JP2009060888A - ヒアルロン酸加水分解酵素及び該酵素を用いた低分子化ヒアルロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有するヒアルロン酸加水分解酵素及び該酵素低分子化ヒアルロン酸の製造方法を提供する。
【解決手段】微生物由来のヒアルロニダーゼを探索し、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有する新規なヒアルロン酸加水分解酵素を得、該酵素で加水分解された低分子化ヒアルロン酸の製造方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微生物由来であり、かつ、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有する新規なヒアルロン酸加水分解酵素、該酵素をコードする遺伝子、該酵素の製造方法、及び該酵素を用いた低分子化ヒアルロン酸の製造方法に関する。

ヒアルロン酸は、Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下「ＧｌｃＮＡｃ」と称する）及びＤ−グルクロン酸（以下「ＧｌｃＵＡ」と称する）の２糖による繰り返し構造［…ＧｌｃＮＡｃ（β−１，４）ＧｌｃＵＡ（β−１，３）ＧｌｃＮＡｃ（β−１，４）ＧｌｃＵＡ（β−１，３）…］からなる直鎖の多糖であり、その高い保湿機能により、医薬品、飲食品、化粧品の分野で広く用いられている。

ヒアルロン酸の体内への吸収性を高めるためには、低分子化ヒアルロン酸の使用が有用である。低分子化の方法としては、アルカリや酸で処理する方法（例えば、特許文献１参照）や酵素的に分解する方法（例えば、特許文献２参照）が挙げられる。酵素的に分解する方法としては、ヒアルロニダーゼによりヒアルロン酸を低分子化する方法が知られている。既知のヒアルロニダーゼは、反応様式により以下の３つの種類に分類される。

反応様式１：ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）
ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合をエンド型で加水分解する。例えば、哺乳類（ヒト、ウシ等）の精巣、血清由来や、ヘビ、ハチの毒液由来等（例えば、非特許文献１、２、特許文献３参照）が知られている。

反応様式２：ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）
ＧｌｃＵＡとＧｌｃＮＡｃを結ぶβ−１，３グリコシド結合をエンド型で加水分解する。例えば、ヒル由来等（例えば、特許文献４参照）が知られている。

反応様式３：ヒアルロン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）
ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合を、β脱離反応を利用してエンド型で分解する。例えば、ストレプトミセス属やストレプトコッカス属等の微生物由来（例えば、非特許文献３参照）が知られている。

しかしながら、従来のヒアルロニダーゼには以下のような課題があった。まず、反応様式１の加水分解型ヒアルロノグルコサミニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３５）及び反応様式２の加水分解型ヒアルロノグルクロニダーゼ（ＥＣ ３．２．１．３６）については、動物由来のものしか見出されておらず、酵素の大量生産が困難であり、高価であった。
一方、反応様式３のヒアルロン酸リアーゼ（ＥＣ ４．２．２．１）は、微生物由来であり、生産効率の観点からは有利である。しかしながら、この酵素により生成する低分子化ヒアルロン酸は、非還元末端に４，５−不飽和ウロン酸を有しており、生体内に存在するヒアルロン酸の非還元末端構造（飽和型）とは構造的に異なる。
医薬品、飲食品、化粧品の用途を考慮すれば、加水分解で生成する低分子化ヒアルロン酸の使用が好ましく、このような技術的背景から、加水分解型であり、かつ、微生物由来のヒアルロニダーゼが強く求められていた。

特開２００６−２６５２８７号公報 特開２００６−２７１３５１号公報 特開２００６−１１９号公報 特表２００３−５０２０４５号公報 「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ，２ｎｄ ｅｄｎ」，（米国），１９６０年，４巻，ｐ．４４７−４６０ 「Ｂｉｏｃｈｅｍａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ」，（米国），１９９７年，２３６巻，ｐ．１０−１５ 「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ」，（蘭国），１９９７年，１３３７巻，ｐ．２１７−２２６

本発明が解決しようとする課題は、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有する微生物由来の酵素及び該酵素で加水分解された低分子化ヒアルロン酸の製造方法を提供することにある。

