JPH04211368A - 脂肪酸特異性リパーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なリパーゼＢに関
する。

【０００２】

【従来の技術】リパーゼは文献でよく知られている。多
くの酵素のようにリパーゼはその特異性において、例え
ば、トリグリセリドのα−又はβ−エステル基に対する
特異性又はトリグリセリドの脂肪酸鎖の違いに対する特
異性が異なる。オレイン酸（９−シス−オクタデセン酸
）及びリノール酸（９−シス−１２−シス−オクタジエ
ン酸）のような９−シス不飽和脂肪酸のグリセロールエ
ステルに対して比較的高度の特異性を有するリパーゼに
関しての文献は知られている〔Ｆｒａｎｚｋｅ　等によ
るＤｉｅ　　Ｎａｈｒｕｎｇ、１７巻（１９７３年、２
号）、　１７１−１８４頁；　Ｓ．　Ｏｋｕｍｕｒａ　
等によるＡｇｒ．Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　、４０巻（
１９７６年、４号）、　６５５−６６０頁；　Ｍ．Ｗ．
　Ｂａｉｌｌａｒｇｅｏｎ等によるＡｐｐｌ．　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　　、３０巻
（１９８９年）、９２−９６　頁及びＲ．Ｇ．　Ｊｅｎ
ｓｅｎ　による考察、Ｌｉｐｉｄｓ、９巻（１９７４年
、３号）、　１４９−１５７頁を参照〕。これらの文献
に記載されている最大の特異性は、オレエート富有グリ
セリル−２−パルミテート−１，３　−ジオレエート（
ＯＰＯ　）からの９９％のオレイン酸（Ｏ）及び１％の
パルミチン酸（Ｐ）〔Ａｌｆｏｒｄによる　Ｊ．　Ｌｉ
ｐｉｄ．　Ｒｅｓ．　、５巻（１９６４年）　３９０−
３９４頁第４表参照、しかし、本明細書における第ＩＶ
表に与えられた結果の論考を参照〕、ヒマワリ油から生
成された９４．０％のＯ＋Ｌ（Ｌはリノール酸）と３．
１　％のＰ、アラキン油から生成される９４．４％のＯ
＋Ｌと４．６　％のＰ［Ｆｒａｎｚｋｅ　等によるＺｂ
ｌ．Ｐｈａｒｍ、１１１　巻（１９７２年）、１０２５
−１０３３　頁、第３表］、オリーブ油から生成された
９３−９３．３　％のＯ＋Ｌと５．７−５．９　％のＰ
［Ｋｒｏｌｌ　等によるＰｈａｒｍａｚｉｅ　、２８巻
（　　１９７３年）、２６３−２６９　頁、第５表］及
びＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　Ｌｉｎｋ
（ＡＴＣＣ　３４６１４）に関して、脂肪酸メチルエス
テルの競合的脂肪分解の動力学に基づいて、Ｏ／Ｐ＝１
００　：２５の比であり、Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ　に
関しては　１００：４のＯ／Ｐ比である　〔Ａｎｅｊａ
　Ｒ．によるＪＡＯＣＳ　、６４巻（１９８７年）、６
４５　頁〕。適度な速度で加水分解される、９−トラン
ス二重結合を有する脂肪酸のエステルは、９−トランス
−１２−シス−オクタデカジエン酸のエステルのみであ
る〔Ｒ．Ｇ．　Ｊｅｎｓｅｎ　及びＲ．Ｅ．　Ｐｉｔａ
ｓによるＬｉｐｉｄｓ、１巻（１９７６年）、１４１−
１４６　頁、Ｒ．　Ｐａｏｌｅｔｔｉ　等編、Ｒａｂｅ
ｎ　Ｐｒｅｓｓ　、ニューヨーク〕。

【０００３】例えば、Ｆｒａｎｚｋｅ　による１９７３
年の文献及びＪａｎｓｅｎの論考には、そのような特異
的９−シス脂肪酸リパーゼは、バクセン酸のような１１
−シス脂肪酸及び６−シス脂肪酸を９シス脂肪酸より非
常にゆっくりした速度で加水分解すると述べられている
。６−シス脂肪酸の例としてはペトロセリン酸（６−シ
ス−オクタデセン酸）及びγ−リノレン酸（６−シス−
９−シス−１２−シス−オクタデカトリエン酸）が挙げ
られる。これらの文献から、脂肪酸の特異性がグリセリ
ドのみならず、メチル又はブチルエステルのような他の
エステルに関しても見出だされたことが明らかである。

【０００４】本発明は、異なる９−シス脂肪酸特異性を
有する２種のリパーゼの混合物を産生する新規な　Ｇ．
　ｃａｎｄｉｄｕｍを見出だしたことに基づくものであ
る。さらに、これらのリパーゼの１つは９−シス脂肪酸
に対して選択的でなく、もう一方のリパーゼは９−シス
脂肪酸に対して非常に特異的であることが見出だされた
。本明細書において、特異的リパーゼをリパーゼＢと呼
び、非特異的リパーゼをリパーゼＡと呼ぶ。

【０００５】リパーゼＡ及びリパーゼＢは、良く知られ
た反応である、触媒としてリパーゼを用いる酵素的トラ
ンスエステル交換において用いられ得る。これらの反応
の例は、例えば英国特許第　１５７７９３３号に見られ
、例えは実施例１１で　　、Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ　
リパーゼは９−シス含有脂肪酸残基の交換に対して比較
的高度な特異性を有すると記載されている。

