CN105191657A - 一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种蛇足石杉无菌苗快速繁殖的方法，包括芽胞采集与处理、外植体表面消毒、内生菌杀灭培养与芽胞萌发、幼苗的继代与增殖、试管苗驯化等步骤。以蛇足石杉芽胞为外植体，经低温处理，芽胞的萌发率显著提高，达到98%；同时，该发明方法采取芽胞灭菌与萌发、幼苗增殖与生根同步化操作，大大缩短了产苗周期，降低了生产成本；所获芽胞污染率低、萌发率高、繁殖速度快，移栽存活率达96%以上，这对可持续性开发利用蛇足石杉野生资源、缓解石杉碱甲市场的供需矛盾及实现蛇足石杉的规模工厂化育苗，具有十分积极的意义。

Description

一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法
技术领域
本发明属于植物无性繁殖技术领域，具体涉及到一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法。
背景技术
蛇足石杉[Huperziaserrata(Thunb.)Trev.]，又名千层塔，为石杉属多年生珍稀药用草本蕨类植物，因其体内含有的次生代谢产物——石杉碱甲被证明是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂而倍受全球医药界的关注，并已将石杉碱甲制剂列为治疗老年痴呆症的首选药用于临床与研究。
自石杉碱甲问世以来，其资源问题一直没有得到解决。首先，由于手性明显，合成、半合成均难度很大，虽能在实验室初步成功，但成本上无法达到工业化生产要求；其次，人们尽管在近缘植物寻找、孢子繁殖、人工栽培、组织培养及内生真菌发酵等方面进行了有益探索，但收效甚少，基本上处于研发起步阶段，不具备大规模商业化开发的价值。因此，目前从蛇足石杉植物中提取是石杉碱甲的唯一来源。
蛇足石杉虽然分布较广，但它对生境要求较高，加之其植株矮小，石杉碱甲含量低，生长周期长，资源恢复期长达15年。经多年的极度采挖，野生资源遭到严重破坏，石杉碱甲资源问题日益严峻。据统计全国现有的蛇足石杉储量，尚不足以应付10年的石杉碱甲提取，严重制约了该药的研究与应用前景。
随着全球人口老龄化进程的加速及老年痴呆人群的逐年递增，国内外对石杉碱甲的需求量日益增加，与之相对应的野生资源越发匮乏，使得石杉碱甲市场供求矛盾的日益凸显。如何找到一个能够在短期内突破石杉碱甲制剂产业链资源瓶颈的蛇足石杉快速繁殖技术途径，已迫在眉睫。
发明内容
针对蛇足石杉野生资源短缺，本发明的目的在于，提供一种蛇足石杉无菌苗快速繁育培养的方法，以满足市场需要。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法，其具体操作步骤如下：
（1）芽胞的采集与处理
采集饱满、无病虫害的蛇足石杉植株芽胞，流水冲洗处理0.5-1小时后，放入带润湿吸水纸的培养器皿中，然后于4℃条件下低温保存与处理。
（2）外植体表面消毒
将低温保存与处理的芽胞置于超净工作台中，无菌水清洗2-3遍，无菌纸吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，无菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗3-5遍。
（3）内生菌杀灭培养与芽胞萌发
经表面灭菌的外植体转移至添加2-3g/l苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s（莫氏）液体培养基中，置于20-23℃、光照强度500-1000lx、光照时间12-14h/d条件下培养3-4周，对外植体的内生菌进行杀灭与芽胞萌发培养。
（4）幼苗的继代与增殖
将已灭菌的外植体转至以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的植物激素组合体系中，于20-23℃、光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%、光照强度1000-3000lx条件下培养，每两个月更换一次培养基。
A、所述的改良Moore’s培养基由下列物质组成：50mg/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、25mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、50mg/L磷酸氢二钾(K2HPO4)、50mg/L氯化铵（NH4Cl）、5.56mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.012mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.012mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、11.15mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、20g/L蔗糖。
B、所述改良Moore’s培养液高压灭菌前调pH值为5.6；培养液与苔藓基质灭菌条件为：121℃、104kPa下灭菌20min。
