CN108707687A - 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 - Google Patents
一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108707687A CN108707687A CN201810535741.8A CN201810535741A CN108707687A CN 108707687 A CN108707687 A CN 108707687A CN 201810535741 A CN201810535741 A CN 201810535741A CN 108707687 A CN108707687 A CN 108707687A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pyricularia oryzae
- millet
- blast bacterium
- millet blast
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 title claims abstract description 65
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 title claims abstract description 65
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 59
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 18
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 abstract description 15
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 13
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 12
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 12
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 244000304962 green bristle grass Species 0.000 description 6
- 241000231139 Pyricularia Species 0.000 description 5
- 235000010086 Setaria viridis var. viridis Nutrition 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 244000025670 Eleusine indica Species 0.000 description 4
- 235000014716 Eleusine indica Nutrition 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015220 Febrile disease Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000005498 Setaria italica Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 1
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 241000234646 Cyperaceae Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 244000152970 Digitaria sanguinalis Species 0.000 description 1
- 235000010823 Digitaria sanguinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001344133 Magnaporthe Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- 235000007226 Setaria italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000002248 Setaria viridis Nutrition 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 1
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 1
- 230000000680 avirulence Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000002252 panizo Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000010902 straw Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,属于植物真菌分子生物学检测技术领域,包括以下步骤:A、DNA提取:分别提取谷瘟病菌和稻瘟病菌的DNA;B、引物设计:利用谷瘟病菌无毒基因PWL3编码区插入849bp的反转录转座子的两端设计一对特异性引物Mol3‑F/Mol3‑F;C、PCR:以提取的谷瘟病菌与稻瘟病菌的总DNA为模板进行PCR扩增,得到扩增产物;D、结果判定:将扩增产物进行电泳检测,若检测到1771bp的目标条带,则判定为谷瘟病菌;若检测到922bp的条带,则判定为稻瘟病菌。通过本发明方法可以将难以区分的谷瘟病菌和稻瘟病菌进行快速、准确的区分,对研究梨孢菌在自然条件下田间传播、繁殖与进化具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于植物真菌分子生物学检测技术领域,具体涉及一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法。通过本发明方法可以将难以区分的谷瘟病菌和稻瘟病菌进行快速、准确的区分,对研究梨孢菌在自然条件下田间传播、繁殖与进化具有重要意义。
