KR100488813B1

KR100488813B1 - 셀룰로모나스 속 gm13 균주 유래의 신규한 엑소키티나아제유전자

Info

Publication number: KR100488813B1
Application number: KR10-2001-0015380A
Authority: KR
Inventors: 신용철; 전영중; 정경화; 최연진
Original assignee: 아미코젠주식회사
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2001-03-23
Publication date: 2005-05-12
Also published as: KR20020075144A

Abstract

본 발명은 셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 신규한 엑소키티나아제 유전자, 상기 엑소키티나아제 유전자 암호화 단백질의 아미노산 서열, 상기 유전자 클로닝을 통한 재조합 엑소키티나아제의 제조 및 상기 제조된 엑소키티나아제를 이용한 키틴 단량체 NAG의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명 엑소키티나아제 유전자는 기존의 공지된 엑소키티나아제 유전자와 그 염기서열 및 아미노산 서열이 상이한 신규한 유전자이며, 재조합 미생물로부터 제조된 엑소키티나아제는 NAG 2당체뿐만 아니라 고중합도의 키틴 올리고당도 효과적으로 분해할 수 있어 키틴 및 키틴 올리고당으로부터 NAG를 생산하기 위한 효소공정에 매우 유용하게 사용할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있다.

Description

셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 신규한 엑소키티나아제 유전자{Novel exochitinase gene from Cellulomonas sp. G13 strain}

본 발명은 셀룰로모나스 속 GM13균주 유래의 신규한 엑소키티나아제 유전자 및 그 유전자 산물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토양 분리균인 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) GM13 균주로부터 엑소키티나아제(exochitinase, N-acetyl- β-D-glucosaminidase)를 암호화하는 신규한 유전자를 분리하고 이를 외래 미생물에 클로닝하여 엑소키티나아제를 제조한 후, 상기 제조된 엑소키티나아제를 이용하여 키틴으로부터 키틴 단량체인 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법에 관한 것이다.

섬유소 다음으로 풍부한 생물질(biomass)인 키틴은 NAG를 기본 단위로 하여 β-1, 4 결합으로 연결된 다당류로서 분자량은 약 1×10⁶정도이다. 키틴은 게, 크릴새우, 보리새우 등과 같은 바다 갑각류들과 거미, 개미, 메뚜기 등과 같은 곤충의 외피를 구성하는 주성분이며, 미생물에서는 녹조류, 효모, 사상균 등의 세포벽 성분으로 발견된다.

이러한 키틴은 최근에 중요한 천연자원으로서 그 응용성이 점차 증가되고 있다. 특히 키틴의 산 가수분해법에 의해 생산되고 있는 D-glucosamine(이하, DGA)과 DGA의 아세틸화 형태인 NAG는 퇴행성 관절염에 효과가 뛰어난 것으로 밝혀졌으며 또한 이들은 항염증, 심장보호, 간장보호, 물질동화 촉진에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그런데 키틴 단량체인 NAG는 생체내 결합조직이나 힘줄, 연골조직 등의 당단백질을 만드는 주요성분으로서 NAG를 포함하는 당단백질은 세포와 세포사이를 연결하는 결합물질로서 조직이나 기관의 완전한 유지에 필수적이다. 이러한 NAG는 소화관의 점막을 구성하는 주요성분으로서 소화관 궤양치료에 도움을 주는 것으로도 알려졌다. 또한 체내에서 NAG가 DGA보다 점막세포에서 훨씬 빨리 이용되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실들로 미루어볼 때 NAG는 DGA보다 개량된 생물 신소재로서 그 효용가치가 매우 높을 것으로 판단된다.

이와 같이 의약용 소재로서의 효용가치가 큰 NAG는 현재 키틴을 6∼12N HCl, 60∼80℃ 조건으로 가수분해하는 산 분해법(acid hydrolysis)으로 생산되고 있다.

이러한 산 분해 과정에서 키틴이 단당으로 분해되고 동시에 탈아세틸화가 일어나 DGA와 NAG가 같이 생성된다. 산 분해 조건에 따라서 DGA와 NAG의 상대적인 비율이 달라질 수 있다. 그러나 탈아세틸화를 줄이기 위해서 산의 농도와 온도를 낮추게 되면 키틴으로부터 얻어지는 NAG의 효율이 낮아지는 문제점이 있다. 게다가 이러한 기존의 NAG 제조공정은 고농도 산을 사용하기 때문에 장치의 부식, 작업의 위험, 불순물 제거를 위한 복잡한 정제공정을 필요로 하는 단점이 있다.

