JP2995289B2 - セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 - Google Patents

セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体

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JP2995289B2
JP2995289B2 JP9221193A JP22119397A JP2995289B2 JP 2995289 B2 JP2995289 B2 JP 2995289B2 JP 9221193 A JP9221193 A JP 9221193A JP 22119397 A JP22119397 A JP 22119397A JP 2995289 B2 JP2995289 B2 JP 2995289B2
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アイミン リュウ
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、セロビオースフォ
スフォリラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベク
ター及び形質転換体に関する。セロビオースフォスフォ
リラーゼ（ＥＣ２．４．１．２０）は、セロビオースを
加リン酸分解する酵素であり、セロビオースとリン酸を
原料としてグルコース−１−リン酸とグルコースが得ら
れる。また、キトビオースを原料にしてグルコサミン−
１−リン酸を、ラクトースを原料にしてガラクトース−
１−リン酸を合成することができる。この酵素は、上記
の反応の逆反応、すなわちグルコース−１−リン酸とグ
ルコースからセロビオースを合成する反応なども進行さ
せることができる。このように、リン酸糖や各種２糖類
の合成に利用される酵素である。
【０００２】
【従来の技術】上記したように、セロビオースフォスフ
ォリラーゼは、各種のリン酸糖の合成反応やその逆反応
による２糖類の合成に関与する酵素である。逆反応で
は、グルコースの他に２−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−
グルコース、マンノース、２−アミノ−２−デオキシ−
Ｄ−マンノース、２−デオキシ−Ｄ−グルコース、６−
デオキシ−Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロース等の糖類を
使用して様々なヘテロ２糖類を合成することができる。
これらのリン酸糖や２糖類は、食品用素材，医薬品用素
材などとして、今後の開発が期待される有用な物質であ
る。しかしながら、従来はセロビオースフォスフォリラ
ーゼとしては、セルビブリオ（Cellvibrio）属及びクロ
ストリジウム（Clostridium)属微生物菌体から抽出した
ものが粗酵素あるいは精製酵素として利用されているに
すぎず、該酵素を安定的に生産して工業的利用の向上を
図ることは行われていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、セロ
ビオースフォスフォリラーゼの一層の活用を図るため、
該酵素の遺伝子をクローニングすることによって、遺伝
子の構造を解明し、遺伝子を発現させて該酵素の工業的
な生産に寄与することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、セロビオ
ースフォスフォリラーゼの構造遺伝子を解明するために
研究を重ねた結果、該酵素の生産能を有するセルビブリ
オ属微生物からセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子
のクローニングに成功し、本発明を完成した。
【０００５】請求項１記載の本発明は、配列表の配列番
号１記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす
るセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子である。請求
項２記載の本発明は、請求項１記載のセロビオースフォ
スフォリラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクターであ
る。請求項３記載の本発明は、請求項２記載のプラスミ
ドベクターで形質転換された形質転換体である。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明者らは、セロビオースフォ
スフォリラーゼ生産能を有するセルビブリオ属由来の細
菌から抽出したセロビオースフォスフォリラーゼを高度
に精製し、そのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。さら
に、このセロビオースフォスフォリラーゼを酵素分解し
てペプチドフラグメントを調製し、それらのアミノ酸配
列を決定した。次いで、それらのアミノ酸配列から確認
できた塩基配列を基にしてプライマーを作製した（配列
表の配列番号１３及び１４参照）。これを用いて、セル
ビブリオ属菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として
行ったポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、ＤＮ
Ａ塩基配列を有する８２０ｂｐの明瞭なバンドを得た。
【０００７】得られたバンド（ＰＣＲ産物）をクローニ
ングし、ＤＮＡシークエンサーで分析してＤＮＡ塩基配
列を解読した（配列表の配列番号１５参照）。このＤＮ
Ａ塩基配列をアミノ酸に翻訳したところ、先に得られた