背景技术
谷子(Setaria italica)起源于我国,是哺育中华民族的主要粮食作物之一,其种植面积和产量均居世界之首。小米营养丰富,随着世界杂粮热的兴起,出口量在稳步增加,已经成为我国的特色创汇杂粮。谷草是牲畜的优质饲草,在耕地紧缺的情况下是发展畜牧养殖业的首选粮草兼用性作物。但是谷子病害的发生,严重影响着谷子的产量和质量。
谷瘟病菌有性态为Magnaporthe oryzae,属于子囊菌门大角间座壳属;无性态为Pyricularia grise,属有丝分裂孢子真菌中的梨孢属,由梨孢菌Pyricularia引发的谷瘟病对谷子产量造成了严重威胁,在我国谷子产区大面积发生,造成大面积的减产,甚至颗粒无收。梨孢菌除了侵染谷子外,还能侵染牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setariaviridis)、马唐(Digitaria sanguinalis)和水稻(Oryza sativa)等多种禾本科和莎草科杂草。目前关于将寄主为马唐的梨孢菌有性态命名为Magnaporthe grise,而其他寄主的梨孢菌命名为Magnaporthe oryzae。稻瘟病菌有性态也为Magnaporthe oryzae,无性态为Pyricularia grise,在形态学如分生孢子大小及菌落等很难将两者区分,但两者之间存在明显的寄主专化性。
在自然条件下谷子田间常见的狗尾草和牛筋草等植物均为梨孢菌自然寄主,经IGS序列分析表明,寄主为狗尾草的梨孢菌与谷瘟病菌是极为相似的,与稻瘟病菌存在差异。杜新法等证实牛筋草和狗尾草的梨孢菌与来自水稻的梨孢菌可发生交叉侵染。直接从杂草寄主上分离的梨孢菌株对水稻的致病性较弱,接种到水稻感病品种发病后再分离的菌株,对水稻致病性增强,对原寄主的致病性基本保持不变。并推断稻瘟病区稻田周围牛筋草、狗尾草等杂草寄主上的梨孢菌在稻瘟病菌的积累和传播方面具有作用。所以从分子水平上快速区分谷瘟病菌与稻瘟病菌在研究梨孢菌在自然条件下田间传播、繁殖与进化具有重要意义。
发明内容
本发明提供了一种利用PCR技术快速区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的方法,该方法具有特异性强、灵敏度高的特点,为研究梨孢菌在田间的传播、繁殖及变异提供支持。
本发明为实现其目的采用的技术方案是:
一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,包括以下步骤:
A、DNA提取:分别提取谷瘟病菌和稻瘟病菌的DNA;
B、引物设计:利用谷瘟病菌无毒基因PWL3设计特异性引物,即在谷瘟病菌无毒基因PWL3基因编码区插入849bp的反转录转座子的两端设计得到一对特异性引物Mol3-F/Mol3-F,序列如下:
Mol3-F:5’-TACAACACCCACGGATATCAC-3’,
Mol3-R:5’-TCGTAGCCTTAGCCACACAC-3’;
C、PCR:以提取的谷瘟病菌与稻瘟病菌的总DNA为模板进行PCR扩增,得到扩增产物;
D、结果判定:将扩增产物进行电泳检测,若检测到1771bp的目标条带,则判定为谷瘟病菌;若检测到922bp的条带,则判定为稻瘟病菌。
步骤C中,控制PCR反应的体系为:25.0μL,其中2×Taq MasterMix12.5μL,上下游引物10μM各1.0μL,DNA模板1.0μL,dH2O 9.5μL。
步骤C中,控制PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min。
步骤D中,将扩增产物进行电泳检测时,取8μL PCR扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测,经EB染色后用BioRad凝胶成像系统成像,观察扩增出的特异性条带,进行结果判定。
本发明的有益效果是:
谷瘟病菌和稻瘟病菌在培养基菌落形态和分生孢子形态均无明显差异,很难实现对两者的区分,而本方法具有快速简便对两者进行区分。本发明应用分子生物学手段,建立了快速、简便的鉴定区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的方法,对研究梨孢菌在田间不同寄主之间的传播侵染具有重要作用。
本领域技术人员普遍认为不可能利用谷瘟病菌无毒基因PWL3设计引物,然后利用PCR实现对谷瘟病菌和稻瘟病菌的区分,因为一般研究人员认为谷瘟病菌和稻瘟病菌无毒基因PWL3基因仅仅会是单碱基变异(SNP),而SNP必须通过测序分析方法才可以进行区分,普通PCR检测很难区分。本发明克服技术偏见,利用谷瘟病菌无毒基因PWL3设计一对特异性引物Mol3-F/Mol3-F。作为PCR扩增的特异性引物,分别以提取的谷瘟病菌与稻瘟病菌的总DNA为模板进行PCR扩增,实现了快速、准确区分谷瘟病菌和稻瘟病菌。
本研究的谷瘟病菌无毒基因PWL3为首次从谷瘟中克隆,还没有任何人对谷瘟这个基因进行克隆研究。原来有人通过研究微管蛋白基因和钙调素基因进行梨孢属下面种的区分,但是基因序列变异只能通过测序分析来研究,无法通过PCR扩增电泳检测分析,因为扩增条带大小一致,而测序分析会使试验成本增加及检测周期加长。本领域中无毒基因如PWL3通常只是用来研究病原菌致病和毒力变异,未发现可用于种之间区分,这是本发明的创新之处。本领域技术人员并不知道谷瘟和稻瘟无毒基因会有显著的差异,对谷瘟病菌无毒基因PWL3测序结果经NCBI在线比对,发现与稻瘟病菌相比谷瘟病菌无毒基因PWL3基因编码区插入849bp的核苷酸片段,与non-LTR retrotransposon:MGL的相似度达到96.7%。所有谷瘟病菌无毒基因PWL3中均有non-LTR retrotransposon:MGL转座子的部分序列,这是本发明可以区分谷瘟和稻瘟病菌的理论基础。
