CN106318875B - 一种蝉花的双向人工培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蝉花的双向人工培养方法，该方法包括如下步骤：步骤1，蝉花菌种在液体培养基中进行扩大培养；步骤2，在培养室内将步骤1经过扩大培养得到的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，菌丝体生长阶段，保持黑暗条件；孢梗束生长阶段转为光照培养，并将已经板结的培养基进行悬空处理；和步骤3，对孢梗束进行采收。
Description
技术领域
本发明涉及一种蝉花的培养方法，具体涉及一种蝉花的双向人工培养方法。
背景技术
中药蝉花为蝉棒束孢Isaria cicadae Miquel(蝉拟青霉Paecilomyces cicadae(Miquel)Samson)寄生在某些蝉若虫上形成的菌虫复合体，是我国传统著名的中药材之一，其药用比冬虫夏草早800年。医家认为蝉花是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材。天然蝉花多生长于竹林中，浙江天目山一带是蝉花的主产区，被称为“南方的虫草”。现代药理研究表明天然蝉花及人工培养蝉花中含有多糖、腺苷和N6-(2-羟乙基)腺苷等核苷类物质、氨基酸、生物碱及麦角甾醇等多种活性物质，具有明显的解热镇痛、抗惊厥等作用，以及显著的抗肾功能衰竭作用，还具有明显的抗肿瘤，调节免疫，抗氧化、抗衰老、抑制乙型肝炎病毒等作用。人工培养蝉花毒性甚微，小鼠口服60g/kg无毒性。近年来，利用生物发酵技术人工培养蝉花并进一步深度开发利用逐渐成为研究的热点。
人工培育蝉花，主要是通过固体发酵的原理，利用小麦作为培养基。将蝉棒束孢通过斜面种子接种到摇瓶、发酵罐扩大培养，经固体发酵形成若花状分叉多枝的孢梗束子实体，经采收干燥即可作食药用原料。
目前，蝉花的人工培养主要是单面培养，即采用立体培养架培养，菌丝只能单向生长，不利于培养基和培养空间的充分利用；且该方法培养时间长，不利于节约生产成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蝉花的双向人工培养方法。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种蝉花的双向人工培养方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，蝉花菌种在液体培养基中进行扩大培养；
步骤2，在培养室内将步骤1经过扩大培养得到的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，菌丝体生长阶段，保持黑暗条件；当处于孢梗束生长阶段时转为光照培养，在菌丝体长满培养基时，将培养基进行悬空；和
步骤3，对孢梗束进行采收；
所述黑暗可以是基本黑暗条件。
进一步，菌丝体长满培养基时，培养基出现板结时将培养基进行悬空。
进一步，培养基悬空后与培养容器顶部和底部的距离分别为12～16cm；更进一步，培养基悬空后与培养容器顶部和底部的距离分别为14～15cm。
进一步，步骤2固体培养过程中，培养温度为20～30℃；更进一步，在菌丝体生长阶段，培养温度为22～24℃；在孢梗束生长阶段，培养温度为20～22℃；
进一步，在孢梗束生长阶段光照强度为100～200Lx。
进一步，步骤2固体培养过程中相对湿度为50～70％；更进一步，相对湿度为65～70％。
本发明步骤1所述液体培养过程以菌种扩增为目的，可采用常规的菌种扩培方法，包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养中的任意一种或几种方法的组合；所用培养基为本领域常规的液体培养基，如马铃薯-蔗糖-琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基、马铃薯-蔗糖-水培养基、马铃薯-葡萄糖-水培养基、酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基，酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基等。
本发明步骤2中所述固体培养基为本领域常规固体培养基，如谷物培养基，可选自小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦、糙米、粳米中的任意一种或几种；农作物秸杆培养基，如麦秆、玉米杆、棉杆、豆杆、芝麻杆中的任意一种或几种；农作物皮壳培养基，如麸皮、大豆皮、棉籽壳等；经济林木树枝培养基等；其中优选谷物培养基。
本发明中所述蝉花(Isaria cicadae Miquel)是广布种，广泛分布在我国秦岭-淮河以南的18个省、市、区。在我国长江以南的亚热带和热带地区，且多在低洼地带及滇藏高原的金沙江、怒江、澜沧江和雅鲁藏布江等河谷地带。只要在其生长季节，每年的6～8月，按照一般中药材的采集方法都可采到，是现有技术中已知菌种，并可以从商业途径购买获得。
本发明所用的蝉花菌株为第CN201110178274.6号专利中公开的保藏号为CGMCCNo.3453的蝉拟青霉菌株[Paecilomyces cicadae(Miq.)Samson]。
本发明培养方法的有益效果在于：
