KR102235833B1 - 토양 메타게놈 유래 신규 트리올레인 선택성 리파아제 유전자 Lip-1307 및 이의 용도 - Google Patents

토양 메타게놈 유래 신규 트리올레인 선택성 리파아제 유전자 Lip-1307 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 알칼리성 리파아제 유전자 Lip-1307 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 토양 메타게놈 유래 신규 리파아제 클론 Lip-1307로부터 재조합한 유전자 Lip-1307-sub-ORF1를 도입한 형질전환체는 트리뷰티린(tributyrin)에 대한 강한 리파아제 활성을 나타내고, 상기 형질전환체로부터 분리 및 정제한 신규 리파아제 단백질 또한 강한 리파아제 활성을 나타내며, 상기 형질전환체로부터 신규 리파아제 단백질을 대량 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규 리파아제 유전자, 이를 포함하는 벡터, 및 이를 도입한 형질전환체는 강한 활성을 갖는 신규 리파아제 단백질의 산업적 대량 생산 및 이를 이용한 트리올레인 선택적 리포밍 기술에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

토양 메타게놈 유래 신규 트리올레인 선택성 리파아제 유전자 Lip-1307 및 이의 용도{Novel triolein selective lipase gene Lip-1307 derived from soil metagenome and use thereof}
본 발명은 토양 메타게놈 유래 신규 트리올레인 선택성 리파아제 유전자 Lip-1307 및 이의 용도에 관한 것이다.
대부분의 알려진 지방분해 효소(리파아제, lipase)는 박테리아에서 유래하나, 전체 환경 미생물 중 0.1 내지 1%만이 표준 기술을 사용하여 배양시킬 수 있기 때문에, 99% 이상의 박테리아 DNA가 밝혀지지 않은 상태로 존재한다(Torsvik et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:782-787, 1990). 이에, 실제로 배양되어 동정된 적이 없는 대다수 미생물들의 유전자 재조합 발현을 통하여 새로운 효소 발견을 가능하게 한 것이 메타게놈(metagenome)이다.
메타게놈은 자연계에 존재하는 모든 미생물의 유전체를 통칭하는 것으로 정의되고, 자연계 시료로부터 미생물을 배양하지 않고 메타게놈을 분리한 후, 이들을 라이브러리로 작성하여 배양가능한 대장균에 도입하는 과정을 통해 분석할 수 있다. 이는 배양이 불가능했던 미생물로부터 유용 산물을 확보하기 위한 방법으로, 유전자의 유래가 되는 미생물에 대한 정보는 얻기가 어려우나 미생물의 산물과 유전자를 동시에 확보할 수 있는 장점이 있다. 미국 위스콘신 대학 연구팀이 처음으로 대형의 메타게놈을 성공적으로 분리하여 세균성 인위적 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC) 벡터에 클로닝하여 메타게놈 라이브러리를 구축하였고, 이로부터 광범위한 항생물질 및 그의 생합성에 관련된 유전자들을 분리하였다(Gillespie et al., 2002, Appl. Environ. Microbiol. 68: 4301-4306; Rondon et al., 2000, Appl. Environ. Microbiol. 66: 2541-2547). TIGR (The Institute for Genomic Research) 연구팀에서도 해양 미생물의 총 미생물 메타게놈 라이브러리를 BAC 벡터에 구축하여 해양 생태계로부터 배양되지 않는 미생물의 유전자원 탐색을 시도하고 있다. 최근에는 다양한 메타게놈으로부터 리파아제를 생산 및 정제하고, 그 특성을 파악하고자 하는 연구가 진행되고 있다(Gupta et al., 2004, Appl. Microbiol. Biotechnol., 64:763-781).
리파아제는 트리글리세라이드(triglyceride)의 에스테르 결합을 가수분해하는 효소로 많은 종류의 동식물과 미생물이 생산하는 것으로 알려져 있으며, 이에 대한 생화학적 특성 및 유전자에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 또한, 높은 기질 특이성, 광학활성 특이성 및 위치 특이성 등의 고유한 특성을 갖고 있기 때문에 유지의 전환뿐만 아니라 수용액에서의 가수분해 및 유기용매 내에서의 (트랜스) 에스터화 반응을 통하여 다양한 정밀화학품, 세제, 식품, 화학 및 제약 산업 등에서 매우 유용하게 사용되며, 특히 광학활성 의약품의 생산에 유용한 효소로 알려져 있다. 최근에는 바이오디젤을 생산하는데 활용되기도 하는 리파아제는 다른 효소들에 비해 상대적으로 저렴하게 생산할 수 있으며 조효소를 필요로 하지 않아 산업적으로 큰 장점이 있기 때문에 생물의약분야에서 생체촉매로 널리 활용되면서 그 중요성이 더욱 부각되고 있다. 특히 알칼리성 리파아제는 세제 중에 많이 사용되는 것으로 광범위한 온도와 pH에서 높은 활성과 안정성을 가져야 하고, 금속 이온, 계면 활성제 및 산화제를 포함한 세제의 다른 성분들과도 양립할 수 있을 것이 요구된다.
토양 메타게놈으로부터 리파아제 활성을 나타낸 선행문헌으로는 Microbiol. Biotechnol. Lett. (2017), 45(1), 63-.70이 있다. 상기 선행문헌에서는 한국 독도 심해 퇴적토 메타게놈에서 새로운 내열성 에스터라아제를 분리한 것을 개시하고 있으나, 트리올레인 선택성 리파아제에 대해서는 개시하고 있지 않다. 대한민국 등록특허 제10-1734935호에서는 유류 오염된 갯벌 메타게놈으로부터 유래한 신규 알칼리성 및 내열성을 가지는 에스테라아제(Est3K) 또는 리파아제(Lip3K)를 개시하고 있으나, 트리올레인 선택성 리파아제에 대해서는 개시하고 있지 않다.