附图说明
图1是谷瘟病菌引物Mol3-F/Mol3-F电泳检测图。
其中,M表示DL2000DNA marker,CK表示空白对照,1-11表示稻瘟不同分离物基因组DNA,12-22表示谷瘟病菌不同分离物基因组DNA。
具体实施方式
很多学者包括谷子领域权威专家都认为谷瘟是由稻瘟病菌侵染,从菌落形态及分生孢子形态无法将两者区分,因此许多人认为两者无区别,认为谷瘟病就是稻瘟菌侵染后发病,但是许多地区没有水稻,谷瘟病依旧发生严重,对谷瘟病初侵染来源存在很大争议,本研究从分子生物学领域明确了谷瘟病并不是由稻瘟病菌侵染而发病,其侵染来源为谷瘟病菌。为今后研究谷瘟和稻瘟病菌田间潜在寄主和初侵染来源,及研究病害循环及流行有非常重要作用。所以快速区分不同寄主之间的梨孢菌对于研究该菌在不同作物间传播及分布,及其阐明瘟病初侵染源及其寄主分布具有一定的意义。下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明谷瘟病菌PWL3基因的获取方式如下:
利用特异性引物PWL3-3和PWL3-4对谷瘟病菌基因组DNA进行PCR扩增,回收目的条带并切胶纯化目的片段,通过克隆测序方法获得谷瘟病菌PWL3基因,其中PWL3-3和PWL3-4序列如下,
PWL3-3:5’-CCTGCGAGTAAA AG CCTGAATCTGA-3’
PWL3-4:5’-CCTTCTGCCTCTGTAGAGACTAGCC-3’。
实施例1
(1)谷瘟病菌与稻瘟病菌基因组DNA的提取
a)将菌体加入到1.5mL离心管中,加入500μL提取缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 8.0,150mM NaCl,100mM EDTA),充分混匀,得到混合液;
b)向混合液中加入5μL蛋白酶K(1mg/mL),再加入提取缓冲液至1mL,65℃水浴30min,得到混合液II;
c)将混合液II分装到两个1.5mL离心管中,加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1,vol/vol/vol,pH=8.0),离心;
d)取上清,移到一个干净的1.5mL离心管中,加入等体积的氯仿,离心;
e)取上清,移到一个干净的1.5mL离心管中,加入等体积的冰冻异丙醇,-20℃冷冻1小时;
f)12,000rpm,4℃离心20min,使DNA沉淀;
g)弃上清,用70%的冰冻乙醇漂洗两次,自然风干后加入0.1mL TE缓冲液(10mMTris–HCl,1mM EDTA,,pH 8.0)使其溶解;
h)加入1μL 10mg/mL RNA酶(终浓度为20μg/mL),37℃酶解2小时,彻底酶解RNA;
i)将DNA再次沉淀,用70%冰冻乙醇漂洗,自然风干,溶解在50μL TE中。
(2)特异性引物的PCR扩增
利用谷瘟病菌和稻瘟病菌无毒基因PWL3的差异,在谷瘟病菌无毒基因PWL3基因编码区插入849bp的反转录转座子的两端设计了一对特异性引物Mol3-F/Mol3-F;
利用引物Mol3-F:5’-TACAACACCCACGGATATCAC-3’和Mol3-R:5’-TCGTAGCCTTAGCCACACAC-3’进行PCR扩增。
PCR反应的体系为:25.0μL,其中2×Taq MasterMix 12.5μL,上下游引物10μM各1.0μL,DNA模板1.0μL,dH2O(灭菌蒸馏水)9.5μL;
PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共进行35个循环;72℃延伸10min。
(3)琼脂糖凝胶电泳及成像观察
分别取8μL谷瘟病菌与稻瘟病菌基因组DNA扩增后的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶上进行电泳,经EB染色后用BioRad凝胶成像系统成像。结果显示,谷瘟病菌扩增目的条带为1771bp,稻瘟病菌扩增目的条带为922bp(图1)。谷瘟病菌PWL3无毒基因1771bp的特异性条带与稻瘟病菌毒PWL3基因922bp的特异性条带的核苷酸序列如序列表所示。表明本发明中的特异性引物可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省农林科学院谷子研究所
<120> 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 922
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tacaacaccc acggaatcac gtcggcgatg gaccagccga atatggaaat tatggaggtg 60
ggcattgggg cgatggatac tatggtcctc caggggagtt tgtacagacc agcgaatacg 120
aatagtgaat aggatggata ctatggtcat caagggcagt ctacaaacaa cagatgacac 180
ggacatggtg gaagcaattg cacctttatg tgaatggtat tgctccgtca agttgagaca 240
gctgtcaaag gcgcgagggt gccgttggaa ataaaagaga gaggggtgca gacaggggtt 300
agaggtgcga aggcgttggc agaggttgca gggagagaaa tgaaggaagc tatgtcgata 360
tattatagga ctttgatttt gataaatttc ttttggacca gcatagaaac ctcttgttgc 420
ctcgcgcatc ccgtcgattg ccgctggaac cgcaaagcag ccctagtacc gtcaaccaca 480