そこで本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、真菌等の微生物由来のヒアルロニダーゼを見出した。そして、本酵素が微生物由来としては新規である、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有する酵素であることがわかった。さらに本酵素をコードする遺伝子、本酵素の製造方法を明らかにし、本酵素を用いた低分子化ヒアルロン酸の製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
（１）微生物由来であり、かつ、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有するヒアルロン酸加水分解酵素。
（２）アミノ酸配列にＧＥＩＤＩ若しくはＧＥＩＤＶモチーフを有することを特徴とする、上記（１）記載のヒアルロン酸加水分解酵素。
（３）下記（ａ）〜（ｅ）の理化学的性質を有する上記（１）又は（２）記載のヒアルロン酸加水分解酵素：
（ａ）作用：ヒアルロン酸をエンド型で加水分解し、偶数単位のオリゴ糖ユニットを産生する；
（ｂ）至適ｐＨ：２．５〜３．５；
（ｃ）至適温度：３５〜５０℃；
（ｄ）熱安定性：５０℃以下；
及び
（ｅ）分子量：約３０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）。
（４）以下の（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素：
（ｆ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｇ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｈ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素の生産能を有する微生物の培養物から該酵素を回収することを特徴とする、ヒアルロン酸加水分解酵素の製造方法。
（６）以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ｉ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｊ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｋ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を示し、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｌ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１から複数個のＤＮＡが欠失、置換及び／又は付加され、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（７）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸を低分子化するための酵素製剤。
（８）ヒアルロン酸に上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素を作用させて、低分子化ヒアルロン酸を生成させることを特徴とする、低分子化ヒアルロン酸の製造方法。

本発明によれば、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有する微生物由来の酵素及び該酵素で加水分解された低分子化ヒアルロン酸の製造方法を提供することができる。

以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明の酵素（以下、「本酵素」と称する）について説明する。本酵素は、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する反応を触媒する酵素である。ヒアルロン酸の分解部位は、特に限定されないが、例えばＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合が挙げられる。
本酵素は、非還元末端に４，５−不飽和ウロン酸を有する低分子化ヒアルロン酸を生成させるリアーゼ反応ではなく、生体内に存在するヒアルロン酸と同じ非還元末端構造（飽和型ウロン酸）を有する低分子化ヒアルロン酸を生成する加水分解反応を触媒するため、産業上、特に有用である。

酵素反応の確認、酵素活性の測定は、例えば、以下のように行うことができる。
ＨＰＬＣ法（例えば、実施例１の５「低分子化ヒアルロン酸の分析」に記載）を用いて生成物の分子量を測定することにより、エンド型の加水分解が起こっていることが示される。
また、ＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合が分解されているかどうかを調べるためには、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），１９５５年，２１７巻，ｐ．９５９−９６６の手順を参照することにより、ＧｌｃＮＡｃの還元末端が生成していることを確認すればよい。
また、本酵素反応が脱離反応ではなく加水分解反応であることを調べるためには、分解生成物において不飽和ウロン酸に特有の２３２ｎｍの吸収がないことを確認すればよい（「糖鎖工学と医薬品開発」，（日本），医薬品副作用被害救済・研究振興基金編，薬業時報社，平成５年１２月，ｐ．３７参照）。
なお、これらの測定方法は、一例を示したものであり、測定の試薬や種類や濃度、ｐＨについて何ら制限するものではない。

本酵素は、微生物を由来とする。通常の培養で安価に生産させることができ、既知の動物由来の酵素と比較して製造が容易であり、産業上有利である。
ここでいう微生物とは、真菌［キノコ、糸状菌（カビ）、酵母］又は原核生物（バクテリア）を指す。
真菌としては、例えば、ペニシリウム属（アオカビ）、アスペルギルス属（コウジカビ）、リゾプス属等の糸状菌、サッカロミセス属、キャンディダ属、デバリオミセス属等の酵母が挙げられる。好ましくはペニシリウム属を由来とするものが挙げられる。具体的には、例えば、ペニシリウム パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）やペニシリウム フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）であり、さらに具体的にはペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株、ＩＡＭ １３７５４株、ＩＡＭ ７０９５株、ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株などが挙げられる。