①双向培养能够更充分地利用和转化培养基，孢梗束得率较单向培养提高了20-40％，而产品的内在质量与单面培养相比无显著性差异；②双向培养能够更充分地利用了培养空间；③双向培养的培养周期较单向培养明显缩短(可节省2d)，节约了生产成本，增加了年生产批次。
附图说明
图1栅栏状支架俯视图
1.支架；2.长方形延伸；3.横梁
图2培养盒示意图
1.上盒盖；2.透气膜孔；3.支架；4.下盒盖
具体实施方式
实验例1 蝉花菌种的扩大培养
斜面培养：将分离纯化的菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11Mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
种子罐培养：在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903～7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
发酵罐培养：在500L气升式发酵罐中装入200L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200L种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903～7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200L。
斜面试管培养基：每1升液体含有200克马铃薯煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水至1000毫升，pH值为6.5；
摇瓶、种子罐及发酵罐中的液体培养基：含有酵母浸出粉1％，复合氨基酸0.5％，白砂糖3.5％，余量补水至100％，pH值为6.5。
实验例2 蝉花菌种的扩大培养
斜面培养：将分离纯化的菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
摇瓶培养：在500m1三角瓶中装入200m1液体培养基，在0.11Mpa压力下高压灭菌30分钟，待冷却至室温，将1支斜面试管的菌种接种到500m1三角瓶培养基上，并置于恒温振荡培养箱，温度22±1℃，150转/分钟条件下培养，培养时间为3天；
种子罐培养：在50L气升式发酵罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述培养好的500m1摇瓶菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903～7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
斜面试管培养基：每1升液体含有200克马铃薯煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水至1000毫升，pH值为6.5；
摇瓶及种子罐培养基：每1升液体含有30克酵母浸出粉，30克白砂糖，5克大豆水解蛋白，加水补至1000毫升，pH值为6.5。
实验例3 蝉花菌种的扩大培养
斜面培养：将分离纯化的菌种接种于斜面试管中，再将接种菌种的斜面试管放入22℃培养箱，培养时间为7天，待菌丝长满试管；
种子罐培养：在50L气升式种子罐中装入20L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％，在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将4瓶上述斜面试管的菌种接入培养基，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903～7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可，终培养体积为20L。
发酵罐培养：在500L气升式发酵罐中装入200L液体培养基，培养基温度大于95℃，加入食用消泡剂，加入量为培养基重量的0.03％,在0.11Mpa压力下，通入蒸汽加热到121℃，并保压30～45分钟；灭菌后，冷却至20℃时，将上述培养好的200L种子罐种子全部接入培养，培养温度为22±1℃，通气量为1：0.5V/V min，保压4.903～7.0845×104Pa，经3天通气培养，达到对数生长期后即可。终培养体积为200L。
斜面试管培养基：每1升液体含有200克马铃薯煮汁，20克蔗糖，20克琼脂，余补水至1000毫升，pH值为6.5；
种子罐及发酵罐培养基：每1升液体含有40克麸皮煮汁，30克白砂糖，余补水至1000毫升，pH值为6.5。
实施例4 固体发酵培养
培养容器：耐高压灭菌的塑料袋，在塑料袋中置入一个栅栏状支架，如图1所示，所述支架包括支架1和长方形延伸2，所述长方形延伸2位于支架1的两侧。当对培养基进行悬空处理时，将支架两侧的长方形延伸2放置于横梁3即可。
固体培养基：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦:水为1：1.4，拌匀后装入塑料袋中，扎紧袋口。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30～50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个塑料袋中按7％的接种量接种实施例1得到的菌种，接种后的塑料袋放入培养室培养。
