CN117535253A - 甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因、融合蛋白以及它们的应用 - Google Patents

甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因、融合蛋白以及它们的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物酶解技术，公开了一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因、融合蛋白以及它们的应用。所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基为(a)‑(d)中任意一项所述的酶：(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有甲酸酯脱氢酶铁硫亚基活性的氨基酸序列所示的酶；(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。该甲酸酯脱氢酶铁硫亚基能够有效降解聚丙烯等塑料，提高聚丙烯的降解效率，进一步与锚定肽连接形成的融合蛋白对聚丙烯具有更高的降解效率。

Description

甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因、融合蛋白以及它们的 应用
技术领域
本发明涉及生物酶解技术，具体地，涉及一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因，一种融合蛋白以及它们在降解塑料中的应用。
背景技术
聚丙烯(PP)是一种线性烃类化合物，根据CH3基团的位置，分为等规聚丙烯(iPP)、无规聚丙烯(aPP)和间规聚丙烯(sPP)。使用PP制造的塑料材料通常具有85-95％的等规指数，即包含89％的iPP和适量的aPP。PP是一种坚韧而灵活的材料，具有出色的机械性能和良好的加工性能，因此常用作在纺织品、标签、文具、包装、汽车部件和实验室设备等生产中，产品涵盖一次性用品到持久耐用品，是全球生产和使用广泛的塑料聚合物之一，这也带来了数量庞大的PP废弃物，但是，与其它合成塑料一样，PP的自然降解过程十分缓慢，暴露在环境中的PP经过风化、光解、磨损、机械和微生物分解会逐渐破碎成微塑料，并以多种方式危害环境和生物。
为了解决PP废物堆积带来的问题，人们常采用填埋、焚烧、回收等传统方法对塑料废弃物进行处理，但是这些方法往往会带来其他问题，例如侵占土地资源、二次污染环境、加工产品性能低等。相比之下，利用微生物代谢将塑料聚合物转化为甲烷和剩余生物质的生物降解是一种理想的处理方式，该过程不会产生任何有害副产物，而且安全性高。目前已经筛选到了一些PP降解微生物，包括铜绿假单胞菌、窄食假单胞菌、赖氨酸芽孢杆菌、云芝、解脂耶氏酵母等，但是利用微生物降解PP受到生物量的影响，降解效率仍较低，降解时间往往持续数周甚至数月，降解效果不理想。
使用生物酶降解PP则可避免受到生物量的限制，酶催化的高效性也可以大大缩短降解时间，提高降解效率。但可应用于降解PP的生物酶仍较为匮乏。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基及其编码基因，一种融合蛋白以及它们在降解塑料中的应用，该甲酸酯脱氢酶铁硫亚基能够有效催化聚丙烯等塑料降解，提高聚丙烯的降解效率，该甲酸酯脱氢酶铁硫亚基进一步与锚定肽连接形成的融合蛋白对聚丙烯具有更高的降解效率。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基为(a)-(d)中任意一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有甲酸酯脱氢酶铁硫亚基活性的氨基酸序列所示的酶；
(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
本发明第二方面提供一种编码甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的基因，该基因具有编码上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的核苷酸序列。
优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
优选地，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和锚定肽。
优选地，所述锚定肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述锚定肽的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基与所述锚定肽通过连接蛋白连接，所述连接蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
本发明第四方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的基因，或者含有编码上述的融合蛋白的核苷酸序列。
优选地，所述重组载体的表达载体为pET-28a(+)质粒。
本发明第五方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因、含有编码上述的融合蛋白的核苷酸序列或者上述的重组载体。
优选地，所述重组菌株选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌中的至少一种；更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌。
本发明第六方面提供一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的制备方法，该方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵，对发酵产物进行分离纯化。
本发明第七方面提供一种酶制剂，所述酶制剂包含上述的方法制备得到的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。
优选地，所述酶制剂为液态制剂或者固态制剂。