また、本酵素は、例えば、配列番号３及び４においては、１１２〜１１６番目の位置に示されるように、微生物由来の多糖加水分解酵素（ＥＣ ３．２．１．−）に特徴的な５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列モチーフ（ＧＥＩＤＩ若しくはＧＥＩＤＶ）を有している（「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，（米国），１９９８年，６４巻，ｐ．３８５−３９１参照）。これらのアミノ酸配列モチーフは、動物由来のヒアルロニダーゼには存在せず、これらのモチーフを有する酵素が微生物由来、かつ、反応が加水分解型であることを示す。従来から知られていた本モチーフを有する微生物由来の多糖加水分解酵素にはヒアルロン酸分解活性は見出されていない。本酵素は、ヒアルロン酸加水分解活性を有し、かつ、本モチーフが存在する酵素として初めて見出された。

また、本酵素の一形態として、例えば、以下の（ａ）〜（ｅ）に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するヒアルロニダーゼ等が挙げられる。
（ａ）作用：ヒアルロン酸をエンド型で加水分解し、偶数単位のオリゴ糖ユニットを産生する。
（ｂ）至適ｐＨ：２．５〜３．５
（ｃ）至適温度：３５〜５０℃
（ｄ）熱安定性：５０℃以下
（ｅ）分子量：約３０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
さらに、本酵素として、例えば、以下の（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質などが挙げられる。
（ｆ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｇ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｈ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。

ここで、「１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された」とは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたことを意味する。特に酵素のＮ末端における複数個のアミノ酸は、プロセッシングを受けて除去されることがあるため、このような考慮が必要である。
また、アミノ酸配列の相同性を評価するために、各種相同性検索プログラムやソフトが提供されており、いずれを用いてもよい。相同性の評価以外にも、好ましくは、同一性の評価も用いられる。相同性と同一性の違いは、同じ性質を持つアミノ酸（例えば、グルタミン酸とアスパラギン酸など）は相同性があるとみなされるが、同一性では区別される。「８０％以上の相同性を示す」とは、配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列との相同性若しくは同一性が、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。

次に、本酵素の製造方法に関して説明する。
本酵素含有組成物は、例えば、上記に例示した微生物を培地で培養することにより製造される。本酵素含有組成物が得られる限り、微生物の培養方法及び酵素組成物の採取方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法が採用できる。
ペニシリウム属（アオカビ）、アスペルギルス属（コウジカビ）、リゾプス属等の糸状菌、サッカロミセス属、キャンディダ属、デバリオミセス属等の酵母を、適当な培地に植菌し、２５〜３５℃、２〜１０日間、静置培養する。
培地としては、例えば、合成培地、米飯等の穀物蒸煮物が使用できる。得られた培養物は、そのまま本酵素含有組成物として利用できるが、０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液を用いて抽出することもできる。さらに通常の酵素精製方法を用いて、本酵素含有組成物中の酵素の純度を高めることができる。このようにして得られた本酵素含有組成物は、ヒアルロン酸の低分子化を行う製剤として使用してもよい。

次に、本酵素をコードする遺伝子（以下、「本遺伝子」という）としては、例えば、以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡからなる遺伝子などが挙げられる。
（ｉ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｊ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、上記本酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を示し、かつ、上記本酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｌ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１から複数個のＤＮＡが欠失、置換及び／又は付加され、かつ、上記本酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
これらのＤＮＡは、本酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている蓋然性が高く、形質転換体を作製し、活性を持つものを選択することができる。本遺伝子と実質的に同一な遺伝子を取得するためには、配列番号１若しくは２の塩基配列を有するＤＮＡ又はその相補鎖、又はそれらの一部を含むプローブによりストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションし、本酵素活性を有するポリペプチドをコードするものを選択することができる。

ここでいうストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件である。このような条件は、個々の生物種により若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーションと洗浄の際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみで容易に決定することができる。このような条件としては、例えば、ハイブリダイゼーションは、ＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）を用いて３７〜４２℃で一晩行う。洗浄は、０．５×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。洗浄の温度は、４５℃以上、好ましくは５２℃以上、さらに好ましくは５７℃以上である。このような条件でハイブリダイズするようなＤＮＡは、本酵素活性を有するタンパク質をコードしている蓋然性が高いが、活性を失うような変異を有するものも含まれる。しかし、それらについては、形質転換を行った後に、形質転換体の酵素産生能を測定することにより容易に取り除くことが可能である。
また、遺伝子配列の相同性の評価はアミノ酸配列の相同性評価と同様に行うことができる。本発明における、「８０％以上の相同性を示す」とは、例えば、８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。

本遺伝子の取得方法としては、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、前述した本酵素生産能を有する微生物菌体から常法、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」 ，ＷＩＬＥＹ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９に記載されている方法を参照して、染色体ＤＮＡ又はｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーを作製する。ついで、上記本酵素のアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列や取得した遺伝子の部分配列情報に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ＰＣＲ法、Ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法、５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の本遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。さらに、既知である類似酵素の遺伝子配列やその周辺の配列、アミノ酸の配列の情報を利用して適当な混合塩基プライマーを作製し、ＰＣＲ法により、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させることもできる。

上記のようにして得られた本遺伝子を、「Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ」，ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０に記載されている手順を参照にして、大腸菌ラクトースオペロンやトリプトファンオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列を保有するベクターＤＮＡに挿入し、得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌等に形質導入して本酵素高生産株を得ることができる。

用いられるベクターＤＮＡは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドＤＮＡ若しくはバクテリオファージＤＮＡ等でもよい。また、得られた組み換え体ＤＮＡを用いて、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物や動物細胞などを形質転換又はそれらに形質導入してそれぞれの形質転換体若しくは形質導入体を得ることができる。

本酵素含有組成物が得られる限り、上記組み換え体ＤＮＡを含む形質転換体又は形質導入体の培養方法及び酵素組成物の採取方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法が採用できる。
組み換え大腸菌を適当な培地に植菌し、２０〜４２℃で６〜１２０時間培養する。培養は通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
培地としては、例えば、ＬＢ培地が使用できる。酵素生産誘導基質として、適量のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を適宜添加してもよい。培養終了後、該培養物をそのまま本酵素含有組成物として利用することができる。

上記培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本酵素を回収することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンＸ−１００等の界面活性剤を用いて菌体から本酵素を抽出する方法等により、菌体から本酵素を回収することができる。

さらに通常の酵素精製方法を用いて、本酵素含有組成物中の酵素含有量を高めることができる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、疎水クロマトグラフ法等を適宜組み合わせて行うことができる。このようにして得られた本酵素含有組成物は、ヒアルロン酸の低分子化を行う際の酵素製剤として使用することができる。

低分子化ヒアルロン酸は、本酵素含有組成物を用いて以下のように製造することができる。
ヒアルロン酸は、その由来や平均分子量は特に限定されず、各種の動物（鶏冠等）又は微生物（例えば、ストレプトコッカス属等）から得られるものが使用できる。また、ヒアルロン酸としては、各種市販品（紀文フードケミファ社製「ヒアルロン酸ＦＣＨ」、キユーピー社製「ヒアルロンサンＨＡ−Ｆ」等）を使用することもできる。

上記ヒアルロン酸に本酵素含有組成物を作用させる際の条件は、使用するヒアルロン酸及びヒアルロニダーゼの種類に応じて適宜設定すればよい。例えば、微生物由来の平均分子量１８０万〜２２０万のヒアルロン酸に、本酵素含有組成物を作用させる場合、０．１％ヒアルロン酸溶液に対して、本酵素含有組成物を添加し、必要に応じてｐＨを適宜調整し、３０〜４０℃で１〜７２時間程度反応させればよい。

