KR100449316B1

KR100449316B1 - 신규한 에스터라제, 및 이를 생산하기 위한 바실러스 니아시니 이엠001

Info

Publication number: KR100449316B1
Application number: KR10-2001-0067072A
Authority: KR
Inventors: 이태석; 나현섭; 박민순; 육진수; 이완희; 오태광; 김형권
Original assignee: 주식회사 엔지켐
Priority date: 2001-10-30
Filing date: 2001-10-30
Publication date: 2004-09-18
Also published as: KR20030035141A

Abstract

본 발명은 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 균주가 생산하는 신규 에스터라제 효소와, 상기 에스터라제를 암호화하는 유전자 및 유전자를 암호화하는 대장균을 이용한 에스터라제의 대량 생산방법에 관한 것으로서, 에스터라제를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 (KCTC 0965BP) 및 형질전환된 대장균E. coliBL21(DE3)/pEST54 (KCTC 10071BP) 및 그 유전자를 제공한다.

Description

신규한 에스터라제, 및 이를 생산하기 위한 바실러스 니아시니 이엠001 {Novel esterase, and Bacillus niacini EM001 for producing the esterase}

본 발명은 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 유래의 신규 에스터라제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유리 지방산의 생산, 지방의 트랜스에스테르화, 에스테르 및 펩타이드의 합성에 유용한 신규한 에스터라제와, 이를 생산하기 위한 바실러스 니아시니 EM001 및 그 형질 전환체에 관한 것이다.

에스터라제는 에스테르 결합을 분해하여 저분자의 지방과 알코올을 만드는 효소로서, 기질 특이성, 광학활성 특이성 등의 독특한 특성을 갖고 있기 때문에, 트랜스에스테르화, 유리 지방산의 생산, 유용한 에스테르 및 펩타이드의 합성을 촉매하는 산업적으로 매우 중요한 효소이다. 현재까지 많은 종류의 동물, 식물, 미생물이 에스터라제를 생산하는 것으로 알려져 있으며, 에스터라제를 생산하는 미생물, 이들 미생물의 유전자, 및 이들에 의하여 생산된 에스터라제의 생화학적 특성에 대한 많은 연구가 이루어지고 있다. 예를 들면, 일본 특허공개공보 소64-67190호는 에스터라제를 생산하는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescensIF03018)의 유전자, 염기서열 및 아미노산 서열을 개시하고 있으며, 미국 특허 5,308,765호 및 5,482,847호는 에스터라제를 생산하는 슈도모나스 퓨티타(Pseudomonas putitaFERM BP-3846)의 유전자를 클로닝하여 염기서열 및 이로부터 추정되는 아미노산 서열을 개시하고 있으며, 또한 형질전환된 대장균에 의한 에스터라제 발현 기술과 이를 통해 생산된 재조합 에스터라제의 물리적 특성을개시하고 있다. 또한 대한민국 특허 공개 제2001-44879호는 광학 활성 카르복실산을 제조할 수 있는 에스터라제를 생산하는 슈도모나스 이어루지노사(Pseudomonas aeruginosa)와, 그 유전자 및 에스터라제의 아미노산 서열 등을 개시하고 있다.

본 발명자들은 식품산업에서 안심하고 사용할 수 있도록, 비독성 바실러스로부터 유래하는 신규한 에스터라제를 찾고자 연구한 결과, 토양으로부터 분리한 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) 유사 균주가 에스터라제를 생산함을 발견하고, 발견된 균주를 분리, 동정하고, 분리된 균주로부터 에스터라제를 대량 생산하는 방법을 개발함으로서 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 에스테르 결합을 효과적으로 분해할 수 있으므로 유리 지방산의 생산, 트랜스에스테르화, 에스테르 및 펩타이드의 합성에 유용하게 사용될 수 있는 신규한 에스터라제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 에스터라제를 생산하기 위한 비독성의 신규한 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 에스터라제를 발현하는 유전자를 밝혀내고, 이를 이용하여 재조합 플라스미드를 제조하고, 제조된 재조합 플라스미드를 이용하여 형질 전환체를 제조함으로서, 상기 에스터라제를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 바실러스 니아시니 EM001 균주의 균체 지방산 프로파일.

도 2는 본 발명에 따른 바실러스 니아시니 EM001 균주의 전자 주사 현미경 사진.

