CN101240282A

CN101240282A - 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib及应用

Info

Publication number: CN101240282A
Application number: CNA2007100085832A
Authority: CN
Inventors: 王宗华; 林艳; 鲁国东; 李宏宇; 潘初沂
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2007-02-09
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-08-13

Abstract

一种稻瘟病菌无毒基因Avr－Pib。通过T－DNA插入突变的方法，分离与鉴定，得到稻瘟病菌无毒基因Avr－Pib。该基因的敲除突变体能引起含有Pib抗病基因的水稻品种感病；敲除突变体以及田间感病菌株通过功能互补实验后，即恢复了无毒性，品种表现为抗病。该基因可以作为新型农药的分子靶点和水稻抗病基因工程。

Description

稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib及应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及稻瘟病菌致病突变体的筛选，无毒基因的敲除、功能互补及应用。

背景技术

由稻瘟病菌Magnaporthe grisea(Herbert)Barr(无性世代Pyricularia grisea)侵染水稻引起的稻瘟病是水稻上最重要的病害之一，有性世代是单倍体异宗配合的子囊菌。该菌能够侵染50多种禾本科植物，包括许多杂草以及重要的谷类作物如小麦、大麦、玉米等，也造成一定的经济损失。目前，种植抗病水稻品种是最为经济有效的措施，但稻瘟病菌致病性变异快，一个高抗品种在生产上使用3-5年就丧失抗性，成为感病品种。因此，如何培育持久抗病的品种以及寻找更为有效的抗病品种利用策略，成为目前水稻生产上的迫切要求。

稻瘟病菌的无毒基因与水稻的抗性基因之间的关系符合Flor提出的基因对基因关系，其机制被推测为病菌无毒基因产生的激发子与寄主抗病基因产生的受体相互识别的结果。研究稻瘟病菌无毒基因的意义在于，通过克隆无毒基因并研究其编码产物，有助于揭示病菌小种和寄主专化性互作的生化机制及其关键的生化途径；为克隆其相应的植物抗病基因提供新的途径；作为探针，是揭示病菌群体毒性组成和变异特点的最有效的方法。到目前为止，已鉴定了至少30个稻瘟病菌无毒基因，其中有5个无毒基因(PWL1，PWL2，AVR1-CO39，AVR-Pita，ACE1)已被克隆。根据这5个无毒基因的功能可以分为两类：第一类是以PWL基因家族为代表的无毒基因，为编码种间特异性的激发子。PWL2首先通过染色体步移的方法得到，该基因转化对画眉草致病野生菌株，转化子丧失对画眉草的致病性但对其他寄主的致病性不改变。PWL1与PWL2来源不同但功能同源，都能阻止病菌对画眉草的致病性；PWL3与PWL4自然条件下没有功能，但将PWL4放在PWL1或PWL2的启动子后，就会有功能，表明PWL是一个快速进化的基因家族。可能PWL基因家族除了决定寄主范围的作用外，还可能有利于保持不同来源菌株在不同寄主群体的适合度的作用。第二类为编码品种特异性的激发子，包括AVR1-CO39，AVR-Pita，ACE1。AVR-Pita编码一个金属蛋白酶，改变该金属蛋白酶中的一个氨基酸，它就不能与Pita互作。AVR-Pita与Pita的互作，第一次从分子水平上证实了稻瘟病菌无毒基因与水稻抗病基因之间符合基因对基因关系的假说。除严格的基因对基因的关系外，稻瘟病菌与水稻之间的互作还可能存在更复杂的关系。无毒基因结构与功能的变异是导致植物抗病性变异的重要原因之一。许多无毒基因还具致病性和毒性的作用。因此，对稻瘟病菌无毒基因的结构功能的研究，是认识稻瘟病菌致病性机制及其变异机理，实现水稻抗瘟性持久化的关键。

稻瘟病菌全基因组序列的测定已经完成，为以功能基因组学方法从全基因组水平研究其关键基因的功能奠定了基础。目前，研究某一个基因功能的最直接简便的方法是构建该基因突变体，对致病性发生变异的分子标签插入的突变体，可以通过TAIL-PCR、质粒拯救和RT-PCR法扩增分子标签的侧翼序列，测序后在全基因组数据库中进行BLAST，对被标签的相关致病基因进行快速分析与鉴定，为最终克隆致病相关基因奠定基础。以此建立的稻瘟病突变库，将为在全基因组水平研究稻瘟菌的致病性及其变异机制提供了快速而准确的方法。