上記の反応により、低分子化されたヒアルロン酸が生成する。反応終了後の反応系から、低分子化ヒアルロン酸を分離精製する方法は任意である。分離法としては、例えば、ろ過法、透析法、抽出法、ゲルろ過、イオン交換樹脂やシリカゲル等を用いるクロマトグラフィー法、再結晶等を適宜用いることができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。

〔実施例１〕
（真菌由来ヒアルロニダーゼの活性確認）
以下の方法により、ペニシリウム属の真菌がヒアルロニダーゼを生産していることを確認した。
１．試験菌株（４種）
（１）ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株
（２）ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５４株
（３）ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ ７０９５株
（４）ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株
２．ヒアルロン酸の調製
ヒアルロン酸（紀文フードケミファ社製「ヒアルロン酸ＦＣＨ ＦＣＨ２００」）を０．１％の濃度で蒸留水に溶解させ、ヒアルロン酸水溶液とした。
３．ヒアルロニダーゼ含有組成物の調製
試験菌株を米飯培地に植菌し、３０℃、３日間静置培養した。培養物に０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液を添加し、１時間振とうした後、遠心により培養上清を調製し、これをヒアルロニダーゼ含有組成物（以下、「本酵素含有組成物」という）とした。コントロールとして、米飯培地を３０℃、３日間同様に静置し、０．２Ｍ ＮａＣｌ水溶液を添加し、１時間振とうした後、遠心により遠心上清を得た。
４．ヒアルロン酸の低分子化処理
ヒアルロン酸水溶液に、ヒアルロニダーゼ含有組成物を任意の割合で両者を混合した後、混合物を３７℃で１８時間程静置し、ヒアルロン酸の低分子化処理を行った。
５．低分子化ヒアルロン酸の分析
低分子化処理後の試料中に含まれるヒアルロン酸の平均分子量について、ゲルろ過カラムを用いて分析した。ゲルろ過の条件は、以下のとおりである。
・カラム： Ｇ４０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ×２，東ソー社製）
・溶離液： ０．２Ｍ ＮａＣｌ
・流 速： １ｍｌ／ｍｉｎ．
・検 出： 吸光度（２１４ｎｍ）
・分子量標準物質： Ｓｈｏｄｅｘ ＳＴＡＮＤＡＲＤ Ｐ−８２

図１に、ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株由来のヒアルロニダーゼ含有組成物を用いて得られた低分子化ヒアルロン酸のゲルろ過カラムによる分析結果を示す。
図１上段が低分子化処理前、図１下段が処理後のヒアルロン酸のチャートである。低分子化処理前におけるヒアルロン酸の分子量のピークは、１００万以上（図１上段）であったが、処理後に得られた低分子化ヒアルロン酸の分子量のピークは、約１万（図１下段）であった。
残りの３株の試験菌株全てについても、図１同様低分子化処理後の試料に含まれるヒアルロン酸の平均分子量は、処理前の平均分子量よりも小さいことが確認された。また、添加した酵素組成物の量若しくは処理時間に応じて、ヒアルロン酸の平均分子量が小さくなっていることも確認された。

一方、上記３．でコントロールとして調製した遠心上清については、低分子化処理の前後でヒアルロン酸の平均分子量は変化しなかった。
以上のことから、４種の試験菌株の全てがヒアルロン酸をエンド型で分解するヒアルロニダーゼを生産し、これらの酵素含有組成物がヒアルロン酸の低分子化製剤として利用可能であることが示された。

〔実施例２〕
（ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株により生産される本酵素の製造）
ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株から抽出したヒアルロニダーゼ含有組成物を２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＱ−セファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）カラム（５ｃｍ×１８ｃｍ）に吸着させた。２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、０〜１Ｍ 塩化ナトリウムを含有する同緩衝液にて直線濃度勾配法により溶出させ、ヒアルロニダーゼ活性を示す画分を回収した。