도 3은 본 발명에 따라 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 에스터라제를 대량으로 생산하기 위한 재조합 플라스미드를 제조하는 과정을 보여주는 모식도.

도 4는 본 발명에 따라 대장균에서 대량 생산된 에스터라제의 SDS 전기영동 분석결과를 보여주는 사진.

도 5a 및 도 5b는 본 발명에 따른 에스터라제에 대한 온도 및 pH의 영향을 도시한 그래프.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에스터라제를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 (KCTC 0965BP) 및 형질전환된 대장균E. coliBL21(DE3)/pEST54 (KCTC 10071BP)을 제공한다.

본 발명은 또한 서열 목록 2에 기재되어 있는 아미노산 서열을 가지는 에스터라제, 및 서열 목록 1에 기재되어 있는 염기서열을 가지는 에스터라제 유전자을 제공하며, 상기 에스터라제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 상기 플라스미드로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 대전 주변 토양의 시료로부터 트리부티린(tributyrin)을 분해할 수 있는 에스터라제를 생산하는 바실러스 균주를 탐색하고, 선별하여신균주를 얻었다. 이를 상세하게 설명하면, 배지에 기질로 트리부티린을 첨가하고, 국내 대전 근교의 토양 등으로부터 얻어진 미생물종들을 37℃에서 배양하였으며, 트리부티린의 에스테르를 가수분해하여 배지표면에 투명환을 형성하는 콜로니를 분리하여 본 발명에 따른 에스터라제를 생산하는 균주를 최종 선별하였다. 얻어진 신균주는 그람 양성의 간균 형태로 내생포자를 형성하고, 카탈라제 활성을 가지고 있으며, 글루코스를 산화하므로, 균의 형태학적 및 생화학적 특성은 바실러스 니아시니(Bacillus niacini)와 유사하였다. 상기 신균주를 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001로 명명하여, 대한민국 균주기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자원센터에 2001년 2월 19일 기탁하여 기탁번호 KCTC 0965BP를 부여받았다.

또한, 상기 신균주가 생산하는 에스터라제를 암호화하는 유전자를 클로닝하고, 이러한 염기 배열로부터 아미노산 서열을 유추한 결과, 상기 신균주는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)가 생산하는 에스터라제와 39%만의 상동성 만을 갖는 신규한 에스터라제를 생산함을 확인하였다. 상기 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001에 의하여 생산되는 에스터라제의 특성을 조사한 결과, 45℃에서 최적 효소 활성을 보였고, 65℃이상에서는 효소 활성이 급격히 감소되었으며, 효소 활성의 최적 pH는 9-10이며, pH 4에서 11까지의 넓은 범위에서 안정하였다. 상기 효소는 단백질 가수분해 효소 저해제로 사용되는 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride: PMSF), 에틸렌디아민테트라 아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA)에 의하여 활성이 저해되지 않았으며, 또한 대부분의 금속 이온에 대하여도 활성이 저해되지 않았다. 또한, 계면활성제의 영향을 살펴본 결과 SDS에 의해서 가역적으로 활성이 저해되었고, Triton X-100같은 계면활성제에 의해서는 저해를 거의 받지 않았다. 이와 같은 에스터라제를 암호화하는 유전자 및 아미노산 시퀀스를 동정하여 서열 목록 1 및 2에 각각 나타내었으며, 이를 미국 Gene Bank에 수탁번호 AF417207로 등록하였다.

이와 같은 신규한 에스터라제의 산업적 대량 생산을 위해 에스터라제 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드(pEST54)를 제조한 후, 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균E. coliBL21(DE3)/pEST54을 제조하여, 이를 유전자 은행에 기탁하여 기탁번호 KCTC 10071BP를 부여받았다. 현재 일반적으로 사용되고 있는 에스터라제의경우, 화학촉매에 비하여 가격이 높기 때문에, 일부 고부가가치의 물질 전환을 제외하고는 사용이 어려운 실정을 고려하면, 본 발명에 따른 형질전환된 대장균주를 이용하여 에스터라제를 대량 생산함으로서 가격 경쟁력을 확보할 수 있다.