发明内容

本发明的目的是提供稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，以及所述基因的应用。

本发明涉及鉴定与分析稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，该基因的存在使稻瘟病菌对含有Pib抗病基因的水稻品种表现为抗病反应。在对稻瘟病菌进行鉴定与分析的过程中，首先随机挑选已建成的T-DNA突变体库中的突变体，筛选到一个致病性增强的突变体。在T-DNA突变体中，大部分情况下由于T-DNA的插入而使某一基因失活，使突变体表现为某一性状缺陷。根据所观察到的突变体表型，可以确认该突变体中被T-DNA标签的基因的功能与编码品种特异性的无毒基因有关。

稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，其特征在于具有SEQ ID1所示的核苷酸序列和SEQ ID2所示的氨基酸序列。通过TAIL-PCR方法获得突变体的T-DNA侧翼序列(T-DNA flaking sequence)，克隆测序，去除载体序列后的核苷酸序列在稻瘟病菌基因组数据库(www.broad.mit.edu/annotation/fungi/magnaporthe_grisea)中BLAST比对。比对结果表明，T-DNA侧翼序列在稻瘟病菌数据库中的同源序列为MGG05450的启动子区，可以确认MGG05450为本发明的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib。

本发明的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib的验证方法，其特征在于包括以下步骤：(1)用同源重组的方法，将野生稻瘟病菌株中的基因片段SEQID1敲除，则对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为感病；(2)采用人工构建的互补载体转化被敲除而缺失所述SEQ ID1基因片段的稻瘟菌株，则所得的互补菌株恢复无毒性，对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为抗病性；(3)将人工构建的互补载体转化对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为感病的田间野生菌株，则所得的功能互补菌株恢复无毒性，对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为抗病性。具体操作方法：首先用同源重组的方法，通过PEG介导的原生质体转化将MGG05450替换成潮霉素转移酶基因。这种基因缺陷型突变体也表现为对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现感病。通过构建基因自带启动子与该基因连接的互补载体，进行功能性互补实验，能够恢复基因敲除突变体与田间野生感病菌株的抗病性。通过以上验证方法，确认被替换的基因MGG05450为稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib。

本发明的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，其实用价值在于：第一，根据该基因的结构和功能，设计新型农药的分子靶点；第二，将无毒基因Avr-Pib与相应的抗病基因Pib共价转入水稻细胞中培育抗病材料，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因能够诱导表达无毒蛋白并作为激发子，激发抗病基因的表达产生受体蛋白，两者相互识别，使寄主产生过敏性反应，阻止病菌的侵染。

本发明可以进一步提供利用该基因获得的无毒性的转化菌株。FJ95054B是一个对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种具有强致病性的田间野生菌株。通过无毒基因Avr-Pib功能性互补实验，不仅使基因敲除突变体对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种恢复了无毒性，而且以FJ95054B为受体，获得了一个对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种不致病而对其他水稻品种的致病性不发生变化的转化菌株Co4/95054B。这一发现进一步确认了Avr-Pib的功能，将有助于揭示稻瘟病菌小种与水稻品种间特异互作及其进化的分子机理。

具体实施方式

实施例1：稻瘟病菌T-DNA突变体库的建立以及致病性增强突变体的获得

本发明是在已有的稻瘟病菌T-DNA突变体库中进行筛选，得到一个致病性显著增强的突变体株T940009401。首先建立稻瘟病菌T-DNA突变体库：将农杆菌菌株AGL-1(含pBHt1)，在基本培养基(含有Kan50μg/mL)上28℃培养48h，吸取培养物离心，并用诱导培养基洗两次，重悬于含有Kan和乙酰丁香酮的诱导培养基中，28℃振荡培养6h；然后吸取100μL上述培养物与100μL稻瘟病菌的分生孢子悬浮液(10⁶个/mL)混合，涂布放在共培养基上的纤维素膜上，在28℃培养36h。用2mL基本培养基洗膜，收集真菌和细菌培养物，然后涂布于含潮霉素和头孢噻肟钠的选择培养基平板上，挑取单个转化子再转至含潮霉素的米糠培养基上(米糠20g，琼脂18g，加水至1L，pH6.5)产孢，单孢分离至酵母培养基上(淀粉10g，酵母粉2g，琼脂15g加水至1L)并保存滤纸片。