이에 본 발명자들은 신규한 리파아제 유전자를 국내 토양 메타게놈으로부터 분리한 후 이로부터 생산된 단백질이 우수한 트리올레인 선택성 리파아제 활성을 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 토양 메타게놈 유래 신규 트리올레인 선택성 리파아제 유전자 및 단백질, 상기 신규 리파아제 유전자를 포함하는 벡터, 이를 도입한 형질전환체, 리파아제 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 트리올레인 선택성 리파아제 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 트리올레인 선택성 리파아제 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양 상등액으로부터 리파아제 단백질을 회수하는 단계; 3) 상기 효소를 이용해서 트리올레인 선택성 리파아제 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 토양 메타게놈 유래 신규 리파아제 클론 Lip-1307로부터 재조합한 유전자 Lip-1307-sub-ORF1를 도입한 형질전환체는 트리뷰티린(tributyrin)에 대한 강한 리파아제 및 에스터라제 활성을 나타내고, 상기 형질전환체로부터 분리 및 정제한 신규 리파아제 단백질 또한 강한 리파아제 활성을 나타내며, 상기 형질전환체로부터 신규 리파아제 단백질을 대량 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 신규 리파아제 유전자, 이를 포함하는 벡터, 및 이를 도입한 형질전환체는 강한 활성을 갖는 신규 리파아제 단백질의 산업적 대량 생산 및 이를 이용한 트리올레인 선택적 리포밍 기술에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 토양 메타게놈으로부터 신규 리파아제 유전자 Lip-1307을 도출하여 신규 리파아제 단백질을 생산하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 토양 메타게놈 라이브러리로부터 리파아제 활성을 갖는 Lip-1307을 포함한 15종의 활성 클론을 도출한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 Lip-1307의 서브클론을 도입한 대장균으로부터 분리한 플라스미드 DNA의 제한효소 Bam HI, Pst I, Eco RI, Xba I Sph I, Hind III, 및 Sma I에 대한 절단 양상을 확인한 도면(A), 및 Lip-1307의 서브클론을 도입한 대장균 중 리파아제 활성을 나타내는 콜로니들을 나타낸 도면(B)이다.
도 4는 Lip-1307-sub의 ORF1 내지 ORF5을 나타낸 도면이다.
도 5는 Lip-1307-sub-ORF1 서열을 포함하는 플라스미드(pET21a(+)-ORF1-6H)의 구조를 도식화한 도면이다.
도 6은 Lip-1307-sub-ORF1이 도입된 대장균에서 분리한 신규 리파아제 단백질의 전기영동 및 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 Lip-1307-sub-ORF1이 도입된 대장균에서 분리한 신규 리파아제 단백질을 FPLC로 정제하는 크로마토그램(A), FPLC를 통해 수득한 각 분획 내 신규 리파아제 단백질 발현을 확인한 도면(B), 및 분리 및 정제한 신규 리파아제 단백질을 담은 용기를 촬영한 사진(C)이다.
도 8은 금속이온 부착 컬럼을 이용하여 정제한 리파아제 단백질의 전기영동 및 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 LOMETS법을 이용하여 LLip-1307 단백질의 이차구조를 예측한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 타겟 단백질인 Lip-1307과 가장 높은 Z score 값을 가지는 3G7N의 서열을 정렬(align)한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 정제한 리파아제단백질의 3차원 구조를 모델링한 도면(A)와 결합부위를 예측한 도면(B)이다.
도 12는 정제한 리파아제 생촉매를 이용한 트리스테아린(18:0)과 트리올레인(18:1)에 대한 선택적 리포밍 결과 도면이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 리파아제 단백질을 제공한다.
상기 리파아제 단백질, 이의 변이체 또는 이의 단편은 토양 메타게놈을 포함한 천연에서 분리하거나, 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)에 의해 합성될 수 있다. 구체적으로, 액상 펩타이드 합성법(Solution Phase Peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide syntheses), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성될 수 있고, 더욱 구체적으로는 고상 펩타이드 합성법으로 합성될 수 있다.
상기 리파아제 단백질은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 본 발명의 단백질과 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 리파아제 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.
상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 것일 수 있고, 구체적으로 Lip-1307-sub-ORF1일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, Lip-1307-sub-ORF1 유전자를 도출하여 GenBank에 등록하였다(MH628531).
상기 리파아제 단백질을 암호화하는 유전자는 토양 메타게놈으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 리파아제 단백질을 암호화하는 유전자는 본 발명의 리파아제 단백질과 동등한 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 범위 내에서, 하나 이상의 핵산 염기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 변이체일 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 유전자와 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 유전자와 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "재조합 벡터"는 특정 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동할 수 있게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "작동할 수 있게 연결된(operably linked)"은 핵산의 발현을 조절하는 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 암호화하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동할 수 있게 연결되어 암호화하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작위적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
상기 재조합 벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 포스미드(fosmid) 벡터, 박테리오파지 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 재조합 벡터는 도 5의 도식화된 구조를 갖는 포스미드 벡터일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절 서열을 포함할 수 있고, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
상기 신호 서열은 숙주세포가 에쉐리키아속(Escherichia) 균인 경우 PhoA 신호 서열 또는 OmpA 신호 서열 등을, 숙주세포가 바실러스속(Bacillus) 균인 경우 α-아밀라아제 신호 서열 또는 서브틸리신(subtilicin) 신호 서열 등을, 숙주세포가 효모인 경우에는 MFα 신호 서열 또는 SUC2 신호 서열 등을, 숙주세포가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호 서열, α-인터페론 신호 서열, 또는 항체 분자 신호 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 재조합 벡터는 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선별하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 재조합 벡터인 경우 복제원점을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 리파아제 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체는 리파아제 단백질이 숙주세포에서 발현하면 그 활성을 나타내게 되므로, 숙주세포의 배양 배지에 트리뷰티린 등의 리파아제 기질을 첨가함으로써, 선택 마커 없이도 형질 전환된 숙주세포의 선별이 가능하도록 할 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터는 발현 물의 정제를 용이하게 하기 위한 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 히스티딘-택(His-taq)을 C-말단에 위치시켜 리파아제 단백질의 정제를 용이하게 하였다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "형질전환"은 "도입"과 동등한 의미로 사용되며, 사용된 방법과 관계없이 외래 폴리뉴클레오타이드를 숙주세포로 전달하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 외래 유전자가 도입되어 외래 유전자의 형질을 나타낼 수 있는 능력을 갖추는 세포로, 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있고, 구체적으로, 상기 원핵세포는 대장균일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 형질전환체는 BL21(DE3)/pET21a+ORF1-6H 균주일 수 있다.