이하, 다음의 실시예를 통하여 본 발명에 따른 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 유래의 신규 에스터라제, 상기 에스터라제를 암호화하는 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드, 상기 재조합 플라스미드를 포함하는 형질 전환체와 상기 형질 전환체에 의한 에스터라제의 생산에 대하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>에스터라제 생산 균주의 분리 및 명명

LB배지(트립톤 1%, 효모 엑기스 0.5%, 소금 0.5%, pH 7.0)에 기질로 트리부티린 0.5%를 첨가하고, 국내 대전 근교의 토양 등으로부터 얻어진 미생물종들을 37℃에서 배양하였으며, 트리부티린의 에스테르를 가수분해하여 배지표면에 투명환을 형성하는 콜로니를 1차 분리하였다. 1차 분리된 콜로니를 상기와 동일한 조성의 선별배지에서 다시 배양하여 투명환의 크기가 큰, 즉 기질의 분해력이 높은 콜로니를 2차 분리하였다.

상기 균주의 정확한 종을 확인하기 위하여 에이피아이 50씨에치비(API 50CHB) 검정시험을 실시한 결과, 하기 표 1과 같은 결과를 얻었으며, 상기 균체의 균체 지방산을 가스크로마토그래피(도 1) 및 전자현미경 사진(도 2) 분석한 결과,균체는 2-4㎛ 크기의 간균형태로 내생포자를 형성하고 있음을 확인하였다.

탄소원	생육여부	탄소원	생육여부
글리세롤	+	살리신	-
에리쓰리톨	-	셀로비오스	+
디-아리비노스	-	말토스	+
엘-아라비노스	-	락토스	+
리보오스	-	멜리비오스	+
디-자이로스	+	수크로스	+
엘-자이로스	-	트레하로스	+
아데니톨	-	이눌린	-
베타-메틸-디-자이로사이드	-	멜레지토스	-
갈락토스	+	라피노스	-
글루코스	+	전분	-
프럭토스	+	글리코겐	-
만노스	+	자이리톨	-
소보스	-	젠티오비오스	-
람노스	-	디-투라노스	-
둘시톨	-	디-릭소스	-
이노시톨	-	디-타가토스	-
만니톨	+	디-푸코스	-
솔비톨	-	엘-푸코스	-
알파-메틸-디-만노사이드	-	디-아라비톨	-
알파-메틸-디-글루코사이드	+	엘-아라비톨	-
엔-아세틸글루코민	+	글루코네이트	-
아미그달린	+	2-케토글루코네이트	-
알부틴	-	5-케토그루코네이트	-
에스쿨린	+

최근에 균 동정에 가장 신뢰성 있는 자료로 이용되는 16S rRNA에 대한 배열조사를 실시하여 얻어진 DNA 염기 배열을 이용하여 다른 바실러스종과의 상동성을 조사한 결과, 신균주는 바실러스(Bacillus niacini)와 99%의 상동성을 보였으며, 바실러스 슈도메가테리움(Bacillus pseudomegaterium)과 98%, 바실러스 푸마리오리(Bacillus fumarioli)와 97%, 바실러스 벤조에보란스(Bacillus benzoevorans), 바실러스 피루무스(Bacillus firumus), 바실러스 프렉서스(Bacillus flexus)와 96%, 바실러스 렌투스(Bacillus lentus)와 95%의 상동성을 보였으므로, 상기 신균주를 바실러스 니아시니(Bacillus niacini)로 동정하였다. 상기 신균주를 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001로 명명하였으며, 한국생명공학연구원 내 유전자원센터에 기탁번호 KCTC 0965BP로 기탁하였다.

<실시예 2>에스터라제 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열 결정

바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 균의 염색체 DNA를 제한 효소HindIII로 완전히 자른 후, 동일한 제한 효소로 자르고 포스파타제 (calf intestinal phosphatase)로 처리한 벡터 pUC19와 함께 연결(ligation)시켜 대장균E. coliXL1-Blue에 형질전환하였다. 이것을 암피실린(ampicillin)을 첨가한 트리부티린 평판배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl, 1% 트리부티린(TBN), 1 mM CaCl₂, 0.5% 아라비아검(gum arabic), 1.5% 아가(agar))에 도말하고, 37℃에서 24시간 배양하여 트리부티린을 분해하여 투명환을 형성하는 콜로니를 찾았다. 이것을 배양하여 플라스미드 DNA를 분리한 결과 3.4 kb 크기의 외래(insert) DNA를 포함한 6.0 kb 크기의 플라스미드를 확인하고 pHIII로 명명하였다. pHIII을E. coliXL1-Blue에 재형질 전환시킨 결과 생성된 콜로니의 100%가 에스터라제 활성을 나타내었다.