atgcttgtcg cttccttgcc gagcttgtca tattctgaat attacagccc tgcgctccag 540
gccaaaattc cataatcatt tgataaacat ttcatttgga ccagctgcca tttcttaatt 600
gtgcacgcag gtgcccggct aataaagccc gacctctttg agagagaaga cacgaatgaa 660
attcgtatat ggttcgccgc cgtctttggg cctgtttcac ttgtttggaa ctcgtgtctg 720
ctaatttgtt gatagattta aagtcgtata tgatccgcgt tccaacgacc aggcacgtat 780
ggagataaac tatacttaac atgagaatat agtaataaaa cctgtaacct tagttttgga 840
ccctccagtt gcgtgaacat ctatatatat cacagcagat cttgaatcga aactacaaga 900
cagtgtgtgg ctaaggctac ga 922
<210> 2
<211> 1771
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
tacaacaccc acggatatca cgtcggcgat ggaccagccg aatatggaaa ttatggaggt 60
gggcattggg gcgatggata ctatggtcct ccaggggagt ttgtacagac cagcgaatac 120
gaatagtgaa taggatggat actatggtca tcaagggcag tctacaaaca acagatgaca 180
cggacatggt ggaagcaatt gcacctttat gtgaatggta ttgctccgtc aagttgagac 240
agctgtcaaa ggcgcgaggg tgccgttgga aataaaagag agaggggtgc agacaggggt 300
tagaggtgcg aaggcgttgg cagaggttgc agggagagaa atgaaggaag ctatgtcgat 360
atattatagg actttgattt tgataaattt cttttggacc agcatagaaa cctcttgttg 420
cctcgcgcat cccgtcgatt gccgctggaa ctgcaaagca gccctagtac cgtcaaccac 480
aatgcttgtc gcttccttgc cgagcttgtc atattctgaa tattacagcc ctgcgctcca 540
ggccaagtag tagtagtagt agtagtagta gtattagtta acgccgggct cggcccggct 600
tgttagccgg ccgttagcaa cctcccgagg ggtatctcgg cgcgcgttct atcttcttta 660
tttacacagg gggaaaacaa ggagggcaga ggcggatcgt gcctgaccgg gttcgggccc 720
ggtcctgctt agggggttag ttcactgacg cgaccccgtg cctaaggtgc aaaaagggtt 780
cgtctgacgg cttgtaccgt gaaatgtggg tgaaaaggca ataaatctat tcctcgtcaa 840
agttcgaatc gtttacgatc ggtgtcccta aacgtaaaat gcgttcgtgg cgcgcggggc 900
gctggcgggc cgctctgggg cgggcgctga agtaattggt ggctatcgaa aacgcctcaa 960
agcttttcgg ttgcccgaaa cttgtctgga agaatttgcg gcgttgggcg cggtctggcg 1020
gcccgaccgg ccgctcgtta tcaaaccacg gccagttttt ccacaccgcc cgcgaaaagc 1080
ggcagtgcac cgggtattta ggggaggtcc gcttccagca ccaggtacac gaggtgtttg 1140
catcctggtg gttgaaacgg tcatggtagg ctttaaaatc gccgtggccg gtcctcatgg 1200
ccaaataatg gcccagtagg ggtcttggca aacgcagttc ctcgggctcc tttctcggtg 1260
tgtattggaa tttccattcc ctatatgcgg gggaccgttc acaaagttct ttacgccacc 1320
agtccttctc tatattcgaa agaatggctc tgaggaccgt gccggcaccg ctatacaagc 1380
gcgctccagg ccaaaattcc ataatcattt gataaacatt tcatttggac cagctgccat 1440
ttcttaattg tgcacgcagg tgcccggcta ataaagcccg acctctttga gagagaagac 1500
acgaatgaaa ttcgtatatg gttcgccgcc gtctttgggc ctgtttcact tgtttggaac 1560
tcgtgtttgc taatttgttg atagatttaa agtcgtatat gatccgcgtt ccaacgacca 1620
ggcacgtatg gagataaact atacttaaca tgagaatata gtaataaaac ctgtaacctt 1680
agttttggac cctccagttg cgtgaacatc tatatatatc acagcagatc ttgaatcgaa 1740