상기 재조합 벡터를 숙주세포로 형질전환 하는 방법은 재조합 벡터가 숙주세포 안으로 삽입되는 것이라면 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들어, CaCl2 방법, 전기천공방법, 미세주입법 등 어느 것이나 가능하다.
또한, 본 발명은 1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 2) 상기 배양된 형질전환체 또는 이의 배양 상등액으로부터 리파아제 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 리파아제 단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 단계 1)에서 형질전환체를 배양하는 단계는 LB(Luria broth) 배지에서 배양할 수 있고, 구체적으로 상기 형질전환체를 선별적으로 증식시킬 수 있는 항생제를 포함한 LB 배지에서 배양할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 형질전환체는 암피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양할 수 있다.
또한, 상기 단계 1)에서 형질전환체를 배양하는 단계는 리파아제 단백질 발현을 유도하는 IPTG(isopropyl-α-D-thiogalacto pyranoside) 등의 유도물질을 처리하여 배양할 수 있고, 구체적으로 IPTG를 최종농도가 0.01 내지 1 mM, 또는 0.05 내지 0.5 mM이 되도록 처리하여 배양할 수 있다.
상기 단계 2)에서 리파아제 단백질을 회수하는 단계는 당업계의 통상적인 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어 염석(황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 리파아제 단백질의 제조방법은, 단계 2)의 회수한 리파아제 단백질을 정제하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 리파아제 단백질을 정제하는 단계는 당업계의 통상적인 단백질 정제 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 겔-투과 크로마토그래피, 역상-고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), 프렙용 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) 및 친화성 컬럼 크로마토그래피 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 리파아제 단백질의 정제는 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 토양 메타게놈 라이브러리를 제작하고, 이로부터 리파아제 활성을 갖는 15종의 활성 클론을 선별하였으며, 이 중 가장 우수한 활성을 갖는 Lip-1307 유전자를 도출하였고, 이를 이용하여 서브 클론을 제작한 후, 삽입된 DNA의 크기가 작으면서 리파아제 활성은 강한 서브 클론 Lip-1307-sub를 선별하였다(도 1 내지 3 참조). 상기 Lip-1307-sub의 염기서열을 분석하여, 리파아제 활성을 갖는 ORF1를 도출하고, Lip-1307-sub-ORF1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입한 대장균 형질전환체를 제작하였다(도 4 및 5 참조). 또한, Lip-1307-sub-ORF1가 도입된 대장균 형질전환체로부터 리파아제 단백질 발현을 확인하고, 상기 단백질을 분리 및 정제하였으며, 상기 신규 리파아제 단백질이 트리뷰티린에 대한 가수분해 활성을 나타냄을 확인하였다(도 6 내지 8 참조). 또한, 상기 신규 리파아제 단백질의 3차원 구조를 모형화하여 결합 부위를 예측하고 효소 개량을 위한 정보를 확보하였다(도 9 내지 도 11 참조). 나아가 포화지방 트리스테아린으로부터 스테아릭산을 알콜분해시키지 못하는 반면, 불포화지방 트리올레인으로부터 올레인산만을 선택적으로 리포밍하는 특성을 확인하였다(도 12 참조).
따라서, 본 발명의 신규 리파아제 유전자, 이를 포함하는 벡터, 및 이를 도입한 형질전환체는 강한 활성을 갖는 신규 트리올레인 선택적 리파아제 단백질의 산업적 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
토양 메타게놈 DNA의 분리 및 분리된 DNA의 크기 확인
충청남도 신성리 갈대 습지에서 채취한 토양을 메쉬 직경이 1.4 ㎜인 체에 걸러서 직경 1.5 ㎜ 이상의 입자와 식물 잔재물 등을 제거하였다. 상기 토양 시료 5 g을 15 ㎖ 완충용액(100 mM Tris-HCl, pH 8.0; 100 mM EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), pH 8.0; 100 mM 인산염 나트륨(sodium-phosphate), pH 8.0; 1.5 M 염화나트륨; 및 1％ CTAB(cetyl trimethylammonium bromide))에 현탁하였다. 상기 현탁액에 100 ㎎/㎖ 농도의 단백질 분해 효소 K(proteinase K, Sigma) 100 ㎕를 첨가한 후, 37℃ 진탕 배양기에서 150 rpm의 속도로 30분간 진탕하고, 20％ SDS 1.5 ㎖를 첨가하여 잘 흔들어 섞어주었다. 상기 혼합물을 65℃ 항온수조에서 30분마다 한 번씩 섞어주면서 2시간 동안 유지하였다. 이후, 7,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 분리하였고, 같은 부피의 클로로포름(chloroform)/이소아밀 알코올(isoamyl alcohol)(24:1)을 첨가하여 섞어준 후, 8,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 DNA가 포함된 상등액만을 새 튜브로 옮겼다. 상등액 부피의 0.6 배에 해당하는 이소프로판올(isopropanol)을 첨가하여 섞어준 후, 11,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 DNA 침전물을 얻었다. 상기 DNA 침전물을 70％ 에탄올로 세척한 후 원심분리하여 에탄올을 제거하였다. 이로부터 얻은 침전물을 건조시키고, 0.5 ㎖의 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 용해시킨 후, 4℃에 보관하였다.
분리된 DNA의 양과 크기 결정은 PFGE(pulsed field gel electrophoresis)로 확인하였다. PFGE는 6 V/㎝에서 120°의 고정각(fixed angle)으로 1 내지 6초의 교대시간(switch time) 조건에서 6시간 동안 수행하였고, 그 결과, 상기 토양 시료 1 g 당 약 1 내지 1.5 ㎍의 메타게놈 DNA가 분리되었음을 확인하였고, 분리된 DNA의 크기는 20 내지 100 kb 정도임을 확인하였다(도 1).
