CN105777881B

CN105777881B - 一种促进十字花科植物耐热性的基因及其应用

Info

Publication number: CN105777881B
Application number: CN201410799941.6A
Authority: CN
Inventors: 何玉科; 白金娟; 吴斐婕
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2019-04-30
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN105777881A

Abstract

本发明涉及一种促进十字花科植物耐热性的基因及其应用。本发明揭示了一个能够明显提高植株抗热能力的抗热基因，该抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。

Description

一种促进十字花科植物耐热性的基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术以及植物学领域，更具体地，本发明涉及一种促进十字花科植物耐热性的基因及其应用。

背景技术

植物的生长发育与环境密切相关，其中温度是影响植物生理过程的重要生态因子，植物在它整个生命过程中所发生的一切生理生化作用，都必须在其所处的环境具有一定的温度条件才能进行。但是，近些年来，频繁的人类活动排放了大量的温室气体，导致全球气候的变暖，并引发极端天气的频繁发生，如局部地区的异常高温、干旱等。正是这种全球气候的变化才使得高温热害变得日益突出，成为限制植物分布、生长和生产力的一个主要环境因子。高温胁迫可引起植物体内一系列的生理生化反应，如细胞膜透性增大，胞质外渗量增加；活性氧含量增加，膜脂过氧化程度加剧，丙二醛积累；细胞核内转录异常，蛋白质加工翻译过程受到抑制，酶丧失活性等等。不难想象这些生理生化反应的改变对植物的影响从生长延迟至器官损坏直至植物死亡，并将严重制约粮食作物和果蔬类植物的生长和发育，使农业生产面临严峻挑战。但是逆境下的植物并不仅仅是被动承受伤害，也会主动的调节适应。正是对这种逆境的不断适应过程，使植物在长期的进化过程中形成了完善的和复杂抗逆系统以适应不良环境。因此，对植物抗热机理进行更深入的研究，是认识植物与环境关系和培育新的抗性品种的重要途径之一，在理论和应用方面都有重要意义。

高温对植物造成的伤害是多方面的，因此植物对逆境胁迫的响应是一个涉及多信号途径、多基因调控的复杂过程，这些基因及其表达产物可以分为三类：(1)参与信号级联放大系统和转录调控的基因和产物，包括Ca²⁺、钙调素(CaM)、热激转录因子(Heat shocktranscription factor Hsf)和蛋白激酶(Mitogen-activated Protein kinases MAPK)等感受并传到热激信号、激活热激基因的表达并诱导植物抗热性；(2)高温胁迫会引起植物体内活性氧代谢失调，激活抗氧化系统消除ROS的生成，进而缓解植物体内的氧化胁迫。(3)高温胁迫诱导的热激蛋白(Heat shock proteins Hsps)直接对蛋白质的保护作用。

然而由于热激类型的不同，植物对高温胁迫的抗热性则主要包括两种：一种是基础抗热性(basal thermotolerance)，即将生长于21-23℃的植物直接转入41-45℃的高温条件下热激0.5-1小时所表现出的抗热性。这种抗热性主要由部分热激转录因子(HSF1和HSF3)以及ROS清除酶参与；另外一种是获得性抗热性，即先将生长于21-23℃的植物转入36-38℃条件下热处理1-2小时后置于常温2小时，再转入41-45℃的高温条件下热激2-3小时表现出的抗热性。这种抗热性主要由部分热激转录因子(HsfA2)以及部分热激蛋白(如Hsp101)参与。无论是哪一种的抗热性，都涉及到多信号途径、多基因协同调控的参与。

综上，本领域仍然有必要筛选在植物中具有抗热能力的基因，进行植物品种改良，提高植物耐热性，为丰富和平衡我国农作物市场提供抗热种质资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进十字花科植物耐热性的基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高十字花科植物耐热性；该多肽是：

(a)SEQ ID NO:2或所示氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高十字花科植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽；

(c)与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列具有80％(较佳地85％；更佳地90％；更佳地95％；更佳地98％)以上相同性，且具有提高十字花科植物耐热性功能的由(a)衍生的多肽。

在一个优选例中，编码所述多肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的十字花科植物选自：芸苔属植物或鼠耳芥属植物。