그러나 효소를 사용하여 NAG를 생산하게 되면 이러한 단점을 극복할 수 있을 것이다. 특히 효소적 방법에 의한 키틴 분해의 경우에는 분해산물인 NAG의 탈아세틸화가 일어나지 않기 때문에 불순물이 생기지 않아 정제 공정이 매우 단순하고 높은 수율로 NAG를 생산할 수 있는 장점이 있다. 그런데 키틴으로부터 효소적 방법에 의해 NAG를 생산하기 위해서는 엔도키티나아제(endochitinase)와 아울러 엔도키티나아제에 의해 생성된 키틴 올리고당을 NAG로 완전 가수분해시키는 엑소키티나아제가 필요하다. 그러나 결정상태의 딱딱한 키틴을 올리고당으로 효과적으로 분해할 수 있는 엔도키티나아제의 개발과 키틴 올리고당으로부터 키틴 단량체인 NAG를 효율적으로 분해할 수 있는 엑소키티나아제의 개발이 부진하여 아직까지 효소적 방법에 의한 NAG 생산 공정이 개발되지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 키틴 올리고당으로부터 NAG를 생산하는 효소공정에 사용될 수 있는 엑소키티나아제의 유전자원을 획득하기 위해서 유전자 재조합 기술을 이용하여 토양 분리균인 셀룰로모나스 속 GM13 균주로부터 엑소키티나아제 유전자를 분리하였고, 그 유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 결정하여 신규한 유전자임을 확인하였다. 또한 재조합 대장균에서 생산되는 셀룰로모나스 속 유래의 엑소키티나아제를 정제하여 효소 특성을 조사한 결과 기존의 엑소키티나아제와는 반응특성이 다른 신규한 효소임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 엑소키티나아제 유전자의 염기서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 전기 염기서열로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리 유전자를 외래 미생물에 클로닝하여 엑소키티나아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조된 엑소키티나아제를 이용하여 키틴으로 부터 키틴 단량체인 NAG를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 키틴 단량체인 N-아세틸글루코사민(N-acetyl-β-D-glucosamine, 이하 NAG)을 제조할 수 있는 셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 신규한 엑소키티나아제 유전자, 상기 엑소키티나아제 유전자 암호화 단백질의 아미노산 서열, 상기 유전자 클로닝을 통한 재조합 엑소키티나아제의 제조 및 상기 제조된 엑소키티나아제를 이용한 키틴 단량체 NAG의 제조방법에 관한 것이다.

키티나아제 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 키티나아제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용가능하다. 크로마토그래피 방법에 의해 순수 분리한 본 발명 키티나아제의 순도 검정은 전기영동법을 이용하여 증명하였으며. 표준분자량 물질과 함께 이동시켜 이동거리를 비교함으로써 키티나아제 분자량을 결정하였다. 본 발명자들은 Superose 12HR 칼럼을 통과한 활성분획의 시료가 전기영동 수행시 약 54,000 달톤의 위치에서 단일 밴드를 보여 엑소키티나아제가 순수하게 정제되었으며 그 분자량이 약 54,000 달톤임을 알 수 있었다.

본 발명에서 셀룰로모나스 GM13 균주로부터 키틴분해 활성을 갖는 키티나아제 유전자를 분리하는 것은 통상의 유전자 분리방법에 준하여 행할 수 있는데, 예컨대 유전자 단편의 삽입이 가능한 벡타를 이용하여 유전자 라이브러리를 제조하고 이들 라이브러리로부터 원하는 키티나아제 유전자를 하나씩 분리하기 위해 이미 알려진 키틴 분해효소 유전자의 유전자의 활성 부위의 보존 지역 중 일부 영역을 DNA 합성기를 이용하여 프로브용 올리고 DHA를 합성한 후, 상기 합성 DNA 프로브를 이용하여 라이브러리 클론과 서던 블로팅을 행하여 시그널을 나타내는 클론을 선별하고 선발된 클론에 대해서 키틴분해활성을 측정할 수 있다. 본 발명 유전자의 분리방법 및 확인방법은 실시예에 기재되어 있다.

셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 엑소키티나아제를 암호화하는 유전자의 염기서열을 결정하여 도 1에 도시한 바와 같이 유전자는 247번 염기에서 1,731번 염기까지의 1,485개의 염기로 구성되며(서열번호 1), 상기 유전자는 도 2에 도시한 바와 같이 494개의 아미노산을 암호화한다(서열번호 2). 한편, 본 발명 엑소키티나아제는 유전자 산물의 아미노산 염기서열에서 세포 외 분비를 담당하는 신호서열이 없어 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 세포 내에서 생산되기 때는 특성을 가지고 있었다.

당업자들은 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 엑소키티나아제 유전자 염기서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함다는 것을 명백히 이해하고 있을 것이다.

따라서, 본 발명에 의해 해석되는 핵산분자는 본 발명 핵산서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 엑소키티나아제 유전자 염기서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.

본 발명은 엑소키티나아제 효소 아미노산 서열(서열번호 2)뿐만 아니라, silent change에 따라 서열내에서 다른 아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. 예컨대, 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있다 (silent change). 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명 엑소키티나아제 효소 단백질 및 아미노산 서열간의 일정범위의 상동성, 예컨대 90-100% 범위내의 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편(fragments) 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명 엑소키티나아제 유전자 염기서열을 공지의 다른 유전자들과 염기서열 상동성을 비교해 보았을 때, 공지의 다른 키티나아제 유전자와는 매우 상이한 상동성을 나타내어 본 발명 유전자가 신규한 유전자임을 확인할 수 있었다. 예컨대 스트렙토미세스 속 엑소키티나아제 유전자(GenBank AF063001)와 약 35%, 비브리오 속 엑소키티나아제 유전자 (GenBank U41417, U24658)와는 약 28%, 트리토더마 속 엑소키티나아제 유전자 (GenBank S80069)와는 약 25%정도의 상동성을 보였다.

본 발명 엑소키티나아제 단백질과 공지의 다른 엑소키티나아제 간에 아미노산 서열 상동성을 비교한 결과, 본 발명의 엑소키티나아제는 당 가수분해효소 20번 군(glycosyl hydrolase family 20)에 속하고, 엑소키티나아제 활성부위로 추정되는 302번째 글루탐산 잔기가 보존되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기한 핵산 염기서열 뿐만 아니라, 이러한 염기서열을 갖는 DNA가 삽입된 재조합 발현벡터도 포함한다. 당업자들은 DNA 절편을 벡터내로 삽입하는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 적절한 전사/해독 조절서열 및 엑소키티나아제 효소 암호화 핵산서열을 이용하여 엑소키티나아제 효소를 암호화하는 발현벡터를 제조할 수 있다. 상기 재조합 발현벡터는 선택된 숙주내에서 작용하는 한 어떠한 벡터도 작용가능한데, 예컨대 당업계에 공지된 통상적인 발현벡터인 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 등이 이용될 수 있다. 발현벡터를 구축하는 방법은 그 자체가 공지되어 있고, 예컨대 Sambrook등의 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989))에 개시되어 있다.

그렇게 하여 제조된 재조합 발현벡터는 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다.

재조합 DNA의 적당한 발현세포로는 세균, 방선균류, 효모, 곰팡이, 동물세포, 곤충세포, 또는 식물세포 등이 이용될 수 있다.

본 발명 엑소키티나아제 효소 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여 엑소키티나아제를 제조할 수 있다.

본 발명 엑소키티나아제 효소 활성을 결정하는 온도, pH 등에 대한 효소 활성 변화를 조사한 결과, 최적 반응온도는 약 55℃이고, 40℃이하의 온도에서는 1시간 방치 후에도 90% 이상의 활성이 남아 있었으나 50℃ 이상의 온도에서는 급격히 실활되어 1시간 후에는 40% 이하의 활성만 존재하였으며, pH 6.0에서 최적 활성을 보이고, pH 7.0과 8.0 사이에서 90% 이상의 활성을 나타내어 이 범위의 pH에서는 비교적 안정한 것으로 나타났다.

본 발명 엑소키티나아제의 기질 특이성을 조사하기 위하여 엑소키티나아제를 위한 인공기질인 p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(pNP-NAG)과 구조적으로 유사한 pNP-N-acetyl-α-D-glucosaminide, pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide, pNP-β-D-mannopyranoside, pNP-β-D-galactopyranoside, pNP-β-D-glucopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside를 기질로 하여 효소활성을 측정한 결과, 인공기질인 pNP-NAG를 가장 잘 가수분해하였으며 pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide에 대해서는 pHP-NAG에 대한 활성과 비교하여 약 20%의 효소활성을 나타내었으나, 나머지 기질에 대해서는 전혀 효소활성을 나타내지 않았다. 특히, 본 발명의 엑소키티나아제는 α-form으로 연결된 동일한 구조의 이성체인 pNP-N-acetyl-α-D-glucosaminide를 전혀 가수분해하지 못하였다.

본 발명 엑소키티나아제 절단 특이성을 조사하기 위하여 NAG의 2당체부터 5당체의 유사체인 pNP-(NAG)₁부터 pNP-(NAG)₄를 기질로 사용한 결과, NAG 2당체의 유사체인 pNP-(NAG)₁를 가장 잘 분해하는 것을 알 수 있었으며 또한 엑소키티나아제는 NAG 2당체뿐만 아니라 3당 이상의 올리고당도 비환원 말단부터 순차적으로 분해하여 p-nitrophenol을 생성함을 알 수 있었다. 즉 본 발명 엑소키티나아제는 NAG 2당체 뿐만 아니라 3당 이상의 키틴 올리고당도 효과적으로 가수분해할 수 있는 특성이 있다. 실제로 본 발명의 엑소키티나아제를 이용하여 키틴 올리고당 혼합물을 가수분해시켰을 때, NAG 2당체뿐만 아니라 3당 이상의 올리고당까지 모두 분해하여 반응산물로서 키틴의 단량체인 NAG만이 생성되는 것을 확인할 수 있었다.

그런데 대부분의 공지된 엑소키티나아제는 NAG 2당체를 잘 분해하기는 하지만 3당 이상의 올리고당에 대해서는 활성이 없는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명의 엑소키티나아제는 키틴으로부터 엔도키티나아제에 의해서 생성된 키틴 올리고 당을 분해하여 NAG를 생산하는데 있어서 더욱 효과적이라고 판단된다.

당업자는 상기 제조방법에 의해 제조된 엑소키티나아제를 포함하는 배양물 또는 조성물 형태로, 또는 분리된 효소를 유리상태 또는 고정화시킨 상태로 상기 설명한 바와 같은 키틴분해 활성을 이용하여 목적 산물을 제조할 수 있다.

본 발명 엑소키티나아제 단백질의 키틴분해 활성을 이용한 다양한 산업적 응용이 가능하다. 본 발명 엔도키나아제를 이용하여 제조한 수용성 저분자 키토산, 키틴 및 이들의 올리고당은 식품, 화장품, 의약품, 농업분야 등의 분야에 광범위하게 이용할 수 있다. 예컨대, 본 발명 엑소키티나아제를 택일적 또는 다른 키티나아제 단백질과 조합적으로 사용함으로써 NAG 단량체 및/또는 키틴올리고당을 제조할 수 있어 건강음료 및 식품개발 등이 가능하다. 또한, 키틴은 곤충이나 곰팡이 또는 선충류 등 농업적 중요 병해충의 세포벽을 구성하는 성분으로 지금까지 병해충 방제는 주로 농약과 같은 화학적 방제에 의존적이나 이러한 구제방법은 환경오염 및 생태계 파괴, 생물농축으로 인한 인축에 대한 독성 부작용 등으로 인해 키틴분해 활성을 갖는 키티나아제를 이용한 농작물 병해충에 대한 생물적 방제에 관한 연구가 많이 이루어지고 있다. 따라서, 본 발명 키틴 분해활성을 갖는 키티나아제 유전자로 형질전환된 세균을 함유하는 미생물 제제를 식물 또는 그 재배지에 적용하거나 또는 본 발명 키티나아제 유전자로 형질전환된 식물을 제조한다면 병해충의 방제도 가능할 것으로 판단된다. 외래 유전자의 미생물 또는 동식물 형질전환 방법은 당업계에 이미 공지되어 있으며, 당업자는 아무런 어려움없이 적절한 미생물과 발현벡터를 적의 선택하여 수행할 수 있다.

본 발명은 셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 엑소키티나아제 유전자의 분리 단계; 클로닝된 유전자의 염기서열 결정 및 분석 단계; 재조합 대장균에서 생산된 엑소키티나아제의 정제 및 정제된 효소의 특성 조사 단계로 구성된다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 셀룰로모나스 속 GM13균주 유래의 엑소키티나아제 유전자의 분리

셀룰로모나스 속 GM13 균주를 LB 액체배지에서 진탕배양한 다음 회수된 균체로부터 Saito와 Miura의 방법(Biochim. Biophys. Acta., 72: 619-629 (1963))으로 염색체 DNA를 분리하였다. 염색체 DNA를 Sau3AI 제한효소로 부분절단하고 3-9 kb 크기의 DNA단편을 분리한 후에 이들 DNA 조각을 BamHI으로 완전절단하고 CIP로 탈인산화시킨 pUC19 플라스미드와 접합시켰다. 이 접합 DNA를 가지고 전기천공법으로 대장균(E. coli JM83)을 형질전환시킨 후에 50 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린 항생제가 함유된 MacConkey 한천배지에 도말하여 형질전환체들을 얻었다.

MacConkey 평판한천배지에 생성된 콜로니들 중에서 흰색을 띠는 형질전환체들을 50 ㎍/㎖ 앰피실린과 2 mM p-nitrophenyl-β-D-N-acetylglucosamine이 첨가된 LB배지에 접종하여 37℃에서 14시간 배양한 후에 노란색을 나타내는 형질전환체를 선발하였다. 그 결과, 약 5,000여 마리의 형질전환체 중에서 노란색을 나타내는 1개의 형질전환체를 선발하였다. 선발된 형질전환체에서 재조합 플라스미드를 분리하여 확인한 결과, 2.4 kb 크기의 셀룰로모나스 유래의 DNA를 함유하고 있었고 이 재조합 플라스미드를 pNAG24로 명명하였다.

실시예 2. 셀룰로모나스 엑소키티나아제 유전자의 염기서열 결정 및 분석

재조합 플라스미드 pNAG24 내에 들어있는 셀룰로모나스 유래의 DNA의 염기서열을 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit을 사용한 Sanger의 방법

(Proc. Natl. Acad. Sci., 74: 5463 (1977))과 자동 염기서열 분석기(Automatic Sequencer ABI310)를 사용하여 결정하였다.

염기서열 결정으로 밝혀진 셀룰로모나스 속 유래의 엑소키티나아제를 암호화하는 유전자의 염기서열은 도 1에 도시한 바와 같다. 또한 상기 유전자 염기서열로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열은 도 2에 도시한 바와 같다.

도 1에 도시한 바와 같이 같이 nagA로 명명된 셀룰로모나스 엑소키티나아제 유전자는 247번 염기에서 1,731번 염기까지의 1,485개의 염기로 구성되어 있었으며, 이 유전자는 도 2에 도시한 바와 같이 494개의 아미노산을 암호화하고 있었다.

본 발명 엑소키티나아제는 셀룰로모나스 속 GM13 균주의 세포 내에서 생산되는 특성을 가지고 있기 때문에 nagA유전자 산물의 아미노산 염기서열에서 세포 외로 분비를 담당하는 신호서열(signal sequence)은 발견되지 않았다.

또한 공지의 다른 유전자들과 염기서열 상동성을 비교해 보았을 때, 본 발명의 nagA 유전자는 스트렙토미세스 속 엑소키티나아제 유전자(GenBank AF063001)와 약 35% 정도의 염기서열 상동성을 보였고, 비브리오 속 엑소키티나아제 유전자(GenBank U41417, U24658)와는 약 28%, 트리토더마 속 엑소키티나아제 유전자(GenBank S80069)와는 약 25% 정도의 상동성을 보였다.

이와 같이 본 발명의 nagA 유전자의 염기서열이 공지의 다른 엑소키티나아제 유전자의 염기서열과 비교적 낮은 상동성을 보이는 것으로 보아 본 발명의 유전자는 신규한 엑소키티나아제 유전자임을 확인할 수 있었다. 또한 nagA 유전자 산물과 공지의 다른 엑소키티나아제 간에 아미노산 서열 상동성을 비교한 결과, 본 발명의 엑소키티나아제는 당 가수분해효소 20번 군 (glycosyl hydrolase family 20)에 속하는 효소임을 알 수 있었으며 엑소키티나아제 활성부위로 추정되는 302번째 글루탐산 잔기가 보존되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 3. 재조합 대장균에서 생산되는 엑소키티나아제의 정제

대장균에서 엑소키티나아제를 과잉생산하기 위하여 고발현 벡터인 pKK223-3 플라스미드의 EcoRI 부위에 엑소키티나아제 유전자(nagA)가 삽입된 재조합 플라스미드 pKCHI22를 제조하였다. 이 재조합 플라스미드를 대장균(E. coli JM109)에 도입하여 얻어진 형질전환체를 LB 배지에서 진탕배양한 후에 600 nm에서의 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 IPTG를 1 mM 되게 첨가하여 엑소키티나아제의 과잉생산을 유도하였다. 그 후에 재조합 대장균이 생산하는 엑소키티나아제의 활성을 측정하였다.

엑소키티나아제의 활성은 인산나트륨 50 mM 완충용액(pH 6.8)에 2 mM p-nitrophenyl-β-D-N-acetylglucosamine을 첨가한 것을 기질로 사용하였다. 이 기질용액 0.2 ml에 적절히 희석된 효소 용액 0.2 ml을 첨가한 후에 50℃에서 15분간 반응시켰다. 그 후에 0.1 M glycine-NaOH 완충용액(pH 10.5) 1 ml을 첨가하여 효소반응을 중지시키고 흡광도 420 nm에서 가수분해시 방출되는 p-nitrophenol 양을 측정하였다. 효소단위(unit)는 분당 1 μ mole의 p-nitrophenol을 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 상기의 방법으로 효소활성을 측정한 결과, lac promoter에 의해서 발현되는 pNAG24 플라스미드를 함유한 재조합 대장균은 0.1 unit/ml의 생산성을 보인 반면에 tac promoter에 의해서 발현되는 pKCHI22 플라스미드를 함유한 재조합 대장균은 19 unit/ml의 높은 효소 생산성을 보였다.

셀룰로모나스 속 GM13 균주 유래의 엑소키티나아제를 정제하기 위해서 pKCHI22 플라스미드를 함유한 재조합 대장균을 항생제가 첨가된 LB배지에서 진탕배양하고 IPTG를 첨가하여 엑소키티나아제의 과잉생산을 유도한 후에 균체를 회수하고 파쇄하였다. 이렇게 해서 얻어진 세포추출물로부터 DEAE-토요펄 65OM 칼럼 크로마토그래피, 페닐-토요펄 65OM 칼럼 크로마토그래피, Superose 12HR FPLC 칼럼 크로마토그래피를 통하여 엑소키티나아제를 정제하였다.

상기 과정에 의해 수득된 활성 분획을 전기영동하여 코마시 염색과 4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosamine(4-MU-GlcNAc)를 이용한 활성염색을 하였을 때, 도 3에 도시한 바와 같이 Superose 12HR 칼럼을 통과한 활성분획의 시료가 약 54,000 달톤의 위치에서 단일 밴드를 보여 엑소키티나아제가 순수하게 정제되었으며 그 분자량이 약 54,000 달톤임을 알 수 있었다.

실시예 4. 순수정제된 엑소키티나아제의 특성

실시예 4-1. 엑소키티나아제의 최적 반응온도와 열안정성

정제된 엑소키티나아제의 최적 반응온도와 열안정성를 조사하기 위해서 다양한 온도에서 효소활성을 측정하여 상대활성도를 도 4에 나타내었다. 도 4의 (가)에서 보는 바와 같이 정제된 효소의 최적 반응온도는 55℃였으며, 도 4의 (나)에서 보는 바와 같이 정제된 엑소키티나아제는 40℃ 이하의 온도에서는 1시간 방치 후에도 90% 이상의 활성이 남아 있었으나 50℃ 이상의 온도에서는 급격히 실활되어 1시간후에는 40% 이하의 활성만 존재하였다.

실시예 4-2. 엑소키티나아제의 최적 pH 와 pH 안정성

정제된 엑소키티나아제의 최적 pH를 알아보기 위해서 여러 가지 PH 조건에서 효소활성을 측정하였다(도 5(가)). 또한 효소의 PH 안정성을 조사하기 위해서 각 PH별로 제조한 50 mM 완충용액에 효소액을 섞은 후 37℃에서 1시간 방치한 다음 잔존활성을 측정하였다(도 5(나)). 그 결과, 정제된 엑소키티나아제는 pH 6.0에서 최적 활성을 보였으며, pH 7.0과 8.0 사이에서 90% 이상의 활성을 나타내어 이 범위의 pH에서는 비교적 안정한 것으로 나타났다.

실시예 4-3. 엑소키티나아제의 기질 특이성

정제된 엑소키티나아제의 기질 특이성을 조사하기 위하여 엑소키티나아제를 위한 인공기질인 p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide(pNP-NAG)과 구조적으로 유사한 pNP-N-acetyl-α-D-glucosaminide, pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide, pNP-β-D-mannopyranoside, pNP-β-D-galactopyranoside, pNP-β-D-glucopyranoside, pNP-β-D-xylopyranoside를 기질로 하여 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 엑소키티나아제는 엑소키티나아제를 위한 인공기질인 pNP-NAG를 가장 잘 가수분해하였으며 pNP-N-acetyl-β-D-galactosaminide에 대해서는 pNP-NAG에 대한 활성과 비교하여 약 20%의 효소활성을 나타내었다.

그러나 본 발명의 엑소키티나아제는 나머지 기질에 대해서는 전혀 효소활성을 나타내지 않았다. 특히, 본 발명의 엑소키티나아제는 α-form으로 연결된 동일한 구조의 이성체인 pNP-N-acetyl-α-D-glucosaminide를 전혀 가수분해하지 못하였다.

실시예 4-4. 엑소키티나아제의 절단 특이성 조사

NAG의 2당체부터 5당체의 유사체인 pNP-(NAG)₁부터 pNP-(NAG)₄를 기질로 사용하여 엑소키티나아제의 절단특이성을 조사하였고, 이들 기질 유사체에 대한 효소활성은 분해결과 생성되는 p-nitrophenol의 양으로 표시하였다. 그 결과 pNP-(NAG)₁, pNP-(NAG)₂, pNP-(NAG)₃, pNP-(NAG)₄에 대한 엑소키티나아제의 상대활성은 각각 100%, 22.9%, 8.8%, 2.65%로 나타났다. 이 결과로부터 본 발명의 엑소키티나아제는 NAG 2당체의 유사체인 pNP-(NAG)₁를 가장 잘 분해하는 것을 알 수 있었으며 또한 엑소키티나아제는 NAG 2당체뿐만 아니라 3당 이상의 올리고당도 비환원 말단부터 순차적으로 분해하여 p-nitrophenol을 생성함을 알 수 있었다. 따라서 본 발명의 엑소키티나아제는 NAG 2당체 뿐만 아니라 3당 이상의 키틴 올리고당도 효과적으로 가수분해할 수 있다는 것을 의미한다. 실제로 본 발명의 엑소키티나아제를 이용하여 키틴 올리고당 혼합물을 가수분해시켰을 때, NAG 2당체뿐만 아니라 3당 이상의 올리고당까지 모두 분해하여 반응산물로서 키틴의 단량체인 NAG만이 생성되는 것을 확인하였다(도 6).

그런데 대부분의 공지된 엑소키티나아제는 NAG 2당체를 잘 분해하기는 하지만 3당 이상의 올리고당에 대해서는 활성이 없는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명의 엑소키티나아제는 키틴으로부터 엔도키티나아제에 의해서 생성된 키틴 올리고당을 분해하여 NAG를 생산하는데 있어서 더욱 효과적이라고 판단된다.

실시예 4-5. 정제된 엑소키티나아제의 kinetic parameters

NAG 2당체의 유사체인 pNP-NAG에 대한 엑소키티나아제의 kinetic parameters를 Lineweaver-Burk plot 방법으로 결정하였다. 그 결과, K_m과 V_max는 각각 125 μ M, 384.6 μ mole/min·mg이었다.

이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명의 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) GM13 균주 유래의 엑소키티나아제 유전자는 기존의 공지된 엑소키티나아제 유전자와 그 염기서열 및 아미노산 서열이 상이한 신규한 유전자이며, 재조합 미생물로부터 제조된 엑소키티나아제는 NAG 2당체뿐만 아니라 고중합도의 키틴 올리고당도 효과적으로 분해할 수 있어 키틴 및 키틴 올리고당으로부터 NAG를 생산하기 위한 효소공정에 매우 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

도 1은 셀룰로모나스 속 GM13 엑소키티나아제를 암호화하는 유전자의 염기서 열을 나타낸 것이다.

도 2는 셀룰로모나스 속 GM13 엑소키티나아제 유전자의 염기서열(도 1의 염기서열 중 염기 247번에서 1,728번까지)로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 3은 재조합 대장균으로부터 정제된 엑소키티나아제를 전기영동하여 코마시 염색과 활성염색을 한 것이다.

도 4는 반응온도의 변화에 따른 정제된 엑소키티나아제의 상대활성도(가)와 안정성(나)을 나타낸 그래프이다.

도 5는 반응 pH의 변화에 따른 정제된 엑소키티나아제의 상대활성도(가)와 안정성(나)을 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명 엑소키티나아제를 이용하여 키틴 올리고당 혼합물로부터 생성된 반응산물을 나타낸 HPLC 그림이다.

<110> AMICOGEN Co., Ltd <120> Novel exochitinase gene from Cellulomonas sp. GM13 strain <160> 2 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 1485 <212> DNA <213> Cellulomonas sp. GM13 <220> <221> gene <222> (1)..(1485) <223> Exochitinase gene from Cellulomonas sp. GM13 <400> 1 gtgtccccga tcgccctcat cccccggccg cagcacctgg accagctcga cgagccgccc 60 ttcgtcctcg gggagacgtc gaccgtcgtc gtcgagccgc ggccggagct catccagacc 120 ggcgtcctca cggccgacct cttcggccgg ctgagcgggc gcgccatcga ggtgcggtac 180 gcgggtgcgg agccggcgcc cggctcgatc gtcctcacgc gtacggcgcc ggtgaccgac 240 ggcggcccgg gcgccgacga gacctaccag gtcgtcgtgc gggcggggcg cgtggaggtc 300 cgctcgccgt cggtcgcggg gctggtgcac ggcgtcgtca cgctgcggca gctcgcgacg 360 gtcgacgagg ggtccgtccg gatcccggcg gtgcgcatcc aggacgcccc gcggttcgcg 420 tggcgcggcc tgtcgatcga cgtggcgcgc cacttcttcg gcgtcgagga cctcaagggc 480 gtcatcgggc tgatggcgca ctacaagctc aacgtgctgc acctgcacct cacggacgag 540 cagggctggc ggctgcacgt gccgtcgcgg ccgaagctca cggagctctc ctccgactcg 600 gcgggtgggg ggcgaccgcg gcggcttcta cacgccgggg gacttcgccg cgctcaccga 660 gtacgccgcg gcgccgcggc atccgcgtgg tcccgggaga tcgacgtgcc cgggcacgtc 720 aacgccgcgc tgcacgcgta cggcgagctg acgccgtccg gcgagccgac cgacgtgtac 780 gacggcatcg aggtcggctt cagccggctg cacgcggacc tgccggcgac ccggccgttc 840 ctggaggccg tcttcaccga cgtcgcggcg atgaccgcgg gggagcacgt ccacatcggc 900 ggcgacgagg tcctcacgat ggagcccgag gagtacgcgc ggttcgtcgc gctcgcggcg 960 caggtcgtgc gggcggcggg caaggaggtc gtcggctggc aggagatcgc gcacacgccg 1020 ctcgagcccg gcaccgttgt ccagtactgg gacacccgcg tggaccccga gccgttcgtt 1080 cgggccgccc gcgagggtgc gcggctgctc atgtcgccgg gctcgaaggc gtacctcgac 1140 atgaagtacg acgcgtcgtt cccgctcggc ctggagtggg cgggtcgcat cgaggtgcgc 1200 gacgcctacg actgggagcc gacgacgctc atcgaggggc tgccggcgga gtccgtcatc 1260 ggcgtggagg cggcggtgtg gaccgagacc ctgcggaccc tcgacgacct cacgacgatg 1320 ctgctcccgc gcctggccgc cgtcgccgag gtcgcgtgga cgccgccgga ggcacgcgac 1380 tgggcggact tccgcggccg ggtggcccgc cacggccagt tctgggacca cctcggcgtg 1440 gcctggtacc gcagcccgca ggtcgactgg tcgacgcgcc cctga 1485 <210> 2 <211> 494 <212> PRT <213> Exhochitinase enzyme from Cellulomonas sp. GM13 <220> <221> PROPEP <222> (1)..(494) <223> Exochtinase enzyme from Cellulomonas sp. GM13 <400> 2 Val Ser Pro Ile Ala Leu Ile Pro Arg Pro Gln His Leu Asp Gln Leu 1 5 10 15 Asp Glu Pro Pro Phe Val Leu Gly Glu Thr Ser Thr Val Val Val Glu 20 25 30 Pro Arg Pro Glu Leu Ile Gln Thr Gly Val Leu Thr Ala Asp Leu Phe 35 40 45 Gly Arg Leu Ser Gly Arg Ala Ile Glu Val Arg Tyr Ala Gly Ala Glu 50 55 60 Pro Ala Pro Gly Ser Ile Val Leu Thr Arg Thr Ala Pro Val Thr Asp 65 70 75 80 Gly Gly Pro Gly Ala Asp Glu Thr Tyr Gln Val Val Val Arg Ala Gly 85 90 95 Arg Val Glu Val Arg Ser Pro Ser Val Ala Gly Leu Val His Gly Val 100 105 110 Val Thr Leu Arg Gln Leu Ala Thr Val Asp Glu Gly Ser Val Arg Ile 115 120 125 Pro Ala Val Arg Ile Gln Asp Ala Pro Arg Phe Ala Trp Arg Gly Leu 130 135 140 Ser Ile Asp Val Ala Arg His Phe Phe Gly Val Glu Asp Leu Lys Gly 145 150 155 160 Val Ile Gly Leu Met Ala His Tyr Lys Leu Asn Val Leu His Leu His 165 170 175 Leu Thr Asp Glu Gln Gly Trp Arg Leu His Val Pro Ser Arg Pro Lys 180 185 190 Leu Thr Glu Leu Ser Ser Asp Ser Ala Gly Gly Gly Arg Pro Arg Arg 195 200 205 Leu Leu His Ala Gly Gly Leu Arg Arg Ala His Arg Val Arg Arg Gly 210 215 220 Ala Ala Ala Ser Ala Trp Ser Arg Glu Ile Asp Val Pro Gly His Val 225 230 235 240 Asn Ala Ala Leu His Ala Tyr Gly Glu Leu Thr Pro Ser Gly Glu Pro 245 250 255 Thr Asp Val Tyr Asp Gly Ile Glu Val Gly Phe Ser Arg Leu His Ala 260 265 270 Asp Leu Pro Ala Thr Arg Pro Phe Leu Glu Ala Val Phe Thr Asp Val 275 280 285 Ala Ala Met Thr Ala Gly Glu His Val His Ile Gly Gly Asp Glu Val 290 295 300 Leu Thr Met Glu Pro Glu Glu Tyr Ala Arg Phe Val Ala Leu Ala Ala 305 310 315 320 Gln Val Val Arg Ala Ala Gly Lys Glu Val Val Gly Trp Gln Glu Ile 325 330 335 Ala His Thr Pro Leu Glu Pro Gly Thr Val Val Gln Tyr Trp Asp Thr 340 345 350 Arg Val Asp Pro Glu Pro Phe Val Arg Ala Ala Arg Glu Gly Ala Arg 355 360 365 Leu Leu Met Ser Pro Gly Ser Lys Ala Tyr Leu Asp Met Lys Tyr Asp 370 375 380 Ala Ser Phe Pro Leu Gly Leu Glu Trp Ala Gly Arg Ile Glu Val Arg 385 390 395 400 Asp Ala Tyr Asp Trp Glu Pro Thr Thr Leu Ile Glu Gly Leu Pro Ala 405 410 415 Glu Ser Val Ile Gly Val Glu Ala Ala Val Trp Thr Glu Thr Leu Arg 420 425 430 Thr Leu Asp Asp Leu Thr Thr Met Leu Leu Pro Arg Leu Ala Ala Val 435 440 445 Ala Glu Val Ala Trp Thr Pro Pro Glu Ala Arg Asp Trp Ala Asp Phe 450 455 460 Arg Gly Arg Val Ala Arg His Gly Gln Phe Trp Asp His Leu Gly Val 465 470 475 480 Ala Trp Tyr Arg Ser Pro Gln Val Asp Trp Ser Thr Arg Pro 485 490

Claims

셀룰로모나스 속 GM13 균주로부터 분리한 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는 엑소키티나아제 유전자.
셀룰로모나스 속 GM13 균주로부터 분리한 서열번호 2와 같은 아미노산서열을 갖는 엑소키티나아제.
상기 제1항의 엑소키티나아제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
상기 제3항의 발현벡터를 포함하는 재조합 엑소키티나아제 제조 형질전환체.
상기 제4항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하여 재조합 엑소키티나아제를 제조하는 방법.
상기 제2항 또는 상기 제5항에 의해 제조된 엑소키티나아제를 이용하여 키틴, NAG 2당체 및 NAG 3당체 이상의 키틴 올리고당으로부터 N-아세틸글루코사민을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 최적 반응온도는 55℃, 최적 PH는 6.0인 것을 특징으로 하는 키틴, NAG 2당체 및 NAG 3당체 이상의 키틴 올리고당으로부터 긴-아세틸글루코사민을 제조하는 방법.
상기 제5항 방법에 의해 제조된 재조합 엑소키티나아제를 포함한 것을 특징으로 하는 형질전환체 배양물 또는 조성물.