtga 300

attgcagaat tcagtgaatc atcgaatctt tgaacgcacc ttgcactcct tggtattccg 360

aggagtatgc ctgtttgagt ctcatggtat tctcaacccc taaatttttg taatgaaggt 420

ttagcgggct tggacttgga ggttgtgtcg gcccttgtcg gtcgactcct ctgaaatgca 480

ttagcgtgaa tcttacggat cgccttcagt gtgataatta tctgcgctgt ggtgttgaag 540

tatttatggt gttcatgctt cgaaccgtct ccttgccgag acaatcattt gacaatctga 600

gctcaaatca ggtaggacta cccgctg 627

Claims (9)

1.一种式(1)所示的石杉碱甲衍生物，其特征在于，所述石杉碱甲衍生物为白色无定型粉末，分子式为C₁₉H₂₄N₂O₂，分子结构中含有石杉碱甲和丁酮结构片段，两结构片段通过石杉碱甲的游离氨基和丁酮2′位形成碳氮键相连而成，

2.一种权利要求1所述石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法利用一株蛇足石杉内生真菌对石杉碱甲进行生物转化，将蛇足石杉内生真菌接种至发酵培养基，同时加入石杉碱甲，在25-28℃、180～200rpm条件下发酵培养14天，取发酵液进行分离纯化，获得所述石杉碱甲衍生物；所述发酵培养基组成为碳源5-30g/L、氮源10-25g/L、无机盐1-5g/L，溶剂为水，pH值自然。

3.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述蛇足石杉内生真菌为白囊耙齿菌(Irpex lacteus ZJUT-HS39)，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2017161，保藏日期为2017年3月31日，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。

4.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、甘露醇、甘油、糊精或半乳糖中的任意一种或几种。

5.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述氮源为黄豆粉、蛋白胨或马铃薯浸出粉中的任意一种或几种。

6.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述无机盐为磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。

7.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述加入发酵培养基的石杉碱甲预先溶解于无水乙醇，浓度10mg/mL，并在无菌条件下经0.22μm微孔滤膜过滤，其在发酵液中的终浓度为0.03-0.2mg/mL。

8.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，蛇足石杉内生真菌(Irpex lacteus ZJUT-HS39)发酵液制备方法为：(1)将蛇足石杉内生真菌(Irpex lacteusZJUT-HS39)接种至斜面培养基，在25-28℃培养5-7天，获得斜面菌体；所述斜面培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，马铃薯浸出粉5-25g/L，KH₂PO₄ 0.5-2g/L，琼脂10-20g/L，溶剂为水，pH值自然；(2)将斜面菌体接种至种子培养基，在25-28℃、180-200rpm、体积装液量30％条件下培养7天，获得种子液；所述种子培养基组成为：葡萄糖10-50g/L，马铃薯浸出粉5-2 5g/L，KH₂PO₄ 0.5-2g/L，溶剂为水，pH值自然；(3)将种子液以体积分数5-10％的接种量接种至发酵培养基，体积装液量30％条件下培养14天，获得发酵液。

9.如权利要求2所述的石杉碱甲衍生物的制备方法，其特征在于，所述发酵液分离纯化方法为：(1)将发酵液过滤除去菌丝，用氨水调节发酵液pH至9-11，用氯仿萃取3次，合并有机层，减压浓缩至无液体流出，得氯仿萃取物；(2)将步骤(1)氯仿萃取物经MCI CHP20P树脂柱层析，依次用体积比5:5的甲醇-水溶液、体积比6:4的甲醇-水溶液、体积比7:3的甲醇-水溶液、体积比8:2的甲醇-水溶液和体积比9:1的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液洗脱2个柱体积，收集体积比5:5的甲醇-水溶液的流出液；(3)将步骤(2)收集的流出液浓缩至干，用ODSC18柱层析进行纯化，依次用体积比3:7的甲醇-水溶液和体积比4:6的甲醇-水溶液洗脱，每个洗脱液均洗脱2个柱体积，薄层层析检测各个流出液，合并含目标组分的流出液，减压浓缩即得石杉碱甲衍生物。