（5）试管苗的驯化培养
将种植基质（原生土：腐殖土:木屑:菌渣=1:3:3:3）先用苯菌灵稀溶液灭菌，再在阳光下暴晒处理8h；取继代增殖培养2次的试管苗开瓶盖驯化一周后，洗净根部培养液，移植到经消毒灭菌处理过的种植基质上，大棚培养1-2个月，即可获得驯化苗，以备大田移栽。大棚培养条件为：遮阳度60～90﹪，温度控制在20-30℃、相对湿度控制在70-90%。
本发明的有益技术效果体现在以下几个方面。
1、芽胞是蛇足石杉上新生的无性繁殖芽，较根、茎、叶等外植体更易除菌，易于建立蛇足石杉的无菌培养再生体系；同时，以芽胞作为外植体进行快速繁殖，不必破损原植物，有利于合理保护及可持续开发利用蛇足石杉野生资源，改善植物濒危的局面。
2、采用4℃低温处理，促进了芽胞快速萌发，其萌发率高达98%；以常规表面灭菌结合高效灭菌剂苯菌灵进行内生菌杀灭培养，实现了芽胞灭菌与萌发的同步化，获得了95％左右的无菌萌发苗，并且有效地控制了外植体的褐化和白化。
3、选择改良Moore’s培养基作为芽胞基本培养基，配以0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的激素组合及苔藓基质，在20-23℃、光照强度1000-3000lx，光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%的培养条件下，实现了蛇足石杉增殖、生根同步化和快速繁殖。实验结果表明：芽胞在上述条件下培养6个月，芽胞苗最高达6.9cm/株，根系生长快且生根数达7条/株，生物量增加6.9倍/株。
4、本发明方法获得的试管苗移植至经苯菌灵稀溶液灭菌，再在阳光下暴晒处理8h的种植基质（原生土：腐殖土:木屑:菌渣=1:3:3:3）上，大棚培养驯化1-2个月，在遮阳度60～90%，温度控制在20-30℃、相对湿度控制在70-90%的条件下，存活率可达96%以上，为实现蛇足石杉的大规模工厂化育苗奠定了基础。
附图说明
图1饱满、无病虫害的芽胞。
图2芽胞灭菌与萌发。
图3转接到苔藓上的幼苗。
图4继代增殖的小苗。
图5小植株已分叉且根系发达。
图6移栽基质上的驯化植株。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步地详细说明，但不仅限于此。
实施例一
1.芽胞低温处理及灭菌条件的优化
9-10月，采集饱满、无病虫害的蛇足石杉植株芽胞，流水冲洗处理0.5-1小时后，放入带润湿吸水纸的培养器皿中（见附图1），然后置于4℃冰箱中低温保存；将经低温处理的芽胞置于超净工作台中，无菌水清洗2-3遍，无菌纸吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，无菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗3-5遍。
经表面灭菌的外植体转移至添加苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s（莫氏）液体培养基中，置于20-23℃、光照强度500-1000lx、光照时间12-14h/d条件下培养3-4周，对外植体的内生菌进行杀灭与芽胞萌发培养，试验结果见下表1。
表1不同低温处理时间及灭菌剂浓度对芽胞萌发及灭菌效果的影响
从上表1可以看出，低温保存3-4周，有利于芽胞的萌发，且芽胞萌发率最高达98%，低温保存时间过短，芽胞萌发率低；同时添加2-3g/l苯菌灵可湿粉DW50，芽胞的污染率最低，且可以很好的控制外植体的褐化和白化，能够获得95%左右的无菌外植体。如图2所示，芽胞经置于4℃冰箱中低温保存4周，接种在添加2g/l苯菌灵可湿粉DW50的Moore’s液体培养基中，培养3周后无污染及褐化，萌发率达100%。
2.幼苗的继代与增殖培养的条件优化
将已灭菌的外植体转至以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的体系中，于20-23℃、光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%、光照强度1000-3000lx条件下培养，每两个月更换一次培养基，同时记录生长速度。芽胞培养6个月后，试验统计结果见下表2。
改良Moore’s培养液由下列物质组成：50mg/L硫酸镁MgSO4·7H2O、25mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、50mg/L磷酸氢二钾(K2HPO4)、50mg/L氯化铵（NH4Cl）、5.56mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.012mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.012mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、11.15mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、20g/L蔗糖。
改良Moore’s培养液高压灭菌前调pH值为5.6；培养液与苔藓基质灭菌条件为：121℃、104kPa下灭菌20min。
表2不同浓度激素组合对蛇足石杉生长、增殖和生根的影响