메타게놈 라이브러리의 작성
상기 실시예 1에서 분리한 메타게놈을 이용하여 저융점 아가로스 겔(low melting point agarose gel)에서 전기영동을 한 후, 20 kb 이상의 DNA를 포함하는 아가로스 겔 블록(block)만을 회수하였다. 회수된 겔 블록에 겔레이즈(GeLase, Epicentre, 미국)를 처리하여 DNA를 순화하고, 휴믹산(humic acid) 등을 제거하였다. 순화된 DNA 조각의 양끝 말단을 DNA 말단-리페어(end-repair) 효소로 처리하여 무딘 말단(blunt end)을 갖는 20 kb 이상의 메타게놈 DNA를 얻었고, 이를 제한효소 Eco72I로 처리한 포스미드(fosmid) 벡터 pEpiFOS-5(Epicentre)에 결찰(ligation)시켰다. 상기 벡터를 상업적인 패키징 시스템(packaging extract, Epicentre)을 이용하여 대장균(Escherichia coli)에 도입한 후 50 ㎍/㎖의 클로람페니콜(chloramphenicol)이 첨가된 LB(Luria broth) 한천 배지에서 자라는 형질전환체들을 선별하였다. 선별된 형질전환체들로부터 SDS-알칼리 용혈(alkali lysis) 방법으로 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 BamHI로 절단한 후 전기영동을 수행한 결과, 선별된 50 개의 형질전환체들 모두 재조합 플라스미드를 포함하고 있어 라이브러리가 잘 작성되었음을 확인하였으며, 삽입된 메타게놈 DNA의 평균 크기는 35 내지 40 kb임을 확인하였다. 상기 선별된 형질전환체들은 배지에 포함된 상태로 희석하여 -80℃에 보관하였다.
실험예 1. 메타게놈 라이브러리로부터 리파아제 활성 클론의 선별
상기 실시예 2에서 작성된 메타게놈 라이브러리로부터 리파아제 활성을 나타내는 클론을 선별하기 위하여, LB 한천배지에 50 ㎍/㎖의 클로람페니콜 및 1％ 트리뷰티린(tributyrin)을 첨가하여 균질화시킨 후, 분주하여 굳히고, -80℃에 풀(Pool)로 보관된 라이브러리를 적절하게 희석하여 배지에 약 300 내지 400개의 콜로니가 배양될 수 있도록 일정량을 도말하였다. 이를 37℃에서 2일간 배양하여 콜로니 주위에 투명한 후광(halo)을 보이는 콜로니를 선발하였다. 선발된 활성 클론의 리파아제 활성을 상기 방법에 따라 재검정하여 최종적으로 15종을 분리하였고(도 2), 이들을 -80℃에 보관하였다.
리파아제 활성 클론(Lip-1307)으로부터 서브클론의 제작
상기 실험예 1에서 분리한 리파아제 및 에스터라제 활성을 보이는 15종의 클론 중 리파아제 활성이 가장 우수한 클론(Lip-1307)으로부터 2차로 서브클로닝을 실시하였다.
3-1. 서브클론의 제작을 위한 최적 제한효소의 도출
Lip-1307의 플라스미드 DNA를 플라스미드 분리 키트(바이오니아, 대한민국)를 이용하여 대량으로 분리한 후, 이를 제한효소 Bam HI, Pst I, Eco RI, Xba I, Sph I, Hind III 또는 Sma I로 절단하여, 절단된 DNA를 아가로스 겔에 전기영동하여 절단 양상을 확인하였다.
그 결과, Pst I를 사용했을 때 상기 DNA가 가장 여러 번 절단됨을 확인하여, 최적 제한효소로 Pst I를 도출하였다(도 3A).
3-2. Lip-1307로부터 서브클론의 제작
상기 실시예 3-1에서 분리한 Lip-1307의 플라스미드 DNA를 제한효소 Pst I로 절단하여 삽입 DNA Lip-1307의 반응물을 만들고 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 삽입 DNA를 순화시켰다. 벡터 DNA(pUC119) 250 ng/㎕을 제한효소 Pst I로 절단하여 반응물을 만들고 반응시킨 후, 벡터가 스스로 달라붙는 것을 방지하기 위하여 SAP(Shrimp alkaline phosphatase)를 처리하여 벡터 DNA를 순화하였다. 상기 순화된 Lip-1307 DNA 및 벡터 DNA(pUC119, Vieira and Messing, Methods Enzymol. 153: 3-11, 1987)를 완충용액(ligation buffer), ATP 및 리가아제(ligase)와 혼합하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 4℃에서 밤새 반응시켜 서브클론을 제작하였다.
실험예 2. Lip-1307의 서브클론 중 Lip-1307-sub의 도출
2-1. Lip-1307의 서브클론이 도입된 형질전환체의 제조, 및 리파아제 활성을 갖는 형질전환체의 선별
상기 실시예 3에서 제작한 서브클론을 상업용 수용성(competent) 대장균 세포 JM109 100 ㎕와 혼합한 후 얼음에서 20분간 방치하고, 42℃에서 45초간 열처리하여 서브클론을 세포 내로 도입한 후, 항생제가 첨가되지 않은 LB 배지 400 ㎕를 가하여 37℃에서 흔들며 45분 동안 배양하였다. 이로부터 형질전환체를 선별하기 위하여 상기 배양액을 1％의 트리뷰티린과 100 ㎍/㎖의 암피실린(ampicillin)이 함유된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양된 플레이트로부터 트리뷰티린을 가수분해하여 강한 후광을 보이는 콜로니들을 선별하였다(도 3B).