在另一优选例中，所述的十字花科植物选自白菜(Brassica rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种提高十字花科植物耐热性的方法，所述方法包括：提高十字花科植物中多肽的表达或活性；该多肽是：

(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或

在一个优选例中，所述的方法包括：将编码所述多肽的多核苷酸转入十字花科植物中。

在另一优选例中，所述的多核苷酸是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(i)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有编码所述多肽的多核苷酸；

(ii)将十字花科植物的组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述编码所述多肽的多核苷酸转入十字花科植物。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(iii)选择出转入了所述编码所述多肽的多核苷酸的植物组织、器官；以及

(iv)将步骤(c)中的植物组织、器官再生并选出转基因植物。

在另一优选例中，所述十字花科植物选自：芸苔属植物或鼠耳芥属植物；更佳地选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

在本发明的另一方面，提供一种多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作鉴定十字花科植物的耐热性的分子标记物；该多肽是：

(a)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；或

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、大白菜BrpHTT1a在不同植物中的RNA测序数据。纵坐标单位：相对于未处理材料的基因表达量的变化倍数。

图2、大白菜内源BrpHTT1a在不同的热处理时间后的表达倍数变化。纵坐标：相对于0.5小时处理材料中基因表达量的变化倍数。

图3、BrpHTT1a在大白菜不同组织中的表达模式。纵坐标：相对于花序中基因表达量的变化倍数。

图4、过量表达BrpHTT1a提高大白菜抗热性。BrpHTT1a-1和BrpHTT1a-2为两株BrpHTT1a转基因大白菜。

具体实施方式

本发明人致力于抗热基因的筛选，经过广泛的研究找到一个能够明显提高植株抗热能力的抗热基因，命名为BrpHTT1a。该抗热基因可应用于抗热分子育种，提高植物耐热性，获得品种改良的植物。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，或者其中包含有本发明的BrpHTT1a基因或其同源基因。如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：十字花科、禾本科、蔷薇科的植物。比如，所述的“植物”包括但不限于：十字花科芸薹属的大白菜、小白菜；十字花科鼠耳芥属植物；禾本科的水稻、小麦、高粱、玉米；此外还包括烟草、瓜果、蔬菜、油菜等等。更佳地，所述的“植物”是十字花科芸薹属或鼠耳芥属的植物。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多肽(蛋白)可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括BrpHTT1a多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种BrpHTT1a多肽的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，所述的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持相应的全长多肽的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持70％的全长多肽的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长多肽的80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，所述的“BrpHTT1a多肽”指具有提高植物耐热性功能活性的SEQ IDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与所述多肽相同功能的、上述序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽的功能。该术语还包括所述多肽的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体等。

任何与所述的多肽同源性高的、且具有提高植物耐热性功能的多肽也包括在本发明内。

发明还提供所述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

在本发明中，“本发明的多肽的保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比，有至多30个，更佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

氨基酸残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr

Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还涉及编码本发明多肽或其保守性变异多肽的多核苷酸序列，即BrpHTT1a基因或其同源基因。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。所述的多核苷酸可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示的序列相同或者是简并的变异体。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽也具有提高植物耐热性的功能。

应理解，虽然本发明的植物抗热(耐热)基因优选获自十字花科植物，但是获自其它植物的与十字花科BrpHTT1a基因高度同源(如具有70％以上，更佳地80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的多核苷酸的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得耐热性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的多肽或其编码基因的用途，用于提高植物的耐热性。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括提高所述植物中BrpHTT1a多肽的表达。

在得知了所述的多肽的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来提高所述多肽的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带多核苷酸的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的多肽。

作为本发明的一种实施方式，将多核苷酸通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到植物细胞中，使所述的植物细胞表达所述的多肽。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达所述多肽的植物。

优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：

(1)将外源的BrpHTT1a基因或其同源基因转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入BrpHTT1a基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子；和

(2)将步骤(1)获得的转入了外源BrpHTT1a基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有BrpHTT1a基因或其同源基因；

(s2)将植物细胞、组织、器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使BrpHTT1a基因或其同源基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入BrpHTT1a基因或其同源基因的植物细胞、组织、器官或种子；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物。

其它增加BrpHTT1a基因或其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强BrpHTT1a基因或其同源基因的表达。或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强BrpHTT1a基因或其同源基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子，水稻、玉米的Ubi启动子等。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。

