CN109371104A - 一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，包括以下步骤：首先准备多个存放的试管和基因提取缓冲液，然后将基因提取缓冲液存储于TE缓冲液中，然后对水稻稻瘟病菌株剪取，并且将基因提取缓冲液与稻瘟病植株进行混合，之后对溶液进行离心混合，混合后对溶液进行水浴处理，水浴加热后进行冷却过滤，然后加入氯仿、异戊醇，并且使其离心混合，之后抽取溶液注入PCR孔板中在‑20℃的环境中冷藏，最后对冷藏后的混合液进行数据采集对比。该便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，可以确保稻瘟病基因提取工作的顺利进行，从而为研究人员带来便利，还可以有效的提高稻瘟病基因的提取检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及水稻稻瘟病检测技术领域，具体为一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法。
背景技术
水稻是农作物中的一种，水稻经剥壳后即产生米，米是南方人民的主要食物，含有丰富的B族维生素等，大米中的碳水化合物主要是淀粉，所含蛋白质主要是米谷蛋白，其中蛋白质的生物价和氨基酸的构成比例相对于其他谷物来说较高。
大米成为人们的主食，其质量越来越受到消费者的关注，因此对于水稻产量的研究日趋火热，但是水稻在种植过程中会发生各种稻瘟病，稻瘟病又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等是全国各稻区常见的重要病害。由水稻梨孢菌引起，在自然条件下稻瘟菌只侵染水稻，稻瘟病分布遍及世界稻区，是稻作生产中的主要病害，主要原因是日照少、雾露持续时间长的河谷地带和气候较温和的沿河地段及水稻生育期处于雨季时较易发生，该病发生流行后，一般稻田减产10％-20％，重的减产40％-50％，局部田块颗粒无收。
因稻瘟病直接影响水稻的产量，所以对于稻瘟病的重视度越来越高，研究人员会对稻瘟病的带病植株基因进行检测，通过检测数据的比对，找到水稻的相应防治方法，虽然目前研究人员对稻瘟病的基因检测方法很多，但是还是存在一些不足之处，例如稻瘟病的基因多为直接从水稻植株上提取，因而会夹杂部分杂质，影响后期的检测效果，而且在基因提取缓冲液与稻瘟病植株混合时，混合进度慢，并且混合后会产生气泡，进一步影响了对稻瘟病基因的检测效率。所以我们提出了一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，以便于解决上述中提出的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，以解决上述背景技术中提出现有的稻瘟病的基因多为直接从水稻植株上提取，因而会夹杂部分杂质，影响后期的检测效果，而且在基因提取缓冲液与稻瘟病植株混合时，混合进度慢，并且混合后会产生气泡，进一步影响了对稻瘟病基因的检测效率的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，包括
步骤1：准备多个存放的试管
将多个试管固定在相应位置，并且试管经过消毒；
步骤2：准备好基因提取缓冲液
将基因提取缓冲液准备好，并且存储于TE缓冲液中；
步骤3：水稻稻瘟病菌株剪取
对水稻发病的植株进行剪取，可以切取不同部位的发病植株，并且分类放在不同的试管中进行存放；
步骤4：添加基因提取缓冲液
将存放于TE缓冲液中的基因提取缓冲液定量倒入装有水稻发病植株的试管中，使溶液与发病植株进行混合，并且上下颠倒摇匀；
步骤5：水浴处理
对装有基因提取缓冲液和带病植株的试管进行水浴处理，加热时长 30min；
步骤6：冷却处理
水浴处理后，将试管放在无菌工作台上，使其在室温下进行自然冷却；
步骤7：过滤处理
然后将试管中的混合物经过相应的过滤装置对其进行过滤，将夹杂在液体中的杂质进行拦截，确保后期的检测效果；