2-2. 선별된 형질전환체의 서브클론 도입 여부 검증
상기 실험예 2-1에서 선별된 콜로니들에서 플라스미드 분리 키트(바이오니아)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 Pst I를 처리한 후, 절단된 DNA를 전기영동으로 확인하였다. 그 결과, Lip-1307의 DNA 절편과 같은 크기의 DNA 절편이 확인되어 상기 형질전환체의 DNA에 Lip-1307의 서브클론이 잘 도입되었음을 확인하였다.
2-3. 서브클론 중 Lip-1307-sub의 도출
상기 실험예 2-1 및 2-2의 결과로부터 형질전환체에 도입된 서브클론의 삽입 DNA 사이즈가 가장 작으면서 리파아제 및 에스터라제 활성이 강한 서브클론을 선별하여, 염기서열을 분석하였으며, 크기가 2,430 bp임을 확인하였다. 선별된 상기 서브클론을 Lip-1307-sub로 명명하였다(서열번호 3).
실험예 3. Lip-1307-sub의 ORF 중 리파아제 활성을 갖는 ORF의 확인
3-1. Lip-1307-sub의 ORF 분석 및 ORF1의 도출
상기 실험예 2-3에서 분석한 Lip-1307-sub의 염기서열로부터 개방형 해독틀(open reading frame, ORF)을 분석하였고, 여러 가지 ORF 중 300 bp이상의 ORF는 4개임을 확인하였다(도 4). 분석된 5개의 ORF 중 ORF1은 트리아실글리세롤 리파아제(Rhizomucormiehei, 37%, Accession No. P19515.2), ORF2는 유사한 유전자가 없음(No significant similarity found), ORF3은 디카복실산 전달체(Anaerobic C4-dicarboxylate transporter DcuA, Escherichia coli O157:H7, 96%, P0ABN7.1), ORF4는 유사한 유전자가 없음(No significant similarity found), ORF5는 아스파테이트 암모니아 리아제(Aspartate ammonia-lyase)로 확인되었기 때문에 유사도는 37%로 낮지만 신규성이 높기 때문에 ORF1을 가장 유력한 신규 리파아제 후보로 도출하였다.
3-2. Lip-1307-sub의 ORF1이 도입된 대장균의 리파아제 활성 확인
상기 실험예 2에서 선별한 Lip-1307-sub 서브클론의 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하고, 상기 실험예 3-1에서 도출된 ORF1에 대한 프라이머를 제작하여(표 1), 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하였다. PCR 반응은 5×완충용액 20 ㎕, N-용액 10 ㎕, 100 pM의 각 프라이머 2 ㎕, 주형 DNA 1 ㎕, pfu DNA 중합효소 1 ㎕ 및 멸균 증류수 64 ㎕를 혼합하여 총 부피 100 ㎕의 조성으로, 95℃에서 30초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 40초의 사이클을 30회 반복하여 수행하였다(Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). pET21a(+) 벡터를 하기 표 1에 기재된 프라이머에 해당하는 제한효소로 각각 절단한 후, 각 PCR 산물을 연결하여 상업용 수용성 대장균 세포 JM109에 상기 실험예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 도입하였다. 상기 대장균을 1% 트리뷰티린이 첨가된 LB 배지에 도말하고 37℃에서 2일간 배양하여 리파아제 활성을 조사하였다.
프라이머명 서열(5'→3') 제한효소 서열번호
ORF1 F GAAGGAGATATACATATGTCCCCTATACTAGGTTA NdeI 4
ORF1 R AAAGATGCTGGATCCACGCGGAACCAGAT XhoI 5
그 결과, ORF1이 도입된 대장균이 강력한 리파아제 활성을 나타냄을 확인하였다.
Lip-1307-sub-ORF1 플라스미드의 제작
상기 실험예 2에서 선별한 Lip-1307-sub 서브클론의 DNA를 분리하여 이를 주형으로 하고, 표 1의 ORF1에 해당하는 프라이머쌍을 이용하여 PCR을 수행하여 Lip-1307-sub의 ORF1 부위 및 제한효소 자리(NdeI 및 XhoI)를 포함하는 플라스미드(pET21a(+)-ORF1-6H)를 제작하였다.
구체적으로, Lip-1307-sub의 DNA를 주형으로 하고, 표 1의 ORF1에 해당하는 프라이머쌍(서열번호 4 및 5)을 이용하여 상기 실험예 3-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 1.5%(w/v) 아가로스 겔 전기영동으로 분석하고, PCR 정제키트(바이오니아)를 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA의 서열을 분석하고, 제한효소 NdeI 및 XhoI로 절단된 pET21a(+)에 결찰시켜 생성된 플라스미드를 pET21a(+)-Lip1307-6H로 명명하였다(도 5).
리파아제 활성을 갖는 신규 리파아제 단백질의 대량 생산
5-1. 신규 리파아제 단백질의 발현 유도
상기 실시예 4에서 제작한 플라스미드를 이용하여 대장균에 리파아제 활성을 갖는 신규 리파아제 단백질 발현을 유도하였다.
구체적으로, 상기 플라스미드를 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3)[F-omp T hsdSB(rB-mB-) gal dcm(DE3)](Stratagen, 미국)에 도입하고, LB 플레이트 상에 도말하였다. 새로운 배지에서 성장한 단일 콜로니를 채취하여 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유한 LB 배지 100 ㎖에 접종하고 37℃에서 배양하여, 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 성장시켰다. 이를 다시 암피실린이 포함된 LB 배지 5,000 ㎖에 접종하고 37℃에서 흔들어 주면서 배양하여, 600 nm에서의 흡광도가 0.6이 될 때까지 성장시켰다. 이후, 1 mM IPTG(isopropyl-α-D-thiogalacto pyranoside, GibcoBRL, 미국)를 첨가하여 단백질 과발현을 유도하고, 20℃에서 16시간 동안 더 배양하였다.