此外，本发明还涉及利用BrpHTT1a基因或其同源基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用BrpHTT1a基因或其同源基因作为一种分子标记，通过检测植物中BrpHTT1a基因或其同源基因的表达情况，鉴定植物的耐热性，并可作为杂交制种过程中真杂种的指示标记。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I.材料与方法

材料

大白菜99Bre(即：B热大白菜，也称为抗热白菜Bre)种子，热敏小白菜HS种子获自上海农业科技种子有限公司。

热敏感白菜Wut获自上海农业科技种子有限公司。

Col为拟南芥野生型，获自中国科学院遗传发育研究所。

植物组织总RNA提取

试剂：TaKaRa RNAiso Reagent抽提试剂盒。

步骤：

a)将材料于液氮中充分研磨，以100mg材料/ml抽提缓冲液的量加入样品中，充分混匀，室温静置10分钟。

b)13000rpm离心5分钟，将上清转入新的离心管中，加入200μl氯仿，充分混匀，室温静置10分钟使其分层。

c)13000rpm离心5分钟，小心吸取上清于新的离心管中。

d)加入等体积异丙醇，混匀后室温静置10分钟。

e)13000rpm离心5分钟，弃上清后用1ml 75％(v/v)乙醇洗一次。

f)7800rpm离心5分钟，弃上清后低速离心，用枪头吸去残留液体，室温晾干，待RNA刚刚干燥后加入适量的无RNase的水，65℃10分钟充分溶解后存于-70℃。

RNA高通量测序

构建RNA文库的材料是抗热白菜Bre和热敏小白菜Wut。所有材料都种植在22℃16小时光照8小时黑暗的长日照条件下；三周后部分材料进行46℃1个小时的热激处理。收集地上部分的植物材料后用Alternative v1.5Protocol(Illumina，2009)提取RNA样品，Illumina GAII测序仪进行深度测序。

Realtime PCR

引物如下：

BrpHTT1a：

正向：5’TCCAAAGAAGAGCATGATTCA 3’(SEQ ID NO:3)；

反向：5’GCGTCGCTTCTGTTGCTTCTC 3’(SEQ ID NO:4)；

ACTIN：

正向：5’TGGCATCAYACTTTCTACAA 3’(SEQ ID NO:5)；

反向：5’CCACCACTDAGCACAATGTT 3’(SEQ ID NO:6)；

试剂如下：

AMV反转录酶(TAKARA)；

RNase抑制剂(TAKARA)；

DNase I(RNase free)(TAKARA)。

步骤如下：

a)用Trizol法分别提取不同热处理的大白菜叶片的总RNA，用DNase I(RNasefree)处理30分钟之后酚氯仿抽提，沉淀，吹干，用无RNase的水溶解。

b)测OD260及电泳定量后，取1μg总RNA，按说明书操作，42℃反应1小时，94℃5分钟以使反转录酶失活。

c)一倍稀释反转录产物后各取1μl做PCR。PCR反应条件：94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，25-28个循环；72℃5min。为校正用于RT-PCR反应的模板量，以Actin的引物进行平行PCR反应作为内对照。

CTAB法植物组织总DNA的提取

试剂如下：

2×CTAB缓冲液(100ml)：10ml 1M Tris pH 8.0；4ml 0.5M EDTA pH8.0；8.19gNaCl；2g CTAB；1g PVP K30定容至100ml。