随机挑取突变体与野生菌株进行接种实验，在1×10⁵/cm²的接种浓度下，得到一个较野生菌株致病性增强的菌株T940009401。

实施例2：突变体T-DNA侧翼序列获得及被标签基因定位

通过TAIL-PCR的方法获得T940001602-2的T-DNA侧翼序列，所用引物为：LB1：5’-GGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATG-3’；LB2：5’-CATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCT-3’；LB3：5’-GAATTAATTCGGCGTTAATTCAGT-3’；AD9：5’-TCGTTCCGCA-3’。将TAIL-PCR第二、三步产物经1.0％琼脂糖电泳后，回收第三步产物中的特异性片段。将回收得到的片段连接到pGEM-T Easy Vector上，进行克隆。将克隆得到的阳性转化子进行测序，将所测得到的序列去除载体序列与T-DNA序列后，在稻瘟病菌数据库进行比对。比对结果表明，该序列位于MGG05450的启动子区。据推测，MGG05450可能具有ATP-NADK活性。

实施例3：被标签基因敲除

在野生菌株Guy11中用同源重组的方法对MGG05450进行敲除。首先构建含有所要敲除基因的上下游同源片段以及真菌筛选标记的重组质粒。分别设计扩增上游与下游同源片段的引物。用限制性内切酶SalI将含有启动子和终止子的潮霉素转移酶基因从pCSN43质粒上切下，回收纯化后，将该片段与另外两个同源片段用T4连接酶进行体外连接。连接产物用上游片段的5’端引物以及下游片段的3’端引物进行扩增。扩增产物连接到T-载体上，进行克隆。提取克隆得到的阳性转化子的质粒DNA，进行下一步的稻瘟病菌原生质体转化。提取野生型菌株的原生质体，以PEG介导的方法，将重组质粒DNA导入原生质体中，于含有潮霉素的培养基上进行筛选生长。生长得到的转化子进行PCR和Southern杂交验证。所得到的阳性转化子，除对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现毒性外，其他性状不发生变化。

实施例4：互补载体构建与敲除突变体功能互补

由于T-DNA突变体的T-DNA插入于MGG05450的启动子区，本发明所构建的互补载体包含该基因基因前2kb的DNA序列。首先，互补载体pBARKS1线性化，用限制性内切酶EcoR I对pBARKS1质粒DNA进行完全酶切进行去磷酸化处理，回收酶切片段后。对野生型基因组DNA进行PCR扩增得到含有启动子区的目的基因片段，也进行EcoR I处理后，与回收的载体片段用T4连接酶进行体外连接。连接产物转化到大肠杆菌中，挑取阳性重组子，提取质粒进行下一步的原生质体转化。分别提取T-DNA突变体与基因敲除突变体的原生质体，同样以PEG介导的方法，将重组质粒DNA导入原生质体中，在含有除草剂的培养基上进行筛选生长。结果表明，敲除突变体的互补转化子能够恢复对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种的无毒性。

实施例5：利用互补载体转化田间毒性菌株为无毒菌株

从实施例4的结果可以看出，具有MGG05450基因自带启动子区与基因编码区的互补载体可以使基因敲除突变体恢复对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种的抗病性。同时在水稻致病性调查的过程中，得到一个对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种有强致病性的田间野生菌株FJ95054B。提取FJ95054B的原生质体，利用实施例4中的功能互补载体，以PEG介导的方法，将重组质粒DNA导入原生质体中，在含有除草剂的培养基上进行筛选生长。将筛选到的具有抗性的稻瘟病菌转化子，以1.5×10⁵个/mL的孢子浓度，同时接种含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种与感病品种CO39。致病性调查后，得到一个转化子为Co4/95054B，能够恢复对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种的无毒性，而对感病品种的致病性不发生改变。