次いで硫安を添加し、２Ｍ 硫安を含有する２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したトヨパールブチル−６５０Ｃ（東ソー社製）カラム（２．５ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。２Ｍ 硫安を含有する２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄後、２〜０Ｍ 硫安を含有する同緩衝液にて直線濃度勾配法により溶出した。溶出された活性画分をセントリプレップ１０（アミコン社製）で濃縮し、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。得られた酵素は、以下の実施例３において説明する本酵素の理化学的性質を決定する際に用いた。

〔実施例３〕
（ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株が生産する本酵素の理化学的性質）
実施例２により得られた本酵素の理化学的性質として、下記（ａ）〜（ｅ）について調べた。

（ａ）作用
以下の方法により、本酵素がヒアルロン酸のＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合をエンド型で加水分解することを確認した。
１．ＨＰＬＣによる低分子化ヒアルロン酸の分析
実施例１中の５番に記載の方法により、本酵素がヒアルロン酸をエンド型で加水分解することを確認した。
２．Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法によるＧｌｃＮＡｃ還元末端の生成の確認
本酵素により生成した低分子化ヒアルロン酸の還元末端がＧｌｃＮＡｃかＧｌｃＵＡのいずれであるかを調べるため、Ｍｏｒｇａｎ−Ｅｌｓｏｎ法によるＧｌｃＮＡｃ還元末端量の定量を行った。
本酵素を作用させたヒアルロン酸溶液について、「Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，（米国），１９５５年，２１７巻，ｐ．９５９−９６６に記載されている手順に沿って測定を行った。
その結果、ＧｌｃＮＡｃ還元末端が新たに生成していることが確認でき、本酵素はＧｌｃＮＡｃとＧｌｃＵＡを結ぶβ−１，４グリコシド結合を分解していることがわかった。
３．低分子化ヒアルロン酸の吸光度分析
ペニシリウム パープロゲナム由来のヒアルロニダーゼ含有組成物を用いて低分子化処理したヒアルロン酸をゲルろ過カラムにより分離した。分子量約１万に相当する溶出時間（１０分）のフラクションについて、多波長検出器（日本分光社製 ＭＤ２０１０ｐｌｕｓ）により吸光度スペクトルを測定した。
結果として得られた低分子化ヒアルロン酸には不飽和ウロン酸に特有の２３２ｎｍの吸収が認められなかった。よって、本酵素含有組成物による低分子化反応は、リアーゼ反応ではなく、加水分解反応であることが示唆された。

（ｂ）至適ｐＨ
ｐＨ２．５〜６．０の範囲で、温度４３℃にて酵素反応を行った。結果を図２に示す。本酵素は、ｐＨ３．０において最も高い活性を示し、ｐＨ２．５〜３．５で高い活性を示したことから、本酵素の至適ｐＨはｐＨ２．５〜３．５であると判断した。

（ｃ）至適温度
３５℃以上の種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図３に示す。最も高い活性を示した温度である４３℃付近での活性に対して５０％以上の活性を示す温度範囲は、３５〜５０℃であった。以上から、本酵素の至適温度の範囲は、３５〜５０℃であると判断した。

（ｄ）熱安定性
各温度で６０分間処理した時の熱安定性の結果は、図４に示すとおりであり、本酵素は、５０℃付近まで安定であった。

（ｅ）分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ＰＡＧミニ「第一」１０／２０（第一化学薬品社製）、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）］で分子量を求めた。本酵素のサブユニットの分子量は、約３０，０００であった。

〔実施例４〕
（本酵素をコードする遺伝子のクローニングと大腸菌による組換え発現）
（１）本酵素のアミノ酸配列の分析
実施例２にて得られたペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株が生産する本酵素を、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）中で、３７℃にて一晩、エンドプロテイナーゼ Ａｓｐ−Ｎ（宝酒造社製）処理し、断片化した。上記断片を、Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８ ＳＧ３００（資生堂社製）を用いた逆相ＨＰＬＣにより分取した。得られた断片ペプチドのアミノ酸配列をエドマン法により分析した。

（２）本酵素をコードするｃＤＮＡ配列の解析
実施例１−３にて得られた菌体３種（ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株、ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５４株、ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株）を液体窒素で凍結し、粉砕した。この菌体破砕物からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを得た。