步骤8：加入氯仿、异戊醇
对过滤后的混合物中加入氯仿、异戊醇，同时对混合物进行离心混合摇匀；
步骤9：混合后溶液的抽取
通过相应的抽取装置，将混合液的上层溶液抽取注入PCR孔板中，然后将PCR孔板放在-20℃的环境下进行冷藏；
步骤10：基因检测
检测时取出PCR孔板，检测装置的探针上标记酶、生物素、放射性同位素，探针对PCR孔板内的混合液进行数据采集，通过与计算机内的DNA检测系统的标准对照表进行对比，计算对比度，自动生成DNA检测数据表。
优选的，所述步骤1中的试管均为2ml离心试管。
优选的，所述步骤2中基因提取缓冲液采用NaCl、Tris-HCl、EDTA和CTAB 的混合液，或者Tris-HCl、EDTA、ddH2O和TE的混合液。
优选的，所述步骤3中水稻带病植株剪取后经过表面灭菌处理，并且放入无菌工作台上进行操作。
优选的，所述步骤4在将装有混合物的试管进行摇匀时，离心转速为 1200rpm，并且将试管口封闭。
优选的，所述步骤5中水浴处理采用水加热的方式，且水浴时长不低于 30min，并且温度控制在70-85℃之间。
优选的，所述步骤6中试管进行自然冷却时处于无菌环境中，且试管上端开口打开。
优选的，所述步骤8中加入氯仿、异戊醇的比例为24：1，且对试管再次进行离心，并且离心转速为1200rpm。
优选的，所述步骤9中将混合溶液注入PCR孔板中时，均为等量注入。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法；
(1)通过不同种类的基因提取缓冲液，可以使稻瘟病基因与不同的基因提取液进行充分混合反应，从而使稻瘟病基因进行高效的提取，提高了稻瘟病基因提取工作的效率，也保证了稻瘟病基因提取工作的正常进行；
(2)通过将基因提取缓冲液存储于TE缓冲液中，因TE缓冲液是弱碱性，对基因(DNA)的碱基有保护性，因而DNA在TE缓冲液中的稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂，进而确保后期稻瘟病基因的正常存储，为后续基因的提取检测带来便利；
(3)当基因提取缓冲液与稻瘟病的基因提取原料混合冷却后，对混合溶液进行过滤工作，这样可以有效的将混合溶液中的杂质截留，防止杂质对后期的基因检测效果带来影响，从而保证了稻瘟病基因后续检测工作的顺利进行；
(4)在过滤过后的混合溶液中添加氯仿、异戊醇，同时对混合物进行离心混合摇匀，因为在提取DNA时为了混合均匀必须剧烈振荡试管，这时在混合液内容易产生气泡，而气泡会阻止相互间的充分作用，加入异戊醇可以降低分子的表面张力，进而能减少提取过程中泡沫的产生，进一步保证了稻瘟病基因提取检测工作的进行；
(5)稻瘟病基因全部提取之后，可以注入PCR孔板中存储，PCR孔板采用优质医疗级聚丙烯(PP)材料制成，广泛应用于一般的分子实验室生物基因的检测，为研究人员的工作带来便利。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例1提供一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，以下对上述方法进行详细介绍。
在对稻瘟病基因提取之前，事先准备好多个用于实验的试管，且试管均为2ml的离心试管，同时准备好基因提取缓冲液，其中基因提取缓冲液采用 NaCl、Tris-HCl、EDTA和CTAB的混合液，为了确保基因提取缓冲液后期的正常使用，研究人员可以将基因提取缓冲液存储于TE缓冲液中，因TE缓冲液是弱碱性，对基因(DNA)的碱基有保护性，因而DNA在TE缓冲液中的稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂，进而确保后期稻瘟病基因的正常存储，为后续基因的提取检测做好准备工作；