本发明第八方面提供上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、上述的基因、上述的融合蛋白、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和上述的酶制剂中的至少一种在降解塑料中的应用。
优选地，所述塑料为聚丙烯。
本发明第九方面提供一种降解塑料的方法，该方法包括以下步骤：将上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、上述的基因、上述的融合蛋白、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和上述的酶制剂中的至少一种作为降解剂，与塑料进行接触。
优选地，所述接触的过程包括：将所述降解剂分批次添加至含有所述塑料的溶液中进行孵育。
优选地，所述降解剂相邻批次的间隔时间为20-28h，所述孵育的条件包括：温度为4-40℃。
通过上述技术方案，本发明提供的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基能够有效催化聚丙烯等塑料的降解，可大大缩短塑料的降解时间、提高降解效率，避免受到生物量的限制；在进一步与靶向肽连接形成的融合蛋白，对聚丙烯等塑料具有更高的降解效率。
附图说明
图1是实施例3中FDISS和FDISS-LCI与PP纤维表面的结合观察图，其中，(a)显示FDISS与PP纤维表面的结合状态，(b)显示融合蛋白FDISS-LCI与PP纤维表面的结合状态；
图2是实施例4中PP颗粒经FDISS和FDISS-LCI降解后颗粒表面的SEM图像，其中，(a)为游离的FDISS降解后PP颗粒，(b)为融合蛋白FDISS-LCI降解后PP颗粒。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基为(a)-(d)中任意一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有甲酸酯脱氢酶铁硫亚基活性的氨基酸序列所示的酶；
(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
具体地，SEQ ID NO.1所示氨基酸序列为：
MSSQDIHARSATTTPMPSVRNQQEVAKLIDVSKCIGCKACQVACSEWNE
LRDEVGHNHGTYDNPMDLTADSWTVMRFTEHENEAGNLEWLIRKDGC
MHCAEPGCLKACPSPGAIVKYANGIVDFNQDKCIGCGYCITGCPFDIPRIS
QKDHKAYKCSLCSDRVSVGMEPACVKTCPTGAIVFGSKEDMKEHAAERI
VDLKSRGYENAGLYDPEGVGGTHVMYVLHHADKPSLYAGLADQPSVSP
LVSLWKGVTKPLALLAMGATVLAGFFHYVRVGPNRADDEEDHGQAEAPVHQVDPSVHTFDPHERR。
组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和组氨酸(His)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见“生物化学”(第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教育出版社，1990年12月)。
蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代Ile，所述残基在蛋白质结构域中所起的作用(比如提供正电荷或形成疏水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可以实现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可以发生在上述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的任意一个氨基酸残基位置上。
除上所述的氨基酸残基取代，本发明提供的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基还包括相比于SEQ ID NO.1所示氨基酸序列在1-309位氨基酸残基任意位置发生一个或多个氨基酸残基缺失或添加或兼而有之的蛋白。
如前所述，本发明提供的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基还可以进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。衍生的蛋白质指与具有上述氨基酸序列的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基具有氨基酸序列上的差异，也可以有不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述诱导变异体可以通过各种技术得到，如辐射或诱变剂等产生的随机突变，也可以通过如定点突变法或其他已知分子生物学的技术。
修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列)形式包括：体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
为了方便纯化，还可以采用本领域常见的标签对(a)或(b)进行添加修饰，所述标签不会影响本发明的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的活性，在实际应用过程中，可以根据需求选择是否添加标签。
在本发明中，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的氨基末端还可以连接信号序列。所述信号序列可以来自大肠杆菌或者枯草芽孢杆菌，但不限于此。
上述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基可以通过人工合成得到，也可以先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