ペプチドフラグメント（配列表の配列番号３〜７参照）
に相当するアミノ酸配列が認められたことから、これら
のペプチドフラグメントが、セロビオースフォスフォリ
ラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。
【０００８】そこで、このＰＣＲ産物をプローブとし
て、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニ
ングを実施した。まず、セルビブリオ属の細菌から抽出
したゲノムＤＮＡを酵素分解後、ラムダファージに in
vitro パッケージングし、ファージライブラリーを作成
した。このファージライブラリーの中から、前記のＰＣ
Ｒ産物をプローブとして、セロビオースフォスフォリラ
ーゼ遺伝子をもつファージをスクリーニングし、得られ
た陽性ファージから該遺伝子を抽出した。さらに、この
ファージから遺伝子を抽出し、制限酵素で分解し、得ら
れたＤＮＡ断片についてサザンハイプリダイゼーション
を行った。その結果、この3.１ＫｂｐのＤＮＡ断片に、
目的とするアミノベプチダーゼ遺伝子の存在を確認し
た。上記のセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子を有
するフラグメントをサブクローニングして、プラスミド
を作製した。このプラスミドを用いて、常法により大腸
菌に形質転換し、形質転換体を得た。
【０００９】以下に、本発明を詳しく説明する。前記し
たように、本発明のセロビオースフォスフォリラーゼ遺
伝子は、セロビオースフォスフォリラーゼ生産能を有す
るセルビブリオ属微生物に由来するものである。このよ
うなセロビオースフォスフォリラーゼ生産能を有するセ
ルビブリオ属微生物の菌株としては、セルビブリオ・ギ
ルバス (Cellvibrio gilvus) ATCC 13127 株等がある。
【００１０】セロビオースフォスフォリラーゼは、上記
微生物菌体から得ることができる。具体的には、上記の
菌株を常法に従い栄養培地で培養後、培養物から菌体を
分離した後、該菌体を常法により破砕、遠心分離してセ
ロビオースフォスフォリラーゼ画分を得る。次に、カラ
ムクロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ等の精製手
段を用いることにより、高度に精製したセロビオースフ
ォスフォリラーゼを得ることができる。
【００１１】次に、この精製したセロビオースフォスフ
ォリラーゼのＮ末端のアミノ酸配列を決定した。配列の
決定には、プロテインシーケンサー４７７Ａ型（パーキ
ンエルマー社製）を用いた。決定したＮ末端のアミノ酸
配列は、配列表の配列番号２に示す通りである。さら
に、このセロビオースフォスフォリラーゼを酵素分解し
て、ペプチドフラグメントを調製し、それらのアミノ酸
配列を決定した（配列表の配列番号３〜１２参照）。
【００１２】解読できたアミノ酸配列から塩基配列を解
読し、これをもとに作製したプライマー（配列番号１３
および配列番号１４参照）を用いて、セルビブリオ属菌
株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を
行った。その結果、ＤＮＡ塩基配列を有する８２０ｂｐ
の明瞭なバンドを得た。得られたバンド（ＰＣＲ産物）
をクローニングし、ＤＮＡシークエンサーで分析してＤ
ＮＡ塩基配列を解読した（配列表の配列番号１５参
照）。このＤＮＡ塩基配列をアミノ酸に翻訳したとこ
ろ、先に得られたペプチドフラグメント（配列表の配列
番号３〜７参照）に相当するアミノ酸配列が認められた
ことから、これらのペプチドフラグメントが、セロビオ
ースフォスフォリラーゼ遺伝子の一部であることが判明
した。
【００１３】そこで、このＰＣＲ産物をプローブとし
て、セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニ
ングを実施した。まず、セルビブリオ属の細菌からＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素で切断して得た画分を、ラムダフ
ァージに in vitro パッケージングし、ファージライブ
ラリーを作成した。ファージライブラリーの中から、前
記のＰＣＲ産物をプローブとして用いて、セロビオース
フォスフォリラーゼ遺伝子をもつファージをスクリーニ
ングし、陽性ファージを得た。
【００１４】この陽性ファージから該遺伝子を抽出し、
制限酵素を作用させて得られた部分分解物を、アガロー
スゲル電気泳動で分離後、サザンハイブリダイゼーショ
ン（「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村
文化社、１９８９年、１５７頁）を行った。その結果、
3.１ＫｂｐのＤＮＡ断片に目的とするセロビオースフォ
スフォリラーゼ遺伝子の存在を確認した。本発明のセロ
ビオースフォスフォリラーゼ遺伝子は、配列表の配列番
号１記載の塩基配列を有する。本発明に係るセロビオー
スフォスフォリラーゼは、新規なアミノ酸配列を有する
酵素であり、これと６５％以上の相同性が認められる蛋
白質は見当たらなかった。
【００１５】次に、この3.１ＫｂｐのＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル電気泳動で調製し、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いて、予め脱リン酸処理
しておいたプラスミドにサブクローニングし、プラスミ
ドpUC-2 を調製した。さらに、このプラスミドを、大腸
菌に形質転換した。形質転換された大腸菌(E.coli pUC-
2)は、工業技術院生命工学工業技術研究析に寄託されて
おり、その受託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６０３３であ
る。なお、プラスミドpUC-2 にはセロビオースフォスフ
ォリラーゼ遺伝子が含まれている。
【００１６】セロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子の
発現は、以上のようにして得た形質転換体である大腸菌
を培養し、その大腸菌及び培養上清中のセロビオースフ
ォスフォリラーゼを測定して確認することができる（Jo
urnal of Biochemistry, 112巻, 40-44 頁, 1992年) 。
また、この形質転換体を栄養培地に２０〜３７℃で１〜
３日間培養し、得られた菌体を破砕したあと、固液分離
して得た上清を常法により精製してセロビオースフォス
フォリラーゼを得ることができる。
【００１７】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。 実施例１ セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) ATCC 13
127 株を栄養培地に培養したのち、培養物から菌体を分
離した。次いで、該菌体を常法により破砕した後、遠心
分離を行い破砕液を得、疎水クロマトグラフィー，イオ
ン交換クロマトグラフィーを活用し、高度に精製したセ
ロビオースフォスフォリラーゼを得た。
【００１８】この精製セロビオースフォスフォリラーゼ
について、プロテインシーケンサー４７７Ａ型（パーキ
ンエルマー社製）により、そのＮ末端のアミノ酸配列を
決定した。決定した配列を配列表の配列番号２に示す。
さらに、このセロビオースフォスフォリラーゼをリシル
エンドペプチダーゼ（メルク社製）で分解してペプチド
フラグメントを調製し、１０種類のペプチドフラグメン
トのアミノ酸配列を決定した。決定したアミノ酸配列を
配列表の配列番号３〜１２に示す。
【００１９】解読できたアミノ酸配列の中から、コドン
の縮重の少ない領域を選び出し、その領域について６箇
所のフォーワードプライマーおよび６箇所のリバースプ
ライマーを作成した。これらを組み合わせ、セルビブリ
オ・ギルバス ATCC 13127 株のゲノムＤＮＡを鋳型と
し、ＰＣＲ反応により増幅させた。その結果、これらの
プライマーの組合せのうち、配列表の配列番号１３に記
載したフォーワードプライマーと、配列表の配列番号１
４に記載したリバースプライマーとを用いて行ったＰＣ
Ｒ反応により、８２０ｂｐの明瞭なバンドが得られた。
【００２０】得られたバンドをクローニングし、ＤＮＡ
シークエンサーで分析したところ、配列表１５に記載の
ＤＮＡ塩基配列が得られた。このＤＮＡ塩基配列をアミ
ノ酸に翻訳したところ、先に得られたペプチドフラグメ
ントのうち、配列表の配列番号３〜７に記載のアミノ酸
配列に相当するアミノ酸配列が認められた。このことか
ら、これらのペプチドフラグメントは、セロビオースフ
ォスフォリラーゼ遺伝子の一部であることが判明した。
そこで、このＰＣＲ産物をプローブとして、セロビオー
スフォスフォリラーゼ遺伝子のクローニングを実施し
た。
【００２１】一方、セルビブリオ・ギルバス ATCC 1312
7 株から、斉藤の方法（蛋自質核酸酵素、１１巻、４４
６頁）によりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮ
Ａを制限酵素 Sau III AI で切断して部分分解し、超遠
心分離することにより約２０Ｋｂｐの画分を得た。この
画分を、ギガパックIIゴールド（ストラタジーン社製）
を用いて、ラムダファージに in vitro パッケージング
し、ファージライブラリーを作成した。
【００２２】ここで、前記のプローブを用いて、常法
（「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村文
化社、１９８９年、１３４頁）によりファージライブラ
リーからセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子をもつ
ファージをスクリーニングした。その結果、５個の陽性
ファージを得た。さらに、このファージから遺伝子を抽
出し、制限酵素 Sac I及びPst I で部分分解し、得られ
た制限酵素分解物をアガロースゲル電気泳動で分離後、
サザンハイプリダイゼーション（「クローニングとシー
クエンス」、渡辺監修、農村文化社、１９８９年、１５
７頁）を行った。その結果、3.１ＫｂｐのＤＮＡ断片
に、目的とするセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子
の存在を確認した。
【００２３】次に、Sambrook，J.，Fritsch, E. F. and
Maniatis, T．"Molecular Cloning, A Laboratory Man
ual 第２版”6.３章 Vo1. 1 (1989)に記載された方法に
従い、この3.１Ｋｂｐのフラグメントをアガロースゲル
電気泳動により調製した。一方、プラスミドpUC-18を制
限酵素 Sac I及びPst I で分解し、アルカリフォスファ
ターゼを用いて脱リン酸処理した。この脱リン酸処理プ
ラスミドに、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造株式
会社製）を用いて、先の3.１Ｋｂｐのフラグメントを常
法（「クローニングとシークエンス」、渡辺監修、農村
文化社、１９８９年、１３４頁記載の方法）によりサブ
クローニングして、プラスミドpUC-2 を調製した。
【００２４】さらに、このプラスミドを用いてSambroo
k，J.，Fritsch, E. F. and Maniatis, T. "Molecular
Cloning, A Laboratory Manual 第２版”1.７４章 Vo1.
1 (1989)に記載された方法に従い、大腸菌に形質転換
した。形質転換された大腸菌は、工業技術院生命工学工
業技術研究析に寄託されており、その受託番号はＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−６０３３である。なお、プラスミドpUC-2に
はセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子が含まれてい
る。
【００２５】以上のようにして得た形質転換体から、プ
ラスミドpUC-2 を多量に調製し、ｄローダミン・ターミ
ネーター・サイクルシークエンシング・キット（パーキ
ンエルマー社製）を用いて塩基配列を解読した。解読し
た塩基配列の情報をつなぎ合わせることにより、セロビ
オースフォスフォリラーゼ遺伝子を構成した。該遺伝子
の塩基配列およびアミノ酸配列は、配列表の配列番号１
に示す通りである。
【００２６】この配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列からなるセロビオースフォスフォリラーゼ遺伝子
を、先に判明しているアミノ酸配列と比較した。その結
果、セロビオースフォスフォリラーゼのＮ末瑞のアミノ
酸配列（配列表の配列番号２参照）は、配列番号１に示
したアミノ酸配列中の１〜４２番目の配列と一致した。
さらに、セロビオースフォスフォリラーゼ由来のペプチ
ドフラグメントの配列（配列表の配列番号３、４、５、
６、７、８、９、１０、１１及び１２参照）は、それぞ
れ配列番号１に示したアミノ酸配列中の９０〜１１４番
目、１１５〜１３１番目、１３２〜１４２番目、１８９
〜２１９番目、２３５〜２５２番目、２７８〜２８８番
目、２８９〜３１９番目、４１１〜４２４番目、５５１
〜５５７番目及び５９０〜６１８番目の配列と一致し
た。
【００２７】また、活性型セロビオースフォスフォリラ
ーゼの分子量を、島津製作所、レーザーイオン化 TOF-M
S KOMPACT MALDI III 型で測定したところ、９1,０００
ダルトンであり、本遺伝子でコードされる蛋白の分子量
９0,８１３と良く一致していた。
【００２８】以上の結果より、塩基配列中にセロビオー
スフォスフォリラーゼ遺伝子を見出した。すなわち、セ
ロビオースフォスフォリラーゼの構造遺伝子は塩基配列
中の３５９番目以降２８２７番目までの間に存在するこ
とが確認された。
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、セロビオースフォスフ
ォリラーゼの遺伝子が提供される。これを発現させるこ
とにより得られる酵素は、加リン酸反応あるいはその逆
反応を進行させて、食品加工及び医薬品工業の分野にお
いて有用な各種リン酸糖やヘテロ２糖類を効率よく製造
することができる。
【００３０】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３１５７ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 プラスミド名：pUC-２ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：３５９..２８２４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAGCTCGGCC CTGATGTCAC GGTCGGAGAG CAGCACGGGC CCACGGTAGT GCCCCGGACG 60 GGTGTCCGGG GCCGTCCGCC CACGCCCGTC CACGCTCCTC CCACACCGTT CCCACACCCC 120 TGTGCGAGCG TCGCGCAGCC CGCCCGGGGC GCCCGGCCGG AGGGTGCGCA CGGACGTGCG 180 ACCTGCGCCC GTTCTCGTCG GGACCCGCGG CGGCTATGAT CCCTCTCGTG AGGCGCGTGG 240 GAGCGCTCTC GCACCGACCA TGAGCCGCGT CAGAGCCTCG ACGCCGACCC GCACGGACGC 300 GGACGGCCGA CCGGGGGGCC GGGCGCGACA CAACCCGAGC ACCCGAGGGG CACCACCG 358 ATG CGG TAC GGC CAT TTC GAC GAC GCG GCG CGC GAG TAC GTC ATC ACG 406 Met Arg Tyr Gly His Phe Asp Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Val Ile Thr 1 5 10 15 ACG CCT CAC ACC CCC TAC CCG TGG ATC AAC TAC CTC GGG TCG GAG CAG 454 Thr Pro His Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Ser Glu Gln 20 25 30 TTC TTC TCG CTG CTC TCC CAC CAG GCC GGC GGC TAC TCG TTC TAC CGC 502 Phe Phe Ser Leu Leu Ser His Gln Ala Gly Gly Tyr Ser Phe Tyr Arg 35 40 45 GAC GCC AAG ATG CGG CGG CTC ACG CGC TAC CGC TAC AAC AAC ATC CCC 550 Asp Ala Lys Met Arg Arg Leu Thr Arg Tyr Arg Tyr Asn Asn Ile Pro 50 55 60 GCG GAC GCG GGC GGC CGG TAC CTG TAC GTC AAC GAC GGC GGC GAC GTG 598 Ala Asp Ala Gly Gly Arg Tyr Leu Tyr Val Asn Asp Gly Gly Asp Val 65 70 75 80 TGG ACC CCG TCG TGG CTG CCG GTC AAG GCG GAC CTG GAC CAC TTC GAG 646 Trp Thr Pro Ser Trp Leu Pro Val Lys Ala Asp Leu Asp His Phe Glu 85 90 95 GCG CGC CAC GGC CTC GGC TAC TCG CGC ATC ACG GGC GAG CGC AAC GGC 694 Ala Arg His Gly Leu Gly Tyr Ser Arg Ile Thr Gly Glu Arg Asn Gly 100 105 110 CTG AAG GTC GAG ACG CTC TTC TTC GTC CCG CTC GGC GAG AAC GCC GAG 742 Leu Lys Val Glu Thr Leu Phe Phe Val Pro Leu Gly Glu Asn Ala Glu 115 120 125 GTG CAG AAG GTC ACC GTC ACC AAC ACG TCC GAC GCC CCG AAG ACG GCG 790 Val Gln Lys Val Thr Val Thr Asn Thr Ser Asp Ala Pro Lys Thr Ala 130 135 140 ACG CTG TTC TCG TTC GTC GAG TTC TGC CTG TGG AAC GCG CAG GAC GAC 838 Thr Leu Phe Ser Phe Val Glu Phe Cys Leu Trp Asn Ala Gln Asp Asp 145 150 155 160 CAG ACG AAC TAC CAG CGC AAC CTG TCG ATC GGC GAG GTC GAG GTC GAG 886 Gln Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Leu Ser Ile Gly Glu Val Glu Val Glu 165 170 175 CAG GAC GGC CCG CAC GGC TCG GCG ATC TAC CAC AAG ACC GAG TAC CGC 934 Gln Asp Gly Pro His Gly Ser Ala Ile Tyr His Lys Thr Glu Tyr Arg 180 185 190 GAG CGC CGC GAC CAC TAC GCC GTG TTC GGC GTG AAC ACC CGC GCG GAC 982 Glu Arg Arg Asp His Tyr Ala Val Phe Gly Val Asn Thr Arg Ala Asp 195 200 205 GGC TTC GAC ACG GAC CGC GAC ACG TTC GTG GGC GCG TAC AAC TCG CTG 1030 Gly Phe Asp Thr Asp Arg Asp Thr Phe Val Gly Ala Tyr Asn Ser Leu 210 215 220 GGC GAG GCG TCC GTC CCG CGC GCC GGG AAG TCC GCG GAC TCG GTC GCG 1078 Gly Glu Ala Ser Val Pro Arg Ala Gly Lys Ser Ala Asp Ser Val Ala 225 230 235 240 TCG GGC TGG TAC CCG ATC GGC TCG CAC TCC GTC GCC GTG ACG CTG CAG 1126 Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Gly Ser His Ser Val Ala Val Thr Leu Gln 245 250 255 CCC GGC GAG TCC CGC GAC CTC GTC TAC GTG CTG GGC TAC CTG GAG AAC 1174 Pro Gly Glu Ser Arg Asp Leu Val Tyr Val Leu Gly Tyr Leu Glu Asn 260 265 270 CCC GAC GAG GAG AAG TGG GCC GAC GAC GCC CAC CAG GTC GTC AAC AAG 1222 Pro Asp Glu Glu Lys Trp Ala Asp Asp Ala His Gln Val Val Asn Lys 275 280 285 GCG CCC GCG CAC GCG CTG CTG GGC CGG TTC GCG ACG AGC GAG CAG GTC 1270 Ala Pro Ala His Ala Leu Leu Gly Arg Phe Ala Thr Ser Glu Gln Val 290 295 300 GAC GCC GCC CTG GAG GCG CTG AAC TCC TAC TGG ACG AAC CTG CTC TCG 1318 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Tyr Trp Thr Asn Leu Leu Ser 305 310 315 320 ACG TAC TCG GTG TCG AGC ACC GAC GAG AAG CTC GAC CGG ATG GTC AAC 1366 Thr Tyr Ser Val Ser Ser Thr Asp Glu Lys Leu Asp Arg Met Val Asn 325 330 335 ATC TGG AAC CAG TAC CAG TGC ATG GTC ACG TTC AAC ATG TCG CGC TCG 1414 Ile Trp Asn Gln Tyr Gln Cys Met Val Thr Phe Asn Met Ser Arg Ser 340 345 350 GCG TCG TTC TTC GAG ACG GGC ATC GGC CGC GGG ATG GGC TTC CGC GAC 1462 Ala Ser Phe Phe Glu Thr Gly Ile Gly Arg Gly Met Gly Phe Arg Asp 355 360 365 TCC AAC CAG GAC CTC CTG GGC TTC GTG CAC CTG ATC CCG GAG CGC GCG 1510 Ser Asn Gln Asp Leu Leu Gly Phe Val His Leu Ile Pro Glu Arg Ala 370 375 380 CGC GAG CGG ATC ATC GAC ATC GCC TCG ACG CAG TTC GCG GAC GGC TCG 1558 Arg Glu Arg Ile Ile Asp Ile Ala Ser Thr Gln Phe Ala Asp Gly Ser 385 390 395 400 GCG TAC CAC CAG TAC CAG CCG CTC ACG AAG CGC GGG AAC AAC GAC ATC 1606 Ala Tyr His Gln Tyr Gln Pro Leu Thr Lys Arg Gly Asn Asn Asp Ile 405 410 415 GGC TCG GGC TTC AAC GAC GAC CCG CTG TGG CTC ATC GCG GGC GTG GCG 1654 Gly Ser Gly Phe Asn Asp Asp Pro Leu Trp Leu Ile Ala Gly Val Ala 420 425 430 GCG TAC ATC AAG GAG TCC GGC GAC TGG GGC ATC CTC GAC GAG CCC GTG 1702 Ala Tyr Ile Lys Glu Ser Gly Asp Trp Gly Ile Leu Asp Glu Pro Val 435 440 445 CCG TTC GAC AAC GAG CCC GGC TCC GAG GTC CCG CTG TTC GAG CAC CTG 1750 Pro Phe Asp Asn Glu Pro Gly Ser Glu Val Pro Leu Phe Glu His Leu 450 455 460 ACG CGC TCC TTC CAG TTC ACG GTG CAG AAC CGC GGC CCG CAC GGC CTG 1798 Thr Arg Ser Phe Gln Phe Thr Val Gln Asn Arg Gly Pro His Gly Leu 465 470 475 480 CCG CTC ATC GGC CGT GCC GAC TGG AAC GAC TGC CTC AAC CTC AAC TGC 1846 Pro Leu Ile Gly Arg Ala Asp Trp Asn Asp Cys Leu Asn Leu Asn Cys 485 490 495 TTC TCG ACG ACC CCG GGC GAG TCG TTC CAG ACG ACC GAG AAC CAG GCG 1894 Phe Ser Thr Thr Pro Gly Glu Ser Phe Gln Thr Thr Glu Asn Gln Ala 500 505 510 GGC GGC GTC GCG GAG TCC GTG TTC ATC GCG GCG CAG TTC GTG CTC TAC 1942 Gly Gly Val Ala Glu Ser Val Phe Ile Ala Ala Gln Phe Val Leu Tyr 515 520 525 GGC GCG GAG TAC GCC ACG CTC GCG GAG CGT CGC GGC CTC GCG GAC GTC 1990 Gly Ala Glu Tyr Ala Thr Leu Ala Glu Arg Arg Gly Leu Ala Asp Val 530 535 540 GCC ACC GAG GCG CGC AAG TAC GTC GAC GAG GTG CGT GCC GCG GTG CTC 2038 Ala Thr Glu Ala Arg Lys Tyr Val Asp Glu Val Arg Ala Ala Val Leu 545 550 555 560 GAG CAC GGC TGG GAC GGC CAG TGG TTC CTG CGT GCC TAC GAC TAC TAC 2086 Glu His Gly Trp Asp Gly Gln Trp Phe Leu Arg Ala Tyr Asp Tyr Tyr 565 570 575 GGC AAC CCG GTC GGC ACG GAC GCC AAG CCC GAG GGC AAG ATC TGG ATC 2134 Gly Asn Pro Val Gly Thr Asp Ala Lys Pro Glu Gly Lys Ile Trp Ile 580 585 590 GAG CCG CAG GGC TTC GCC GTC ATG GCG GGC ATC GGC GTC GGC GAG GGC 2182 Glu Pro Gln Gly Phe Ala Val Met Ala Gly Ile Gly Val Gly Glu Gly 595 600 605 CCG GAC GAC GCG GAC GCG CCG GCC GTC AAG GCG CTC GAC TCC GTG AAC 2230 Pro Asp Asp Ala Asp Ala Pro Ala Val Lys Ala Leu Asp Ser Val Asn 610 615 620 GAG ATG CTC GGC ACG CCG CAC GGC CTG GTG CTG CAG TAC CCG GCG TAC 2278 Glu Met Leu Gly Thr Pro His Gly Leu Val Leu Gln Tyr Pro Ala Tyr 625 630 635 640 ACG ACG TAC CAG ATC GAG CTC GGC GAG GTC TCC ACG TAC CCG CCC GGC 2326 Thr Thr Tyr Gln Ile Glu Leu Gly Glu Val Ser Thr Tyr Pro Pro Gly 645 650 655 TAC AAG GAG AAC GGC GGC ATC TTC TGC CAC AAC AAC CCC TGG GTG ATC 2374 Tyr Lys Glu Asn Gly Gly Ile Phe Cys His Asn Asn Pro Trp Val Ile 660 665 670 ATC GCC GAG ACG GTC GTG GGG CGC GGT GCG CAG GCG TTC GAC TAC TAC 2422 Ile Ala Glu Thr Val Val Gly Arg Gly Ala Gln Ala Phe Asp Tyr Tyr 675 680 685 AAG CGG ATC ACC CCC GCG TAC CGC GAG GAC ATC TCC GAC ACG CAC AAG 2470 Lys Arg Ile Thr Pro Ala Tyr Arg Glu Asp Ile Ser Asp Thr His Lys 690 695 700 CTC GAG CCG TAC GTG TAC GCG CAG ATG ATC GCG GGC AAG GAG GCG GTG 2518 Leu Glu Pro Tyr Val Tyr Ala Gln Met Ile Ala Gly Lys Glu Ala Val 705 710 715 720 CGC GCC GGC GAG GCG AAG AAC TCG TGG CTC ACC GGA ACG GCG GCG TGG 2566 Arg Ala Gly Glu Ala Lys Asn Ser Trp Leu Thr Gly Thr Ala Ala Trp 725 730 735 AAC TTC GTC GCG GTG TCC CAG TAC CTG CTG GGC GTG CGG CCC GAC TAC 2614 Asn Phe Val Ala Val Ser Gln Tyr Leu Leu Gly Val Arg Pro Asp Tyr 740 745 750 GAC GGC CTC GTG GTC GAC CCG CAG ATC GGT CCG GAC GTC CCC TCG TAC 2662 Asp Gly Leu Val Val Asp Pro Gln Ile Gly Pro Asp Val Pro Ser Tyr 755 760 765 ACG GTC ACC CGC GTG GCC CGC GGC GCG ACG TAC GAG ATC ACG GTG ACC 2710 Thr Val Thr Arg Val Ala Arg Gly Ala Thr Tyr Glu Ile Thr Val Thr 770 775 780 AAC TCG GGC GCC CCG GGC GCG CGT GCG TCG CTC ACG GTC GAC GGC GCG 2758 Asn Ser Gly Ala Pro Gly Ala Arg Ala Ser Leu Thr Val Asp Gly Ala 785 790 795 800 CCC GTC GAC GGC CGC ACG GTC CCC TAC GCC CCG GCC GGC TCG ACC GTC 2806 Pro Val Asp Gly Arg Thr Val Pro Tyr Ala Pro Ala Gly Ser Thr Val 805 810 815 CGC GTC GAG GTG ACC GTC TGACCCGCGG GTCCGACGGC TGACGTCATG 2854 Arg Val Glu Val Thr Val 820 ACGATGGTCC AGGAGATCGA GACGCCCGCG CCGGCGGCCC CTGCCGGCGC GGGGGTCGCG 2914 CCCGAGCGCG TCGTGACGCT GCGCTCCGGT GCGTGGGAGC TCGACGTGCT CCCGCGCACC 2974 GGGGCGGCCC TCGGCGGTGG CCGCATCCGC ACCTCGGACG GCGTGTGGCG CGACCTGCTG 3034 CGCCCGACGC GCCCGACCGT CCTGGGCGAC CCGGAGAAGT GCTCGTCGTT CCCGATGGTG 3094 CCGTGGTCCA ACCGCATCCG CGACGGCGTG CTCGCCTTCG GCGGGCGCTC GTGGCAGCTG 3154 CAG 3157
【００３１】配列番号：２ 配列の長さ：４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Met Arg Tyr Gly His Phe Asp Asp Ala Ala Arg Glu Tyr Val Ile Thr 1 5 10 15 Thr Pro His Thr Pro Tyr Pro Trp Ile Asn Tyr Leu Gly Ser Glu Gln 20 25 30 Phe Phe Ser Leu Leu Ser His Gln 35 40
【００３２】配列番号：３ 配列の長さ：２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Ala Asp Leu Asp His Phe Glu Ala Arg His Gly Leu Gly Tyr Ser Arg 1 5 10 15 Ile Thr Gly Glu Arg Asn Gly Leu Lys 20 25
【００３３】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Val Glu Thr Leu Phe Phe Val Pro Leu Gly Glu Asn Ala Glu Val Gln 1 5 10 15 Lys
【００３４】配列番号：５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
【００３５】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス（Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Thr Glu Tyr Arg Glu Arg Arg Asp His Tyr Ala Val Phe Gly Val Asn 1 5 10 15 Thr Arg Ala Asp Gly Phe Asp Thr Asp Arg Asp Thr Phe Val Gly 20 25 30
【００３６】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Ser Ala Asp Ser Val Ala Ser Gly Trp Tyr Pro Ile Gly Ser His Ser 1 5 10 15 Val Ala
【００３７】配列番号：８ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
【００３８】配列番号：９ 配列の長さ：３１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス（Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Ala Pro Ala His Ala Leu Leu Gly Arg Phe Ala Thr Ser Glu Gln Val 1 5 10 15 Asp Ala Ala Leu Glu Ala Leu Asn Ser Tyr Trp Thr Asn Leu Leu 20 25 30
【００３９】配列番号：１０ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 Arg Gly Asn Asn Asp Ile Gly Ser Gly Phe Asn Asp Asp Pro 1 5 10
【００４０】配列番号：１１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物
【００４１】配列番号：１２ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物配列 Ile Trp Ile Glu Pro Gln Gly Phe Ala Val Met Ala Gly Ile Gly Val 1 5 10 15 Gly Glu Gly Pro Asp Asp Ala Asp Ala Pro Ala Val Lys 20 25
【００４２】配列番号：１３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アミノ酸配列から作成） 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 GARTAYGTSA TYACSAC 17
【００４３】配列番号：１４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（アミノ酸配列から作成） 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 Cellvibrio gilvus が生産した酵素の分解物 配列 ACCTGRTGBG CRTCRTC 17
【００４４】配列番号：１５ 配列の長さ：８２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源 生物名：セルビブリオ・ギルバス (Cellvibrio gilvus) 株名：ATCC 13127 直接の起源 ＰＣＲ反応物 配列 GAGTACGTCA TCACGACGCC TCACACCCCC TACCCGTGGA TCAACTACCT CGGGTCGGAG 60 CAGTTCTTCT CGCTGCTCTC CCACCAGGCC GGCGGCTACT CGTTCTACCG CGACGCCAAG 120 ATGCGGCGGC TCACGCGCTA CCGCTACAAC AACATCCCCG CGGACGCGGG CGGCCGGTAC 180 CTGTACGTCA ACGACGGCGG CGACGTGTGG ACCCCGTCGT GGCTGCCGGT CAAGGCGGAC 240 CTGGACCACT TCGAGGCGCG CCACGGCCTC GGCTACTCGC GCATCACGGG CGAGCGCAAC 300 GGCCTGAAGG TCGAGACGCT CTTCTTCGTC CCGCTCGGCG AGAACGCCGA GGTGCAGAAG 360 GTCACCGTCA CCAACACGTC CGACGCCCCG AAGACGGCGA CGCTGTTCTC GTTCGTCGAG 420 TTCTGCCTGT GGAACGCGCA GGACGACCAG ACGAACTACC AGCGCAACCT GTCGATCGGC 480 GAGGTCGAGG TCGAGCAGGA CGGCCCGCAC GGCTCGGCGA TCTACCACAA GACCGAGTAC 540 CGCGAGCGCC GCGACCACTA CGCCGTGTTC GGCGTGAACA CCCGCGCGGA CGGCTTCGAC 600 ACGGACCGCG ACACGTTCGT GGGCGCGTAC AACTCGCTGG GCGAGGCGTC CGTCCCGCGC 660 GCCGGGAAGT CCGCGGACTC GGTCGCGTCG GGCTGGTACC CGATCGGCTC GCACTCCGTC 720 GCCGTGACGC TGCAGCCCGG CGAGTCCCGC GACCTCGTCT ACGTGCTGGG CTACCTGGAG 780 AACCCCGACG AGGAGAAGTG GGCCGACGAC GCCCACCAGG T 821
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 北村 義明 茨城県つくば市吾妻２丁目１−２−704 −401 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
    からなるタンパク質をコードするセロビオースフォスフ
    ォリラーゼ遺伝子。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のセロビオースフォスフォ
    リラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクター。
  3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドベクターで形
    質転換された形質転換体。
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