5-2. 발현된 신규 리파아제 단백질의 분리
상기 배양액을 6,000 ×4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고, 침전물을 차가운 완충용액(50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) 10 ㎖로 3 회 세척하였다. 이를 용해 완충용액(pH 7.0, 50 mM Tris-HCl, 200 mM 염화나트륨)에 재현탁 시킨 후 초음파 분쇄기(CosmoBio Co., LTD, 일본)로 파쇄하였다. 파쇄된 세포를 12,000 ×4℃에서 30분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하여 침전된 단백질을 수득하였다. 상기 단백질을 램나이 샘플 완충용액(Laemmli sample buffer)과 혼합한 후, SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue R250)로 염색하여 74.9 kDa의 리파아제 단백질이 존재함을 확인하였다(도 6A).
5-3. 분리된 신규 리파아제 단백질의 정제
금속이온 부착 컬럼을 이용하여 상기 실시예 5-1에서 분리한 리파아제 단백질을 정제하였다.
구체적으로, Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid, QIAGEN, 독일)를 크로마토그래피 컬럼(bed volume, 15 ㎖, Millipore, 미국)에 첨가하여 컬럼을 니켈 이온으로 포화시키고, 황산염 형태의 50 mM 니켈 용액을 가하여 결합되지 않은 금속이온을 제거하였다. 상기 컬럼에 분리한 리파아제 단백질이 함유된 용액을 첨가하고, 완충용액(50 mM Tris-HCl, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.4)으로 컬럼을 세척한 후, 연속적인 이미다졸(imidazole) 구배를 두고 상기 완충용액을 통과시켜 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography, FPLC)로 정제하였고(도 7A), 정제된 리파아제 단백질을 각 분획으로 수득하였다. 각 분획을 이용하여 상기 실시예 5-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 전기영동을 수행하여 74.9 kDa의 리파아제 단백질이 존재함을 확인하였다(도 7B). 상기와 같이 리파아제 단백질의 존재를 확인한 분획들(분획 23, 24, 26, 27, 28, 30 및 32)을 합한 후, 완충용액(50 mM Tris-HCl, 0.15 M 염화나트륨, pH 7.4)으로 1 ㎎/㎖의 농도가 되도록 희석하고, 용기에 담아 -70℃에 보관하였다(도 7C). 또한, 상기 합한 분획을 이용하여 실시예 5-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 수행하여 74.9 kDa의 리파아제 단백질을 재확인하였다(도 8).
Lip-1307 의 단백질 3차원 구조 분석
6-1. Lip-1307 단백질 서열정보 (총 309 AAs)
정제된 단백질의 아미노산 서열을 바이오니어를 통해 분석한 결과 총 309개의 아미노산으로 구성되는 서열번호 1의 아미노산 서열을 확인하였다.
6-2. LLip-1307의 예상 단백질 이차구조
공지된 LOMETS법(LOMETS: A local meta-threading-server for protein structure prediction". Nucleic Acids Research, 2007, 35: 3375-3382)을 이용하여 상기 309개의 아미노산으로 구성되는 Lip-1307 단백질의 이차구조를 예측하였으며, 그 결과는 도 9에 나타내었다.
6-3. 구조구축을 위한 템플릿 선정 (threading templates)
PDB 라이브러리의 LOMETS에 의해 식별된 구조 템플릿을 이용하여 모델링을 진행하였다. 다중 스레딩 방법(multiple threading method) 이용하여 높은 스레딩 정렬(threading alignment)의 정규화된 점수 (이하 Z score로 명명)를 갖는 구조 중에서 가장 큰 값을 갖는 표 2의 트리아실글라이세롤 리파아제(Triacylglycerol Lipase, pdb id: 3G7N)를 선정하였다.
PDB Z
score a 		Molecule Organism Resolution
(Å) 		Seq. length Seq.
iden/sim.(%)
3G7N 3.25 Triacylglycerol Lipase Penicillium expansum 1.30 258 19.0 / 36.6
aZ score: 스레딩정렬(threading alignment)의 정규화된 점수. Zscore>1이 좋은 정렬.
타겟 단백질인 Lip-1307과 가장 높은 Z score 값을 가지는 3G7N의 서열을 정렬(align)하였다(서열 동일성/유사도: 19.0%/36.6%). 그 결과는 도 10에 나타내었다.
6-4. I-TASSER 방법에 의한 호몰로지 모델링(homology modeling)을 통해 예측한 단백질 구조 모델
선정된 템플릿을 이용하여 형성된 호몰로지 모델(homology model)들을 C score를 기반으로 배열하였다. SPICKER 방법을 사용해서 페어 와이즈(pair-wise) 구조 유사성을 기반으로 가장 큰 구조 클러스터에 해당하는 최대 다섯 가지 모델을 예측하였고, 각 모델의 신뢰도는 예측된 모델의 품질을 추정하기 위한 신뢰도 점수 (이하 C score로 명명)에 의해 정량적으로 측정되며, 가장 높은 점수를 갖는 모델 1(model 1)을 선정하였다(표 3).
Model C score a Exp.TM score b Exp.RMSD b Cluster density c
1 -0.47 0.65±0.13 7.3±4.2 0.2161
aC score: 예측된 모델의 품질(quality)를 추정하기 위한 신뢰도 점수.
bTM score/RMSD: 두 구조간의 구조적 유사성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 표준 점수법.
cCluster density: 클러스터밀도가 높다는 것은 더 나은 품질의 모델을 의미함.
6-5. 모델 1(Model 1) 템플릿의 RMSD 측정
가장 좋은 C score와 높은 클러스터 밀도(Cluster density)를 갖는 모델 1(model 1)을 후보 구조(candidate structure)로 선정하였고, 스레딩 템플릿과의 RMSD 비교를 진행하였다.
6-6. 리간드 결합 부위의 예측
구조 예측 기반 방법을 사용하여 COFACTOR (구조 비교와 단백질-단백질 네트워크 사용) 및 COACH(여러 프로그램의 기능을 결합한 방식)를 통해 표적 단백질의 리간드 결합 부위를 제안하였다. 제안된 결합 부위 중에서 C score가 가장 높은 리파아제(pdb id: 1GT6)의 리간드를 토대로 형성된 결합 부위 1을 선정하였다.
그 결과, 결합 부위를 형성하는 아미노산 잔기를 도 11에 나타내었다(도 11).
