KR100997735B1 - 갯벌 메타게놈 유래 신규 저온성 리파제 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갯벌 메타게놈 유래 신규 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase) 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 생산된 신규 저온성 리파제는 수용성 형태로 발현되므로 대량생산이 가능하고, 우수한 리파제 활성을 나타냄으로써 다양한 산업에 응용될 수 있다.

메타게놈, 저온성 리파제

Description

갯벌 메타게놈 유래 신규 저온성 리파제 및 이의 제조방법{NOVEL GENE ENCODING LOW TEMPERATURE ACTIVATED LIPASE DERIVED FROM TIDAL FLAT METAGENOME AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 갯벌 메타게놈 유래 신규 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

리파제(lipase)는 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스터(ester) 결합을 가수분해하는 효소로, 많은 종류의 동식물과 미생물이 생산하는 것으로 알려져 있으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 유전자 자체에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 높은 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 고유한 특성에 의해 폭넓게 이용되는 주요한 효소이다. 그러나 통상의 화학적 방법을 통해 에스테르화합물을 합성할 경우, 반응성이 상대적으로 낮고 비특이적 반응으로 인하여 광학특이적, 위치특이적인 제품 생산이 어려우며, 고온 고압에서 수행되므로 에너지가 많이 요구되고 부반응이 다수 일어날 수 있어 고순도의 정밀화학제품 생산에 어려움이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해 광학특이성, 위치특이성을 갖는 리파제 등을 이용하여 극복하고자 하는 노력이 있다. 또한, 리파제는 세제, 표백제의 첨가제로 연구돼 왔으나, 통상의 낮은 세정 온도하에서 충분한 활성을 지니는 리파제의 개발이 세제, 표백제로의 이용에 더욱 요구되고 있다.

상기 리파제를 포함한 신규 효소를 발굴하고자 하는 노력은 주로 배양이 가능한 미생물을 대상으로 이루어졌고, 이로부터 밝혀진 다양한 미생물 효소들이 산업적으로 이용되고 있다. 그러나 최근 많은 분자미생물 생태학의 연구들은 자연계에 존재하는 99%이상의 미생물들이 실험실에서 행해지는 전통적인 배양기법을 통해서는 분리 동정되지 않는다는 사실을 증명하였다(Amann et al., Microbiol. Rev. 59: 143-169, 1995; Hugenholtz and Pace, Trends Biotechnol. 14: 190-197, 1996; Ward et al., Nature 345: 63-65, 1990). 그에 따라 자연계로부터 배양 없이 직접적으로 추출한 모든 미생물의 유전체인 메타게놈(metagenome)을 이용하여 라이브러리를 만들어 그동안 배양되지 않아서 이용하지 못했던 많은 신규 유전자들을 발굴하고 그 유용 산물을 확보하고자 하는 새로운 연구가 진행되고 있다.

메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의된다. 일반적으로, 메타게놈 연구는 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하는 단계로 구성된다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하기 위한 방법으로, 확보한 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보를 얻기는 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다. 미국 위스콘신 대학 연구팀은 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 BAC(bacterial artificial chromosome) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들을 분리하였다(Gillespie et al ., Appl . Environ . Microbiol . 68: 4301-4306, 2002; Rondon et al., Appl . Environ . Microbiol . 66: 2541-2547, 2000). TIGR(The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 벡터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다.

이에 본 발명자들은 다양한 미생물이 존재하는 갯벌의 메타게놈 라이브러리로부터 신규 저온성 리파제 유전자를 분리하여 상기 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 후 상기 형질전환체로부터 생산된 단백질이 우수한 리파제 활성을 나타내며, 20도 이하의 저온에서도 효과적으로 활성을 나타냄을 확인하였다. 또한 수용성 형태로 효과적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 우수한 활성을 나타내는 신규 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase) 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터가 형질 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 재조합 저온성 리파제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

아울러, 1) 상기 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 저온성 리파제의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원 형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase) 활성을 갖는 하기 a 내지 c 중 어느 하나의 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다:

a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드;

b) 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드와 엄격한 조건에서 혼성되는 폴리뉴클레 오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

c) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 우수한 활성을 나타내는 신규 저온성 리파제의 발굴을 위해, 배양이 불가능한 미생물을 포함하는 갯벌 토양 샘플로부터 DNA를 추출하여 제작한 메타게놈 라이브러리를 대상으로 트리카프릴린(tricaprylin)을 효과적으로 분해하는 우수한 리파제 활성을 나타내는 콜로니를 탐색하였다. 상기 콜로니의 재조합 플라스미드를 분리하여 염기서열 분석한 결과, 서열번호 2로 기재되는 381개 아미노산[GenPept 등록번호 ACB11220(1,146개의 염기; 서열번호 1, GenBank 등록번호 EU515239)]으로 이루어지며 분자량이 약 42 kDa으로 예측되는 저온성 리파제의 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다(도 1 참조). 상기 저온성 리파제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 오셔노박터종 RED65(Oceanobacter sp. RED65)의 GenPept 등록번호 ZP_01306758 단백질과 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 리파제 유전자 집단과 상동성이 없는 것으로 보여 저온성 리파제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다(표 1 참조). 또한, 본 발명의 저온성 리파제는 글리신-X-세린-X-글리신(Gly-X-Ser-X-Gly)의 공통서열(consensus sequence) 내의 186번째 세린잔기(Ser), 278번째 아스파라긴산(Asp) 및 306번째 히스티딘(His)으로 이루어진 리파제에 보존되는 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있었다(도 2 참조).