【０００６】本発明のリパーゼＢは、ブタペスト条約に
基づく寄託機関Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ　ｔｈｅ　ＣＡＢ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　（ＣＭ
ＩＣＣ　）に１９８９年１０月１７日に　ＣＭＩ　３３
５４２６　として寄託された微生物であるＧ．ｃａｎｄ
ｉｄｕｍの菌株により産生される細胞外リパーゼの一画
分である。リパーゼＢの単離は下記に記載する。リパー
ゼＢの非常に特異的な特性から考えると、リパーゼＢは
重要で新規な酵素であり、その化合物自体と種々の反応
、例えば非常に純粋なオレイン酸の製造における反応に
おけるリパーゼＢの用途との両方とも本発明の実施態様
となる。　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１０６巻（１９８
９年）、３８３−３８８　頁、“　ｃＤＮＡ　Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｇ．ｃａｎｄｉｄ
ｕｍ　Ｌｉｐａｓｅ　”で　Ｓｈｉｍａｄａ等はリパー
ゼ遺伝子のｃＤＮＡ配列を記載している。このヌクレオ
チド配列から、彼等は成熟　Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ　
　が５９，０８５の分子量を有する　５４４−アミノ酸
ポリペプチドであることを導き出した（　３８７頁、及
び　３８６頁の図４を参照）。しかし、彼等はその　３
８３頁に、用いたリパーゼは、Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ
ＡＴＣＣ　３４６１４であると述べており、このリパー
ゼはその論文の参考文献３　　　　　　［Ｔｓｕｊｉｓ
ａｋａ　等による、Ａｇｒ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．
　３７　巻（１９７３年、６号）、１４５７−１４６４
　頁］に　Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ　Ｌｉｎｋ　リパー
ゼとして述べている。この「ＡＴＣＣ　３４６１４」リ
パーゼは、Ｏ／Ｐが　１００：２５の加水分解比を有す
る、Ａｎｅｊａ　により用いられた（１９８７年の上記
文献参照）ものと同じものであり、そのことは、彼等は
本発明のリパーゼＢよりも特異性の非常に低いリパーゼ
を用いたことを意味する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、９−シス脂
肪酸エステルに対して非常に高度の特異性を有する新規
なリパーゼＢに関するものであり、本明細書では９−シ
ス脂肪酸エステルとは、−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）７−Ｃ
Ｈ　＝ＣＨ−Ｒ基を含有する脂肪酸であり、そのオレフ
ィン基はシス二重結合であり、Ｒ　は、メチル、エチル
、ヘキシル、オクチル基又はＣ３０までの基のような、
そしてリノール及びα−リノレン（９−シス−１２−シ
ス−１５−シスオクタデカトリエン酸）の残部のような
不飽和基を包含する、飽和又は不飽和炭化水素基である
、。Ｒ　基は分岐していてもよく、１以上の環状基又は
ヒドロキシル又はエポキシ基を含有していてもよい。た
だし、分枝又は置換が−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）７−ＣＨ
　＝ＣＨ−Ｒ基のエステル化−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）７
−ＣＨ＝ＣＨ−　部分又はＨＯ−ＣＯ−（ＣＨ２）７−
ＣＨ＝ＣＨ−Ｒ脂肪酸のエステル化におけるリパーゼ活
性を妨害しないものである。

【０００８】本発明は、本明細書に記載したように、４
０：６０乃至６０：４０の比のオレイン酸メチル及びパ
ルミチン酸メチルの１％の混合物と、約８のｐＨを有す
る水性相を含有する水中油型エマルジョンを２０ｍｌ加
水分解するために、４０℃、１５分間で約　２００−４
００　単位のリパーゼが用いられ、オレイン酸メチルと
パルミチン酸メチルとの比較試験において、オレイン酸
：パルミチン酸が、　１００：３より大きい比のオレイ
ン酸及びパルミチン酸を遊離すると定義される特異性を
有する、本質的に純粋なリパーゼＢを供給する。

【０００９】そのようなリパーゼＢの１例は下記の他の
特性を有する： ａ）実施例２に記載したように、グリコシル化形でＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより測定した５８．３ｋＤａ　の分子量
を有し、ｂ）約　５．９％の　Ａｌａ、　３．７％の　
Ａｒｇ、１５．９％のＡｓｎ　及び　Ａｓｐ、　９．３
％の　Ｇｌｎ及びＧｌｕ　、　５．３％の　Ｇｌｙ、　
３．４％の　Ｈｉｓ、　３．６％の　Ｉｌｅ、　９．２
％の　Ｌｅｕ、　４．０％のＬｙｓ　、　２．４％の　
Ｍｅｔ、　７．０％の　Ｐｈｅ、　６．２％の　Ｐｒｏ
、　８．３％の　Ｓｅｒ、　５．４％のＴｈｒ　、　５
．９％の　Ｔｙｒ及び、　４．５％の　Ｖａｌを含み、
ここで、国際的に認められたアミノ酸の三文字略号が用
いられており、そのパーセンテージはリパーゼＢの水解
物の総アミノ酸組成物の重量に基づくものであり、Ｃｙ
ｓ　と　Ｔｒｙの量が決定されていないアミノ酸組成物
であり、そして ｃ）　　Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　及びＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｔｒｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　の部
分的アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有する。 好ましくは、このアミノ酸配列は、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ　、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇ
ｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ　及びＴｈｒ−Ｉｌｅ−
Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ　から成る群から選択
される少なくとも１つの部分的アミノ酸配列を含有する
。

【００１０】本明細書で百分率及び量は他に表示がなけ
れば重量によるものであり、「本質的に純粋なリパーゼ
Ｂ」とは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８
％、より好ましくは９９％のリパーゼＢを含有し、従っ
て５％より多くの、好ましくは２％より多くの、より好
ましくは１％より多くの他の活性リパーゼを含有しない
活性リパーゼを意味し、百分率は、存在する活性リパー
ゼの総量に基づいて計算されたものである。従って、粗
リパーゼ混合物には、その他の成分が存在する。「活性
リパーゼ」は、脂肪酸エステルをなお加水分解できるリ
パーゼを意味する。従って、種々の原因で、例えば変性
により、不活性化されているリパーゼはもはや活性リパ
ーゼとはみなされない。

【００１１】

【課題を解決するための手段】リパーゼＢの使用　　本
発明はさらに、混合脂肪酸エステルに存在する９−シス
脂肪酸の選択的加水分解のために、特にオレイン酸と、
その他の脂肪酸、特に２価の９−デセノイル（−ＯＣＯ
−　（ＣＨ２）７−ＣＨ　＝ＣＨ−　）基を含有しない
脂肪酸、の脂肪酸残基を含有するエステルを加水分解し
、そしてその後にオレイン酸又は他の９−シス脂肪酸を
加水分解混合物から分離させることにより非常に純粋な
オレイン酸を生成するために上記定義のリパーゼＢを使
用することに関する。高オレインヒマワリ油からオレイ
ン酸を生成するための加水分解は、国際出願公開　８９
０３４１９号に記載されている。本発明のリパーゼＢは
、前記公報に記載されているリパーゼよりも、より特異
的である。従って、リパーゼＢは、例えば医薬的分野に
用途が見出だされる、非常に高純度のオレイン酸を生成
するために、オリーブ油及びタロー油のような、高含量
のオレイン酸残基を有するトリグリセリドの混合物を処
理するのに用いられ得る。しかし、オレイン酸のグリセ
ロールエステルに加えて、他のオリゴ、モノ−アルコー
ルのオレイン酸エステルも又、オレイン酸の生成のため
の出発物質として用いられる。トリ−、ジ−及びモノ−
グリセリドのように、他のアルコールのこれらのエステ
ルも又、オレイン酸残基以外の脂肪酸部分を含有し得る
し、特にもしこれらの他の脂肪酸が飽和されているか又
は９番目の炭素原子とカルボキシル基との間に１つ以上
のオレフィン基を含有するか又は９−トランスオレフィ
ン基を有するなら、同じ又は異なるアルコールと幾つか
の脂肪酸とのエステルの混合物で有り得る。純粋でない
オレイン酸のエステル混合物、例えば不飽和脂肪酸を加
水分解して得られるオレイン酸のエステル化異性体を含
有するエステル混合物も又オレイン酸源として用いられ
る。その場合、前記異性体とは対照的に真のオレイン酸
（９−シス−オクタデセン酸）のみが加水分解される。 又、リパーゼＢはリノール酸やオレイン酸のエステルと
他のエステル化された脂肪酸を含有する油から選択的加
水分解によってリノール酸又は、リノール酸とオレイン
酸の混合物を生成するのにも用いられる。同様に、９−
シス−パルミトレイン酸を含有するソースから純粋な９
−シス−パルミトレイン酸を生成することができる。こ
の様に、９−シス脂肪酸エステルのみが加水分解され、
他の（飽和、トランス異性体又は部位異性体）残基は全
く加水分解されないか又は実質的には加水分解されない
。

【００１２】リパーゼＢの他の使用には、９−シス脂肪
酸を選択的に交換するために、又は９−シス脂肪酸をエ
ステルと反応させることにより前記９−シス脂肪酸を前
記エステルに導入するために、９−シス脂肪酸を部分的
エステルと反応させることにより前記脂肪酸を前記部分
エステルに導入するために、又は、９−シス脂肪酸と、
１つ以上のヒドロキシル基を含有するアルコールとを、
一般に知られるエステル化の条件下で反応させるにより
前記９−シス脂肪酸と前記アルコールからのエステル又
は部分エステルを生成するために行われる、トリグリセ
リドの混合物をエステル交換することが包含される。例
えば、トリグリセリド中のモノ不飽和９−シス脂肪酸残
基、例えばオレイン酸残基を、少なくとも１つの９−シ
ス二重結合を有するポリ不飽和脂肪酸残基（しかし、６
−シス二重結合をも有するものは含まない）、例えばリ
ノール酸及びα−リノレン酸のような必須脂肪酸の残基
で置換するために、又はその逆の置換をするためにリパ
ーゼＢを用いることができる。リパーゼＢのこの使用の
一つの応用は、ＰＯＰ　、ＰＯＳ、ＳＯＳ　、ＰＬＰ　
、ＰＬＳ　及びＳＬＳ　、又はＬＰＬ　、ＬＳＬ　、Ｌ
ＰＯ　、ＬＳＯ　、ＯＰＯ　又はＯＳＯ　、（Ｌ　、Ｏ
　及びＰ　は上記で定義した通りであり、Ｓは飽和脂肪
酸、例えばパルミチン酸又はステアリン酸、のアルキル
カルボキシル残基を意味する）のような対称トリグリセ
リドの９−シス脂肪酸残基の交換を触媒することである
。モノ不飽和脂肪酸をポリ不飽和脂肪酸で置換すること
により、ヒト血中のコレステロール高含量を抑制するの
に望ましい成分であるポリ不飽和脂肪酸残基の含量が増
大したトリグリセリドを生成する。

【００１３】加水分解分解される又はエステル化される
脂肪酸は少なくとも１つの２価の９−デセノイル（−Ｏ
−ＣＯ−（ＣＨ２）７−ＣＨ＝ＣＨ−　）基を含有する
条件を満たす限り、そのエステルのモノー又はポリ−不
飽和脂肪酸残基の鎖長はさほど重要でない。しかし、Ｃ
１６−Ｃ１８脂肪酸残基を用いるのが好ましい。最も好
ましい脂肪酸残基はオレイン酸残基及びリノール酸残基
を含む。加水分解又は（インター）エステル交換は酵素
的トランスエステル交換に用いるものとして記載されて
いるいずれかの方法で行い得る（英国特許第　１５７７
９３３号、欧州特許第　００３４０６５号、欧州特許第
　００６９５９９号及び欧州特許第　００９３６０２号
を参照）。その反応は回分式又は連続式のいずれの方法
でも行い得る。反応系に非常に少量の水が存在すること
は酵素の活性を保持することにおいて有利である。欧州
特許第　００６４８５５号に記載されているように、系
の水の存在による有害作用を低減させるために、その系
に水乾燥手段を加えることができる。反応時間は、欧州
特許第　００９３６０２号に指摘されているように、２
時間以下が好ましい。反応温度は０乃至８０℃とするこ
とができ、４０乃至６０℃が好ましい。

【００１４】本発明は又、上記のリパーゼＢの使用によ
り得られる生成物にも関する。かかる生成物は、リパー
ゼＢを上記記載の使用態様の一つを用いることにより得
られる。又、前記生成物を含有する食用生成物にも関す
る。そのような食用生成物は、食品、例えばチョコレー
ト組成物及びベビーファッツ（　ｂａｂｙ　ｆａｔｓ）
、又マーガリンやその他のスプレッドを包含する。

【００１５】本発明を　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎ
ｄｉｄｕｍ（　ＣＭＩ　ＣＣ　３３５４２６）から単離
されるリパーゼＢで例示したが、本発明は、同じ又は異
なる数のアミノ酸残基を有し、１以上の異なるアミノ酸
組成を含有するリパーゼＢの改変物質をも、その生成ポ
リペプチドがなおリパーゼとして活性であり、上記リパ
ーゼＢと同等又はそれより高い特異性を有する限り、包
含する。リパーゼの高特異性が本質的に低減されないな
ら、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　）の
程度も又重要でない。

【００１６】本発明を下記の実施例により説明する。

【００１７】

【実施例】実施例　　１：　　研究室スケールの発酵槽
でのＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　リパー
ゼの産生　　牛乳から単離されたＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
　ｃａｎｄｉｄｕｍ　（ＣＭＩ　ＣＣ３３５４２６、上
記参照）の胞子を蒸留水１ｌ当たり、ＫＨ２ＰＯ４を　
１．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌを　１．０ｇ、ＭｇＳＯ４・７　
Ｈ２Ｏ　を１．２　ｇ、ディフコ・ベーター・ラブ・イ
ースト・エクストラクト（Ｄｉｆｃｏ　Ｂｅｔａ　　Ｌ
ａｂ　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　）を　２０．０　
ｇ、オリーブ油を２５．０ｇ、ＺｎＳＯ４を１７ｍｇ、
ＭｎＳＯ４を１７ｍｇ及びＦｅＳＯ４を１７ｍｇ含有す
る培地に接種した。すべての培地成分を一緒に　　１２
１℃で３０分間滅菌した。発酵を行うための出発パラメ
ーターは下記の通りである：　　温度　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３０℃　　一
連の３ラッシユトン勾配刃（Ｒｕｓｈｔｏｎ　ｐｉｔｃ
ｈｅｄ　ｂｌａｄｅｓ）　　　　　　を用いる攪拌　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　４００ｒ．ｐ．ｍ
．　　　風量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．１６ｖ／ｖ／ｍ　　　酸素補充　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３
２ｖ／ｖ／ｍ　　　　　ｐＨ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　６．４　 発酵のｐＨをリパーゼ生成の間、０．８８アンモニア溶
液を用いて　４．５に維持した。Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
の栄養増殖（　ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ　ｇｒｏｗｔｈ）
の間に生じるバイオマスの含量により、酸素高要求が満
たされ、溶解された酸素が２０％より多く維持されるよ
うにに、曝気及び攪拌の２つのパラメーターが変換され
ることが必要であった。これらのパラメーターを、生じ
る泡の程度に依存して、空気及び酸素の合わせた流速を
０．８３ｖ／ｖ／ｍ　まで、最大攪拌速度を８００ｒ．
ｐ．ｍ．　まで増加させた。泡はＳｉｌｃｏｌａｐｓｅ
５０００（商標名）（ＩＣＩ　から入手）を約　１００
ｐ．ｐ．ｍ．を接種時に添加して使用することによって
も調整した。上清中に見出だされるリパーゼの滴定量の
非常な増加は培養物の胞子形成と同時に起こるようであ
った。接種点からの回収の通常の時間は２４−３２　時
間であった。約２４時間で培地にさらに硫酸マグネシウ
ムを　０．２５ｇ／ｌ添加することが有利であることが
わかった。

【００１８】実施例　　２：　　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
　ｃａｎｄｉｄｕｍ　からの２つの細胞外リパーゼの精
製及び分離　　発酵培養物をホワットマン・ナンバー１
［Ｗｈａｔｍａｎ　Ｎｏ．　１　（商標名）］紙を用い
て濾過し、２つのリパーゼ（そのうちの１つが特異的リ
パーゼＢである）を含有する粗酵素溶液４リットルを得
た。ｐＨの調整を　５．８にし、　０．５％ｗ／ｖ　の
トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ　−１００（商標名）を
添加した後、この溶液を、５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨを５．８　に）中で平衡にしたＱセファロー
ス・ファースト・フロウ［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓ
ｔ　Ｆｌｏｗ　（商標名）、ファルマシアから入手］に
結合させた。この酵素を、１ｌの塩勾配液［５０ｍＭの
燐酸ナトリウム緩衝液中の０乃至　０．５Ｍ　のＮａＣ
ｌ（ｐＨを　５．８に）、流速１ｍｌ／　分］を用いて
、アニオン交換体から溶出し（最終量　３００ｍｌ）、
生物活性の１ピークを生じた。この濃縮リパーゼ溶液試
料（３０，０００単位）を水中に５０−５０　に希釈し
、２０ｍＭのピペラジン・ＨＣｌ　ｐＨ　４．０で平衡
にしたカチオン交換体Ｓセファロース・ファスト・フロ
ウ［（商標名）、ファルマシアから入手］を５ｍｌに結
合させた。流速２ｍｌ／　分でのＦＰＬＣにより生じる
、２０ｍＭのピペラジン・ＨＣｌ　中、４．０　乃至　
５．３からのｐＨ勾配液２００ｍｌ　が活性の２つのピ
ークを生じた。ｐＨ　４．２乃至　４．５で溶出された
最初のピークは、「リパーゼＡ」に相当し、溶出液の最
初の３５ｍｌ中に回収され、酵素１５００単位を得た。 ｐＨ４．７５　乃至　５．１で溶出された２番目のピー
クは、純粋な特異的「リパーゼＢ」に相当した（５０乃
至　１１５ｍｌの溶出液から回収された１３，０００単
位）。Ｓ−セファロース（商標名）からのリパーゼＡ及
びＢの溶出プロファイルを図１に示した。

【００１９】適切な標準を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り測定されたリパーゼＢの変性分子量は５８．３ｋＤａ
　であった。デグリコシル化（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａ
ｔｉｏｎ　）のためのＥｎｄｏ　Ｈ処理の後に、この方
法により見出だされたリパーゼＢの分子量は５４．０ｋ
Ｄａ　に減少した。

【００２０】２つの較正した、直列のスパロース（Ｓｕ
ｐｅｒｏｓｅ）１２（商標名）ＦＰＬＣカラム（ファル
マシアから入手）を用いるゲル濾過により測定した未変
性リパーゼＢの分子量は　４８．９　ｋＤａ　であった
。そのカラムを５０ｍＭの燐酸ナトリウム緩衝液中で平
衡（ｐＨを７．５　に、０．１５Ｍ　の塩酸）にし、非
特異結合を防ぐため、ウシ血清アルブミンで最初に被覆
した。カラムを較正するために下記の標準物質（ファル
マシアから入手）を用いた：カタラーゼ（　２３２ｋＤ
ａ　）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、フォスフォリ
ラーゼ（９７．４ｋＤａ　）、オボアルブミン（４５　
ｋＤａ）、キモトリプシノーゲン（２５ｋＤａ　）及び
リボヌクレアーゼ（１３．７ｋＤａ　）。試料を　２０
０　ｌループを経て装填させ、０．３ｍｌ／分で溶出し
、２００　ｌ　の画分を回収した。リパーゼは　２８０
ｎｍの吸収及び酵素活性により位置が確認された。

【００２１】４．５０のｐＩ（デグリコシル化のために
用いられる　Ｅｎｄｏ　Ｈ　を用いる処理の前及び後の
両方での）を等電点電気泳動により決定した。これは、
製造業者使用説明書により較正されたｐＨ　４．０−６
．５ゲルを用いてＰＨＡＳＴ　（商標名）ゲル系（ファ
ルマシアから入手）で行われた。

【００２２】実施例　　３：　　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ
　ｃａｎｄｉｄｕｍ　の他のリパーゼと比較したリパー
ゼＢの特異性　　最初に、Ｇ．　ｃａｎｄｉｄｕｍ　か
らの、下記のリパーゼの活性をオリーブ油標準分析を用
いて調べた。

【００２３】 Ｉ　　　　　　：　　天野製薬（株）、日本、名古屋、
ＩＩ　　　　：　　バイオキャタリスト・リミテッド（
ＢＩＯＣＡＴＡＬＹＳＴ　Ｌｔｄ．）、英国、ポンティ
プリーズＩＩＩ　　：　　ＡＴＣＣ　３４６１４、米国
、メリーランド州、ロックビル ＩＶ　　　　：　　ＮＲＲＬＹ５５２、ノーザン・ユー
ティリゼーション・リサーチ・アンド・ディベロップメ
ント・ディビジョン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｕｔｉｌｉｚ
ａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄＤｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、米国農業省、米国、イ
リノイ州、ピオリア Ｖ　　　　　　：　　ＮＲＲＬＹ５５３（同ソース）Ｖ
Ｉ　　　　：　　粗コルワース・リパーゼ（ＣＯＬＷＯ
ＲＴＨ　ＬＩＰＡＳＥ　） ＶＩＩ　　：　　コルワース・リパーゼＡＶＩＩＩ：　
　コルワース・リパーゼＢ各酵素溶液試料を、５％オリ
ーブ油、２％のアラビアゴム及び　０．５％のＣａＣｌ
２を含有する水中油型エマルジョン２０ｍｌに添加した
。そのエマルジョンは、ルーカス・ダウ（Ｌｕｃａｓ　
Ｄａｗ　）により市販されているウルトラソニック・ソ
ニフィーエ（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｓｏｎｉｆｉｅｒ
　）で速度６で３分間音波処理により生成した。オリー
ブ油標準分析法を４０℃で行い、脂肪酸の遊離を、０．
１ＮａＯＨ　でｐＨを８にして、自動滴定法［ラディオ
メーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）、商標名、コペンハ
ーゲン］で測定した。時間に対する滴定剤の量のカーブ
が得られた。リパーゼの活性はこのカーブの最大の勾配
から計算した。酵素の１単位は上記の条件下で、１分間
にオリーブ油から１モルの脂肪酸を遊離する酵素の量と
して定義される。

【００２４】さらに特異性の研究のために、異なる基質
が選ばれ、それによってエマルジョン中の５％オリーブ
油がその基質により下記の量で置換された。 １％パーム脂肪の液状部（ｐａｌｍ　ｏｌｅｉｎｅ　）
　　本実験で用いられる、パーム脂肪の液状部（ｐａｌ
ｍ　ｏｌｅｉｎｅ　）の脂肪酸組成を第Ｉ表に示した。

【００２５】第Ｉ表：　　本明細書に記載されたパーム
脂肪の液状部の脂肪酸組成 　　脂肪酸基　　　　　　　　　　　　１２：０　　１
４：０　　１６：０　　１６：１　　１８：０　　１８
：１　　１８：２　　１８：３及び　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　２０．０ 　　パーム脂肪液状部 　　　　における量　　　　　　　　　０．４　　　１
．０　　４０．２　　　０．２　　　４．３　　４２．
６　　１０．４　　　０．９ その反応はリパーゼ３０単位溶液で４０℃１５分間触媒
作用を受けた。消化は試料２ｍｌに対して１Ｍ　のＨＣ
ｌ　を１ｍｌ添加することにより終結した。消化生成物
を石油エーテル（沸点４０−６０　℃）で抽出し、アナ
ケム［（Ａｎａｃｈｅｍ　）、英国、ルートン］から入
手した、１ｍｍのシリカゲルＧで塗布した、２０×２０
　ｃｍ　ガラス板上での　ＴＬＣにより分離した。展開
を、７０：３０：１の割合での石油エーテル（４０−６
０　℃）／ジエチルエーテル／ギ酸中で行った。５０％
メタノール中０．０１％のフロキシン　　　　　　［（
Ｐｈｌｏｘｉｎ　）、商標名］を吹き掛けた後に紫外線
をあててバンドを可視化した。脂肪酸バンドをジエチル
エーテルで抽出し、触媒として、メタノール中の１４％
三フッ化ホウ素を用いてメチル化した。遊離脂肪酸の組
成を、エマルジョンの遊離脂肪酸の最初の量と１５分間
の値との違いとして測定した。その結果を第ＩＩ表に示
した。この結果により、不飽和基質に対してリパーゼＢ
は高特異性を示した。パーム脂肪液状部からリパーゼＢ
により遊離された脂肪酸は、パルミチン酸を　０．４％
しか含有しなかった。それに対し、他の　Ｇｅｏｔｒｉ
ｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　　リパーゼを用いて、パ
ーム脂肪の液状部から実質量のパルミチン酸が遊離され
た。

【００２６】第ＩＩ表：　　本明細書に記載した条件下
で種々の　　Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ
　リパーゼによりパーム脂肪液状部から遊離された脂肪
酸の組成（％）　　　　　　　　　　　　　　　　 リパーゼ　　　　　　　　Ｉ　　　　　ＩＩ　　　　　
ＩＩＩ　　　　　ＩＶ　　　　　Ｖ　　　　　ＶＩ　　
　　　ＶＩＩ　　　　　ＶＩＩＩ 脂肪酸： １６：０　　　　　　　　　２１．０　　　３４．７　
　　　４１　　　　　　７．８　　　１８．９　　２０
．５　　　　４０．５　　　　　０．４　１８：０　　
　　　　　　　　０．７　　　　０．５　　　　　１．
０　　　　０．０　　　　０．０　　　０．２　　　　
　０．９　　　　　０．０　１８：１　　　　　　　　
　６７．６　　　５２．８　　　　４４．８　　　７７
．３　　　６９．５　　６６．６　　　　４６．２　　
　　８３．９　１８：２　　　　　　　　　１０．７　
　　１２．０　　　　１３．２　　　１４．９　　　１
１．６　　１２．７　　　　１２．４　　　　１５．７
　 ０．５　％の、オレイン酸、パルミチン酸、エライジン
酸及びバクセン酸（＝１１−　シス−　オクタデセン酸
）のメチルエステル 　　反応は、酵素溶液を５単位用いて、３０℃で３分間
行われた。各メチルエステルの加水分解の速度はオレイ
ン酸メチルの速度と比較して計算し百分率で表した。そ
の結果を第　ＩＩＩ表に示した。パルミチン酸メチルエ
ステルにおいてリパーゼＢが非常に低い活性であること
を確認するために、反応を　２００単位の酵素で触媒し
たが、なお０に近い速度を示した。

【００２７】第　ＩＩＩ表：　　本明細書に記載された
条件下で種々のＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕ
ｍ　リパーゼによる、脂肪酸のメチルエステルの加水分
解の比較速度　　　　　　　　　　　　　　　　　　 リパーゼ　　　　　　　　　Ｉ　　　ＩＩ　　　　ＩＩ
Ｉ　　　　ＩＶ　　　　Ｖ　　　　　ＶＩ　　　　ＶＩ
Ｉ　　　　　　ＶＩＩＩオレイン酸 　　エステル　　　　　１００　　　１００　　　１０
０　　　１００　　　１００　　　１００　　　　１０
０　　　　　　１００エライジン酸 　　エステル　　　　　　２０．２　　３０．２　　１
５．２　　４１．１　　３４．８　　１５．９　　　２
３．９　　　　　　０．７バクセン酸 　　エステル　　　　　　１０．６　　１５．９　　２
１．０　　２２．２　　２６．１　　　８．５　　１３
．１　　　　＜　０．０１　パルミチン酸 　　エステル　　　　　　４５．７　　６６．７　　４
２．９　　５４．４　　３４．４　　２６．８　　６４
．２　　　　＜　０．００１ １％の、オレイン酸メチルとパルミチン酸メチルの等モ
ル混合物　　　３０９オリーブ油単位のリパーゼＢによ
り加水分解を触媒した。試料の脂肪酸組成を、パーム脂
肪の液状部に関して記載されたように１５分間反応後に
測定した。ただし、唯一の違いは、残存するメチルエス
テルからの遊離の脂肪酸の分離は薄層クロマトグラフィ
ー［石油エーテル（沸点４０−６０　℃）／ジエチルエ
ーテル／ギ酸を９０：１０：１］で行ったことであった
。ＦＦＡ　の組成は１％のパルミチン酸エステルと９９
％のオレイン酸エステルであった。

【００２８】リパーゼＢの特異性を、０．５　％ＣａＣ
ｌ２を含有する２％のアラビアゴム中、４０℃で下記の
基質のエマルジョンで調べた： １％ＰＰＯ＝グリセリル　２，３（１）−ジパルミチン
酸エステル−１　（３）−オレイン酸エステル１％ＰＯ
Ｐ＝グリセリル　１，３−ジパルミチン酸エステル−２
−オレイン酸エステル １％ＳＯＳ＝グリセリル　１，３−ジステアリン酸エス
テル−２−オレイン酸エステル この反応を３０オリーブ油単位のリパーゼＢを用いて１
５分間行った。トリグリセリドから遊離された遊離脂肪
酸の分析を、パーム油脂肪液状部に関して記載したよう
に行った。その結果を第ＩＶ表に示した。この結果から
不飽和基質に対するリパーゼＢの高特異性を確認した。 特に、リパーゼＢ及びＰＰＯ、ＰＯＰ及びＳＯＳを用い
てのオレイン酸エステル／パルミチン酸エステル／ステ
アリン酸エステルの比として表されたその結果は、上記
のアルフォード等による（１９６４年）第４表に記載さ
れたものより非常に良かった。

【００２９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　リ
パーゼＢ　　　　　　　　　　　　アルフォード・リパ
ーゼ　　　　　　　　ＰＯＰ　　　　　　　　　　９８
．９：１．１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　８０：２０　　　　　　　　ＰＰＯ　　　　　　　
　　　９９．５：０．５　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　６５：３５　　　　　　　　ＳＯＳ　　
　　　　　　　　９９．１：０．１　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　９８：　２ 第ＩＶ表：　　本明細書に記載された条件下でリパーゼ
Ｂにより純粋なトリグリセリドから遊離される脂肪酸の
組成（％）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　脂肪酸　　　　　　　　　　　　１６：０　　　　
　　　　　　　１８：０　　　　　　　　　　　　　　
　１８：１トリグリセリド： ＰＯＰ　　　　　　　　　　　　　１．１　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　９８．９ＰＰＯ　　　　　　　　　　　　　０．５　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　９９．５ＳＯＳ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１　　　　　
　　　　　　　　　　　９９．９

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、リパーゼＡおよびリパーゼＢの、Ｓセ
ファロースからの溶出プロファイルである。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　４０：６０乃至６０：４０の比である
   オレイン酸メチルとパルミチン酸メチルの混合物を１％
   と、ｐＨが約８である水性相を含有する水中油型エマル
   ジョン２０ｍｌを加水分解するためには、４０℃で１５
   分間、約　２００乃至　４００単位のリパーゼが用いら
   れ、オレイン酸メチルとパルミチン酸メチルを用いる比
   較試験で１００　：３より大きい、オレイン酸とパルミ
   チン酸の比で、オレイン酸とパルミチン酸を遊離させる
   と定義された特異性を有する、本質的に純粋なリパーゼ
   Ｂ。
2. 【請求項２】　　ａ）グリコシル化形（ｇｌｙｃｏｓｙ
   ｌａｔｅｄ　ｆｏｒｍ　）でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測
   定した５８．３ｋＤａ　の分子量を有し、 ｂ）約　５．９％の　Ａｌａ、　３．７％の　Ａｒｇ、
   １５．９％のＡｓｎ　及び　Ａｓｐ、　９．３％の　Ｇ
   ｌｎ及びＧｌｕ　、　５．３％の　Ｇｌｙ、　３．４％
   の　Ｈｉｓ、　３．６％の　Ｉｌｅ、　９．２％の　Ｌ
   ｅｕ、　４．０％のＬｙｓ　、　２．４％の　Ｍｅｔ、
   　７．０％の　Ｐｈｅ、　６．２％の　Ｐｒｏ、　８．
   ３％の　Ｓｅｒ、　５．４％のＴｈｒ　、　５．９％の
   　Ｔｙｒ及び、　４．５％の　Ｖａｌを含有し、そのパ
   ーセンテージはリパーゼＢの水解物の総アミノ酸組成物
   の重量に基づくものであり、Ｃｙｓ　と　Ｔｒｙの量が
   決定されていないアミノ酸組成物を有し、そして ｃ）　　Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ａ
   ｓｐ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ　及びＧｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
   Ｔｒｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａ
   ｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　の部
   分的アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有するという付
   加的特性を有する、請求項１に記載のリパーゼＢ。
3. 【請求項３】　　Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｔ
   ｈｒ−Ｇｌｙ　、Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇ
   ｌｕ−Ｇｌｙ　及びＴｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−
   Ｐｒｏ−Ｖａｌ　から成る群から選択される部分的アミ
   ノ酸を少なくとも１種含有するアミノ酸配列を有する、
   請求項１又は請求項２に記載のリパーゼＢ。
4. 【請求項４】　　活性リパーゼＢの含量が、存在する活
   性リパーゼの総量の少くとも９８％、好ましくは、少な
   くとも９９％である、請求項１乃至３のいずれかに記載
   のリパーゼＢ。
5. 【請求項５】　　触媒としてのリパーゼの存在下で、９
   −シス脂肪酸の混合エステル中に存在する９−シス脂肪
   酸の選択的加水分解の方法であって、請求項１乃至４の
   いずれかに記載のリパーゼＢを用いることを含む方法。
6. 【請求項６】　　オレイン酸及び、特に、二価の９−デ
   セノイル（−Ｏ−ＣＯ−（ＣＨ２）７−ＣＨ　＝ＣＨ−
   　）基を含有しない脂肪酸である、他の脂肪酸の脂肪酸
   残基を含有するエステルの加水分解を行ない、次いで加
   水分解混合物からオレイン酸を分離することにより、非
   常に純粋なオレイン酸（９−シス−オクタデセン酸）を
   製造する、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】　　トリグリセリドの混合物を、インター
   エステル交換用触媒としてのリパーゼの存在下でインタ
   ーエステル交換する方法であって、選択的に９−シス脂
   肪酸を交換する目的で、請求項１乃至４のいずれかに記
   載されたリパーゼＢを用いることを含む方法。
8. 【請求項８】　　９−シス脂肪酸を、触媒としてのリパ
   ーゼの存在下でエステルと反応させることにより、前記
   ９−シス脂肪酸を前記エステルに導入する方法であって
   、請求項１乃至４のいずれかに記載のリパーゼＢを用い
   ることを含む方法。
9. 【請求項９】　　９−シス脂肪酸を部分的エステルと反
   応させることにより前記脂肪酸が前記部分的エステルに
   導入される、請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】　　９−シス脂肪酸と、１つ以上のヒド
    ロキシル基を含有するアルコールをリパーゼの存在下で
    酵素的エステル化として一般的に知られる条件下で反応
    させることにより、前記９−脂肪酸及び前記アルコール
    からエステル又は部分的エステルを製造する方法であっ
    て、請求項１乃至４のいずれかに記載のリパーゼＢを用
    いることを含む方法。
11. 【請求項１１】　　加水分解、エステル化又はインター
    エステル交換用の触媒として、請求項１乃至４のいずれ
    かに記載のリパーゼＢを用いることにより得られる生成
    物。
12. 【請求項１２】　　請求項５乃至１０のいずれかに記載
    の方法により、その後任意に分離工程を行うことにより
    得られる請求項１１に記載の生成物。
13. 【請求項１３】　　請求項１１又は請求項１２に記載の
    生成物を含有する食品。