1×CTAB缓冲液(100ml)：5ml 1M Tris pH 8.0；2ml 0.5M EDTA pH8.0；1g CTAB定容至100ml。

高盐TE(100ml)：1ml 1M Tris pH 8.0；200μl 0.5M EDTA pH8.0；5.844g NaCl定容至100ml。

10％(w/v)CTAB(50ml)：5g CTAB；2.045g NaCl定容至50ml。

步骤如下：

a)取5g植物材料液氮中研磨粉末后转入40ml离心管中。

b)加入15ml 65℃预热的2×CTAB缓冲液(1:1)，上下混匀后于65℃温育10min，其间不断上下颠倒几次。

c)加入1倍体积的氯仿:异戊醇(24:1)，混匀后11000rpm离心5min。

d)吸取上清至新的离心管中，补入1/10体积10％CTAB，然后加入1倍体积的氯仿:异戊醇，混匀后离心5min。

e)取上清，重复d)步骤2-3次，最后一次离心后将上清转入新的离心管，加入大于2倍体积的沉淀缓冲液(1×CTAB)，温和的混匀，于室温下放置30min。

f)离心并收集沉淀，将沉淀重悬于65℃的5ml高盐TE中，此时可加一些Rnase，37℃温育30min。

g)11000rpm离心10min后将上清转移至新的1.5ml离心管中。

h)加入2倍体积无水乙醇，混匀后于-20℃放置30min，离心，弃上清，用70％乙醇洗涤后晾干，溶于100μl TE中。

35S::BcpHTT1a基因组DNA载体构建

从基因组扩增BcpHTT1a的基因组DNA的引物如下：

正向：5’GGATCCATGTCTCACGAGTGTCATCCCG 3’(SEQ ID NO:7)；

反向：5’GTCGACTTACTTGAATATGCAAGGGACG 3’(SEQ ID NO:8)；

步骤如下：

a)用PCR的方法从B热大白菜基因组总DNA中分离BcpHTT1a基因组片段。

b)BrpHTT1a基因组片段用BamHI和SalI双酶切后克隆到pCAMBIA1300载体(获自CAMBIA公司)上(PCR片段连在35S和Nos中间)，测序验证。

c)利用冻融转化方法将pCAMBIA1300-BrpHTT1a正向基因载体导入农杆菌GV3101(购自Invitrogen)中，并PCR鉴定。

BrpHTT1a双链RNA沉默载体构建

a)采用引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，用PCR的方法从B热大白菜cDNA中分离BcpHTT1a编码序列，并连接到pBluscript克隆载体上。

b)用EcoRI和KpnI双酶切BrpHTT1a，正向克隆到pHANNIBAL载体(获自澳大利亚CSIRO组织)的第一处多克隆位点处，用XbaI和PstI双酶切BrpHTT1a，反向克隆到pHANNIBAL载体的第二处多克隆位点处(pHANNIBAL初始载体获自澳大利亚CSIRO组织)，测序验证。然后将含有双链BrpHTT1a的片段用EcoRI和PstI双酶切连入pCAMBIA1300载体(插入片段连在35S和Nos中间)中。

冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

a)从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取GV3101单菌落，转到20ml LB液体培养基(rif 50mg/l，GM 5050mg/l)中，于28℃250rpm振荡培养过夜(不可太浓)。(下面全部操作均在无菌条件下进行)。

b)冰浴20分钟后，将菌液分装5ml的离心管(每管4ml)中，冰浴10分钟。

c)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃菌液。

d)每管加入1ml充分预冷的20mM CaCl₂以重悬菌体。冰浴10分钟。

e)4000rpm(5-10℃)离心10分钟，弃上清。

f)每管加入300μl 20mM CaCl₂(视菌体浓度而定)，合并后分管于1.5ml的离心管中。

g)每管加入1μl质粒或所有连接产物，冰浴5分钟，再放入液氮中4-5分钟。

h)37℃放5分钟，每管加入400μl LB培养基于28℃温育2小时使细菌复苏，并表达相应的抗生素抗性基因。

i)各取200μl体积涂板，室温放置一会儿，于28℃培养。

浸花法转化拟南芥及筛选

试剂：

转化缓冲液(1L)：大量元素(50×)：10ml；微量元素(1000×)：0.5ml；CaCl2(100×)：5ml；铁盐(200×)：2.5ml；有机(100×)：10ml；蔗糖：50g；6-BA(1mg/ml)：10μl；SilwetL-77：400μl(真空抽滤则用200μl)；用KOH调至pH5.8，定容1L。