pHIII의 3.4 kb 크기의 외래 DNA의 염기서열분석은 M13 프라이머(primer), 역프라이머(reverse primer)를 이용하여 자동 서열 분석 시스템(automatic sequencing system)으로 서열분석(sequencing)을 하였다. DNASTAR 프로그램을 이용하여 1,488개의 염기 (495개 아미노산)로 이루어진 에스터라제의전사해독틀(open reading frame: ORF)를 찾았으며 이를 서열 목록 1(염기) 및 서열 목록 2(아미노산)에 각각 나타내었다. ORF는 495개의 아미노산으로 분자량이 54,098인 에스터라제로 구성되었으며, 미국 Gene Bank에 수탁번호 AF417207로 등록하였다.

상기 에스터라제는 BLAST 프로그램을 이용하여 SWISSPROT에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 바실러스 서틸리스 (Bacillus subtilis)가 생산하는 에스터라제 (PNBCE)의 아미노산 서열과 39%의 상동성만이 있었으며, Gene Bank에 있는 아미노산 서열과 비교 분석한 결과, 바실러스 써모카테눌라투스(Bacillus thermocatenulatus)가 생산하는 리파제 (BTL2)와는 23개의 아미노산이 다른 것으로 나타났다. 기타 기존의 에스터라제와 본 발명에 따른 에스터라제의 아미노산 서열의 상동성 비교는 표 2에 나타낸 바와 같다. 이와 같은 결과로부터 본 발명에 따른 에스터라제는 종래의 것과는 다른 신규한 것임을 알 수 있었다.

에스터라제	아미노산 서열상의 상동성 (%)
파라나이트로벤질 에스터라제(p-Nitrobenzyl esterase)	39
싸이오에스터라제(Thioesterase)	33
펜메디팜 하이드롤라제(Phenmedipham hydrolase)	33

<실시예 3>에스터라제의 대량생산을 위한 재조합 벡터의 개발

바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 에스터라제를 대량으로 생산하기 위한 대량 생산용 재조합 플라스미드의 제조공정의 모식도를 도 3에 도시하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 에스터라제 유전자를 포함하는 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 염색체 DNA를 템플레이트(template) DNA로 하고, 합성된 2개의 프라이머(서열목록 3 및 4)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(Polymer chain reaction: PCR)을 수행하였다. 합성된 DNA 양끝을 제한효소NdeI과HindIII으로 자른 후, 동일한 제한효소로 처리된 대량 생산용 벡터 pET-22b(+)와 함께 연결(ligation)시킴으로써, 대량 생산용 재조합 플라스미드 pEST54를 개발하였다.

재조합 플라스미드 pEST54에는 강력한 T7 프로모터(promotor)와 판독 신호가 내재되어 있어서 T7 RNA 폴리머라제(polymerase) 유전자를 갖고 있는E. coliBL21(DE3)을 숙주로 사용하는 경우 원하는 에스터라제를 대량 생산할 수 있다.

<실시예 4>대장균에서의 에스터라제의 대량 생산

재조합 플라스미드 pEST54를 지니는E. coliBL21(DE3) 균을 암피실린 100 ㎍/㎖이 포함된 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출액, 0.5% NaCl)플라스크에서 OD_600nm가 0.5으로 될 때까지 배양한 후, IPTG를 최종농도 1mM이 되도록 배양액에 넣으면, 세포 내 에스터라제의 양이 급격하게 증가한다. IPTG를 가한 후 균을 배양하면서 시간별로 세포 내 에스터라제의 활성을 측정한 결과, 5시간 후에는 세포 내 에스터라제의 양이 세포 추출액의 리터당 450units까지 증가하게 되었으며, 도 4의 SDS 전기영동 분석결과(X축은 정제시 용출 순서)에 나타난 바와 같이, 분자량54,000 위치에서 주 밴드가 나타났다.E. coliBL21(DE3)/pEST54 균이 생산하는 에스터라제는 트리부티린 평판 배지 상에서는 트리부티린을 분해하여 투명환을 형성하므로 활성을 감지할 수 있었다. 여기서, 상기 에스터라제의 활성은 일정한 pH에서 합성기질인 p-니트로페닐 카프릴레이트(p-nitrophenyl caprylate)가 효소에 의해 가수분해되어 생성되는 p-니트로페놀(p-nitrophenol)의 양을 405nm에서 흡광도를 측정하여 계산하였으며, 효소 1unit는 분당 1μ㏖의 p-니트로페놀(p-nitrophenol)을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