本发明第二方面提供一种编码甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的基因，该基因具有编码如上所述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的核苷酸序列。
根据本发明，优选地，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列。
如上所述，相应地，核苷酸序列的5'端和/或3'端还可以连接有标签的编码序列。
进一步优选地，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
具体地，SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为：
ATGAGTAGTCAGGACATCCACGCCCGCTCCGCGACCACCACGCCGATGCCCTCGGTGCGGAACCAGCAGGAAGTGGCGAAACTGATCGACGTGTCCAAGTGCATCGGTTGCAAGGCCTGCCAGGTCGCCTGCTCGGAATGGAACGAGCTGCGCGACGAGGTCGGCCACAACCACGGCACCTACGACAACCCCATGGACCTGACGGCCGACTCGTGGACGGTGATGCGTTTCACCGAGCACGAGAACGAGGCCGGCAACCTCGAGTGGCTGATCCGCAAGGATGGCTGCATGCACTGCGCCGAGCCGGGCTGCCTGAAGGCCTGCCCGAGCCCGGGGGCGATCGTGAAGTACGCCAACGGCATCGTTGACTTCAACCAGGACAAGTGCATCGGTTGCGGCTACTGCATCACCGGTTGCCCGTTCGACATCCCCCGGATCTCGCAGAAGGACCACAAGGCCTACAAGTGCAGCCTGTGTTCCGACCGCGTCTCGGTGGGCATGGAGCCGGCCTGCGTGAAGACCTGCCCGACCGGCGCCATCGTCTTCGGCAGCAAGGAGGACATGAAGGAACACGCCGCCGAACGCATCGTCGACCTGAAGAGCCGCGGCTACGAGAACGCCGGCCTGTACGACCCCGAAGGGGTGGGCGGCACCCACGTGATGTACGTGCTGCACCACGCCGACAAGCCGTCGCTCTACGCCGGCCTGGCCGACCAGCCGAGCGTCAGCCCGCTGGTCAGCCTGTGGAAGGGCGTGACCAAGCCGCTGGCGCTGCTGGCCATGGGCGCCACGGTGCTCGCCGGGTTCTTCCACTATGTGCGCGTCGGTCCCAACCGCGCGGACGACGAGGAAGACCACGGGCAAGCCGAGGCACCGGTGCACCAGGTCGATCCGTCGGTACACACCTTTGACCCGCACGAGCGTCGTTGA。
本发明提供的核苷酸序列通常可以用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核苷酸序列，可以很容易得到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。
一旦获得了有关核苷酸序列，就可以用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通常将所得核苷酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的宿主细胞分离得到有关核苷酸序列。此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白含有上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和锚定肽。
本发明通过将甲酸酯脱氢酶铁硫亚基与锚定肽连接，可将甲酸酯脱氢酶铁硫亚基高效附着在聚丙烯等塑料的表面，相较于游离的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基，对塑料具有更高的降解效率，进一步缩短降解时间，应用更为广泛。
本发明中，所述锚定肽可以采用与聚丙烯等塑料具有疏水相互作用的功能钛，利用其与塑料的选择性结合和高亲和力，将甲酸酯脱氢酶铁硫亚基有效附和在聚丙烯等塑料表面。优选地，所述锚定肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示。进一步优选地，所述锚定肽的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示。
具体地，锚定肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
MAIKLVQSPNGNFAASFVLDGTKWIFKSKYYDSSKGYWVGIYEVWDRK；
锚定肽的核苷酸序列(SEQ ID NO.4)：
ATGGCCATTAAACTGGTTCAGAGCCCGAATGGTAATTTTGCAGCAAGC
TTTGTTCTGGATGGCACCAAATGGATCTTCAAAAGCAAATACTATGAC
AGCAGCAAAGGTTATTGGGTGGGTATTTATGAAGTGTGGGATCGCAAATAA。
本发明中，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基与所述锚定肽可直接连接，优选地，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基与所述锚定肽通过连接蛋白连接，所述连接蛋白的氨基酸序列为SEQID NO.5所示，其属于一段柔性连接蛋白；
连接蛋白(SEQ ID NO.5)：GGGSGGGSGGGS。
本发明第四方面提供一种重组载体，所述重组载体含有上述的基因，或者含有编码上述的融合蛋白的核苷酸序列。
本发明中，重组载体中使用的“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等，本发明优选的表达载体为pET-28a(+)质粒。重组载体的构建过程可先采用PCR扩增获得载体的线性片段，再将载体片段与基因片段采用无缝克隆的方式，利用同源臂进行连接。
本发明第五方面提供一种重组菌株，所述重组菌株含有上述的基因、含有编码上述的融合蛋白的核苷酸序列或者上述的重组载体。