以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA，试验统计结果表明，在9组试验中，芽胞苗均能在增殖的同时又生根，达到增殖生根同步化，其中最优的激素组合为0.045mg/lIBA,0.9mg/lKT,0.5mg/lNAA，培养6个月后，芽胞苗高达6.9cm/株，根系生长快且生根数达7条/株，生物量增加6.9倍/株，如图5所示，蛇足石杉继代增殖培养6个月后，植株形成分叉，且根系发达，实现了蛇足石杉增殖、生根同步化和快速繁殖。
3.试管苗的驯化培养
将继代增殖培养2次的试管苗开瓶盖驯化一周，洗净根部培养液，移植到经苯菌灵稀溶液灭菌，然后在阳光下暴晒处理8h的种植基质（原生土：腐殖土:木屑:菌渣=1:3:3:3）上大棚培养1-2个月，即可获得驯化苗，以备大田移栽。大棚培养条件为：遮阳度60～90﹪，温度控制在20-30℃、相对湿度控制在70-90%。如图6所示，蛇足石杉无菌苗长势良好，存活率达97%以上，为实现蛇足石杉的大规模工厂化育苗奠定了基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种蛇足石杉无菌苗的快速繁育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）芽胞的采集与处理：采集饱满、无病虫害的蛇足石杉的芽胞，流水冲洗0.5-1小时，然后于4℃条件下低温保湿保存与处理3-4周；
（2）外植体表面消毒：将经低温保湿保存处理的芽胞于超净工作台中，无菌水清洗2-3遍，无菌纸吸干表面水分；然后浸泡于70%乙醇中30-60秒，无菌水清洗3-5遍；最后置于5%的次氯酸钠溶液中消毒8-10分钟，无菌水清洗3-5遍；
（3）内生菌杀灭培养与芽胞萌发：经表面灭菌的外植体转移至添加苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s液体培养基中，于20-23℃、光照强度500-1000lx、光照时间12-14h/d条件下培养3-4周；
（4）幼苗的继代与增殖：将已灭菌的外植体转至以苔藓为基质，添加改良Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA，0.3-0.9mg/lKT，0.25-0.75mg/lNAA的植物激素组合体系中，于20-23℃、光照时间12-14h/d、相对湿度70-90%、光照强度1000-3000lx条件下培养，每两个月更换一次培养基；
（5）试管苗的驯化培养：将种植基质先用苯菌灵稀溶液灭菌，再在阳光下暴晒处理8h；取继代增殖培养2次的试管苗开瓶盖驯化一周后，洗净根部培养液，移植到经消毒灭菌处理过的种植基质上，大棚培养1-2个月，即可获得驯化苗，以备大田移栽。
2.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述芽胞处理是于4℃冰箱中低温保湿保存与处理3-4周。
3.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述芽胞内生菌杀灭与萌发是在添加2-3g/l苯菌灵可湿粉DW50的改良Moore’s液体培养基中进行。
4.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述的幼苗继代与增殖的培养基为以苔藓为基质，并添加了改良的Moore’s培养液以及0.015-0.045mg/lIBA、0.3-0.9mg/lKT和0.25-0.75mg/lNAA。
5.根据权利要求1或4所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述的改良Moore’s培养液由50mg/L硫酸镁(MgSO4·7H2O)、25mg/L氯化钙(CaCl2·2H2O)、50mg/L磷酸氢二钾(K2HPO4)、50mg/L氯化铵（NH4Cl）、5.56mg/L硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、9.31mg/L乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)、0.415mg/L碘化钾(KI)、0.125mg/L钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.012mg/L硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.012mg/L氯化钴(CoCl2·6H2O)、11.15mg/L硫酸锰(MnSO4·H2O)、4.3mg/L硫酸锌(ZnSO4·7H2O)和20g/L蔗糖组成；所述改良Moore’s培养液高压灭菌前的pH值为5.6，培养液与苔藓基质灭菌条件为121℃、104kPa下灭菌20min。
6.根据权利要求1所述一种蛇足石杉无菌苗的快速繁殖方法，其特征在于所述试管苗的驯化培养所使用的种植基质的组成为原生土:腐殖土:木屑:菌渣=1:3:3:3；大棚培养条件为：遮阳度60～90﹪，温度控制在20-30℃、相对湿度控制在70-90%。
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