<실시예 5>에스터라제의 분리 정제 방법

E. coliBL21(DE3)/pEST54균이 대량 생산한 에스터라제를 다음과 같이 순수 분리하였다. 50 mM의 Tris-HCl (pH 7.5) 완충액에 있는E. coli균체를 초음파 분쇄법으로 파쇄한 후, 원심분리하여 얻은 상층액을 니켈 컬럼에 가하여 에스터라제를 순수 분리하였으며, 이때의 전체 단백질양(total protein), 단백질 활성(total activity), 상대활성(specific activity), 정제도, 회수율(Recovery) 등을 표 3에 나타내었다. 순수 분리된 신규 에스터라제의 p-니트로페닐 카프릴레이트(p-nitrophenyl caprylate)에 대한 비활성은 6.3 units/mg 였으며, 재조합 플라스미드를 가진 균주에 포함된 전체단백질을 1로 보았을 때 정제과정을 통하여 에스터라제 효소가 차지하는 비율(정제도)은 1.26배이므로, 니켈 칼럼에 의하여 에스터라제 효소의 순도가 증가함을 알 수 있다.

단계	전체 단백질(mg)	단백질 활성(U)	상대 활성(u/mg)	정제도(fold)	회수율(%)
세포추출물	90	450	5	1	100
니켈 칼럼	60	378	6.3	1.26	84

순수 분리한 신규 에스터라제의 특성을 다음과 같이 조사하였다.

<실험예 1>신규 에스터라제 효소의 특성 실험

순수 분리된 에스터라제에 대해 스펙트로포토미터 에세이 방법으로 효소 작용 온도 및 pH의 영향을 조사하여 도 5a 및 도 5b에 각각 나타내었다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 온도의 경우 45℃에서 최적 활성을 보였고, 65℃ 이상에서는 효소활성이 급격히 감소되었다. 에스터라제의 열안정성을 측정하기 위해 각 온도에서 30분간 방치한 후 45℃에서 효소활성을 측정한 결과 40℃까지 안정하였다. 도 5b에 도시한 바와 같이, pH를 달리하면서 에스터라제 활성을 측정한 결과 최적 pH가 9-10으로 나타났으며, 여러 가지 pH에서 14시간 동안 방치한 후 에스터라제의 잔존 활성을 측정한 결과 pH 4 내지 11까지의 넓은 범위에서 안정한 효소활성을 나타냄을 알 수 있다.

이 효소에 대한 여러 가지 단백질 가수분해 효소 저해제로 사용되는 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride: PMSF), 에틸렌디아민테트라 아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA)의 영향을 살펴본 결과 활성이 거의 저해 받지 않았다. 또한 여러 가지 금속 이온의 영향을 살펴본 결과 대부분의 이온에 활성이 저해되지 않았다. 한편 계면활성제의 영향을 살펴본 결과 SDS에의해서 가역적으로 활성이 저해되었고, Triton X-100같은 계면활성제에 의해서는 거의 저해되지 않았다.

<실험예 2>신규 에스터라제를 이용한 합성기질의 분해

표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 5에 따라 생산한 효소는 p-니트로페닐 아세테이트(p-nitrophenyl acetate), p-니트로페닐 카프릴레이트 (p-nitrophenyl caprylate), p-니트로페닐 카프레이트(p-nitrophenyl caprate), p-니트로페닐 라우레이트(p-nitrophenyl laurate) 보다 p-니트로페닐 프로피오네이트(p-nitrophenyl propionate), p-니트로페닐 부티레이트 (p-nitrophenyl butyrate), p-니트로페닐 카프로에이트 (p-nitrophenyl caproate)에 대한 가수 분해능이 특히 우수하였다.