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 서열번호 2로 기재되는 신규 저온성 리파제의 활성을 측정하고자, 우선, 상기 신규 저온성 리파제를 암호화하는 서열번호 1의 저온성 리파제 유전자를 벡터에 클로닝하고(도 4 참조), 상기 벡터를 대장균에 형질전환시킨 후, 상기 형질전환체로부터 생산된 저온성 리파제를 정제하였다. 상기 정제된 본 발명의 저온성 리파제를 SDS-PAGE 방법으로 확인함으로써 분자량이 약 42 kDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었으며, 본 발명의 저온성 저온성 리파제는 수용성 형태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이와 같이, 본 발명의 갯벌 메타게놈 유래 저온성 리파제는 우수한 활성을 나타내고 생산이 용이하므로, 상기 저온성 리파제 단백질은 유지의 전환뿐만 아니라 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 널리 활용될 수 있다.

또한, 본 발명의 리파제는 다음과 같은 특성을 나타낸다: pH 5.0 내지 11.0 범위에서 안정하며, pH 8.0에서 최적 활성을 나타내고(도 6 참조); 0℃-50℃까지 활성을 나타내고 30℃에서 최적활성을 나타내며(도 7 참조); 대부분 2가 금속 이온에 의해 활성이 증가되며(표 1 참조); 계면활성제에 의해 활성이 모두 저해되는 것을 확인하였다(표 2 참조). 또한 여러 파라-니트로페닐 에스터(p-nitrophenyl ester) 중에서 파라-니트로페닐 로레이트(p-nitrophenyl laurate, C12)에 대한 활성이 가장 높았으며, 이는 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)에 비해 그 활성이 약 10배 정도 증가한 것으로, 상대적으로 긴 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 본 발명의 단백질은 에스터라제가 아니라 리파제임을 알 수 있었다(도 8 참조).

여기서, "엄격한 조건하에서 혼성화되는 폴리뉴클레오티드"란 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열의 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 탐침자로서 사용하여 콜로니 혼성화 기술, 플라크 혼성화 기술, 서던(southern) 혼성화 기술 등에 의해 수득된, DNA 등의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 상기 혼성화 방법은, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning 제 3 판, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997] 등에 기재된 방법일 수 있다.

본원에 사용된 "엄격한 조건"이라는 용어는 낮은 엄격성 조건, 중간 엄격성 조건 또는 높은 엄격성 조건 중에서 임의로 선택될 수 있다. "낮은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 32℃에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5%(v/v) SDS, 50%(v/v) 포름아마이드이다. "중간 엄격성 조건"은, 예를 들어, 42℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5%(v/v) SDS, 50%(v/v) 포름아마이드이다. "높은 엄격성 조건"은, 예를 들어, 50℃ 에서의 5 x SSC, 5 x Denhardt 용액, 0.5%(v/v) SDS, 50%(v/v) 포름아마이드이다. 이들 조건하에서, 상동성이 더 높은, DNA 등의 폴리뉴클레오티드는 더욱 높은 온도에서 효율적으로 수득될 것으로 예상되지만, 혼성화 엄격성에는 온도, 탐침자 농도, 탐침자 길이, 이온세기, 시간, 염 농도 및 기타를 비롯하여 복수의 요인들이 연루되므로, 당업자는 유사한 엄격성을 구현하기 위해 이들 요인들을 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체 또는 단편을 Ni-nitrilotriacetic acid범위에 포함한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 아미노산 서열의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 아미노산 서열의 상동성을 가지며 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 한다. 그러나, 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 서열번 호 1의 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 포함한다. 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드란 80％ 이상, 바람직하게는 90％ 이상, 가장 바람직하게는 95％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 70% 이상의 서열 상동성을 가지며 암호화된 단백질의 동일한 생화학적 활성을 가진다면 본원 발명에 포함된다. 상술한 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩되나, 본 발명은 이에 제한되지 않고, 동일 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 단백질을 코딩할 수 있는 한, 서열번호 1의 염기서열과 실질적으로 동일한 다른 염기서열을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자에 의해 코딩될 수도 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 재조합 발현벡터의 제작 시에는, 상기 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모 터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파이지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 관심 단백질인 저온성 리파제가 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리카프릴린 등의 리파제 기질을 첨가함으로써, 별도의 선택마커 없이도 형질전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.

또한, 상기 재조합 발현벡터는 발현물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자에 작동 가능하도록 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 이때, 상기 분리정제용 태그는 GST, poly-Arg, FLAG, 히스티딘-택(His-tag) 및 c-myc 등이 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 히스티딘-택을 C-말단에 위치시켜 니켈-엔티에이(Ni-NTA, Ni-nitrilotriacetic acid) 컬럼을 이용하여 발현된 저온성 리파제를 정제하였다.