actacaagac agtgtgtggc taaggctacg a 1771
Claims (4)
1.一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,其特征在于,包括以下步骤:
A、DNA提取:分别提取谷瘟病菌和稻瘟病菌的DNA;
B、引物设计:在谷瘟病菌无毒基因PWL3基因编码区插入849bp的反转录转座子的两端设计一对特异性引物Mol3-F/Mol3-F,序列如下:
Mol3-F:5’-TACAACACCCACGGATATCAC-3’,
Mol3-R:5’-TCGTAGCCTTAGCCACACAC-3’;
C、PCR:以提取的谷瘟病菌与稻瘟病菌的总DNA为模板进行PCR扩增,得到扩增产物;
D、结果判定:将扩增产物进行电泳检测,若检测到1771bp的目标条带,则判定为谷瘟病菌;若检测到922bp的条带,则判定为稻瘟病菌。
2.根据权利要求1所述的一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,其特征在于,步骤C中,控制PCR反应的体系为:25.0μL,其中2×Taq MasterMix 12.5μL,上下游引物10μM各1.0μL,DNA模板1.0μL,dH2O 9.5μL。
3.根据权利要求1所述的一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,其特征在于,步骤C中,控制PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,35个循环,72℃延伸10min。
4.根据权利要求1所述的一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的PCR检测鉴定方法,其特征在于,步骤D中,将扩增产物进行电泳检测时,取8μL PCR扩增产物在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测,经EB染色后用BioRad凝胶成像系统成像,观察扩增出的特异性条带,进行结果判定。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810535741.8A CN108707687B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810535741.8A CN108707687B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN108707687A true CN108707687A (zh) | 2018-10-26 |
CN108707687B CN108707687B (zh) | 2021-04-27 |
Family
ID=63871108
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810535741.8A Expired - Fee Related CN108707687B (zh) | 2018-05-30 | 2018-05-30 | 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN108707687B (zh) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109371104A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-02-22 | 广东海洋大学 | 一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法 |
CN110205401A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-06 | 中国农业大学 | 一种基于pcr技术快速区分稻梨孢和灰梨孢的方法及其所用特异性引物 |
CN111206115A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-05-29 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷瘟病菌pcr检测引物组及其应用 |
CN111334601A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-06-26 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷子大斑病早期诊断的方法 |
CN113278722A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 云南省农业科学院农业环境资源研究所 | AvrPiz-t中持有Inago2的solo-LTR毒性候选菌株的筛选方法 |
CN113584208A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 天津海关动植物与食品检测中心 | 一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法 |
CN114058731A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-02-18 | 云南农业大学 | 一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1831008A (zh) * | 2006-03-16 | 2006-09-13 | 华南农业大学 | 水稻稻瘟病菌无毒基因Avr-Pii及其应用 |
CN1952177A (zh) * | 2006-09-28 | 2007-04-25 | 南京农业大学 | 稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法 |