합성기질	상대 가수분해력 (%)
p-니트로페닐 아세테이트	68
p-니트로페닐 프로피오네이트	77
p-니트로페닐 부티레이트	77
p-니트로페닐 카프로에이트	100
p-니트로페닐 카프릴레이트	27
p-니트로페닐 카프레이트	22
p-니트로페닐 라우레이트	4.5

상술한 바와 같이, 본 발명은 신규 에스터라제를 생산하는 바실러스 니아시니 (Bacillus niacini) EM001 균주와 에스터라제를 암호화하는 유전자 및 대장균에서의 대량 생산법과 대량 생산된 에스터라제의 응용에 관한 것으로서, 본 발명에 따르는 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 균주가 대량 생산하는 신규 에스터라제는 40℃까지 안정하고 45℃에서 최적활성을 보여 여러 가지 에스테르와 펩타이드의 합성 등에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

<110> ENZY CHEM CO., LTD <120> Novel esterase, Bacillus niacini EM001 and transgenic microorganism for producing the esterase <130> pdez237 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1488 <212> DNA <213> Bacillus niacini EM001 <400> 1 atgactaaaa cgattgttgg aagcgtttac ggtaaattac agggggaaca agtcgatggt 60 gtctgttcat ggaaaggggt tccatacgct aagccgcctg ttggggcact tcgattccgt 120 gctccagagc gaccagattc atgggagggt gttcgacaag caacatcttt ttctcctgtt 180 gcgcctcaaa cacaaagaga aatcatggag tttttcggaa atgatatctc gaatatgaat 240 gaggattgtc tgtacttgaa tgtttggtca cctggagctg atgacaaaaa acgtcctgtt 300 atggtttgga ttcacggagg tgcctttgta tcaggatccg gctcgagcag ttggtatgac 360 ggagcgtcct ttgctgcaca aggtgatgtt gtcgtagtaa cgattaatta ccgcctcggg 420 atattaggct ttttgcacct tggtgaaatc ggtggagaag aatatgccac ttctggaaac 480 tgcggtattc ttgatcaggt agctgctttg caatgggtgc aggaaaatat tgcatctttt 540 ggcggggatc cgaacaatgt aacggtcttt ggagaatcag caggtgcaat gagcattgga 600 gtcttgctag gattcccttc tgcacagggt cttttccata atgctatttt acaaagtggt 660 gcggcagcta atgtccattc ttcggaaacc gctactaaag ttgctggaca tctattagct 720 gctttacaag tcgaacctac gaatctatcc aaattagagg aattgtcagt ggagcagtta 780 attcaagtgg ccgatcttgt ccctccgatg agcttaggtc ctgtaatcga tggagtatct 840 ctgccgaaac atcctcaaga agcgatcgcg gatggatcag caaaggatgt ttctatcctg 900 gtaggtacaa acaaagatga atacaatatt ttcagtgtgt ttgaccctga atggaagaat 960 gcggatgaag caaaggttac tgctctgttt gaaaaaacat ttggaccttt agtgcaggtt 1020 atttcaaagt ttatccctgg ggggctaaat caagaccttt ttaataaatt gcttacagat 1080 acaatattta ccaatcctgc acaaaaactg gctgagttgc aggtgaatca gggtacgcct 1140 gtttggatgt accgctttga ttgggagaca ccagtgtttg gtggggcatt aaaatcgacg 1200 cacgcgttag agattccatt tgtttttaac actctaagaa cgcctaatac agaaaacttt 1260 acgggatctt ctccagagcg ccaacagata gcagatcaaa tgcaccagag atggatcaac 1320 tttgccaaga gcggtcatcc aaattcagac agactcctgg aatggccaag ctatgatatg 1380 aataatcgct ccacgatgat ttttaataat gagagtatag tggttaatga tccaaatcgt 1440 gaagatcgat taaaatggga acaattatcc atggtgatga aagggtag 1488 <210> 2 <211> 495 <212> PRT <213> Bacillus niacini EM001 <400> 2 Met Thr Lys Thr Ile Val Gly Ser Val Tyr Gly Lys Leu Gln Gly Glu 1 5 10 15 Gln Val Asp Gly Val Cys Ser Trp Lys Gly Val Pro Tyr Ala Lys Pro 20 25 30 Pro Val Gly Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Glu Arg Pro Asp Ser Trp 35 40 45 Glu Gly Val Arg Gln Ala