培养过程和培养条件：菌丝体生长阶段，培养室温度为22～24℃，空气相对湿度65％～70％，将培养室遮光，使发菌室基本黑暗；待菌丝体长满培养基时，培养基由于菌丝渗透、扭结并与其中的小麦颗粒相互缠绕而逐渐板结，转入光照培养，同时将平铺于栅栏支架上的已经板结的培养基进行悬空处理，即将塑料袋中栅栏状支架的两侧延伸分别放置在横梁上，从而将培养基质悬空，塑料袋上下均保持12～16cm对称的培养空间。此后为诱导形成孢梗束时期，培养室温度为20～22℃，空气相对湿度65％～70％，保证有散射光(100Lx～200Lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
采收及处理：至孢梗束成熟，尚未大量产生孢子时进行采收；采收后的孢梗束在相对湿度45％～50％的除湿间除湿40h～50h，进入烘干室准备烘干。烘箱设置温度60℃，干燥时间8h～10h。干燥结束后装入PE袋中，扎口放置阴凉干燥处。干燥结束测定孢梗束水分，其应≤6％。
实施例5 固体发酵培养
培养容器：聚丙烯培养盒，如图2所示，所述培养盒包括上盒盖1、透气膜孔2、支架3和下盒盖4，所述支架3固定于下盒盖4上，距离上盒盖顶和下盒盖均14cm，支架平面距离下盒盖口的平面2.5cm，在上盒盖1和下盒盖4上分别有两个透气膜孔2，上贴透气膜；当对培养基进行悬空处理时，缓慢将培养盒上下倒置，培养基就会在重力作用下平落支架3上。
固体培养基：将大米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为大米:水为1：1.3，拌匀后装入培养盒中，此时上盒盖在下，下盒在上，培养基在上盒盖里。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30～50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按5％的接种量接种实施例2得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。
培养过程和培养条件：菌丝体生长阶段，培养室温度为22～24℃，空气相对湿度65％～70％，将培养室遮光，使发菌室基本黑暗；待菌丝体长满培养基时，培养基由于菌丝渗透、扭结并与其中的小麦颗粒相互缠绕而逐渐板结，转入光照培养，同时将已经板结的培养基质进行悬空处理，即缓慢将培养盒上下倒置，已经板结的培养基就会在重力作用下平落支架上。此后为诱导形成孢梗束时期，培养室温度为20～22℃，空气相对湿度65％～70％，保证有散射光(100Lx～200Lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
采收及处理：同实施例4。
实施例6 固体发酵培养
培养容器：耐高压灭菌的塑料袋，在塑料袋中置入一个栅栏状支架，如图1所示，所述支架包括不锈钢支架1和长方形延伸2，所述长方形延伸2位于不锈钢支架1的两侧，当对培养基进行悬空处理时，将支架两侧的长方形延伸2放置于横梁3即可。
固体培养基：将糙米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为糙米：水为1：1.5，拌匀后装入塑料袋中，扎紧袋口。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30～50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个塑料袋中按7％的接种量接种实施例3得到的菌种，接种后的塑料袋放入培养室培养。
培养过程和培养条件：菌丝体生长阶段，培养室温度为22～24℃，空气相对湿度65％～70％，将培养室遮光，使发菌室基本黑暗；待菌丝体长满培养基时，培养基由于菌丝渗透、扭结并与其中的小麦颗粒相互缠绕而逐渐板结，转入光照培养，同时将平铺于栅栏装支架上的已经板结的培养基进行悬空处理，即将塑料袋中栅栏状支架的两侧延伸分别搁在梁上，从而将培养基质悬空，塑料袋上下均保持12～16cm对称的培养空间。此后为诱导形成孢梗束时期，培养室温度为20～22℃，空气相对湿度65％～70％，保证有散射光(100Lx～200Lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
采收及处理：同实施例4。
实施例7 固体发酵培养
培养容器：聚丙烯培养盒，如图2所示，所述培养盒包括上盒盖1、透气膜孔2、支架3和下盒盖4，所述支架3固定于下盒盖4上，距离上盒盖顶和下盒盖均14cm，支架平面距离下盒盖口的平面2.5cm，在上盒盖1和下盒盖4上分别有两个透气膜孔2，上贴透气膜，当对培养基进行悬空处理时，缓慢将培养盒上下倒置，培养基就会在重力作用下平落支架3上。
固体培养基：小米清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小米:水为1：1.3，拌匀后装入培养盒中，此时上盒盖在下，下盒在上，培养基在上盒盖里。将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30～50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按5％的接种量接种实施例1得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。