CN101050233A (zh) * | 2007-03-16 | 2007-10-10 | 华南农业大学 | 水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用 |
CN101240282A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 福建农林大学 | 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib及应用 |
CN102534010A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-07-04 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 稻瘟病菌无毒基因分子检测引物及其应用 |
-
2018
- 2018-05-30 CN CN201810535741.8A patent/CN108707687B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1831008A (zh) * | 2006-03-16 | 2006-09-13 | 华南农业大学 | 水稻稻瘟病菌无毒基因Avr-Pii及其应用 |
CN1952177A (zh) * | 2006-09-28 | 2007-04-25 | 南京农业大学 | 稻瘟病菌无毒基因的分子标记方法 |
CN101240282A (zh) * | 2007-02-09 | 2008-08-13 | 福建农林大学 | 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pib及应用 |
CN101050233A (zh) * | 2007-03-16 | 2007-10-10 | 华南农业大学 | 水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi39及其应用 |
CN102534010A (zh) * | 2012-01-17 | 2012-07-04 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 稻瘟病菌无毒基因分子检测引物及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
SWEIGARDJ A等: "Identification,cloning,and characterizaiton of PWL2,a gene for host species specificity in the rice blast fungus", 《PLANT CELL》 * |
申浩冉等: "谷瘟病菌无毒基因PWL家族检测及变异分析", 《华北农学报》 * |
穆慧敏等: "PWL基因家族在稻瘟病菌中的分布及变异初探", 《浙江农业学报》 * |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109371104A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-02-22 | 广东海洋大学 | 一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法 |
CN110205401A (zh) * | 2019-07-03 | 2019-09-06 | 中国农业大学 | 一种基于pcr技术快速区分稻梨孢和灰梨孢的方法及其所用特异性引物 |
CN111206115A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-05-29 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷瘟病菌pcr检测引物组及其应用 |
CN111334601A (zh) * | 2020-03-12 | 2020-06-26 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷子大斑病早期诊断的方法 |
CN111334601B (zh) * | 2020-03-12 | 2022-06-03 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷子大斑病早期诊断的方法 |
CN111206115B (zh) * | 2020-03-12 | 2022-06-24 | 河北省农林科学院谷子研究所 | 一种谷瘟病菌pcr检测引物组及其应用 |
CN113278722A (zh) * | 2021-05-11 | 2021-08-20 | 云南省农业科学院农业环境资源研究所 | AvrPiz-t中持有Inago2的solo-LTR毒性候选菌株的筛选方法 |
CN113584208A (zh) * | 2021-08-06 | 2021-11-02 | 天津海关动植物与食品检测中心 | 一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法 |
CN113584208B (zh) * | 2021-08-06 | 2024-03-08 | 天津海关动植物与食品检测中心 | 一种运用PCR引物检测Diaporthe novem的方法 |
CN114058731A (zh) * | 2021-11-30 | 2022-02-18 | 云南农业大学 | 一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用 |
CN114058731B (zh) * | 2021-11-30 | 2023-05-23 | 云南农业大学 | 一种用于区分稻瘟菌来源的分子标记及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN108707687B (zh) | 2021-04-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108707687A (zh) | 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法 | |