可以通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到宿主细胞(菌株)中，如氯化钙法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞，优选为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌中的至少一种，更优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichia coli)，比如可以为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明第六方面提供一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的制备方法，该方法包括：将如上所述的重组菌株和/或如上所述的菌剂接种至发酵培养基中进行发酵，对发酵产物进行分离纯化，得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。
本发明提供的制备甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的方法包括：培养本发明提供的重组菌株，诱导编码甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的基因的表达；分离提纯所表达的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。其中，所述培养条件为常规的培养条件，如培养基可采用溶剂为水，溶质及其终浓度分别为：胰蛋白胨5-15g/L，酵母提取物1-10g/L，NaCl 5-15g/L(具体可以为LB培养基)，在温度为35-40℃、转速为200-250rpm的条件下培养。
由于本发明提供的重组菌株中含有编码甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的基因，其可以高效地表达甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。培养后经过分离提纯，即可得到高纯度的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。可以采用本领域技术人员公知的方法进行分离提纯，在此不再赘述。
本发明第七方面提供一种酶制剂，所述酶制剂包含如上所述的方法制备得到的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基。
所述酶制剂可以以液态制剂或者固态制剂的形式存在。所述酶制剂中可以含有本领域常规制备酶制剂时添加的辅料，本领域技术人员可以根据需要选择。
基于本发明提供的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基能够有效催化聚丙烯等塑料降解，提高聚丙烯的降解效率，本发明第八方面提供上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、上述的基因、上述的融合蛋白、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和上述的酶制剂中的至少一种在降解塑料中的应用。
根据本发明，所述塑料可以为聚丙烯、聚乙烯等常见的聚合物塑料，优选地，所述塑料为聚丙烯(PP)。
本发明第九方面提供一种降解塑料的方法，该方法包括以下步骤：将上述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、上述的基因、上述的融合蛋白、上述的重组载体、上述的重组菌株、上述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和上述的酶制剂中的至少一种作为降解剂，与塑料进行接触。
根据本发明，相对于每克的塑料样品，所述降解剂的用量可以为50-70mg。
根据本发明，优选地，所述接触的过程包括：将所述降解剂分批次添加至含有所述塑料的溶液中进行孵育；优选地，所述降解剂相邻批次的间隔时间为20-28h。所述孵育的条件可以是所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基适合的条件，优选情况下，所述孵育的条件包括：温度为4-40℃，具体可以为4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，以及上述两个数值之间的任意值；更优选地，所述孵育的条件包括：温度为4-30℃，有利于提高对塑料降解的效率。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1pET-28a(+)-FDISS和pET-28a(+)-FDISS-LCI重组质粒的构建
(1)以假单胞菌LICME 200610WGH-6(由南京师范大学黄和教授课题组提供，已在CN112159771A中公开)的DNA为模板，分别以FDISS-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和FDISS-R-1(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)，FDISS-F(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)和FDISS-R-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)为引物(Primer)，进行PCR扩增；PCR反应体系如表1所示，PCR反应条件如表2所示，PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切下正确的条带，胶回，得到目的片段甲酸酯脱氢酶铁硫亚基-1(以下简称FDISS-1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)以及目的片段甲酸酯脱氢酶铁硫亚基-2(以下简称FDISS-2，FDISS-2与FDISS-1的核苷酸序列相同，仅同源臂不同，表6中FDISS-R-1和FDISS-R-2的下划线标粗部分为引物中的同源臂部分)。
表1 PCR反应体系