실험예 4. Lip-1307 의 트리올레인 선택적 알코올 분해 특성 확인
상기 실시예 5-1에서 제작한 Lip-1307-sub-ORF1가 도입된 대장균에서 발현된 신규 리파아제 단백질의 트리올레인 선택적 알코올 분해 특성을 확인하였다.
구체적으로, 2 ml 바이알에 50 μg의 단백질을 함유하는 효소 Lip-1307을 첨가하고 동결 건조시켰다.
이어서, 메틸알코올에 용해된 20 ml의 18:0 또는 18:1 트라이글리세라이드 (순도> 99 %)를 500 ㎕ 분취량 (총 부피 1.5 ml)으로 각 바이알에 첨가하였다. 반응 혼합물을 진탕 인큐베이터 (200 rpm)에서 40 ℃로 반응시키고, 0, 24 및 96시간에 1 ml의 디메틸 클로라이드를 첨가하고 반응을 종결시켰다. 유리 지방산 메틸 에스테르의 생성은 가스 크로마토그래피 (GC)로 분석하였다. 가스 크로마토그래피(GC) 분석은 DB-1HT 컬럼 (30 m x 0.32 mm x 0.1 m)으로 Agilent Technologies 7820A에서 수행하였다. 오븐 온도를 40 ℃에서 1분 동안 유지한 다음 12 ℃/분의 속도로 28.167분 동안 350 ℃로 프로그래밍하였다. 캐리어 가스는 유량 350 ml/분의 공기이고, 인젝터는 3 μL의 주입 부피로 1:20으로 분할되었고, 검출기는 350 ℃에서 불꽃 이온화 검출기(FID)를 사용하였다(25 ml/분의 질소 구성 가스).
그 결과 도 12에 나타난 바와 같이, Lip-1307 생촉매는 포화지방 트리스테아린(tristearin, 18:0)과 불포화지방 트리올레인(triolein, 18:1)이 공존하는 상황에서 포화지방산의 메틸-스테아르산염(methyl-stearate)은 생산하지 않고 불포화지방산의 메틸-오레인산염(methyl-oleate)만을 선택적으로 시간이 경과 하면서 증가시키는 것을 확인하였다. 시판되고 있는 Amano사의 Lip-21과 유사한 정도의 우수한 활성을 나타내었다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Novel triolein selective lipase gene Lip-1307 derived from soil metagenome and use thereof <130> 2019p-11-040 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> lipase Lip-1307 <400> 1 Met Ser Ile Phe Thr Glu Trp Pro Thr Glu Arg Tyr Pro Thr Ser Leu 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ser Ile Ala Pro Gln Tyr Asp Lys Ser Thr Ala Leu Ala 20 25 30 Leu Ser Trp Ala Met Gln Leu Ala Tyr Glu Thr Gly Asn Arg Ala Lys 35 40 45 Leu Glu Arg Ile Val Arg Gln Trp Asp Trp Asp Phe Leu Asp Ile Tyr 50 55 60 Ala Ala Arg Val Gly Ser Ile Leu Pro Met Thr Ser Ala Lys Gly Phe 65 70 75 80 Ile Ala Gly Pro Arg Asp Leu Ala Ile Leu Ala Phe Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Pro Met Met Ile Asp Asp Trp Ile Ile Asp Phe Thr Val His Arg Asn 100 105 110 Ala Asp Gly Val His Glu Gly Phe His Gly Ala Val Gln Ser Ile Trp 115 120 125 Lys Pro Ile Ala Lys Ile Leu Gly Arg Asp Gly Glu Ala Gly Thr Arg 130 135 140 Arg Ile Leu Ile Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Val Leu 145 150 155 160 Ala Ala His Arg Leu Ile Lys Glu Gly Val Val Glu Pro Glu Arg Leu 165 170 175 Leu Gly Val Tyr Thr Tyr Gly Met Pro Arg Val Gly Asp Ala Glu Phe 180 185 190 Ala Ala Asn Tyr Ala Ala Thr Gly Asp Leu Glu Arg Arg Thr Tyr Arg 195 200 205 Phe Ile His Gly Glu Asp Ile Val Pro Gln Val Pro Pro Met Glu Glu 210 215 220 Pro Phe Asn Phe Arg His Val Gly Arg Ser Leu Gln Val Ala His Gly 225 230 235 240 Gly Leu Phe Gln Asn Ser Gln Phe Asp Ala Ile Gly Ala Thr Pro Phe 245 250 255 Ser Leu Thr Gly Ile Phe Gly Ala Leu Arg Thr Thr Pro Leu Ala Gln 260 265 270 Arg Pro Lys Phe Pro Gly Asp Pro Leu Val Ser Phe Ala Ile Ala Ala 275 280 285 Leu Pro Pro Ala Ile Arg Asp His Leu Pro Asp Gly Tyr Leu Arg Ala 290 295 300 Cys Gly Ala Thr Leu 305 <210> 2 <211> 930 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip-1307-sub-ORF1 <400> 2 atgagcatct ttacggaatg gccgacggaa cgctatccaa cctcgctccc gccgctgtcc 60 atcgcgcctc aatatgacaa gtcgacagcg ctcgcgctct cttgggcaat gcaactggcc 120 tatgaaaccg gcaatagagc caagctcgag cgcattgttc gccaatggga ctgggatttt 180 ctcgacatat acgccgcgcg tgttggcagc attttgccca tgaccagcgc caaaggcttt 240 atcgcaggtc cacgagacct cgcgatcctg gctttctcgg gcaccgatcc gatgatgatc 300 gatgactgga tcatcgattt taccgttcat cgcaatgccg acggcgtgca tgagggcttc 360 cacggtgctg ttcagtccat atggaaaccg atcgcgaaga tcctggggcg agacggcgag 420 gcgggcacac ggcgcattct catcaccgga catagccttg gaggcgcact ggccgtcttg 480 gcggcgcatc gattgatcaa agaaggggtg gtggagccgg aacgccttct gggggtctac 540 acttacggga tgccacgcgt aggcgatgct gaattcgcgg cgaattacgc ggcgacaggc 600 gatctggagc gtcgcaccta ccgcttcatt catggcgagg acatcgtccc gcaggtgccg 660 ccgatggagg aaccgttcaa ttttcgccat gtcggaagat ctttgcaggt cgcgcatggc 720 ggcttgttcc agaacagcca atttgacgcg atcggggcaa cgcccttctc cctcacagga 780 atattcggcg cgttgcggac cacgcccctg gctcagaggc ccaaattccc aggcgatcca 