以上实施实例中的限制性内切酶酶切体系与连接体系皆按照各酶产品说明书中的要求进行操作。

Untitled1.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>福建农林大学

<120>稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib及应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1500

<212>DNA

<213>稻瘟病菌Magnaporthe grisea

<400>1

atggcgttac ccctgaggat cccaggggct ttacgattta cagtctcgac taaactccgc 60

acagccgtcc catcatcgtc atggacgaat cttcgacacg gctgggccag ccgcaacttt 120

tcagcgaccg cccgccggcg tgaaattctc gacgtctcta tgctgccgga tcgcatcgtc 180

cctagatacc aggaaagcca agcgtcatcg ctccttctac tccactggcc tcaacctccg 240

cggaatattc tcctgattcc caagttgcat gcgcctcagg tcaccctctc tgccgtcgcc 300

ttcgccaagc acctgcacag caactacccg gacctaaatc tcgttttcga gagccgcatc 360

gccaacgcca ttcacgaaag cctaccgttc cccatctaca cggccagcga tgccagcagc 420

acccatagct tccccaacaa gattgacctc gtcaccaccc tcggaggcga tggcaccatt 480

ttgcgcgccg ctagcctctt ctccctgcag gccagcgtcc caccgatact atcctttagc 540

atgggctccg ttggcttcct gggcgagtgg aagtttgacg agtacaagcg cgcctggagg 600

gaggtctaca tgagcggcag cggcgtcgcc gtagaggatt tgtatgcacc ccacacccag 660

acggccgcct cgggtcacgg acctgacgcg gctgtgtcac gcatcggcga ggatgcctca 720

ccagtgagac caccctgggg ctgggagcgc agcccgggca agtccatggg acctagccgg 780

acatccaaga tgctgctccg tcaccgcctc aaggtcggtg tctatgacga gcacggcgtc 840

aacatcaaca gccagctcat ccccacctcg acggctcagc ccgggtacag ccaggcgccg 900

ccatccctgt cctcgcaagg agtctcttcc ccgcagccac cactcaacgc tggcgccccg 960

cctgccatac atgccatcaa cgagctgctt atccatcgcg gaccacaccc gcaccttgcc 1020

attatcgaca tctatctcaa caaccatttc ctgaccgagg ctgtcgccga cggcatcctg 1080

atcagcaccc cgacgggctc gacagcctac agtctcagcg caggcggctc catcatccac 1140

ccgctcgtag gctcgcttct aatcacgccc atttgcccgc gaagcctcag cttccggccg 1200

ctcgttctgc ccctcaacac aaaggtctcg ttgcgcttga gcgacaagaa ccgcggccgt 1260

gagctcgagg ttagcatcga cggcaagcgc cgggcaggcg tcggtatcgg catggaagtc 1320

cacgtcgagg gcgaagctgt cggccgctcc gccgacggca cctggaaggg cggcgtgccc 1380

tgcgtcatcc gcgcccctgg caaggaggtt gagggcgtcg ccgacgacga cgacggctgg 1440

gtgggtggcc taaatggtct gctcaagttc aattacccgt tcggagaagc ggggcattga 1500

<210>2

<211>499

<212>PRT

<213>稻瘟病菌Magnaporthe grisea

<400>2

Untitled1.ST25

Met Ala Leu Pro Leu Arg Ile Pro Gly Ala Leu Arg Phe Thr Val Ser

1 5 10 15

Thr Lys Leu Arg Thr Ala Val Pro Ser Ser Ser Trp Thr Asn Leu Arg

20 25 30

His Gly Trp Ala Ser Arg Asn Phe Ser Ala Thr Ala Arg Arg Arg Glu

35 40 45

Ile Leu Asp Val Ser Met Leu Pro Asp Arg Ile Val Pro Arg Tyr Gln

50 55 60

Glu Ser Gln Ala Ser Ser Leu Leu Leu Leu His Trp Pro Gln Pro Pro

65 70 75 80

Arg Asn Ile Leu Leu Ile Pro Lys Leu His Ala Pro Gln Val Thr Leu

85 90 95

Ser Ala Val Ala Phe Ala Lys His Leu His Ser Asn Tyr Pro Asp Leu

100 105 110