表2 PCR反应条件
温度 时间
98℃ 3min
98℃ 10s
Tm <55℃15s；>55℃5s
72℃ 60s/kb
72℃ 5min
(2)以擎科生物技术有限公司合成的pET-28a(+)-LCI质粒为模板，分别以Vector-F-2(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)和Vector-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，Vector-F-1(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)和Vector-R(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)为引物(Primer)，进行PCR；PCR反应体系同表1，反应条件同表2，PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，切下正确的条带，胶回，分别得到载体片段pET-28a(+)以及载体片段pET-28a(+)-LCI，其中LCI的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示、核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(3)用一步克隆试剂盒(采购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品编号为C113-01)连接步骤(1)中得到的目的片段FDISS-1和载体片段pET-28a(+)，重组反应体系见表3，以温度为37℃反应30min，得到重组质粒pET-28a(+)-FDISS-1；同样地，采用该一步克隆试剂盒连接步骤(1)中得到的目的片段FDISS-2和载体片段pET-28a(+)-LCI，得到重组质粒pET-28a(+)-FDISS-2-LCI。
表3重组反应体系
(4)分别取10μL步骤(3)得到的重组质粒，加入100μL感受态大肠杆菌DH5α中，转化后均匀涂布在含50μg/mL卡那霉素kana的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜；挑取平板上长出的转化子，以其为模板，T7-F(核苷酸序列SEQ ID NO.12所示)和T7-R(核苷酸序列SEQID NO.13所示)为引物(Primer)，进行菌落PCR；菌落PCR反应体系见表4，菌落PCR反应条件见表5，PCR得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析后，选择条带正确的转化子送测，测序正确的则为构建成功的重组质粒pET-28a(+)-FDISS-1和重组质粒pET-28a(+)-FDISS-2-LCI。
表4菌落PCR反应体系
表5菌落PCR反应条件
温度 时间
95℃ 3min
95℃ 15s
Tm 57℃
72℃ 15s/kb
72℃ 5min
实施例1中所采用的各个引物核苷酸序列见表6。
表6
实施例2 FDISS和FDISS-LCI融合蛋白的表达和纯化
(1)将实施例1中得到的重组质粒pET-28a(+)-FDISS-1和pET-28a(+)-FDISS-2-LCI分别转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，得到过表达FDISS的重组菌株I和过表达FDISS-LCI的重组菌株II；
(2)将过表达FDISS的重组菌株I和过表达FDISS-LCI的重组菌株II分别按1体积％的接种量接入20mL添加有50μg/mL卡那霉素kana的LB液态培养基中，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下过夜培养(约12h)得到重组菌株I种子液和重组菌株II种子液；
(3)将重组菌株I种子液和重组菌株II种子液分别按10体积％的接种量分别接入250mL添加有50μg/mL卡那霉素kana的LB液态培养基中，在温度为37℃、转速为220rpm的条件下摇菌直到OD600介于0.4-0.6之间；在培养液中分别添加0.5mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷IPTG，在温度为18℃、转速为120rpm的条件下诱导表达20h，将表达结束后的菌液以温度为4℃、转速为8000rpm离心10min，弃上清，再用PBS缓冲液清洗菌泥两次；
(4)将菌泥用5mL的PBS缓冲液重悬，置于冰水混合物中，超声破碎30min(开3s，关7s，功率比45％)，将破碎后的细胞混合物以温度为4℃、转速为12000rpm离心30min，取上清；打开Ni预装柱上下堵头，使柱子中的浓度为20体积％的乙醇-水溶液在重力作用下流出，立即注入5-10mL的Buffer A(10mM咪唑溶液：磷酸二氢钠7.8g/L，氯化钠17.4g/L，咪唑0.68g/L，过0.22μm水系滤头)，使其在重力作用下流出，平衡柱子；立即注入破碎后的上清(过0.22μm水系滤头)，使其在重力作用下流出，使得目标蛋白挂柱；立即注入5-10mL的Buffer B(20mM咪唑溶液：磷酸二氢钠7.8g/L，氯化钠17.4g/L，咪唑1.36g/L，过0.22μm水系滤头)，使其在重力作用下流出，洗脱杂蛋白；立即注入5-10mL的Buffer C(300mM咪唑溶液：磷酸二氢钠7.8g/L，氯化钠17.4g/L，咪唑20.4g/L，过0.22μm水系滤头)，使其在重力作用下流出，滴下2-3滴时，立即用离心管接2mL洗脱下的含目标蛋白FDISS的洗脱液I以及含融合蛋白FDISS-LCI的洗脱液II，剩余的Buffer C滴完；依次加入5-10mL的Buffer B和5-10mL的Buffer A(过0.22μm水系滤头)平衡柱子，最后再加入2-3mL浓度为20体积％的乙醇-水溶液(过0.22μm有机滤头)，堵住Ni预装柱上下，置于4℃冰箱中保存；
(5)将含目标蛋白FDISS的洗脱液I以及含融合蛋白FDISS-LCI的洗脱液II用超滤管超滤，除去目标蛋白洗脱液中的高浓度咪唑，得到浓缩蛋白；将浓缩蛋白用BCA试剂盒(采购自杭州弗德生物科技有限公司，产品编号为FD2001)测量浓度，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，确认条带的位置正确后置于-80℃冰箱中保存。