더 나아가, 본 발명의 재조합 발현벡터의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자와 분리정제용 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 생물의학과 정밀화학 분야에서 생체 촉매로 유용하게 활용되는 단백질로써, 정제용 태그에 의해 기능이 저하될 수 있으므로 제거되는 것이 바람직하다. 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다.

발명의 실시태양에서, 상기 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있고, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 사용된 경우에는 상기 폴리뉴클레오 티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 상기 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 분비 후 단백질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편이 생산될 수 있도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 재조합 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 신규 저온성 리파제를 대량 생산할 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 바람직하게, 상기 숙주세포는 대장균이며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 신규 저온성 리파제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제작하고(도 4 참조), 이를 대장균에 형질전환시켰다. 상기 형질전환체로부터 발현된 저온성 리파제는 트리카프릴린을 효과적으로 분해하여 우수한 리파제 활성을 나타냄을 확인하였으며, 상기 형질전환체를 2008년 2월 23일자로 한국생명공학연구원내 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11286BP로 기탁하였다.

아울러, 1) 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 저온성 리파제의 제조방법을 제공한다.

상기 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 N-말단에는 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결될 수 있고, 이로 인해 재조합 저온성 리파제의 정제 또는 원래 형태의 저온성 리파제의 수득이 가능할 수 있다. 즉, 재조합 저온성 리파제를 분리정제용 태그를 이용하여 정제한 후, 상기 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소를 처리하는 단계를 추가로 포함함으로써 원래 형태의 저온성 리파제를 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 가정용 또는 산업용의 의류 또는 식기세척용 세제 첨가물로 사용될 수 있다. 리파제는 지방 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스터(ester) 결합을 가수분해하는 효소로, 지방 오염물의 제거를 위하여 1980년대 후반부터 세제에 사용되어 왔다. 본 발명의 저온성 리파제는 약알칼리성인 세척 용수에서 활성이 유지될 수 있도록 활성 범위가 pH 5.0 내지 11.0이며, 바람직하게는 pH 8.0에서 최적활성을 나타내는 내알칼리성 단백질이므로(도 6 참조), 상기 결과를 바탕으로 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편은 지방 오염물의 제거를 위한 세제 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 저온성 리파제는 대부분의 2가 이온에 의해 활성이 증가하므로(표 1 참조), 상기 2가 이온에 의해 부가된 경도를 갖는 탈이온수 내에 혼합되어 사용될 수 있다. 상기 2가 이온에는 Ca²⁺ 또는 Mn²⁺ 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 포함하는 리파제 결핍에 의한 질환 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 상기 리파제 결핍에 의한 질환에는 식욕부진(anorexic states), 흡수불량(malabsorption), 체중감소(weight losses) 등이 있을 수 있다. 상기 약학적 조성물은 추가로, 리파제 촉진제를 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 염을 포함할 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로 국부, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있으며, 바람직한 제형은 주사제일 수 있다. 주사제는 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가 가능하고 피하주사, 근육내 주사 및 정맥 주사 등이 가능하다. 투여량은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 투여방법, 표적 세포, 발현정도 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 광학 분할제로서 이용하여 정밀화학품을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 정밀화학품은 특히 광학활성의 의약품일 수 있고, 이때 효소의 광학선택성을 증가시키기 위한 효소의 화학적 변형, 효소정제, 유기용매 처리, 반응조건 선택, 반응 용매 설계 등의 다양한 기술을 응용할 수 있다.

아울러, 본 발명의 저온성 리파제 및 이의 변이체 또는 이의 활성 단편을 유제품에 처리하는 단계를 포함하는 치즈의 제조방법에 사용될 수 있다. 상기 저온성 리파제는 치즈의 숙성 및 향미를 추가하는 등의 치즈 생산과 같은 식음료 산업에 이용될 수 있다. 미국 등록 특허 제 4,708,876 호에는 유제품을 락트산과 함께 배양시킨 후에 다양한 프로테아제, 펩티다제 및 리파제를 첨가하는 것을 포함한다. 상기 제 4,708,876 호 특허는 치즈 응유 대신에, 출발 물질로서의 우유로부터, 유장 부산물을 형성하지 않고 제조될 수 있는 치즈 가향 농축물을 기술한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 생산된 신규 저온성 리파제는 수용성 형태로 발현되므로 대량생산이 가능하고, 우수한 리파제 활성을 나타냄으로써 다양한 산업에 응용될 수 있다.