然后研究人员对带病的水稻植株进行剪取，在剪取过后，对植株的外表面进行灭菌处理，并且放入无菌工作台上进行操作，这时研究人员将经过灭菌处理的稻瘟病植株放入离心试管中，接着将基因提取缓冲液倒入离心试管中，封闭试管口，保证试管内环境的稳定，同时对试管进行离心处理，并且离心转速为1200rpm，使缓冲液与稻瘟病植株充分混合，当混合溶液混匀后，研究人员将试管放入热水中进行水浴处理，且水浴时长不低于30min，并且温度控制在70-85℃之间，因为在这个温度之间，DNA的双链会解开，失去原有的活性，更加方便对DNA的提取；
在装有稻瘟病混合溶液的试管进行水浴处理后，研究人员将其放在无菌的环境下，让其自然冷却，冷却时可以打开试管口，加快冷却进度，当混合溶液冷却过后，将混合溶液经过过滤装置处理并且倒入干净的试管中，将混合溶液中的杂质去除，确保后期稻瘟病基因检测的效果，接着研究人员在试管中加入氯仿、异戊醇，且氯仿、异戊醇的比例为24：1，并且对混合物进行再次离心混合摇匀，离心转速同样为1200rpm，因为在提取DNA时为了混合均匀必须剧烈振荡试管，这时在混合液内容易产生气泡，而气泡会阻止相互间的充分作用，因此加入异戊醇可以降低分子的表面张力，从而能减少提取过程中泡沫的产生，进一步保证了稻瘟病基因提取检测工作的进行；
之后研究人员将混合溶液中的上层溶液抽取，并且等量注入到PCR孔板中，PCR孔板采用优质医疗级聚丙烯(PP)材料制成，可广泛应用于一般的分子实验室对生物基因的提取检测，为研究人员的操作带来便利，然后将注有混合液的PCR孔板放置到-20℃的环境下进行冷藏，以供后续检测使用；
当检测时，研究人员取出PCR孔板，检测装置的探针上标记酶、生物素、放射性同位素，探针对PCR孔板内的混合液进行数据采集，通过与计算机内的DNA检测系统的标准对照表进行对比，计算对比度，然后自动生成DNA检测数据表，从而使得研究人员根据PCR孔板上各个混合液的DNA检测数据表进行对比确定准确的DNA检测数据表。
实施例2
本实施例1提供一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，以下对上述方法进行详细介绍。
在对稻瘟病基因提取之前，事先准备好多个用于实验的试管，且试管均为2ml的离心试管，同时准备好基因提取缓冲液，其中基因提取缓冲液采用 Tris-HCl、EDTA、ddH2O和TE的混合液，为了确保基因提取缓冲液后期的正常使用，研究人员可以将基因提取缓冲液存储于TE缓冲液中，因TE缓冲液是弱碱性，对基因(DNA)的碱基有保护性，因而DNA在TE缓冲液中的稳定性较好，不易破坏其完整性或产生开环及断裂，进而确保后期稻瘟病基因的正常存储，为后续基因的提取检测做好准备工作；
然后研究人员对带病的水稻植株进行剪取，在剪取过后，对植株的外表面进行灭菌处理，并且放入无菌工作台上进行操作，这时研究人员将经过灭菌处理的稻瘟病植株放入离心试管中，接着将基因提取缓冲液倒入离心试管中，封闭试管口，保证试管内环境的稳定，同时对试管进行离心处理，并且离心转速为1200rpm，使缓冲液与稻瘟病植株充分混合，当混合溶液混匀后，研究人员将试管放入热水中进行水浴处理，且水浴时长不低于30min，并且温度控制在70-85℃之间，因为在这个温度之间，DNA的双链会解开，失去原有的活性，更加方便对DNA的提取；
在装有稻瘟病混合溶液的试管进行水浴处理后，研究人员将其放在无菌的环境下，让其自然冷却，冷却时可以打开试管口，加快冷却进度，当混合溶液冷却过后，将混合溶液经过过滤装置处理并且倒入干净的试管中，将混合溶液中的杂质去除，确保后期稻瘟病基因检测的效果，接着研究人员在试管中加入氯仿、异戊醇，且氯仿、异戊醇的比例为24：1，并且对混合物进行再次离心混合摇匀，离心转速同样为1200rpm，因为在提取DNA时为了混合均匀必须剧烈振荡试管，这时在混合液内容易产生气泡，而气泡会阻止相互间的充分作用，因此加入异戊醇可以降低分子的表面张力，从而能减少提取过程中泡沫的产生，进一步保证了稻瘟病基因提取检测工作的进行；