Asn Leu Val Phe Glu Ser Arg Ile Ala Asn Ala Ile His Glu Ser Leu

115 120 125

Pro Phe Pro Ile Tyr Thr Ala Ser Asp Ala Ser Ser Thr His Ser Phe

130 135 140

Pro Asn Lys Ile Asp Leu Val Thr Thr Leu Gly Gly Asp Gly Thr Ile

145 150 155 160

Leu Arg Ala Ala Ser Leu Phe Ser Leu Gln Ala Ser Val Pro Pro Ile

165 170 175

Leu Ser Phe Ser Met Gly Ser Val Gly Phe Leu Gly Glu Trp Lys Phe

180 185 190

Asp Glu Tyr Lys Arg Ala Trp Arg Glu Val Tyr Met Ser Gly Ser Gly

195 200 205

Val Ala Val Glu Asp Leu Tyr Ala Pro His Thr Gln Thr Ala Ala Ser

210 215 220

Gly His Gly Pro Asp Ala Ala Val Ser Arg Ile Gly Glu Asp Ala Ser

225 230 235 240

Pro Val Arg Pro Pro Trp Gly Trp Glu Arg Ser Pro Gly Lys Ser Met

245 250 255

Gly pro Ser Arg Thr Ser Lys Met Leu Leu Arg His Arg Leu Lys Val

260 265 270

Gly Val Tyr Asp Glu His Gly Val Asn Ile Asn Ser Gln Leu Ile Pro

275 280 285

Thr Ser Thr Ala Gln Pro Gly Tyr Ser Gln Ala Pro Pro Ser Leu Ser

290 295 300

Untitled1.ST25

Ser Gln Gly Val Ser Ser Pro Gln Pro Pro Leu Asn Ala Gly Ala Pro

305 310 315 320

Pro Ala Ile His Ala Ile Asn Glu Leu Leu Ile His Arg Gly Pro His

325 330 335

Pro His Leu Ala Ile Ile Asp Ile Tyr Leu Asn Asn His Phe Leu Thr

340 345 350

Glu Ala Val Ala Asp Gly Ile Leu Ile Ser Thr Pro Thr Gly Ser Thr

355 360 365

Ala Tyr Ser Leu Ser Ala Gly Gly Ser Ile Ile His Pro Leu Val Gly

370 375 380

Ser Leu Leu Ile Thr Pro Ile Cys Pro Arg Ser Leu Ser Phe Arg Pro

385 390 395 400

Leu Val Leu Pro Leu Asn Thr Lys Val Ser Leu Arg Leu Ser Asp Lys

405 410 415

Asn Arg Gly Arg Glu Leu Glu Val Ser Ile Asp Gly Lys Arg Arg Ala

420 425 430

Gly Val Gly Ile Gly Met Glu Val His Val Glu Gly Glu Ala Val Gly

435 440 445

Arg Ser Ala Asp Gly Thr Trp Lys Gly Gly Val Pro Cys Val Ile Arg

450 455 460

Ala Pro Gly Lys Glu Val Glu Gly Val Ala Asp Asp Asp Asp Gly Trp

465 470 475 480

Val Gly Gly Leu Asn Gly Leu Leu Lys Phe Asn Tyr Pro Phe Gly Glu

485 490 495

Ala Gly His

Claims

1. 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，其特征在于具有SEQ ID1所示的核苷酸序列。

2. 根据权利要求1所述的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib，其特征在于具有SEQ ID2所示的氨基酸序列。

3. 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib的验证方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取野生稻瘟病菌菌株，将权利要求1所述的基因片段SEQ ID1敲除，则对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为感病；

(2)采用人工构建的互补载体转化被敲除而缺失所述SEQ ID1基因片段的稻瘟菌株，则所得的互补菌株恢复无毒性，对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为抗病性；

(3)将人工构建的互补载体转化对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为感病的田间野生菌株，则所得的功能互补菌株恢复无毒性，对含有水稻抗瘟基因Pib的水稻品种表现为抗病性。

4. 利用如权利要求1或2所述的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib作为靶点基因制备新型农药。

5. 将权利要求1或2所述的稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib与相应的抗病基因Pib共价转入水稻细胞中培育抗病材料。