이하, 실시예 및 제제예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 메타게놈 라이브러리 구축

전라북도 부안금 새만금 간척지 갯벌에서 채취한 토양 시료 10 g을 50 ㎍/㎖의 프로테이나제(proteinase) K를 포함하는 동일부피의 DNA 추출용 완충액[100 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0, Sigma, USA) ; 100 mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid, Sigma, USA); 100 mM 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate, pH 8.0, Sigma, USA); 1.5 M 염화나트륨(NaCl, Junsei, Japan); 1%(w/v) CTAB(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, Sigma, USA)]에 현탁시킨 후, 음이온 계면활성제(sodium dodecyl sulfate, SDS, Sigma, USA)를 최종 2%(v/v)가 되게 첨가하여 65℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 그 후, 원심분리를 통해 획득한 상등액에 1.6 M 염화나트륨(NaCl)을 포함한 30%(v/v) 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 동일 부피만큼 첨가시켜 잘 섞어 주었다. 침전된 DNA는 원심분리를 통해 분리하여 TE 완충용액에 현탁하였고, 동일 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(phenol/chloroform/isoamyl alcohol)(25:24:1) 혼합액과 클로로포름/이소아밀 알코올(chloroform/isoamyl alcohol)(24:1) 혼합액을 첨가하여 두 번 추출하였다. 원심분리하여 획득한 상등액에 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 DNA를 침전회수하였다. DNA 침전물을 완전히 건조시켜 멸균수에 녹인 후 불순물을 완전히 제거하고, 약 23~48 kb 정도의 DNA 단편으로 부분 절단하기 위해 PFGE(pulse-field gel electrophoresis, Bio-Rad, USA)를 이용하여 전기영동하고 Gelase(Epicentre, USA)를 사용하여 겔 용출을 수행하였다. 정제된 DNA 단편들은 CopyControl fosmid 라이브러리 제작 키트(Epicentre, USA)를 사용하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였다.

라이브러리의 질을 검사하기 위해, 형질전환체들을 무작위적으로 선택하여 재조합 플라스미드를 추출하여 제한효소 처리한 후 전기영동으로 확인한 결과, 모두 재조합 플라스미드가 포함되어 있었으며, 삽입된 메타게놈의 평균 크기는 35 kb였다.

< 실시예 2> 리파제 활성을 가진 재조합 플라스미드의 탐색 및 분리

실시예 1에서 수득한 메타게놈 라이브러리로부터 리파제 유전자를 탐색하기 위해, 리파제에 의해 분해되는 트리카프릴린(tricaprylin; 이하, TCN)을 포함하는 배지에서 상기 메타게놈 라이브러리를 배양하였다.

구체적으로, 상기 메타게놈 라이브러리를 TCN 에멀젼[1%(v/v) TCN, Sigma, USA; 1 mM 염화칼슘(CaCl₂), Junsei, Japan; 0.5%(v/v) 아라비아 고무(Gum arabic), Sigma, USA]이 첨가된 영양 고체배지[1%(w/v) 트립톤(trypton), Difco, USA; 0.5%(w/v) 이스트 추출물(yeast extract), Difco, USA; 0.5%(w/v) 염화나트륨(NaCl), Junsei, Japan; 1.5%(w/v) 한천(agar), Junsei, Japan]에 도말하여 37℃에서 배양하였다. 이때, 리파제에 의해 트리카프릴린이 분해되어 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 트리카프릴린 분해능이 가장 우수한 콜로니로부터 재조합 플라스미드를 분리하여 pFosLipEH166으로 명명하였다.

< 실시예 3> 신규 리파제 유전자의 클로닝 및 염기 서열 분석

실시예 2에서 분리한 플라스미드 pFosLipEH166으로부터 신규 리파제의 유전자를 클로닝하고 염기 서열을 분석하였다.

<3-1> 신규 리파제 유전자의 클로닝

구체적으로, 플라스미드 pFosLipEH166을 Sau3AI 제한 효소로 절단한 다음, 포스파타제(calf intestinal phosphatase; TaKaRa, Japan)를 처리한 pUC19 벡터(Novagen, USA)에 삽입시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 상기 형질전환 균주를 엠피실린(ampicillin)이 첨가된 TCN 고체배지(1%(v/v) 트립톤, 0.5%(v/v) 효모추출액, 0.5%(v/v) NaCl, 1%(v/v) TCN, 1 mM CaCl₂, 0.5%(v/v) 아라비아 고무, 1.5%(v/v) 한천)에 도말하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하여 TCN을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 배양하여 플라스미드를 분리한 결과 2.2 kb 크기의 삽입체(insert DNA)를 포함한 5.9 kb 크기의 플라스미드를 확인하였고, 이를 pUC166으로 명명하였다. 아울러, pUC166을 동일한 방법으로 대장균 DH5α에 재 형질전환시킨 결과 생성된 콜로니들은 모두 리파제 활성을 나타냄을 확인하였다.

<3-2> 신규 리파제 유전자의 염기 서열 분석

실시예 3-1에서 수득한 pUC166의 염기 서열을 샷건 시퀀싱(shot-gun sequencing) 방법으로 Big Dye DNA Sequencing kit(AppliedBiosystems, USA)를 이 용하여 분석하였다. 상기 염기 서열은 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 ORF finder(//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)를 이용하여 전사해독프레임(open reading frame, ORF)을 동정하였고, 블라스트엑스(BlastX; www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 이용하여 전사해독프레임의 기능을 예측하였다.