培养过程和培养条件：菌丝体生长阶段，培养室温度为22～24℃，空气相对湿度65％～70％，将培养室遮光，使发菌室基本黑暗；待菌丝体长满培养基时，培养基由于菌丝渗透、扭结并与其中的小麦颗粒相互缠绕而逐渐板结，转入光照培养，同时将已经板结的培养基质进行悬空处理，即缓慢将培养盒上下倒置，已经板结的培养基就会在重力作用下平落在栅栏横杆上。此后为诱导形成孢梗束时期，培养室温度为20～22℃，空气相对湿度65％～70％，保证有散射光(100Lx～200Lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
采收及处理：同实施例4。
实施例8 对照实施例
固体培养基：将小麦清洗控水后，加入适量的水，其重量比为小麦:水为1：1.4，拌匀后装入密封的聚丙烯盒子中(盒子上方盖打孔，孔上贴中有透气膜)；将装好培养基的培养容器放置灭菌锅内，121℃下灭菌30～50min；灭菌后，培养容器移置缓冲室内，自然冷却至24℃以下移置接种室内。
接种：接种前培养容器先在超净工作台或百级层流罩内(下)用紫外光照射0.5h；每个培养容器按7％的接种量接种实施例1得到的菌种，接种后的容器放入培养室培养。
培养条件：培养室温度为22～24℃，空气相对湿度65％～70％；首先要将培养室遮光，使发菌室基本黑暗。待菌丝体长满培养基时，转入光照培养。接种后定期检查，及时剔除生长势差、感染杂菌的培养容器。此后为诱导形成孢梗束时期，保持培养室温度为20～22℃，相对空气湿度65％～70％，保证有散射光(100Lx～200Lx)诱导孢梗束形成。培养室要适时通风换气，保持发菌室空气新鲜。
采收及处理：同实施例4。
培养结果比较
1、实施例4-8固体培养时间和孢梗束得率结果比较，结果见表1。
表1 培养时间和孢梗束得率结果
| 培养时间/天 | 孢梗束得率％ | |
| 实施例4 | 26 | 14.1±1.35Aa |
| 实施例5 | 26 | 12.2±1.02Bb |
| 实施例6 | 26 | 13.1±1.30Aa |
| 实施例7 | 26 | 13.5±1.24Aa |
| 实施例8 | 28 | 11.0±1.03Cc |
2、实施例4及实施例8孢梗束营养成分含量比较，结果见表2。
表2 孢梗束营养成分含量
通过比较可以看出，实施例4～7的双面培养较实施例8的单面培养具有明显优势：
①双向培养能够更充分地利用和转化培养基，孢梗束得率较单向培养提高了20～40％，而产品的内在质量与单面培养相比无显著性差异；
②双向培养能够更充分地利用了培养空间；
③双向培养的培养周期较单向培养明显缩短(可节省2天)，节约了生产成本，增加了年生产批次。
Claims (8)
1.一种蝉花的双向人工培养方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1，蝉花菌种在液体培养基中进行扩大培养；
步骤2，在培养室内将步骤1经过扩大培养得到的菌种接种到固体培养基中进行固体培养，菌丝体生长阶段，保持黑暗条件；当处于孢梗束生长阶段时转为光照培养，在菌丝体长满培养基时，培养基出现板结时将培养基进行悬空；和
步骤3，对孢梗束进行采收；
其中，固体培养阶段的培养容器为聚丙烯培养盒，所述培养盒包括上盒盖1、透气膜孔2、支架3和下盒盖4，所述支架3固定于下盒盖4上；当对培养基进行悬空处理时，将培养盒上下倒置使培养基平落在支架3上；培养基悬空后与培养容器顶部和底部的距离分别为12～16cm。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2固体培养过程中，培养温度为20～30℃。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在菌丝体生长阶段，培养温度为22～24℃；在形成孢梗束阶段，培养温度为20～22℃。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤2固体培养过程中相对湿度为50～70％。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1所述液体培养过程包括斜面培养、摇瓶培养、种子罐培养、发酵罐培养中的任意一种或几种方法的组合。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1所述液体培养基包括马铃薯-蔗糖-琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基、马铃薯-蔗糖-水培养基、马铃薯-葡萄糖-水培养基、酵母浸出粉-复合氨基酸-蔗糖培养基，酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培养基，麸皮煮汁-白砂糖培养基中的任意一种或几种的组合。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2所述固体培养基包括谷物培养基、农作物秸杆培养基、农作物皮壳培养基、经济林木树枝培养基中的任意一种。
8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述谷物培养基包括小麦、玉米、大米、小米、黄豆粉、荞麦、大麦、燕麦中的任意一种或几种。
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