筛选培养基平板：3％(w/v)蔗糖MS0固体培养基(pH5.8)加入卡那霉素(Kan)至50mg/l(用于Nossen背景拟南芥的筛选)。

步骤：

a)当拟南芥抽苔后茎高约5厘米时可以进行转化，若待转化的植株结实率低则要在植株打顶4天后进行。

b)转化前，将已授粉的花和角果去除掉。并使土壤吸水过夜。

c)将已培养过夜的农杆菌1:100稀释于大瓶培养基中，28℃培养24小时后，4℃5000rpm离心20分钟，弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于原菌液的两倍体积的转化缓冲液中，使OD600在0.8左右。

d)拟南芥的地上部分完全浸入菌液中30秒，取出平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日移入人工气候室正常竖直培养。收种子后干燥2周。

e)种子经无菌消毒后铺于含50mg/l Kan的Ms0固体平板中，经4℃春化两天后移到组培室，卡那抗性苗移到土中继续生长。

f)取叶片提取基因组DNA经PCR检测得到阳性苗，再经两代筛选得到转基因的纯系，用于进一步分析。

真空抽滤法转化白菜及筛选

(1)大白菜的转化

a)将大白菜种子放在浸湿水的滤纸上4℃春化2个月(经过春化的大白菜可在小苗期抽薹开花，便于转化)，然后把下胚轴已伸长的大白菜小苗移入土中，待其抽薹并开第一朵花时可以进行转化。转化前要将土壤浸湿过夜。

b)含农杆菌的转化液的准备同拟南芥转化方法。

c)将大白菜的地上部分倒置并完全浸入菌液中，放在带真空泵的干燥器中，真空抽5分钟两次(2分钟间隔)至大白菜的叶片透明化，放气后取出植株平放，覆盖保鲜膜和报纸，黑暗下过夜，次日将大白菜移栽入大盆中，正常培养。开花期于蕾期人工授粉，套袋。收种子后干燥2周。

d)经无菌消毒的大白菜种子于无菌滤纸上吸干水，用镊子转入含Kan50mg/l培养基的三角瓶中。4℃春化2到3天，移入恒温室培养。

e)大白菜的转化子要等到真叶长出才能鉴别出来：绿色的真叶，根正常发育。而非转化子的大白菜真叶为白色，无根。待转化子长出3-4片真叶后，经过3天炼苗后可以移入土中。

拟南芥转基因抗热表型分析

分别挑选转BrpHTT1a基因过量表达的拟南芥T3代株系与野生型分别播种在MS₀培养基上，于22℃光照条件下培养7天。在野生型与转基因株系长一致的条件下，将培养皿放在44℃条件下热激1小时后，拿出来放在22℃光照条件下再培养7天，此时可观察到转基因株系较野生型在热激后能正常存活，显示其具有显著抗热性。

大白菜转基因抗热表型分析

分别挑选转BrpHTT1a基因过量表达和转BrpHTT RNAi的大白菜T3代株系与野生型分别播种在营养土中，于22℃光照条件下培养14天。在野生型与转基因株系长一致的条件下，采用45℃/35℃(12h-on/12h-off)昼夜不同高温温度，一共处理10天，分别在处理5天、10天、22℃复水2天后观察。植物表型分类如下：

叶片皱缩反卷：轻度A、中度A+、严重A++；

叶片失绿程度：轻度B、中度B+、严重B++；

植株生长滞缓：轻度C、中度C+、严重C++；

植株萎蔫死亡：轻度D、中度D+、严重D++。

II.实施例

实施例1、BrpHTT1a的序列分析和在不同品种白菜中的基因表达

本发明人在大白菜中发现一个抗热相关的基因，本发明人将之命名为BrpHTT1a。其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，基因组序列如SEQ ID NO:9所示，编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

RNA高通量测序测定BrpHTT1a在芸薹属不同抗热品种中的基因表达情况。结果表明，BrpHTT1a在芸薹属不同抗热品种中的表达差异最为显著，如图1。

实施例2、BrpHTT1a表达受高温诱导

本发明人在大白菜热处理后的高通量测序数据中发现，BrpHTT1a的转录本含量在热处理后显著升高，为未热处理材料中该基因表达量的19.23倍。

为进一步确定BrpHTT1a是如何被高温实时调控的，本发明人通过对野生型幼苗材料在45℃条件下进行0.5-4h等不同时间的热处理后分别取材，利用Real time qRT-PCR分析BrpHTT1a的表达。由图2的结果可以看出，高温胁迫可以显著的诱导BrpHTT1a的表达，而且处理时间越长，BrpHTT1a的表达量越高，在热处理4小时的时候表达量相对于0.5小时提高了9.52倍。