그 결과, 서열번호 2로 기재되는 381개 아미노산(서열번호 1; 1,146개의 염기)으로 이루어지며 분자량이 약 42 kDa으로 예측되는 리파제의 ORF(open reading frame)를 찾을 수 있었다(도 1). 상기 ORF는 리파제 단백질 코딩 영역으로 예상되며, 상기 유전자를 리파제 LipEH166으로 명명하였고, NCBI에 등록하였다(GenPept 등록번호 ACB11220, GenBank 등록번호 EU515239).

<3-3> 신규 리파제 유전자의 상동성 분석

서열번호 2의 신규 리파제의 아미노산 서열을 BLAST 프로그램을 이용하여 GenBank 및 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 리파제 LipEH166은 오셔노박터종 RED65(Oceanobacter sp. RED65)의 GenPept 등록번호 ZP_01306758 단백질과 가장 높은 유사성을 나타내었으며, 이전에 보고된 리파제 유전자 집단과 상동성이 없는 것으로 보여 리파제를 암호화하는 신규한 유전자로서 확인되었다(표 1). 또한, 도 2에 나타난 바와 같이 본 발명의 리파제는 글리신-X-세린-X-글리신(Gly-X-Ser-X-Gly)의 공통서열(consensus sequence) 내의 186번째 세린잔기(Ser), 278번째 아스파라긴산(Asp) 및 306번째 히스티딘(His)으로 이루어진 리파제에 보존되는 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 갖고 있었다.

LipEH166과 유사한 단백질들

단백질 명	미생물 소스	GenBank 번호	동일 아미노산 비율/ 유사 아미노산 비율 (%)	e_value
LipEH166	메타게놈	EU515239
분비단백질 (Uncharacterized Secreted protein)	Oceanobacter sp. RED65	EAT12501.1	65/77	2e-143
분비단백질 (Uncharacterized Secreted protein)	Marinomonas sp. MED121	EAQ66139.1	58/73	2e-121
분비단백질 (Uncharacterized Secreted protein)	Clostridium acetobutylicum ATCC 824	AAK81489	34/52	5e-56

<3-4> 계통발생트리 ( phylogenetic tree ) 구축

실시예 3-3의 결과를 바탕으로, 아미노산 서열에 따라 분류된 8개 리파제 패밀리(family)에 속하는 44개의 리파제 아미노산 서열과 본 발명의 LipEH166의 아미노산 서열(서열번호 2)을 대상으로 레이저진 6.0 프로그램을(Lasergene 6.0, ClustalV method, DNASTAR Inc., USA) 이용하여 계통발생트리를 구축하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 LipEH166 및 이와 유사한 아미노산 상동성을 지니는 기능이 알려지지 않은 단백질은 다른 리파제 패밀리와 독립적인 리파제 패밀리임을 알 수 있었다.

< 실시예 4> 형질전환체의 제조

본 발명의 신규 리파제를 대량으로 생산할 수 있는 LipEH166 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 제조하였다(도 4).

구체적으로, 실시예 2의 방법으로 분리된 pFosLipEH166을 주형 DNA로 하고, 합성된 서열번호 3 및 4로 기재되고 각각 NdeI과 XhoI의 제한효소 절단부위를 가지는 프라이머쌍을 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다.

서열번호 3: 5' - CCGCTCGAGATAATTTTTGCGTTCAAACTGG - 3'(NdeI 제한효소 절단부위 포함)

서열번호 4: 5‘- GGAATTCCATATGATGCTAAGACAATTTCGAATTC - 3'(XhoI 제한효소 절단부위 포함)

상기 PCR 산물을 정제하여 NdeI과 XhoI의 제한효소로 절단한 후, 동일한 제한효소와 포스파타제(calf intestinal phosphatase)를 처리한 강력한 T7프로모터와 판독신호가 내재되어 있는 발현용 벡터 pET-22b(+)(Novagen, USA)의 제한효소 NdeI과 XhoI부위에 서열번호 1의 LipEH166 유전자를 클로닝하고(재조합벡터 pET22b(+)-LipEH166), 이를 대장균 C43(DE3)에 전자충격유전자전달(electroporation)을 수행하여 형질전환시켜 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-LipEH166을 제조하였고, 상기 균주를 한국생명공학연구원내 생물자원센터에 2008년 2월 23일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11286BP).

< 실시예 5> 리파제 의 생산

<5-1> 리파제 발현 및 정제

실시예 4에서 수득한 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-LipEH166을 앰피실린 (ampicillin, 100 ㎍/㎖)이 포함된 액체 영양 배지에서 600 ㎚에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양한 후, 최종 농도 0.5 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 배양액에 넣어 12시간 동안 추가로 배양하였다. 원심분리를 통해 대장균 C43(DE3)/pET22b(+)-LipEH166을 회수하여, 결합완충액[50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0), 500 mM NaCl, 10 mM 이미다졸(imidazole)]에 현탁시킨 후, 초음파 분쇄법으로 파쇄하였다. 이를 다시 원심분리하여 회수한 상층액만을 니켈-엔티에이(Ni-NTA: nitrilotriacetic acid; Qiagen, Germany) 컬럼에 가하여 이미다졸(imidazole) 농도 구배를 이용해 리파제를 용출시킨 후 투석농축하였다.