上記（１）で得られたアミノ酸配列を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基としたＰＣＲ用プライマーを作製した。３種のＲＮＡを鋳型とし、ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ．３．０（宝酒造社製）により増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ単離し、塩基配列を決定した。その結果、得られたＤＮＡ断片は本酵素をコードする遺伝子の一部分（部分遺伝子）であることがわかった。

次いで、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、３’−ＲＡＣＥ及び５’−ＲＡＣＥに必要となるオリゴヌクレオチドをそれぞれ設計した。ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ） Ｖｅｒ．３．０（宝酒造社製）及び５’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて３’−ＲＡＣＥおよび５’−ＲＡＣＥを行い、増幅したＤＮＡ断片をそれぞれ単離し、塩基配列を決定した。結果として、各ＤＮＡ断片は本酵素をコードする遺伝子の一部分（部分遺伝子）であり、開始コドン（ＡＴＧ）若しくは終止コドンを有していることが判明した。

以上の操作により、本酵素をコードする遺伝子配列の全長を決定した。遺伝子配列情報に基づいてアミノ酸配列を推定し、上記（１）で得られたＮ末端アミノ酸配列を比較したところ、ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株由来の酵素（成熟型酵素）はＮ末端のＭＫＧＩＴＬＡＴＡＡＶＰＬＬＬＳＶＧＶＡＡ（配列番号５）の部分が除去されていることがわかった。これにより、ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株由来の本酵素の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号３のように推定した。
ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５４株については、得られた遺伝子配列及び推定されたアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号３と完全に一致していた。
また、ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株については、ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株由来の酵素のアミノ酸配列と比較した結果、Ｎ末端のＭＫＴＳＴＬＡＡＡＶＣＱＶＦＬＧＴＲＡＶＡ（配列番号６）の部分が除去されていることが予想された。これにより、ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株由来の本酵素の遺伝子配列及びアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号４のように推定した。

配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列について既知の各種ヒアルロニダーゼとの相同性を調べたが、有意な相同性は認められなかった。また、配列番号３及び配列番号４に示されるように、微生物由来の多糖加水分解酵素（ＥＣ ３．２．１．−）に特徴的な５アミノ酸配列（ＧＥＩＤＩ）がともに１１２〜１１６番目の位置に有していることがわかった。このようなモチーフ配列を有する酵素でヒアルロニダーゼ活性を有するものはこれまでに知られていない。
よって、本酵素は、微生物由来の新規なヒアルロン酸加水分解酵素であることが本結果からも示された。

（３）本酵素をコードする全長ｃＤＮＡのクローニング
成熟型酵素の遺伝子全長を取得するために、配列番号１及び配列番号２の５’末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加した配列を成熟型酵素の遺伝子とみなし、５’末端あるいは３’末端を含むオリゴヌクレオチド（計３０塩基のオリゴヌクレオチド、３’末端側は相補鎖）を設計した。ペニシリウム パープロゲナム ＩＡＭ １３７５３株については、プライマー中にＥｃｏＲＶ部位を組み込んでおき、ＰＣＲで増幅した産物を、ＥｃｏＲＶを作用させて消化することにより、コーディング領域が得られるようにしておいた。すなわち、５’−ＡＧＴＧＴＧＧＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号７）、アンチセンスプライマーとして５’−ＣＴＣＣＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号８）を合成した。ペニシリウム フニクロスム ＩＡＭ １３７５２株については、プライマー中にＰｖｕＩＩ部位を組み込んでおき、ＰＣＲで増幅した産物を、ＰｖｕＩＩを作用させて消化することにより、コーディング領域が得られるようにしておいた。すなわち、５’−ＧＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＧＣＴＧＣＡＣ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号９）、アンチセンスプライマーとして５’−ＴＧＡＴＡＴＣＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＡＣＡＡ−３’（３０ ｍｅｒ）（配列番号１０）を合成した。先に調製したＲＮＡを鋳型とし、それぞれ３’−Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（宝酒造社製）用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた増幅ＤＮＡ（約９００ｂｐ）の塩基配列をそれぞれ解析した結果、配列番号１及び配列番号２と完全に一致した。