因此，RNA测序的数据和Realtime PCR的结果都显示，BrpHTT1a的表达受到高温的诱导。

实施例3、BrpHTT1a表达具有组织泛在性

本发明人通过Realtime PCR技术分别分析了大白菜不同组织部位，如幼苗，莲座叶，茎，茎生叶，花序，角果中BrpHTT1a的积累量。结果表明该基因在不同部位均有一定程度的表达，BrpHTT1a其中幼苗期的表达最高，在其他组织部位表达量相对较低，如图3。

这种泛在性表达也说明，BrpHTT1a是生长发育所必不可缺的基因。

实施例4、过量表达BrpHTT1a提高植株抗热性

为了进一步验证BrpHTT1a的功能，本发明人将这该基因在35S启动子的启动下分别转入拟南芥和大白菜Bre。在不同的转基因株系中分别获得了超过30个的转基因株系，在所述的转基因株系中，发现BrpHTT1a的转录本含量的确有所升高。

通过Real time qRT-PCR筛选部分转基因株系分别用于抗热表型分析。表达株系与野生型幼苗同时进行基础性和获得性抗热性分析。

在转基因拟南芥中，BrpHTT1a过表达株系热处理后，植株存活率均在80％以上，而野生型col的存活率为10％。

在大白菜中，转基因植株相比野生型，在45℃处理10天后，野生型幼苗发生萎蔫，而转基因株系的萎蔫程度较低，在22℃回复生长2天后，野生型植株已经死亡，而转基因植株则保持了良好的生长状态，并有新的叶片发生(图4)，表型统计结果如表2所示，表明过表达BrpHTT1a能显著提高植株抗热性。

表2、转基因大白菜热处理后表型统计

实施例5、BrpHTT1a沉默植株对高温敏感

利用RNA干扰技术，本发明人构建了能够沉默BrpHTT1a的双链RNA干扰载体，并在35s启动子驱动下，转化了大白菜Bre。

结果，一共获得了3个转基因株系，分别命名为1ai-1，1ai-2和1ai-3，其中2个株系通过RealtimePCR检测，BrpHTT1a，的表达相对于野生型明显降低。本发明人将BrpHTT1a沉默株系与野生型同时进行基础性和获得性抗热性分析，发现转基因植株相比野生型无论是在基础性还在在获得性抗热性中均呈现较高的叶片黄化率和植株死亡率，即表现出明显的高温敏感特征，如表1。

这一结果表明，BrpHTT1a基因对植株高温胁迫响应是必要的。

实施例6、BrpHTT1a能够激活Hsfs基因的表达

为了验证BrpHTT1a是通过什么基因途径参与植株的抗热反应，本发明人以BrpHTT1a沉默以及过表达的转基因植株为材料，利用Real time qRT-PCR技术对大白菜中几个Hsfs家族成员的表达量进行了分析。

结果表明，在Hsfs家族成员中，HsfA1a/1b/1d/1e，HsfA2，HsfA3，HsfA4c，HsfA7b以及HsfB2b的表达明显的受到BrpHTT1a的正调控。在常温条件下，大白菜的Hsf基因在BrpHTT1a过表达植株中表达量明显上调，而在基因沉默株系中的表达量下降。在45℃条件下处理4小时以后，BrpHsf基因的表达量在过表达植株中进一步提高，而在基因沉默株系中的表达量则与常温处理的差异不大，表明在高温胁迫条件下BrpHTT1a可以通过激活部分Hsfs成员的表达，后者再进一步启动下游基因的转录，从而起到级联放大的效果，促使植株在短时间内迅速对高温胁迫做出响应，提高了植株存活率。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用于提高十字花科植物耐热性；该多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，编码所述多肽的多核苷酸是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的十字花科植物选自：芸苔属植物或鼠耳芥属植物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的十字花科植物选自白菜(Brassicarapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

5.一种提高十字花科植物耐热性的方法，所述方法包括：提高十字花科植物中多肽的表达或活性；该多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括：将编码所述多肽的多核苷酸转入十字花科植物中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的多核苷酸是SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:9所示核苷酸序列的多核苷酸。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述十字花科植物选自：芸苔属植物或鼠耳芥属植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述十字花科植物选自白菜(Brassica.rapa)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)。

11.一种多肽或编码该多肽的多核苷酸的用途，用作鉴定十字花科植物的耐热性的分子标记物；该多肽是SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。