<5-2> 리파제 의 확인

실시예 5-1에서 정제한 단백질 농도는 나노드롭 스펙트로포토미터(Nanodrop Spectrophotometer, Nanodrop, USA)를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정한 후, 5×SDS(0.156 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5%(v/v) SDS, 37.5%(v/v) 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10%(v/v) SDS-PAGE 겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 시료를 전개한 다음 겔을 쿠마시 염색 방법으로 염색한 후 탈색하여 각각의 재조합 단백질의 발현량을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 본 발명의 리파제는 발현 12 시간 후 시료 속 단백질의 분자량이 약 42 kDa으로 효과적으로 생산되었음을 알 수 있었으며, 이는 리파제의 아미노산 배열로부터 추론된 분자량과 상당히 근접하여 이 단백질 밴드가 본 발명의 신규 리파제인 것을 확인할 수 있었다. 또한 본 발명의 리파제는 수용성 형태로 발현이 이루어지고 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 갯벌 메타게놈으로부터 분리한 리파제 의 특성 조사

실시예 5-1에서 정제한 리파제 LipEH166의 pH 및 온도 변화에 따른 효소활성, 다양한 탄소길이를 갖는 기질에 대한 특이성 및 다양한 금속이온과 계면활성제에 대한 영향을 측정하였다. 구체적으로, 효소활성 측정을 위한 반응액은 10 mM 파라-니트로페닐 에스테르(p-nitrophenyl ester) 기질 10 ㎕, 에탄올 40 ㎕, 50 mM 트리즈마 완충액(Tris-HCl, pH 8.0) 940 ㎕, 및 실시예 5-1에서 정제한 리파제 효소액 5 ㎕을 첨가하여 5분 또는 60분간 반응시키면서, 기질에서 분해되어 나오는 파라-니트로페놀(p-nitrophenol)을 405 ㎚에서의 흡광도 증가율로 측정하였다. 이때, 1 유닛(U)은 분당 1 μmol의 파라-니트로페놀을 가수분해하여 생산할 수 있는 효소의 양으로 정의하였다.

<6-1> pH 에 대한 리파제 의 특성

리파제 활성에 대한 pH의 영향을 조사하기 위해, pH 4 내지 12의 다양한 반응액에서 5분간 방치한 후 활성을 측정한 결과 pH 8.0에서 최대의 활성을 나타내었고(도 6a), 상기 다양한 pH에서 60분간 방치한 후 리파제의 잔존 활성을 측정한 결과 pH 5.0~11.0의 넓은 범위에서 안정한 것으로 나타났다(도 6b).

<6-2> 온도에 대한 리파제 의 특성

리파제 활성에 미치는 온도의 영향을 조사한 결과, 0 내지 70℃의 다양한 온도의 반응액에서 5분간 방치한 후 활성을 측정한 결과 30℃에서 최적 활성을 보였고(도 7a), 열에 대한 안정성을 조사하기 위해 각 온도에서 60분간 방치한 후 잔존 효소활성을 측정한 결과 50℃까지의 온도범위에서 그 활성이 유지되어 안정한 것으로 나타났다(도 7b). 특히, LipEH166은 기존의 널리 알려진 리파제와 다르게 20℃ 이하의 저온에서 활성이 상대적으로 높고, 안정성이 뛰어나 저온성 리파제임을 알 수 있다.

<6-3> 다양한 탄소길이에 대한 리파제 의 특성

다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 특이성을 알아보기 위하여, 상기 반응액의 파라-니트로페닐 에스테르를 C2 내지 C18[파라-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate, C2), 파라-니트로페닐 프로피오네이트(p-nitrophenyl propionate, C3), 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4), 파라-니트로페닐 카프로에이트(p-nitrophenyl caproate, C6), 파라-니트로페닐 카프릴에이트(p-nitrophenyl caprylate, C8), 파라-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate, C10), 파라-니트로페닐 로레이트(p-nitrophenyl laurate, C12), 파라-니트로페닐 미리스테이트 (p-nitrophenyl myristate, C14), 파라-니트로페닐 팔미테이트(p-nitrophenyl palmitate, C16), 파라-니트로페닐 스티어레이트(p-nitrophenyl stearate, C18)]의 기질로 대체하여 동일한 방법으로 리파제 활성을 비교하였다. 각각의 기질은 Sigma-Aldrich, USA에서 구입하였다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 여러 파라-니트로페닐 에스터(p-nitrophenyl ester) 중에서 파라-니트로페닐 로레이트(p-nitrophenyl laurate, C12)에 대한 활성이 가장 높았으며, 이는 파라-니트로페닐 부틸레이트(p-nitrophenyl butyrate, C4)에 비해 그 활성이 약 10배 정도 증가하였다. 따라서 상대적으로 긴 아실 사슬을 가진 기질을 더 잘 분해하는 LipEH166은 에스터라제가 아니라 리파제임을 알 수 있었다.