840 ttagtttctt ttgcgatagc agccctgcca ccggcgattc gcgatcattt gccggatggc 900 tatttgcgtg cctgcggcgc aacgctttag 930 <210> 3 <211> 2430 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip-1307-sub <400> 3 cgcatggtcc gggttcctcc tagagtccga cctgcaggca gtttccgccc ctgtccggag 60 atgttgatgc tcatacccgc gctgaacgcc gtctcaatcg cctttggcaa catccgggct 120 gggctcggca caattacacc tgcgtgggct ggaaccgtcc cgcgctgtct gccttggata 180 tcggtgtcgc cgtgaccagc cgcgctccgg catcggtcgc cagcacatcc gcttcaccat 240 tggttcgatg ctcgacccag aagtctttgc cggtggtgca agcgccaagg gatgcgccca 300 atataatggt cgctacaagc tgtcgggtaa gcatggcgga ctccccataa agaatgtact 360 accactagat cgcaatcaga gcgtgtagct taatactact tttagacgtc tgtccagtcc 420 gtcgctaaac gcactaaagc gttgcgccgc aggcacgcaa atagccatcc ggcaaatgat 480 cgcgaatcgc cggtggcagg gctgctatcg caaaagaaac taatggatcg cctgggaatt 540 tgggcctctg agccaggggc gtggtccgca acgcgccgaa tattcctgtg agggagaagg 600 gcgttgcccc gatcgcgtca aattggctgt tctggaacaa gccgccatgc gcgacctgca 660 aagatcttcc gacatggcga aaattgaacg gttcctccat cggcggcacc tgcgggacga 720 tgtcctcgcc atgaatgaag cggtaggtgc gacgctccag atcgcctgtc gccgcgtaat 780 tcgccgcgaa ttcagcatcg cctacgcgtg gcatcccgta agtgtagacc cccagaaggc 840 gttccggctc caccacccct tctttgatca atcgatgcgc cgccaagacg gccagtgcgc 900 ctccaaggct atgtccggtg atgagaatgc gccgtgtgcc cgcctcgccg tctcgcccca 960 ggatcttcgc gatcggtttc catatggact gaacagcacc gtggaagccc tcatgcacgc 1020 cgtcggcatt gcgatgaacg gtaaaatcga tgatccagtc atcgatcatc atcggatcgg 1080 tgcccgagaa agccaggatc gcgaggtctc gtggacctgc gataaagcct ttggcgctgg 1140 tcatgggcaa aatgctgcca acacgcgcgg cgtatatgtc gagaaaatcc cagtcccatt 1200 ggcgaacaat gcgctcgagc ttggctctat tgccggtttc ataggccagt tgcattgccc 1260 aagagagcgc gagcgctgtc gacttgtcat attgaggcgc gatggacagc ggcgggagcg 1320 aggttggata gcgttccgtc ggccattccg taaagatgct cattgccttc ctccctcctt 1380 gtcataggcg gtccggtatg gctggtctcg tgccgctcgc gcgtctgttt tggcgtctat 1440 cctgttctca aatagcggaa atgatcgccc tttgccgtct gtctggatag atcggattcg 1500 aatgcacgcc aggcgaactg cagttgaacg ttatggagcc cggtcattgg ccaggccatg 1560 ttcgaatccg ttcacattct gaccaacgct tgctacaacc tgctggaaaa atgcattaac 1620 ggcatcactg ctaacaaaga agtgtgcgaa ggttacgttt acaactctat cggtatcgtt 1680 acttacctga acccgttcat cggtcaccac aacggtgaca tcgtgggtaa aatctgtgcc 1740 gaaaccggta agagtgtacg tgaagtcgtt ctggaacgcg gtctgttgac tgaagcggaa 1800 cttgacgata ttttctccgt acagaatctg atgcacccgg cttacaaagc aaaacgctat 1860 actgatgaaa gcgaacagta atcgtacagg gtagtacaaa taaaaaaggc acgtcagatg 1920 acgtgccttt tttcttgtga gcagtaactt aaaaataaca atctaatatc aacttgttaa 1980 aaaacaagga aggctaatat gctagttgta gaactcatca tagttttgct ggcgatcttc 2040 ttgggcgcca gattgggggg aataggtatt ggttttgcag gcggattggg ggtgctggtt 2100 cttgccgcta ttggcgttaa acccggtaac atcccgttcg atgtcatctc cattatcatg 2160 gcggttatcg ccgctatttc tgccatgcag gttgctggcg gtctggacta tctggttcat 2220 cagacagaaa agctgctgcg ccgtaacccg aaatacatca cgatcctcgc accgatcgtg 2280 acctatttcc tgactatctt tgctggtact ggcaacatct ctctggcgac actgccagtt 2340 atcgctgaag ttgcgaagga acaaggcgtt aaaccttgcc gtccgctgtc tactgcaggc 2400 atgcaagctg gcgtaatcat tcattgtccg 2430 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip-1307-sub ORF1 forward <400> 4 gaaggagata tacatatgtc ccctatacta ggtta 35 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip-1307-sub ORF1 reverse <400> 5 aaagatgctg gatccacgcg gaaccagat 29

Claims (9)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 리파아제 단백질 존재 하에 지방산 트리글리세리드로부터 불포화지방산을 선택적으로 가수분해하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 지방산 트리글리세리드는 트리올레인 및 트리스테아린을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 불포화지방산은 트리올레인인 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 리파아제 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 유전자로부터 발현되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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