之后研究人员将混合溶液中的上层溶液抽取，并且等量注入到PCR孔板中，PCR孔板采用优质医疗级聚丙烯(PP)材料制成，可广泛应用于一般的分子实验室对生物基因的提取检测，为研究人员的操作带来便利，然后将注有混合液的PCR孔板放置到-20℃的环境下进行冷藏，以供后续检测使用；
当检测时，研究人员取出PCR孔板，检测装置的探针上标记酶、生物素、放射性同位素，探针对PCR孔板内的混合液进行数据采集，通过与计算机内的DNA检测系统的标准对照表进行对比，计算对比度，然后自动生成DNA检测数据表，从而使得研究人员根据PCR孔板上各个混合液的DNA检测数据表进行对比确定准确的DNA检测数据表。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，包括：
步骤1：准备多个存放的试管
将多个试管固定在相应位置，并且试管经过消毒；
步骤2：准备好基因提取缓冲液
将基因提取缓冲液准备好，并且存储于TE缓冲液中；
步骤3：水稻稻瘟病菌株剪取
对水稻发病的植株进行剪取，可以切取不同部位的发病植株，并且分类放在不同的试管中进行存放；
步骤4：添加基因提取缓冲液
将存放于TE缓冲液中的基因提取缓冲液定量倒入装有水稻发病植株的试管中，使溶液与发病植株进行混合，并且上下颠倒摇匀；
步骤5：水浴处理
对装有基因提取缓冲液和带病植株的试管进行水浴处理，加热时长30min；
步骤6：冷却处理
水浴处理后，将试管放在无菌工作台上，使其在室温下进行自然冷却；
步骤7：过滤处理
然后将试管中的混合物经过相应的过滤装置对其进行过滤，将夹杂在液体中的杂质进行拦截，确保后期的检测效果；
步骤8：加入氯仿、异戊醇
对过滤后的混合物中加入氯仿、异戊醇，同时对混合物进行离心混合摇匀；
步骤9：混合后溶液的抽取
通过相应的抽取装置，将混合液的上层溶液抽取注入PCR孔板中，然后将PCR孔板放在-20℃的环境下进行冷藏；
步骤10：基因检测
检测时取出PCR孔板，检测装置的探针上标记酶、生物素、放射性同位素，探针对PCR孔板内的混合液进行数据采集，通过与计算机内的DNA检测系统的标准对照表进行对比，计算对比度，自动生成DNA检测数据表。
2.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤1中的试管均为2ml离心试管。
3.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤2中基因提取缓冲液采用NaCl、Tris-HCl、EDTA和CTAB的混合液，或者Tris-HCl、EDTA、ddH2O和TE的混合液。
4.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤3中水稻带病植株剪取后经过表面灭菌处理，并且放入无菌工作台上进行操作。
5.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤4在将装有混合物的试管进行摇匀时，离心转速为1200rpm，并且将试管口封闭。
6.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤5中水浴处理采用水加热的方式，且水浴时长不低于30min，并且温度控制在70-85℃之间。
7.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤6中试管进行自然冷却时处于无菌环境中，且试管上端开口打开。
8.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤8中加入氯仿、异戊醇的比例为24：1，且对试管再次进行离心，并且离心转速为1200rpm。
9.根据权利要求1所述的一种便于对水稻的稻瘟病基因进行提取检测的方法，其特征在于：所述步骤9中将混合溶液注入PCR孔板中时，均为等量注入。
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