<6-4> 금속이온에 대한 리파제 의 영향

하기의 표 2에서와 같은 다양한 농도의 다양한 금속이온에 대한 리파제의 활성을 측정한 결과, 5 mM 칼슘이온(Ca²⁺)이나 5 mM 망간이온(Mn²⁺)에 의해 활성이 130%까지 증가하는 것을 확인하였다.

금속이온에 대한 리파제의 효소활성

금속이온	효소활성 상대치(%)			제조사
	1 mM	5 mM	10 mM	Junsei, Japan
염화칼슘(CaCl2)	112	132	109	Junsei, Japan
황산구리(CuSO4)	26	15	12	Junsei, Japan
황산니켈(NiSO4)	73	80	55	Junsei, Japan
황산아연(ZnSO4)	50	15	17	Junsei, Japan
황산망간(MnSO4)	108	98	101	Junsei, Japan
염화코발트(CoCl2)	80	89	76	Junsei, Japan
황산마그네슘(MgSO4)	107	118	103	Junsei, Japan
황산철(FeSO4)	77	95	21	Junsei, Japan

<6-5> 계면활성제에 대한 리파제 의 영향

하기의 표 3과 같은 다양한 농도의 다양한 계면활성제에 대한 리파제의 활성을 측정한 결과, 0.1%(v/v) 또는 1%(v/v) 계면활성제에 의해 활성이 모두 저해되는 것을 확인하였다.

계면활성제에 대한 리파제의 효소활성

계면활성제	효소활성 상대치(%)		제조사
	0.1%(v/v)	1%(v/v)	Junsei, Japan
트윈 20(Tween 20)	16	8	Junsei, Japan
트윈 40(Tween 40)	13	8	Junsei, Japan
트윈 60(Tween 60)	10	8	Junsei, Japan
트윈 80(Tween 80)	17	19	Junsei, Japan
트리톤 X-100(Triton X-100)	10	4	Sigma, USA
SDS	16	7	Sigma, USA
Na-타우로콜레이트(Na-taurocholate)	9	5	Sigma, USA
디옥시콜레이트(Deoxycholate)	23	16	Sigma, USA
CHAPS	16	1	Sigma, USA

이상 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 기술하였으나, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 기술자는 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 저온성 리파제 LipEH166의 염기서열과 아미노산 서열을 나타낸 도이다(*: 정지코돈).

도 2는 본 발명의 저온성 리파제 LipEH166의 아미노산 서열과 이와 유사한 리파제의 아미노산 서열사이의 상동성을 비교한 결과를 나타낸 도이다. ▼로 표시돼 있는 아미노산들은 잘 보존되어있는 리파제 특이적 세작용기 촉매(catalytic triad)를 나타낸 것이다.

도 3은 본 발명의 저온성 리파제 LipEH166과 기존에 알려진 여러 리파제 패밀리(family)로부터 선별된 여러 리파제와의 계통발생트리를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에 따른 갯벌 메타게놈 유래의 신규 저온성 리파제 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pET22b(+)-LipEH166의 모식도이다.

도 5는 갯벌 메타게놈 유래 저온성 리파제 유전자로 형질전환된 대장균에서 목적하는 42 kDa의 저온성 리파제의 정제를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:

레인 1: 분자량 표준 마커; 및,

레인 2: Ni-NTA 컬럼을 통해 최종 순수 정제된 저온성 리파제.