CN111763687B (zh) | 一种基于基因编辑技术快速培育玉米单倍体诱导系的方法 | |
CN104313175A (zh) | 一种致病疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法 | |
Acosta et al. | Identification and molecular characterization of phytoplasmas and rickettsia pathogens associated with ‘Bunchy Top Symptom’(BTS) and ‘Papaya Bunchy Top’(PBT) of papaya in Cuba | |
Basım et al. | Identification and characterization of Didymella bryoniae causing gummy stem blight disease of watermelon (Citrullus lanatus) in Turkey | |
CN102094080B (zh) | 一种同时检测三类镰刀菌毒素的快速分子检测方法与应用 | |
Salehi et al. | Peach witches’-broom, an emerging disease associated with ‘Candidatus Phytoplasma phoenicium’and ‘Candidatus Phytoplasma aurantifolia’in Iran | |
CN107384946B (zh) | 水稻淀粉分支酶sbe3基因的人工定点突变体及其应用 | |
CN103820469B (zh) | 玉米纹枯病抗病相关基因grmzm2g169240及其应用 | |
Samanta et al. | Mating types analysis of Magnaporthe oryzae populations by molecular methods | |
Navalinskien et al. | Molecular detection and characterization of phytoplasma infecting Callistephus chinensis plants in Lithuania | |
Hsieh et al. | Detection of Ranavirus by PCR and in situ hybridization in the American bullfrog (Rana catesbeiana) in Taiwan | |
CN103820470A (zh) | 玉米纹枯病抗病相关基因grmzm2g174449及其应用 | |
Pradhan et al. | Characterization of Trichoderma strains for novel species-specific markers by multiplex PCR and antagonistic property against Alternaria ricini in castor (Ricinus communis L.) | |
CN104231062B (zh) | 棉花黄萎病菌致病相关蛋白及其编码基因VdPR3和应用 | |
CN102851363A (zh) | 一种快速鉴定辣椒疫霉对丁吡吗啉抗药性的方法及专用引物 | |
CN103981265B (zh) | 谷子锈菌巢式pcr高效检测方法 | |
CN105567827A (zh) | 一种同时检测异育银鲫多种寄生粘孢子虫的pcr方法 | |
CN106434689A (zh) | 一种植物抗病必需基因ShORR‑1及其应用 | |
Motghare et al. | Use of NCM based DNA extraction method for simultaneous detection of citrus mosaic badnavirus and Candidatus Liberibacter asiaticus by duplex PCR | |
CN104278042A (zh) | 一个玉米纹枯病抗病相关基因grmzm2g315431及其应用 | |
Mahmud et al. | Screening sugarcane somaclones and their parent varieties against red rot (Colletotrichum falcatum) and assessment of variability by RAPD and SSR markers | |
CN104164514A (zh) | 同时检测迟缓爱德华氏菌和鮰爱德华氏菌的荧光探针pcr方法 | |
Lan et al. | Among-Population Genetic Diversity of Rice Blast Fungus Based on Fingerprinting of Virulence-related genes | |
Mwangi et al. | REGULAR ARTICLE COMPARATIVE ANALYSIS ASSOCIATED TO VIRULENCE OF PSEUDOMONAS SYRINGAE PV. GARCAE, THE CAUSATIVE AGENT OF BACTERIAL BLIGHT OF COFFEE IN KENYA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20210427 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |