KR101075580B1

KR101075580B1 - 슈도알테로모나스 이사첸코니로부터 분리된 신규 엑소키티나아제

Info

Publication number: KR101075580B1
Application number: KR1020080111458A
Authority: KR
Inventors: 이홍금; 임정한; 김인희; 박하주; 강필성; 김성진; 김주영; 김일찬; 홍순규; 김덕규; 이유경; 이성구
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2011-10-20
Also published as: KR20100052650A

Abstract

본 발명은 신규 엑소키티나아제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 북극 해수에서 분리된 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718 균주 유래의 신규 엑소키티나아제 및 그 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 엑소키티나아제는 저온을 포함한 다양한 온도 및 pH 범위에서 높은 활성을 나타내고, 다양한 금속 이온의 존재하에서도 안정적으로 효소활성을 유지하고 있어, 키틴과 키틴올리고머를 이용하여 키틴모노머의 생산에 유용하다.

엑소키티나아제, 키틴, 키틴올리고머, 저온활성

Description

슈도알테로모나스 이사첸코니로부터 분리된 신규 엑소키티나아제{Novel Exochitinase Isolated from Pseudoalteromonas issachenkonii}

본 발명은 신규 엑소키티나아제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 북극 해수에서 분리된 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718 균주 유래의 신규 엑소키티나아제 및 그 용도에에 관한 것이다.

키틴은 N-acetyl D-glucosamine (GlcNAc)이 β-(1, 4) 결합으로 결합되어 있는 폴리머로 (Kurita et al., Prog. Polym. Sci., 26:1921, 2001; Roberts, London Macmillan Press, 1, 1992), 자연계에서 셀룰로오스 다음으로 풍부한 물질이며, 전 세계적으로 1,000억 톤 이상이 생산되는 것으로 추산된다. 또한, 키틴은 곰팡이의 세포벽, 갑각류와 곤충의 껍질, 연체동물의 골격 및 달걀 껍질 등의 주요 구성 성분으로 토양 및 해양 세균의 탄소원으로 사용된다 (Gooday et al., Biodegradation, 1:188, 1990; Kuranda and Robbins, J. Biol. Chem., 266:19707, 1991; Wang and Chang, Appl. Environ. Microbiol., 63:380, 1997; Wen et al., Biotechnol. Appl. Biochem., 35:213, 2002). 국내의 경우, 키틴 주생산원은 게, 크릴과 같은 갑각류이며, 이들 갑각류는 체중의 약 75%가 키틴으로 구성되어 있지만, 식용부만 사용되고 체충의 약 50% (약 150톤)는 폐기되고 있어, 이에 따른 환경문제가 대두되고 있으며, 키틴의 산업적 이용을 위한 연구가 요구되고 있다.

키틴 및 그 분해산물들은 광범위한 산업적 유용성을 가지고 있다. 이러한 유용 물질들은 항균, 항콜레스테롤, 항암 활성 및 폐수처리, 약물전달, 상처치료 등에 유용하기 때문에 생화학, 식품, 환경, 제약, 의료, 그리고 농업 등의 시장에서 중요한 물질이다 (Dahiya et al., World J. Microbiol. Biotechnol., 21:1611, 2005; El-Sayed et al., World J. Microbiol. Biotechnol., 16:87, 2000; Hoster et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 66:434, 2005; Karasuda et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 67:221, 2003; Orunsi and Trinci, Microbiology, 43:17, 1985; Yuan and Crawford, Appl. Environ. Microbiol., 61:3119, 1995). 키틴 유래의 유용물질들은 일반적으로 산가수분해, 플로오르화 수소, 및 sonolysis 같은 화학적 분해 및 합성방법을 통해 얻고 있다. 하지만, 화학적 방법에 의한 유용물질 생산은 비용대비 효율이 작으며, 환경 오염 및 안정성의 문제를 지니고 있기 때문에, 효소를 이용한 친환경적, 고효율 방법의 연구 확대가 필요하다.

키티나아제는 키틴을 GlcNAc 모노머 또는 올리고머로 가수분해하는 효소로서, 글리코실하이드롤라아제 패밀리 18 및 19에 속한다. 패밀리 18 및 19 키티나아제는 아미노산 서열, 단백질 구조에서 명확한 차이를 보이며, 패밀리 19 키티나아제는 오직 식물에만 존재하는 것에 반해, 패밀리 18 키티나아제는 포유류, 곤충, 식물, 세균, 곰팡이 등 많은 생명체에 존재한다. 키티나아제는 분해양식에 따라 크게 엑소키티나아제와 엔도키티나아제로 나눌 수 있다 (도 1). 엑소키티나아제는 GlcNAc 사슬의 비환원성 말단으로부터 GlcNAc 모노머를 생산하는 N-아세틸-β-글루코사미니다아제와 키토바이오스(chitobiose, GlcNAc dimer)를 생산하는 키토바이오시다아제로 세분할 수 있으며, 식물 유래 패밀리 18 키티나아제가 주로 포함되어 있다.

반면, 엔도키티나아제는 GlcNAc 사슬 내부를 무작위로 가수분해하는 효소이다 (McCreath and Gooday, J. Microbiol. Methods, 14:229, 1992; Sahai and Manocha, FEMS Microbiol. Rev., 11:317, 1993). 다양한 산업 현장에서, 키토헥사오즈(chitohexaose)와 키토헵타오즈(chitoheptaose)가 강력한 항암 효과를 나타내기 때문에, 제약산업에서 특히 키티나아제가 중요한 촉매제로 여겨지고 있다. 이러한 키토올리고사카라이드 외에도 순수한 글루코사민과 GlcNAc의 생산에 있어서도 또한 중요한 촉매제로 키티나아제가 사용되고 있다. 현재, Vibrio alginolyticus 유래 키티나아제는 콜로이드상 키틴으로부터 키토펜타오스(chitopentaose)와 키토트리오스(chitotriose) 생산에 이용되고 있다. 산업적으로 유용한 GlNAc 올리고머들은 필요한 사슬 길이가 다양하기 때문에, 다양한 생물체 유래의 엑소키티나아제와 엔도키티나아제의 적절한 조화가 시도되고 있으며, 이를 위해 식물, 세균, 곤충, 및 곰팡이 등 유래 키티나아제의 분리 및 특성 조사가 세계적으로 활발히 이루어지고 있다 (Howard et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 30:627, 2003).

극한지 서식생물로부터 분리한 효소는 일반적으로 고압, 고온, 저온, 고염분 및 다양한 pH 등의 환경조건에서도 안정적인 촉매반응이 가능하기 때문에 산업적 가치가 크다. 특히, 저온환경에 적응한 생물로부터 획득한 저온효소는 중온과 저온에서 높은 활성을 나타내기 때문에 중온효소와 비교하여 효소의 안정성, 효율성, 경제성 등의 측면에서 우월하며, 효소산업에서 각광을 받고 있다. 현재까지 Alteromonase sp., Moritella marina 등의 소수 세균 유래 저온성 키티나아제가 분리 및 특성 연구가 이루어 졌으며, 산업적 요구에 따라 저온성 키티나아제 연구는 지속적으로 증가 될 것으로 기대되고 있다 (Lonhienne et al., J. Bacteriol., 183:1773, 2001; Mavromatis et al., Protein Eng., 16:497, 2003).

이에, 본 발명자들은 저온 미생물로부터 새로운 키티나아제를 분리하고자 예의 노력한 결과, 북극 해수에서 키틴분해 활성을 나타내는 미생물을 분리하고, 이로부터 키틴 분해활성이 뛰어난 새로운 엑소키티나아제를 분리하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 저온환경에서 서식하는 미생물로부터 분리된 키티나아제 및 상기 키티나아제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키티나아제를 이용하여, 키틴을 분해하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 엑소키티나아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 엑소키티나아제 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 엑소키티나아제를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(KCTC 11415BP) 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 엑소키티나아제를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 키티나아제를 이용하여 키틴 폴리머를 키틴 모노머 또는 키틴 올리고머로 분해하는 방법에 있어서, 상기 키티나아제로 상기 엑소키티나아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 엑소키티나아제에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소키티나아제는 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(KCTC 11415BP) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 북극 카라해(Cara Sea) 해안가에서 분리한 키틴분해활성을 가진 선별균주를 대상으로 저온활성을 포함한 온도 적용범위가 넓고 엑소키티나제를 생산하는 해양미생물 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(Pseudoalteromonas issachenkonii KOPRI 22718)를 동정하고, 상기 균주를 2008년 11월 7일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁 (기탁번호: KCTC 11415BP)하고, 상기 미생물 Pseudoalteromonas issachenkonii KOPRI 22718로부터 생산되는 엑소키티나제 (exochitinase)를 Chi22718라고 명명하였다.

본 발명의 Chi22718의 분자량은 SDS-PAGE 젤에서 확인한 결과 약 100 kDa이었고, 온도별 효소활성은 0℃, 10℃ 및 40℃에서 효소활성은 각각 약 20%, 40% 및 100%를 유지하는 것으로 조사되어, 넓은 온도범위에서 키틴 분해효소로 이용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 pH에 따른 효소활성을 조사한 결과, 염기성 조건에서 효소활성이 안정되며, pH 5~11의 조건에서 활성을 최소 60% 이상 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

다른 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 엑소키티나아제 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서, Chi22718의 염기서열 및 아미노산 서열을 분석한 결과, Chi22718 유전자는 2,631개의 뉴클레오타이드로 이루어져 있으며 876개의 amino acid로 구성되어 있으며, N-말단 부분에는 절단부위가 존재하고, 유전자 내부에는 키틴결합도메인을 가진다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 미생물의 키티나아제 유전자들에서 공통적으로 존재하는 것으로 알려진 키티나아제 패밀리 18 활성 부위가 잘 보존되어 있는 것으로 확인되었다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(KCTC 11415BP) 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 엑소키티나아제의 제조방법에 관한 것이다.

Chi22718는 가용성 키틴을 함유한 배양배지에서 생산이 유도되며, 25℃ 배양 조건에서는 배양시간에 따른 차이는 나타내나, 세포생장 및 Chi22718의 생산이 이루어진다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 양태에서는 High Q 이온교환 크로마토그래피를 이용하여, 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718 배양액으로부터 Chi22718을 분리·정제하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 상기 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 엑소키티나아제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전자는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터를 포함한 다양한 벡터들에 도입될 수 있다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다.

그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

본 발명에서 사용된 T-벡터를 포함한 다양한 벡터들은 여러개의 제한효소 절단부위를 모아놓은 멀티클로닝사이트(MCS)를 포함하고 있는데 이들은 lacZ 유전자 내에 위치한다. MCS는 lacZ 유전자의 리딩 프레임(reading frame)을 파괴하지 않으므로 적당한 숙주세포에서는 lacZ의 발현이 이루어져 생물학적 활성을 지닌 β-갈락코시다제 효소를 합성해낸다. 이 숙주세포를 무색 화학물질인 X-gal을 포함하는 배지에서 배양하면 이 효소에 의해서 X-gal이 분해되어 불용성의 청색물질을 만들게 된다. 그러므로 MCS에 외래 DNA의 삽입이 이루어지지 않은 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포 콜로니는 청색을 띈다. 반대로 MCS에 외래 DNA가 삽입되면 플라스미드 벡터의 lacZ 리딩 프레임이 깨지면서 β-갈락토시다제가 만들어지지 않고 그 결과 무색의 숙주세포 콜로니가 형성된다. 본 발명에 따른 DNA 칩의 제조방법에서, 상기 벡터는 슬라이드 상에 집적하기를 원하는 DNA가 벡터에 정상적으로 클로닝되었는지 여부를 확인시켜 주기 때문에 더욱더 유용하게 이용될 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 따른 DNA 칩의 제조방법에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E.coli균주 DH5a, E.coli균주 JM101, E.coli K12균주 294, E.coli균주 W3110, E.coli균주 X1776, E.coli XL-1Blue(Stratagene) 및 E.coli B 등을 포함한다. 그러나 FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주. 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리 움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.

원핵세포의 형질전환은 Sambrook et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1: 841,1982)이 또한 이러한 세포들을 형질전환하는데 사용될 수 있다.

본 발명에서 상기 유전자를 숙주세포의 염색체상에 삽입하는 방법으로는 통상적으로 알려진 유전자조작방법을 사용할 수 있으며, 일례로는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 비바이러스성 벡터를 이용하는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있으며, pET 계열 벡터(Novagen)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 pET 계열 벡터를 사용하여 클로닝을 수행하면, 발현되는 단백질의 말단에 히스티딘기들이 결합되어 나오므로, 상기 단백질을 효과적으로 정제할 수 있다. 클로닝된 유전자로부터 발현된 단백질을 분리하기 위해서는 당업계에 공지된 일반적인 방법이 이용될 수 있으며, 구체적으로, Ni-NTA His-결합 레진(Novagen)을 사용하는 크로마토그래피 방법을 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명에서 "발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어, Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 바이러스의 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 프로모터는 대장균에서 본 발명의 단백질을 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 키티나아제를 이용하여 키틴 폴리머를 키틴 모노머 또는 키틴 올리고머로 분해하는 방법에 있어서, 상기 키티나아제로 상기 엑소키티나아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서, 효소반응의 특이성을 분석하기 위하여 분리·정제한 Chi22718을 다양한 기질과 반응시키고 반응산물을 HPLC로 분한 결과, Chi22718는 60분의 반응 시간동안에도 GlcNAc (G1)를 분해하지 못하였으나, GlcNAc2 (G2)와 GlcNAc3 (G3)의 경우에는 짧은 10분 반응시간부터 G1을 생산하기 시작하여 반응시간이 증가함에 따라 더 많은 G1을 생산하였다. GlcNAc5 (G5)을 60분 동안 반응시킨 결과, G5는 거의 모두 G1으로 분해되었다. GlcNAc6 (G6)은 60분 동안 반응시킨 결과, G6는 G5+G4+G3+G2+G1의 혼합물로 전환되었으며, 반응시간이 증가함에 따라 G1 의 생산량은 더욱 증가하였다. 위의 최종분해산물 분석 결과를 바탕으로, Chi22718은 엑소키티나아제임을 확인할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 키티나아제 생산균주의 선별

북극 Cara Sea 해안가에서 채취한 해수 시료에 20% 글리세롤 용액 혼합한 후에 0.4 % 팽화(swollen) 키틴이 첨가된 ZoBell 배지 (peptone 5g/l, yeast extract 1g/l, FePO₄ 0.01g/l, aged sea water 750ml, distilled water 250ml, pH 7.0)에 도말하여 25℃에서 배양한 후, 상기 고체배지에서 투명환을 형성하는 균주를 대상으로 형성된 콜로니 크기의 비율을 측정하여 간접적으로 키틴 분해활성능을 조사하였다. 최종적으로 키틴분해활성을 나타내는 9종의 세균을 분리하였으며, 이들 중 pNP-GlcNAc에 대해 높은 활성을 나타내어,엑소키티나아제를 생산하리라 예상하는 하나의 균주(KOPRI 22718로 명명)를 선발하여 실험에 사용하였다. KOPRI 22718이 분비하는 엑소키티나아제를 Chi22718로 명명하였다.

실시예 2: KOPRI 22718 균주의 동정

KOPRI 22718 균주는 16S rDNA 유전자분석을 이용하여, 하기방법으로 동정하였다 (Takahiro Kaneko et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 65:1054, 2001).

ZoBell 고체배지에서 배양한 KOPRI 22718 균체를 2ml ZoBell 액체배지에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 원심분리 (12,000g, 15 min, 4 ℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체의 게놈 DNA는 Wizard 게놈 DNA 정제용 키트(Promega, USA)를 사용하여 추출하였다. 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 하기 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용하여 하기 조건하에서 PCR을 수행하여 16S rDNA를 증폭하였다.

서열번호 3: 5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'

서열번호 4: 5'-AAG GAG GTG ATC CAN CCR CA-3'

PCR 반응물 (총 부피 50μl): 0.2μM의 프라이머, 1.5mM의 MgCl₂, 0.2mM의 dNTPs, 0.1 %의 BSA (Boehringer Mannheim), 10ng의 주형 DNA, 및 2.5U의 Taq DNA polymerase (Promega)

PCR 반응조건: 94 ℃, 5분 → [94 ℃, 1분간 → 55 ℃, 1분 → 72 ℃, 2분]: 35회 → 72 ℃, 7분

PCR 반응산물은 아가로오즈 겔 전기영동으로 통해 예정된 사이즈 (1.5 kb)를 확인하고, Wizard PCR 프렙 DNA 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 정제하였다.

16S rDNA 염기서열을 결정하기 위해서, PCR 증폭을 위해서 사용하였던 서열번호 3 및 4의 프라이머와 서열번호 5~8의 내부 프라이머를 이용하고, ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystem)와 자동 염기 서열 결정 장치 (model 377, Applied Biosystem)를 사용하여 PCR 산물로부터 직접 16S rDNA 염기서열을 결정하였다.

서열번호 5: 5'-GAC TCC TAC GGG AGG CWG CAG-3'

서열번호 6: 5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG-3'

서열번호 7: 5'-GGA TTA GAT ACC CCG GTA-3'

서열번호 8: 5'-TCA CGC ATG MTA CAA TGG-3'

결정된 16S rDNA 염기서열은 서열번호 2 (2,631 bp)와 같으며, 16S rDNA 유전자의 대부분을 포함한다. 16S rDNA 염기서열은 GeneBank 데이터 베이스의 BLAST search (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST)와 RDP (Ribosomal Data Project : http://www.cme.msu.edu/RDP/html/indexhtml)에서 제공하는 인터넷 서비스를 통해, 각 균주의 대략적인 분류학적인 위치를 추정하고 각각의 데이터베이스에서 비교할 염기서열 데이터를 얻었다. RDP 데이터베이스로부터 분리된 균주에 대해 계통학적으로 가장 가까운 그룹의 미리 정렬된 염기서열에 대하여 Phydit 프로그램을 사용하여 정렬하였다. 계통학적인 분석을 위해서 PHYLIP (version 4.57c)을 이용하였 다. 상동성은 DNADIST 프로그램의 Kimura's 2-파라메타 방법을 이용하여 측정하였고, 계통도는 Neighbor-joining 프로그램을 이용하여 작성하였다.

염기서열을 비교한 결과, 가장 가까운 유연관계를 가지는 속은 슈도알테로모나스(Pseudoalteromonas)로 나타났으며 슈도알테로모나스 이사첸코니(P. issachenkonii)와 100% 상동성이 있음을 확인하였으며, 2008년 11월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다 (Pseudoalteromonas issachenkonii KCTC 11415BP).

실시예 3: KOPRI 22718 균주를 이용한 엑소키티나아제 Chi22718의 생산

(1) 콜로이드상 키틴의 제조

콜로이드상 키틴을 제조하기 위하여, 먼저 crab shell chitin (practical grade, Sigma) 100 g에 포화된 HCl 500 ml을 첨가하여 혼합하고 상온에서 1시간 동안 방치하여 팽화시켰다. 팽화된 키틴에 증류수 500 ml를 첨가한 다음, 균질화된 팽화된 키틴을 유리 퓨넬(glass funnel)로 거르고, 증류수로 충분히 세척하여 약 pH 5.0으로 적정하고, 이 후 1N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정함으로써, 최종적으로 콜로이드상 키틴(swollen chitin)을 제조하였다. 이후 필요양은 0.02% 소듐 아자이드(sodium azide)를 첨가하여 농도조정하고, 4℃에 보관하면서 사용하였다.

(2) KOPRI 22718 배양 및 Chi22718 생산

KOPRI 22718을 25 ml의 0.2% swollen chitin이 첨가된 ZoBell 배지에서 배양 (25℃)하면서 시간별로 배양액을 채취하였다. 배양액으로부터 얻은 200μl의 상층액, 10μl의 기질 pNP-GlcNAc (10 mM) 그리고 800μl의 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.6)를 섞은 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 200μl of 1 N NaOH 용액을 첨가하고 얼음에 10 분간 유지시킨 후, 엑소키티나아제의 작용으로 pNP-GlcNAc로부터 떨어져 나온 pNP(p-nitrophenol)을 UV 스펙트로메타를이용하여 400nm에서 측정하였다. pNP의 소거계수(extinction coefficient) 값 (17,000 M^-1cm^-1)과 흡광도를 사용하여 생산된 pNP의 량으로 환산하였다. 엑소키티나아제 효소 활성 1unit는 1mg의 효소가 1 시간에 1umole의 pNP를 방출하는 것으로 정의하였다. 배양액의 엑소키티나아제 활성을 측정하였을 때, 배양이 시작된 지 약 70 시간 이후부터 활성이 나타나기 시작하여 약 230 시간까지 활성이 점차 증가하여 최대 10 U/mg의 활성이 나타났고, 그 이후 배양이 완료되는 시점까지 엑소키티나아제의 활성이 유지되었다 (도 2).

실시예 4: Chi21702의 분리 및 정제

KOPRI 22718이 생산하는 세포외 키틴분해 효소인 Chi22718의 정제를 위해 KOPRI 22718을 0.2% 팽화키틴이 포함된 ZoBell 배지를 사용하여, 25℃에서 7일간 배양하였다. 버퍼교환법을 이용해 배지 내의 단백질을 농축한 후, high Q 이온교환크로마토그래피를 이용한 정제를 수행하였다.

버퍼 A[10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6)]와 버퍼 B[10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) 1 M NaCl 포함]을 용매로 사용하였는데, 버퍼 B의 단계별 농도구배(step-wise gradient, 35%, 55%, 80%, 100%)를 통해서 NaCl의 농도를 점차 증가시켰다. 분리과정에서 NaCl 농도를 증가시킴으로써 용출되는 두 개의 피크를 얻었으며 (도 3), 55% 버퍼 B 그래디언트 과정에서 용출되는 두 번째 피크 (16-17 분획)에 존재하는 단백질은 pNP-GlcNAc에 대해 16.989±0.807 U/mg의 활성을 나타냈으며, 약 100kDa의 단백질이 많이 존재하였다 (도 4). 일반적으로 세균, 식물, 또는 곤충 유래 키티나아제는 단백질 크기에 있어서 20kDa에서 90kDa까지 다양하게 존재한다고 보고되어 있으므로, 두번째 피크내에 존재하는 키틴분해 단백질을 KOPRI 22718이 생산하는 엑소키티나아제 Chi22718로 추정하였다.

실시예 5: Chi22718의 기질특이성

엑소키나아제 Chi22718의 분해 패턴에 관한 특성을 조사하기 위한 최적의 기질을 선택하기 위하여, pNP-GlcNAc, pNP-(GlcNAc)2 혹은 pNP-(GlcNAc)3를 최종 농도가 0.1mM로 첨가된 1ml의 50 mM 소듐인산버퍼(pH 7.6)에 13.06μg의 Chi22718를 첨가하여 37℃에서 5분간 반응을 수행하였다. 100μl의 1 N NaOH를 첨가하여 반응을 종결시킨 후, pNP량을 UV 스펙트로메타를 이용하여 400 nm에서 측정하였다.

일반적으로 pNP-GlcNAc과 pNP-(GlcNAc)3는 각각 β-N-아세틸글루코사미다아제(엑소키티나아제)와 엔도키티나아제의 활성을 확인하기 위해 사용하는 기질인데, Chi22718는 pNP-GlcNAc에 대해 단위활성 16.989±0.807 U/mg를 나타내었고 pNP- (GlcNAc)2와 pNP-(GlcNAc)3에 대해서는 단위활성이 각각 4.867±0.069와 5.155±0.055 U/mg를 나타내었다 (표 1). 상기 결과는 Chi22718이 엑소키티나아제(β-N-acetylglucosaminidase)이며, 키틴과 키틴올리고머로부터 키틴모노머 생산용 생물촉매제로 이용할 수 있음을 의미한다.

실시예 6: Chi22718의 분해산물 분석

효소반응의 특이성을 분석하기 위하여, 실시예 4에서 분리·정제한 Chi22718을 다양한 기질과 반응시킨 다음, 반응산물을 HPLC로 분석하였다. 여러 종류의 키틴올리고머(monomer-hexamer)를 기질로 이용하고, 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.6)에 기질 및 실시예 4에서 분리·정제한 키티나아제 Chi22718을 첨가하여, 37℃에서 시간 간격 (0-60분)으로 반응을 지속시킨 다음, HPLC를 수행하여 생성된 최종분해산물을 분석하였다 (Ingunn A. et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1748:180, 2005).

HPLC의 수행에 있어서 분석 조건은 다음과 같다:

(1) column : TSK-Gel amide-80 column (0.46 id x 25 ㎝)

(2) eluent : acetonitrile : water (70:30)

(3) flow rate : 0.7 ml/min

(4) system : Hewlett Packard 1100 model

(5) standard : N-Acetyl-D-glucosamine(G1),

N,N'-Diacetyl-chitobiose(G2),

N,N',N"-Triacetyl-chitotriose(G3),

N,N',N'',N''',N''''-Pentacetyl-chitopentaose (G5),

Hexa-N-Acetylchitohexaose(G6).

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Chi22718는 60분의 반응 시간동안에도 GlcNAc (G1)를 분해하지 못하였으나, GlcNAc2 (G2)와 GlcNAc3 (G3)의 경우에는 짧은 10분 반응시간부터 G1을 생산하기 시작하여 반응시간이 증가함에 따라 더 많은 G1을 생산하였다. GlcNAc5 (G5)을 60분 동안 반응시킨 결과, G5는 거의 모두 G1으로 분해되었다. GlcNAc6 (G6)은 60분 동안 반응시킨 결과, G6는 G5+G4+G3+G2+G1의 혼합물로 전환되었으며, 반응시간이 증가함에 따라 G1의 생산량은 더욱 증가하였다. 위의 최종분해산물 분석 결과를 바탕으로, Chi22718은 엑소키티나제임을 확인할 수 있었다. 또한 효소의 anomer 형태간의 관계를 조사하기 위하여 TSK-Gel amide-80 column (250 mm x 4.6 mm) (Tosoh Biosep)으로 측정하였는데, N-acetyl-chitooligosaccharide는 N-acetyl-glucoamine 환원말단의 α anomer (earlier peak) 및 β anomer (later peak), 2개의 peak로 분리되었고, α anomer 및 β anomer의 비율은 대략 1: 0.7~0.8인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7: Chi22718의 특성

(1) 온도와 pH에 따른 효소활성 조사

Chi22718의 최적 활성 온도를 측정하기 위해 0.1mM pNP-GlcNAc, 정제된 Chi22718 5.2μg 및 50mM 소듀 포스페이트 버퍼(pH 7.6)로 구성된 1ml의 반응 혼합액을 0℃에서 60℃사이의 다양한 온도에서 1시간 동안 반응시켰다.

Chi22718의 최적 활성 pH를 측정하기 위해 버퍼용액을 다음과 같이 구성하였다: 50 mM sodium acetate (pH 4.0, 5.0, 6.0), 50mM potassium phosphate (pH 6.0, 7.0, 7.6, 8.0, 9.0, 9.5), 50mM Tris-HCl (pH 8.0, 8.5, 9.5). 0.1mM pNP-GlcNAc, 정제된 Chi22718 13.06μg 및 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.6)로 구성된 1ml의 반응 혼합액을 37℃에서 5 분간 반응시켰다.

Chi22718의 온도 안정성을 알아보기 위해 정제된 효소 5.2μg이 포함된 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.6) 990μl를 10℃에서 60℃사이의 다양한 온도에서 1시간 동안 처리하였다. 그 후, pNP-GlcNAc (10 mM) 10μl를 첨가하여 37℃에서 1 시간 반응시켰다.

Chi22718의 활성에 안정한 pH를 알아보기 위해 다음과 같은 buffer 용액을 구성하였다: 50 mM sodium acetate (pH 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0), 50 mM potassium phosphate (pH 7.0, 8.0, 9.0), and 50 mM sodium tetraboratefer (pH 10.0, 11.0). 정제된 효소 26.12μg이 포함된 각 pH 용액 1ml를 1 시간 동안 얼음에 방치한 후, pH 처리된 효소액 100μl (2.612 ug)와 10μl pNP-GlcNAc (10 mM), 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.6) 890 ul를 섞어서 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다.

기질 특이성 실험을 통해 pNP-GlcNAc 기질이 Chi22718의 활성에 대한 최적 기질로 확인되었기 때문에, pNP-GlcNAc이 Chi22718의 특성 규명을 위한 기질로 사용되었다. Chi22718의 가수분해 활성은 40℃까지 점차적으로 증가하며 그 이후로 급격히 활성이 감소하는 것을 확인하였다 (도 6의 A). 특히, Chi22718는 40℃에서의 100% 활성과 비교하여, 0℃와 10에서 각각 약 20%와 40%의 상대적 ㅎ호화활성을 보인다는 것을 볼 수 있었다. 이는 현재까지 보고된 저온성 키티나아제의 0℃ 상대활성과 비교할 만 한 활성을 가지고 있음을 나타낸다 (28%, Alteromonas sp.; 10%, Moritella marina).

일반적으로 알려진 저온성 효소는 호냉성 세균이 생산하며, 저온에서 높은 활성을 보이며 또한, 온도 민감성을 보인다. Chi22718이 40℃ 이상에서 잔존활성이 급격히 줄어드는 것은 Chi22718이 저온성 효소임을 보여준다. Chi22718의 최고 활성 pH는 9.0-9.5 이며 (도 6의 C), Chi22718은 10-40℃, pH 10-11에서 1 시간 동안 안정하였다 (그림 6의 B 및 D). Chi22718은 pH 특성에 나타나 있듯이, 중성 보다 강한 염기성의 조건에서 큰 활성을 보였다. 온도 조건과 pH 조건을 고려해 보았을 때, Chi22718은 저온 및 염기 조건의 환경을 필요로 하는 산업환경에서 유용한 biocatalyst가 될 수 있으리라 판단된다.

(2) 금속 이온과 계면활성제에 따른 효소활성 조사

여러 금속 이온과 계면활성제(Detergent)가 Chi22718의 활성에 어떤 영향을 주는지 알아보기 위해 13.06μg의 정제된 Chi22718가 포함된 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.6)에 2mM의 KCl, CuSO₄, MgSO₄, CaCl₂, BaCl₂, SDS, EDTA, 또는 NaN₃를 섞고, 이에 따라 구성된 각 혼합액 990μl를 1시간 동안 얼음에 방치하였다. 그 후, 10μl pNP-GlcNAc (10mM)를 첨가하고, 37℃에서 5 분간 반응을 수행한 후 잔존 Chi22718의 활성을 측정하였다.

Chi22718의 반응 메커니즘에 있어 금속 이온의 효과를 알아보며, 다양한 계면활성제의 영향을 알아보기 위해 여러 금속 이온과 계면활성제를 첨가하여 반응을 수행한 결과, EDTA, NaN₃, Ca²⁺, Ba²⁺, 및 K⁺은 Chi22718 활성에 미비한 증가를 일으키며, Cu²⁺, SDS는 Chi22718의 활성을 강력히 억제하였다 (도 7). 단백질 변성 물질인 SDS에 대해서 2mM에서 쉽게 변성되며, Cu²⁺에 의해 활성이 억제되는 현상은 Serratia pylmuthica 유래 키티나아제에서 보고되었는데, 이 키티나아제는 항곰팡이 활성을 가지고 있다.

(3) 효소역학 분석

정제된 효소의 pNP-(GlcNAc)n 기질에 대한 kcat과 Km 값을 측정하였다. 각 기질의 최종 농도와 첨가된 효소의 양은 다음과 같다: pNP-(GlcNAc)2 (0.03-0.15 mM), 15.93μg; pNP-(GlcNAc)2 (0.03-0.15 mM), 31.87μg; pNP-(GlcNAc)3 (0.005-0.03 mM), 31.87μg. 위의 언급한 각 기질과 효소가 포함되어 있는 50mM sodium phosphate buffer (pH 7.6) 1mL의 반응 혼합액을 37℃에서 3 분간 반응을 수행하였다. 효소의 각 기질에 대한 kcat과 Km 값은 실험에 따른 Lineweaver-Burk plot을 얻은 후 산출하였다.

효소의 pNP-GlcNAc, pNP-(GlcNAc)2 그리고 pNP-(GlcNAc)3에 대한 turnover number (kcat)와 Michaelis constant (Km)을 계산하였다 (표 2). pNP-GlcNAc에 대한 Chi22718의 Km과 kcat 값은 각각 0.112mM 과 1.41 sec^-1로 계산되었으며, kcat/Km (catalytic efficiency) 값은 12.627sec^-1mM^-1이었다. pNP-(GlcNAc)2에 대한 Km=0.082 mM and kcat=0.287 sec^-1를 이용해 pNP-(GlcNAc)2에 대한 kcat/Km 값은 3.516sec^-1mM^-1로 산출되었다. 또한 pNP-(GlcNAc)3에 대한 Km, kcat, kcat/Km 값은 각각 0.023 mM, 0.162 sec^-1, 6.944 sec^-1mM^-1이었다. pNP-(GlcNAc)n의 사슬이 길수록 효소의 기질에 대한 친화력 측면에서 높다는 것을 확인하였다 (표 2).

pNP-(GlcNAc)2와 pNP-(GlcNAc)3 기질은 Chi22718의 작용에 의해 순차적으로 GlcNAc를 생산하며, 한 분자의 기질이 모두 분해었을 때의 속도 (V)의 개념이 들어가기 때문에 kitetics와 substrate specificity에서 비교적 큰 오차를 가지고 있다. 반면, Chi22718은 pNP-GlcNAc에 대한 효율적인 kcat/Km 값을 가진다. 이를 통해 Chi22718은 β-N-acetylglucosaminidase 로서의 활성을 가지고 있다는 것을 재차 확인하였으며, 산업적으로 유용한 GlcNAc 생산에 있어 좋은 biocatalyst가 될 수 있다는 것을 확인하였다.

실시예 8: Chi22718의 유전자 서열 분석

KOPRI 22718 균주의 게놈 DNA를 분리하여 Chi22718 유전자의 염기서열을 결정하였다.

ZoBell 고체배지에서 배양한 KOPRI 22718 균체를 2ml ZoBell 액체배지에 접종하여 25℃에서 24시간 동안 배양한 다음, 원심분리 (12,000 g, 15 min, 4 ℃)하여 균체를 회수하였다. 회수한 균체의 genomic DNA는 Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega)를 사용하여 추출하였다.

V. harveyi 및 V. alginolyticus로부터 확인된 키티나아제의 염기서열을 바탕으로 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머를 제작하고, 상기 프라이머를 이용하여, KOPRI 22718의 키티나아제 유전자 일부(약 200 bp)를 증폭하였다.

서열번호 9: 5’-GATATCGACTGGGAGTTCCC-3’(sense primer)

서열번호 10:5’-CATAGAAGTCGTAGGTCATC-3’(antisense primer)

상기 증폭된 유전자 단편을 이용하여 5'- & 3'- RACE PCR (GeneRacer kit, Invitrogen)을 수행하였다. 3' ends RACE PCR을 위해, adapter oligo (dT) primer가 포함된 poly(A) mRNA를 이용하여 first-strand cDNA를 합성하였다. 3‘-RACE 산물을 주형으로 이용하고, 새로운 프라이머(서열번호 11 및 서열번호 12)와 3‘-RACE adaptor 프라이머 (AUAP)를 이용하여 유전자 증폭을 수행하였다.

서열번호 11: 5'-TCAACTGGTAAACTGATCACC-3’(3’raceF1)

서열번호 12: 5'-TGATGCTGACAATGGTGAC-3' (3'raceF2)

0.2 g cDNA template, 10 M 3’raceF1 primer and 3’-Adaptor primer, 10 M of each dNTP, LA Taq DNA polymerase [5 U/l]). 5' end RACE PCR을 위해서 두 개의 프라이머(서열번호 13 및 서열번호 14) 를 합성하였다.

서열번호 13: 5'-ATGATAGCCGTAAGTCTGTGC-3'(5'GSP3-1)

서열번호 14:5'-TATGATGAGCAAGCACAAGC-3'(5’GSP3-2)

First cDNA는 유전자 특이 프라이머(gene specific primer) 5'GSP3-1을 이용하여 합성한 후, cDNA의 TdT tailing과 column purification을 시행하였다. 유전자 증폭에는 5'-abridged anchor 프라이머(AAP)와 함께 5'GSP3-2를이용하였다.

5'- & 3'- end RACE는 94℃/5분, 98℃/30초, 55 ~ 58℃/1분, 72℃/1분, 72℃/10분 조건에서 35회 증폭과정을 거쳐 수행하였다. 증폭된 유전자 산물은 1% agarose gel상에서 확인하였으며, pGEM T-easy vector (Promega, WI, USA)에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

그 결과, chi22718 유전자는 2,631bp의 염기서열을 가지는 것으로 확인되었으며, chi22718는 876개의 아미노산으로 구성되어 있는 분자량이 약 92.7 kDa의 효소 단백질이며, N-말단에 21개로 추정하는 signal peptide를 가지고 있는 것으로 추정하였다. chi22718 유전자 염기서열로부터 추정한 아미노산 서열을 NCBI blastp (protein-protein blast) database에 등록되어 있는 기능이 입증된 세균 유래 키티나아제의 아미노산 서열과 비교 분석하였을 때, Chi22718 아미노산 ㅅ서열은 Gamma-proteobacteria Pseudoalteromonas sp. strain S91의 키티나아제 (ChiC)의 서열과 가장 높은 유사성 [identity, 594/875 (67%); similarity, 688/875 (78%)]을 보였다.

NCBI conserved domain database (CDD)를 이용하여 Chi22718의 아미노산 서열을 분석해 보면, 중간 위치(244th - 343th)에 키티나아제의 키틴분해활성에 중요한 카탈리틱 모티프(catalytic motif, DXXDXDXE, 303th-310th)가 존재하며, 흥미롭게도 C-말단 부위(792th-863th)에 두 개의 보존된 키틴 결합부위(792th-811th과 843th-861th)가 존재하고 있는데, 이로 인해 Chi22718은 다른 키티나아제와 비교해서 동일한 시간에 더 많은 키틴기질과 반응할 수 있으리라 예상된다.

일반적으로 세균 유래 키티나아제는 세 개의 도메인 (N-말단 시그널 페펩티드, 키틴/셀룰로오스 결합 도메인 및 촉매 도메인)으로 구성되어 있는 모듈상 효소로 알려져 있으며(Hoell et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1748:180, 2005), 촉매 도메인의 아미노산 서열과 구조 차이에 의해 패밀리 18 혹은 패밀리 19로 분류된다(Henrissat et al., Biochem. J., 280:309, 1991). 패밀리 18 키티나아제는 보존된 촉매 모티프(DXDXE)를 가지고 있는데, 글루타메이트(glutamate)가 촉매산(catalytic acid)로서 작용하고 있다(Synstad et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 72:715, 2004; Synstad et al., Eur. J. Biochem., 271:253, 2008). 위의 분석 결과를 바탕으로, KOPRI 22718이 분비하는 Chi22718을 패밀리 18 키티나아제로 분류하였다.

도 1은 엔토키티나아제와 엑소키티나아제의 키틴분해기작을 나타낸 것이다.

도 2는 KOPRI 22718로부터 엑소키티나아제 Chi22718의 배양시간에 따른 활성을 나타낸 것이다.

도 3은 FPLC-High Q 이온 교환 크로마토그래피를 이용한 Chi22718의 분리결과를 나타낸 것이다.

도 4는 High Q 이온 교환 크로마토그래피를 통해서 분리한 단백질의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 것으로, 레인 1은 분자량 마커이고, 레인 2는 35% 버퍼 B 에서 용출된 분획이며, 레인 3은 55% 버퍼 B에서 용출되는 분획이다.

도 5는 Chi22718의 엑소키티나제 활성에 의해 생성된 키틴올리고머 최종분해산물을 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 것으로, G6, G5 그리고 G1은 60분 반응 후의 결과이며, G3와 G2는 10분 반응 후의 결과이다.

도 6은 chi22718 활성에 대한 온도와 pH의 영향을 나타낸 그래피이다.

도 7은 Chi22718의 활성에 대한 금속 이온과 계면활성제의 영향을 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Ocean Research & Development Institute <120> Novel Exochitinase Isolated from Pseudoalteromonas issachenkonii <130> P08-B182 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 876 <212> PRT <213> Pseudoalteromonas issachenkonii <400> 1 Met Asn Ile Lys Gln Leu Thr Ala Ala Met Gly Val Ala Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Ser Val Ser Ala Ala Pro Ser Thr Pro Ser Ile Asn Trp Glu Pro 20 25 30 Gln Gln Tyr Ser Phe Val Glu Val Asp Leu Glu Gly Asn Gly Ser Tyr 35 40 45 Lys Gln Leu Val Thr Arg Val Glu Gln Val Asn Ile Asn Ile Glu Trp 50 55 60 Ser Ala Trp Ser Gly Asp Gly Gly Asp Ser Tyr Lys Val Tyr Phe Asp 65 70 75 80 Asp Met Leu Val Asn Glu Gly Thr Leu Ala Asp Gly Ser Lys Ser Gly 85 90 95 Thr Ile Ser Phe Pro Tyr Asp Lys Ala Gly Arg His Thr Met Tyr Val 100 105 110 Glu Leu Cys Glu Gly Gly Thr Thr Cys Ala Arg Ser Ala Gly Lys Pro 115 120 125 Ile Val Ile Ala Asp Thr Asp Gly Gly His Leu Ala Pro Leu Pro Met 130 135 140 Asp Val Asp Pro Asn Asn Arg Asp Ile Gly Val Lys Gln Asp Leu Val 145 150 155 160 Thr Gly Ala Tyr Phe Val Glu Trp Gly Ile Tyr Gly Arg Asp Tyr Asp 165 170 175 Val Thr Asn Met Pro Ala Gln Asn Leu Ser His Ile Leu Tyr Gly Phe 180 185 190 Ile Pro Ile Cys Gly Glu Asn Ala Ser Leu Thr Gly Gly Pro Lys Arg 195 200 205 Ala Leu Glu Thr Ala Cys Ala Gly Ser Ala Asp Tyr Glu Val Val Ile 210 215 220 His Asp Pro Trp Ala Ala Val Gln Lys Ala Leu Pro Gly Val Asp Ala 225 230 235 240 Lys Asp Pro Ile Arg Gly Thr Tyr Ser Gln Leu Met Ala Leu Lys Gln 245 250 255 Arg Tyr Pro Asp Ile Lys Ile Leu Pro Ser Val Gly Gly Trp Thr Leu 260 265 270 Ser Asp Pro Phe Gly Gly Phe Thr Asn Lys Ala Asn Arg Asp Thr Phe 275 280 285 Val Ala Ser Met Glu Glu Phe Leu Arg Thr Trp Lys Phe Tyr Asp Gly 290 295 300 Val Asp Ile Asp Trp Glu Phe Pro Gly Gly Asp Gly Pro Asn Pro Asp 305 310 315 320 Ile Gly Asp Pro Ile Asn Asp Gly Pro Ala Tyr Val Ala Leu Met Gln 325 330 335 Glu Leu Arg Ala Met Leu Asp Lys Leu Glu Ala Glu Thr Gly Arg Thr 340 345 350 Tyr Glu Leu Thr Ser Ala Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Lys Ile Glu Asp 355 360 365 Val Asp Tyr Gln Ala Ala Ser Gln Tyr Met Asp Tyr Ile Phe Ala Met 370 375 380 Thr Tyr Asp Phe Tyr Gly Ala Trp Ser Asn Val Thr Gly His Gln Thr 385 390 395 400 Ala Leu Tyr Cys Gly Glu His Met Ser Val Gly Gln Cys Asn Gly Thr 405 410 415 Gly Leu Asp Glu Asn Gly Glu Pro Arg Lys Gly Pro Ala Tyr Thr Thr 420 425 430 Asp Asn Ala Val Gln Leu Leu Leu Ala Gln Asn Val Pro Ser Lys Lys 435 440 445 Ile Val Val Gly Thr Ala Met Tyr Gly Arg Gly Trp Glu Gly Val Tyr 450 455 460 Pro Gln Asn Ala Ala Val Asp Gly Asn Pro Met Thr Ala Ser Gly Asn 465 470 475 480 Gly Pro Leu Lys Gly Ser Thr Ala Gln Gly Val Trp Glu Asp Gly Val 485 490 495 Ile Asp Tyr Lys Gly Val Lys Ala Asn Met Ile Gly Ala Ala Gly Thr 500 505 510 Gly Ile Asn Gly Phe Glu Val Gly Tyr Asp Glu Gln Ala Gln Ala Ala 515 520 525 Tyr Val Trp Asn Arg Ser Thr Gly Lys Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Arg 530 535 540 Lys Ser Val Leu Ala Lys Gly Ala Tyr Val Asn Gln His Asn Leu Gly 545 550 555 560 Gly Leu Phe Ala Trp Glu Ile Asp Ala Asp Asn Gly Asp Ile Leu Asn 565 570 575 Ala Met His Asp Gly Leu Gly Gly Val Val Ala Pro Pro Ser Asn Lys 580 585 590 Lys Pro Val Val Ser Val Ser Ser Ser Val Ser Val Asn Ser Gly Glu 595 600 605 Ser Ile Thr Val Thr Ala Ser Ala Thr Asp Ala Asp Asn Asp Pro Leu 610 615 620 Ser Phe Ser Trp Ser Ala Asp Ser Ala Leu Val Val Ser Gly Gln Asn 625 630 635 640 Thr Ser Ser Leu Val Ile Asn Ala Pro Thr Val Thr Thr Asp Thr Gln 645 650 655 Tyr Val Ala Thr Val Ala Val Ser Asp Gly Gln Ala Thr Val Asn Arg 660 665 670 Asp Val Val Val Asn Val Ile Ala Pro Thr Ser Gly Gly Glu Asn Thr 675 680 685 Ala Pro Ser Val Asn Ala Ile Ala Asn Val Ser Val Glu Glu Gly Ala 690 695 700 Ser Ala Ser Val Ala Val Val Ala Asn Asp Ala Gln Asn Asp Ala Leu 705 710 715 720 Thr Tyr Thr Trp Thr Val Pro Ala Gly Leu Thr Leu Val Gly Ser Gly 725 730 735 Ala Asn Val Ser Ile Glu Ala Gly Ala Val Asp Thr Asp Thr Asn Phe 740 745 750 Thr Val Ser Val Ala Val Ser Asp Gly Ala Leu Thr Thr Thr Gln Ser 755 760 765 Phe Ser Val Thr Val Thr Asn Gly Asp Thr Thr Thr Pro Pro Thr Gly 770 775 780 Asp Trp Asp Ala Ser Val Ala Tyr Val Gly Gly Asp Val Val Thr Tyr 785 790 795 800 Asn Gly Val Glu Tyr Lys Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly Glu Arg Pro 805 810 815 Asp Leu Gly Gly Ala Trp Glu Ala Thr Thr Gln Pro Thr Asp Gly Thr 820 825 830 Gly Val Glu Val Trp Gln Pro Thr Ala Ile Tyr Asn Ser Gly Asp Glu 835 840 845 Val Ser Tyr Gln Gly Asn Lys Tyr Gln Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly 850 855 860 Asn Glu Pro Gly Ser Thr Asp Val Trp Leu Ala Leu 865 870 875 <210> 2 <211> 2631 <212> DNA <213> Pseudoalteromonas issachenkonii <400> 2 atgaatatta aacaattaac cgcagctatg ggtgttgcac tatttgccgg ttctgtatcg 60 gcagcgcctt ctacaccaag tattaattgg gagccacagc aatattcgtt tgttgaggta 120 gaccttgagg gaaacggttc ttacaaacag ctggttaccc gtgttgagca agttaatatc 180 aacattgaat ggagtgcgtg gagcggtgat ggcggcgata gctataaagt gtactttgat 240 gacatgctag taaatgaggg cacgcttgct gatggttcta aaagtggcac tatttcattc 300 ccttatgata aagcaggccg ccatacaatg tatgttgaac tatgtgaagg cggcacgacc 360 tgtgcaagaa gtgcgggtaa gccaattgta attgctgaca ctgacggcgg acatttagca 420 ccattaccta tggatgttga cccaaataac cgtgatattg gcgttaagca agatttagtg 480 acgggcgctt actttgttga gtgggggatc tatggccgtg attacgatgt aacgaatatg 540 ccagcacaaa acctgagtca tattttgtat ggcttcattc caatttgtgg tgaaaatgcg 600 tcgttaactg gcggtcctaa gcgcgcactg gaaacagcct gtgcgggctc tgcagattac 660 gaagtggtta ttcacgaccc atgggccgca gtacaaaaag cattgccagg ggttgatgct 720 aaagatccca ttcgtggtac ttactcgcag ttaatggcac taaaacagcg ctaccccgat 780 attaaaattt taccatctgt aggtggttgg acgttatcag acccatttgg tggttttact 840 aataaagcaa accgcgacac ctttgttgcc tcaatggaag agtttttaag aacctggaag 900 ttttacgatg gtgttgatat tgactgggaa ttcccaggtg gtgacggccc caatcctgat 960 attggcgatc caattaacga tggcccagcc tatgtggcgc ttatgcaaga gctgcgcgct 1020 atgcttgata agctagaagc agaaacgggt cgtacttacg agttaacctc agccattggt 1080 gctggttacg ataaaattga agatgtagat tatcaagccg caagccagta catggattac 1140 atttttgcca tgacctatga cttttatggt gcatggagta acgtaactgg tcatcaaact 1200 gcactttact gtggcgagca catgagtgtt ggtcaatgta atggcactgg gcttgatgaa 1260 aatggcgaac ctcgtaaagg ccctgcttat accaccgata atgcagtaca gctgttactt 1320 gcgcaaaatg taccatcgaa aaaaatcgtc gtcggcacag ccatgtatgg ccgtggttgg 1380 gaaggtgttt acccgcaaaa tgcagcggtt gatggtaacc caatgaccgc ctctggtaat 1440 ggcccgttaa aaggctccac ggcacaaggt gtatgggaag atggagttat tgattacaaa 1500 ggcgttaaag ccaatatgat tggtgcggca ggcaccggta ttaatggttt tgaagtgggt 1560 tatgatgagc aagcacaagc cgcttatgta tggaatcgct caactggtaa actgatcacc 1620 tatgatagcc gtaagtctgt gctggccaaa ggtgcgtatg ttaatcagca taacttgggc 1680 ggtttatttg catgggaaat tgatgctgac aatggtgaca ttctaaatgc aatgcatgat 1740 ggcttagggg gcgtagttgc gccgccaagt aataaaaaac cagttgtttc agtgtcttca 1800 tctgtgtctg ttaattcagg cgagagcatc acagtaacgg cttctgcaac cgatgcagat 1860 aacgatccac tgagctttag ctggagtgct gatagcgcgc tagtagtatc tggacaaaat 1920 acatcatcac tggttattaa tgcgccaaca gtgactacag atacacagta tgttgcaacc 1980 gttgcggtat cagatggtca agcaacagta aatcgtgatg ttgttgttaa tgttattgcg 2040 ccgacatcag gcggcgaaaa tacagcaccg agtgttaatg caattgctaa tgttagtgtt 2100 gaagaaggcg catcagcaag tgttgctgta gttgcaaacg atgcacaaaa cgatgcgctt 2160 acatatacgt ggacagtacc agcaggctta acgttagtgg gcagcggtgc aaatgtaagt 2220 attgaggcag gcgctgtaga tacagataca aacttcactg tttcagttgc agtaagtgat 2280 ggcgcattaa ctacaacgca aagctttagc gtaacagtga caaatggtga tactaccact 2340 ccaccaacag gagattggga tgcgagtgtt gcatacgttg gtggcgatgt cgtcacttat 2400 aacggcgttg aatataaagc aaagtggtgg actcaaggcg agcgtcctga tttaggtggt 2460 gcgtgggagg caacaacaca gcctacagat ggtacgggtg tcgaagtttg gcagccaacg 2520 gctatttata acagtggtga tgaagtttct tatcaaggta ataagtacca agctaaatgg 2580 tggactcaag ggaacgagcc aggctcaacc gatgtatggt tagcacttta a 2631 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaggaggtga tccanccrca 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gactcctacg ggaggcwgca g 21 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtattaccgc ggctgctg 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggattagata ccccggta 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tcacgcatgm tacaatgg 18 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gatatcgact gggagttccc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 catagaagtc gtaggtcatc 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 tcaactggta aactgatcac c 21 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tgatgctgac aatggtgac 19 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atgatagccg taagtctgtg c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tatgatgagc aagcacaagc 20

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 엑소키티나아제.
제1항에 있어서, 슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(KCTC 11415BP) 유래인 것을 특징으로 하는 엑소키티나아제.
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 엑소키티나아제 유전자.
제3항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항의 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
제3항의 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 제5항의 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물.
서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 엑소키티나아제 유전자가 숙주세포의 염색체상에 삽입되어 있거나, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 엑소키티나아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터가 숙주세포에 도입되어 있는 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 엑소키티나아제를 제조하는 방법.
슈도알테로모나스 이사첸코니 KOPRI 22718(KCTC 11415BP) 균주를 배양하는 것을 특징으로 하는 제1항의 엑소키티나아제를 제조하는 방법.
키티나아제를 이용하여 키틴 폴리머를 키틴 모노머 또는 키틴 올리고머로 분해하는 방법에 있어서, 상기 키티나아제로 제1항의 엑소키티나아제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.