도 6은 pH에 따른 저온성 리파제의 활성과 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 7은 온도에 따른 저온성 리파제의 활성과 안정성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 저온성 리파제의 다양한 탄소 길이를 갖는 기질에 대한 분해활성을 나타낸 그래프이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel gene encoding low temperature activated lipase derived from tidal flat metagenome and preparation method thereof <130> 8P-03-47 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1146 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> uncultured bacterium <400> 1 atgctaagac aatttcgaat tctcttactg accctctcgg catgctttgt acttttctct 60 atgtctgcac aggcggcgga cactctggac tacggtctct actggtttga cggtaacaat 120 acctccgtaa aagcagtcga agccgacggc actgtaaaca acgtgccact caaatattac 180 gacccgtcca agccaaccat cgttcacttc cacggttggc agccgggagc tgccacccgt 240 ggagacggtt atgatagaga agacttccgt ttcgtgtggg gcgatgagga cgtgattacc 300 tctacctcct ggaaaaacaa ggggtggaac attgcctatt tttactggga ccagtttgct 360 gacgaatccg aagtaaaaga cgctgaagcc aagatgtgga ccgccaatgg cccacgtggc 420 atgcgctaca aactgaaaga cggttcatac agcacgcagt tctcacccaa caaatcggtc 480 ggtcagattg cgtttgaaca ggtaactgct gcactggcgg gcaacacatc gcactacgtt 540 cgactgtcag gccactcact tggcaaccaa ttggctacca tcgtggcttc caaaatcagc 600 gatgcagtgt acgcaggttc cgtgggcaac aatgtcacgg tcgatcgcct ggagctgctc 660 gatccattct ggtcagccga tggcaaagcc taccttggcg atgccaacgg tgatggcgct 720 aacgactggg tcggcgagcg cactcgctgg aacatcgaaa cactgatcca gcgtcacaac 780 ctgccagtta cctggtacaa atcctccggt atccaggatg cctgggtcgg cgacaggaac 840 actgaactgg agggcatcgt caccttcatc cataaccgtt tctggtacct cgcttcagcc 900 gattatctga acaagcataa tcatgttgtt ccctggtact tccgctccat ggcctcagcc 960 gcgcccgaag aggtcaccat caactggtgg aaccagcgca ctcaaacagg aaaagacgcc 1020 gccagcgctg ccaccgacga cggacgaatt cgcaacatga tgggtgacac ctatcactgg 1080 gatcaggtcg aaggccgcta cacggcagat ccgcaagacg accagtttga acgcaaaaat 1140 tattaa 1146 <210> 2 <211> 381 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> uncultured bacterium <400> 2 Met Leu Arg Gln Phe Arg Ile Leu Leu Leu Thr Leu Ser Ala Cys Phe 1 5 10 15 Val Leu Phe Ser Met Ser Ala Gln Ala Ala Asp Thr Leu Asp Tyr Gly 20 25 30 Leu Tyr Trp Phe Asp Gly Asn Asn Thr Ser Val Lys Ala Val Glu Ala 35 40 45 Asp Gly Thr Val Asn Asn Val Pro Leu Lys Tyr Tyr Asp Pro Ser Lys 50 55 60 Pro Thr Ile Val His Phe His Gly Trp Gln Pro Gly Ala Ala Thr Arg 65 70 75 80 Gly Asp Gly Tyr Asp Arg Glu Asp Phe Arg Phe Val Trp Gly Asp Glu 85 90 95 Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Trp Lys Asn Lys Gly Trp Asn Ile Ala 100 105 110 Tyr Phe Tyr Trp Asp Gln Phe Ala Asp Glu Ser Glu Val Lys Asp Ala 115 120 125 Glu Ala Lys Met Trp Thr Ala Asn Gly Pro Arg Gly Met Arg Tyr Lys 130 135 140 Leu Lys Asp Gly Ser Tyr Ser Thr Gln Phe Ser Pro Asn Lys Ser Val 145 150 155 160 Gly Gln Ile Ala Phe Glu Gln Val Thr Ala Ala Leu Ala Gly Asn Thr 165 170 175 Ser His Tyr Val Arg Leu Ser Gly His Ser Leu Gly Asn Gln Leu Ala 180 185 190 Thr Ile Val Ala Ser Lys Ile Ser Asp Ala Val Tyr Ala Gly Ser Val 195 200 205 Gly Asn Asn Val Thr Val Asp Arg Leu Glu Leu Leu Asp Pro Phe Trp 210 215 220 Ser Ala Asp Gly Lys Ala Tyr Leu Gly Asp Ala Asn Gly Asp Gly Ala 225 230 235 240 Asn Asp Trp Val Gly Glu Arg Thr Arg Trp Asn Ile Glu Thr Leu Ile 245 250 255 Gln Arg His Asn Leu Pro Val Thr Trp Tyr Lys Ser Ser Gly Ile Gln 260 265 270 Asp Ala Trp Val Gly Asp Arg Asn Thr Glu Leu Glu Gly Ile Val Thr 275 280 285 Phe Ile His Asn Arg Phe Trp Tyr Leu Ala Ser Ala Asp Tyr Leu Asn 290 295 300 Lys His Asn His Val Val Pro Trp Tyr Phe Arg Ser Met Ala Ser Ala 305 310 315 320 Ala Pro Glu Glu Val Thr Ile Asn Trp Trp Asn Gln Arg Thr Gln Thr 325 330 335 Gly Lys Asp Ala Ala Ser Ala Ala Thr Asp Asp Gly Arg Ile Arg Asn 340 345 350 Met Met Gly Asp Thr Tyr His Trp Asp Gln Val Glu Gly Arg Tyr Thr 355 360 365 Ala Asp Pro Gln Asp Asp Gln Phe Glu Arg Lys Asn Tyr 370 375 380 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ccgctcgaga taatttttgc gttcaaactg g 31 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 ggaattccat atgatgctaa gacaatttcg aattc 35

Claims (9)

1. 하기 a 또는 b의 폴리펩티드로 구성된 저온성 리파제(Low-temperature activated lipase):

   a) 서열번호 1로 기재되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드; 및,

   b) 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
2. 서열번호 1로 기재되는 저온성 리파제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
3. 삭제
4. 제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터.
5. 제 4항의 재조합 발현벡터가 숙주세포에 형질 도입된 형질전환체.
6. 제 5항에 있어서, 상기 형질전환체는 기탁번호 KCTC 11286BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
7. 1) 제 2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;

   2) 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,

   3) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 단백질의 발현을 유도하고 이를 수득하는 단계로 구성되는 재조합 저온성 리파제의 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, 단계 1)의 폴리뉴클레오티드의 N-말단에 분리정제용 태그를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위가 추가로 연결되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 재조합 저온성 리파제에 제 8항의 단백질 절단효소 인식부위를 절단할 수 있는 단백질 분해효소를 처리하여 원래 형태의 저온성 리파제를 수득하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

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