（４）ＨＡａｓｅをコードする遺伝子の大腸菌による組換え発現
３’−ＲＡＣＥで増幅したＨＡａｓｅをコードするＤＮＡ（約９００ｂｐ）を制限酵素（ＥｃｏＲＶもしくはＰｖｕＩＩ）で処理し、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むＤＮＡ配列（Ｔｈｅ Ｏｐｅｒｏｎ， ｐ．２２７, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８０を参照）を保有するｐＫＫ２２３−３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のクローニングサイトに挿入し、組換え体プラスミドＤＮＡ ｐＨＡａｓｅを得た。

Ｄ．Ｍ．Ｍｏｒｒｉｓｏｎの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，ｐ．３２６−３３１，１９７９）に従い、組換え体プラスミドＤＮＡ ｐＨＡａｓｅを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（宝酒造社製）を形質転換し、形質転換株、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＨＡａｓｅ）を得た。菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ−１００（キアゲン社製）を用いて組換え体プラスミドｐＨＡａｓｅを抽出して精製し、組換え体プラスミドを得た。得られたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ｐＨＡａｓｅ）を、ＬＢ−ＩＰＴＧ−ａｍｐ培地〔バクトトリプトン１％（ｗ／ｖ），酵母エキス０．５％（ｗ／ｖ），ＮａＣｌ ０．５％（ｗ／ｖ），イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（１ｍＭ）及びアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）〕にて１０時間振とう培養した。結果として培養温度２５℃のときに、菌体破砕液中に最大のＨＡａｓｅ活性が確認された。

ペニシリウム属由来のヒアルロニダーゼ含有組成物を用いて得られた低分子化ヒアルロン酸の、ゲルろ過カラムによる分析結果を示した図である。 実施例３における本酵素の至適ｐＨを示した図である。 実施例３における本酵素の至適温度を示した図である。 実施例３における本酵素の熱安定性を示した図である。

Claims (8)

1. 微生物由来であり、かつ、ヒアルロン酸をエンド型で加水分解する活性を有するヒアルロン酸加水分解酵素。
2. アミノ酸配列にＧＥＩＤＩ若しくはＧＥＩＤＶモチーフを有することを特徴とする、請求項１記載のヒアルロン酸加水分解酵素。
3. 下記（ａ）〜（ｅ）の理化学的性質を有する請求項１又は２記載のヒアルロン酸加水分解酵素：
   （ａ）作用：ヒアルロン酸をエンド型で加水分解し、偶数単位のオリゴ糖ユニットを産生する；
   （ｂ）至適ｐＨ：２．５〜３．５；
   （ｃ）至適温度：３５〜５０℃；
   （ｄ）熱安定性：５０℃以下；
   及び
   （ｅ）分子量：約３０，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）。
4. 以下の（ｆ）、（ｇ）又は（ｈ）で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素：
   （ｆ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｇ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列において、１から複数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；
   （ｈ）配列番号３若しくは４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素の生産能を有する微生物の培養物から該酵素を回収することを特徴とする、ヒアルロン酸加水分解酵素の製造方法。
6. 以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のＤＮＡからなる遺伝子：
   （ｉ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｊ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
   （ｋ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡと８０％以上の相同性を示し、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
   （ｌ）配列番号１若しくは２で表される塩基配列からなるＤＮＡにおいて、１から複数個のＤＮＡが欠失、置換及び／又は付加され、かつ、ヒアルロン酸加水分解活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
7. 請求項１〜４のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素を含有することを特徴とする、ヒアルロン酸を低分子化するための酵素製剤。
8. ヒアルロン酸に請求項１〜４のいずれかに記載のヒアルロン酸加水分解酵素を作用させて、低分子化ヒアルロン酸を生成させることを特徴とする、低分子化ヒアルロン酸の製造方法。

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