Thr Ser Phe Ser Pro Val Ala Pro Gln Thr 50 55 60 Gln Arg Glu Ile Met Glu Phe Phe Gly Asn Asp Ile Ser Asn Met Asn 65 70 75 80 Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Trp Ser Pro Gly Ala Asp Asp Lys 85 90 95 Lys Arg Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Val Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Ser Ser Ser Trp Tyr Asp Gly Ala Ser Phe Ala Ala Gln Gly 115 120 125 Asp Val Val Val Val Thr Ile Asn Tyr Arg Leu Gly Ile Leu Gly Phe 130 135 140 Leu His Leu Gly Glu Ile Gly Gly Glu Glu Tyr Ala Thr Ser Gly Asn 145 150 155 160 Cys Gly Ile Leu Asp Gln Val Ala Ala Leu Gln Trp Val Gln Glu Asn 165 170 175 Ile Ala Ser Phe Gly Gly Asp Pro Asn Asn Val Thr Val Phe Gly Glu 180 185 190 Ser Ala Gly Ala Met Ser Ile Gly Val Leu Leu Gly Phe Pro Ser Ala 195 200 205 Gln Gly Leu Phe His Asn Ala Ile Leu Gln Ser Gly Ala Ala Ala Asn 210 215 220 Val His Ser Ser Glu Thr Ala Thr Lys Val Ala Gly His Leu Leu Ala 225 230 235 240 Ala Leu Gln Val Glu Pro Thr Asn Leu Ser Lys Leu Glu Glu Leu Ser 245 250 255 Val Glu Gln Leu Ile Gln Val Ala Asp Leu Val Pro Pro Met Ser Leu 260 265 270 Gly Pro Val Ile Asp Gly Val Ser Leu Pro Lys His Pro Gln Glu Ala 275 280 285 Ile Ala Asp Gly Ser Ala Lys Asp Val Ser Ile Leu Val Gly Thr Asn 290 295 300 Lys Asp Glu Tyr Asn Ile Phe Ser Val Phe Asp Pro Glu Trp Lys Asn 305 310 315 320 Ala Asp Glu Ala Lys Val Thr Ala Leu Phe Glu Lys Thr Phe Gly Pro 325 330 335 Leu Val Gln Val Ile Ser Lys Phe Ile Pro Gly Gly Leu Asn Gln Asp 340 345 350 Leu Phe Asn Lys Leu Leu Thr Asp Thr Ile Phe Thr Asn Pro Ala Gln 355 360 365 Lys Leu Ala Glu Leu Gln Val Asn Gln Gly Thr Pro Val Trp Met Tyr 370 375 380 Arg Phe Asp Trp Glu Thr Pro Val Phe Gly Gly Ala Leu Lys Ser Thr 385 390 395 400 His Ala Leu Glu Ile Pro Phe Val Phe Asn Thr Leu Arg Thr Pro Asn 405 410 415 Thr Glu Asn Phe Thr Gly Ser Ser Pro Glu Arg Gln Gln Ile Ala Asp 420 425 430 Gln Met His Gln Arg Trp Ile Asn Phe Ala Lys Ser Gly His Pro Asn 435 440 445 Ser Asp Arg Leu Leu Glu Trp Pro Ser Tyr Asp Met Asn Asn Arg Ser 450 455 460 Thr Met Ile Phe Asn Asn Glu Ser Ile Val Val Asn Asp Pro Asn Arg 465 470 475 480 Glu Asp Arg Leu Lys Trp Glu Gln Leu Ser Met Val Met Lys Gly 485 490 495 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal primer <400> 3 ttgcatatga ctaaaacgat tgttggaag 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal primer <400> 4 tttgaagctt ccctttcatc accatggat 29

Claims

에스터라제를 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 니아시니(Bacillus niacini) EM001 (KCTC 0965BP).
에스터라제를 대량 생산하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 대장균E. coliBL21(DE3)/pEST54 (KCTC 10071BP).
서열 목록 2에 기재되어 있는 아미노산 서열을 가지는 에스터라제.
서열 목록 1에 기재되어 있는 염기서열을 가지는 에스터라제 유전자.
제4항의 에스터라제 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드.
제5항에 있어서, 상기 플라스미드는 pEST54인 것인 재조합 플라스미드.
삭제