实施例3锚定肽LCI与聚丙烯PP的特异性结合
选择长度为2cm的PP纤维，在室温(25±5℃)下，分别在含有实施例2获得的目标蛋白FDISS或者融合蛋白FDISS-LCI的PBS缓冲液中培养10min，然后取出PP纤维用10mL的Tris/HCl(PH 6.8)缓冲液，反复进行三次洗涤，最后在荧光显微镜下进行观察，结果见图1。目标蛋白FDISS起指示作用，PP纤维与FDISS共培养后没有散发绿色荧光，说明目标蛋白FDISS自身不会与PP结合；而与融合蛋白FDISS-LCI共培养后的PP纤维散发出绿色荧光，说明LCI携带FDISS结合到了PP纤维的表面，证明LCI可以帮助游离的蛋白结合到PP表面。
实施例4目标蛋白FDISS和融合蛋白FDISS-LCI对聚丙烯PP的降解
在2mL添加有25mg PP颗粒的PBS缓冲液中，分别加入目标蛋白FDISS或者融合蛋白FDISS-LCI，使其终浓度为0.25mg/mL，每24h添加一次，在30℃下共孵育72h；孵育结束后用PBS缓冲液超声清洗PP颗粒两次，再用纯水超声清洗一次，烘干后利用SEM观察PP颗粒表面形态的变化，结果见图2，并进行称重计算降解前后PP颗粒的失重率，结果见表7。可见，比起游离状态的的FDISS，利用融合蛋白FDISS-LCI帮助FDISS固定在PP颗粒表面进行降解，加剧了PP颗粒表面的劣化。
实施例5
在2mL添加有25mg PP颗粒的PBS缓冲液中，分别加入目标蛋白FDISS或者融合蛋白FDISS-LCI，使其终浓度为0.25mg/mL，每24h添加一次，在4℃下共孵育72h；孵育结束后用PBS缓冲液超声清洗PP颗粒两次，再用纯水超声清洗一次，烘干后进行称重计算降解前后PP颗粒的失重率，结果见表7。
实施例6
在2mL添加有25mg PP颗粒的PBS缓冲液中，分别加入目标蛋白FDISS或者融合蛋白FDISS-LCI，使其终浓度为0.25mg/mL，每24h添加一次，在25℃下共孵育72h；孵育结束后用PBS缓冲液超声清洗PP颗粒两次，再用纯水超声清洗一次，烘干后进行称重计算降解前后PP颗粒的失重率，结果见表7。
实施例7
在2mL添加有25mg PP颗粒的PBS缓冲液中，分别加入目标蛋白FDISS或者融合蛋白FDISS-LCI，使其终浓度为0.25mg/mL，每24h添加一次，在40℃下共孵育72h；孵育结束后用PBS缓冲液超声清洗PP颗粒两次，再用纯水超声清洗一次，烘干后进行称重计算降解前后PP颗粒的失重率，结果见表7。
表7
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基，其特征在于，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基为(a)-(d)中任意一项所述的酶：
(a)具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶；
(b)SEQ ID NO.1所示的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基且仍具有甲酸酯脱氢酶铁硫亚基活性的氨基酸序列所示的酶；
(c)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末端连接有标签的氨基酸序列所示的酶；
(d)在(a)或(b)所述氨基酸序列的氨基末端连接有信号序列的氨基酸序列所示的酶。
2.一种编码甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的基因，其特征在于，该基因具有编码权利要求1所述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因具有编码具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的酶的核苷酸序列；
优选地，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白含有根据权利要求1所述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和锚定肽；
优选地，所述锚定肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示；
优选地，所述锚定肽的核苷酸序列SEQ ID NO.4所示；
优选地，所述甲酸酯脱氢酶铁硫亚基与所述锚定肽通过连接蛋白连接，所述连接蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示。
5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2或3所述的基因，或者含有编码权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述重组载体的表达载体为pET-28a(+)质粒。
6.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株含有权利要求2或3所述的基因、含有编码权利要求4所述的融合蛋白的核苷酸序列或者权利要求5所述的重组载体；
优选地，所述重组菌株选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌中的至少一种；更优选地，所述重组菌株为大肠杆菌。
7.一种甲酸酯脱氢酶铁硫亚基的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵，对发酵产物进行分离纯化。
8.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求7所述的方法制备得到的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基；
优选地，所述酶制剂为液态制剂或者固态制剂。
9.权利要求1所述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组菌株、权利要求7所述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和权利要求8所述的酶制剂中的至少一种在降解塑料中的应用；
优选地，所述塑料为聚丙烯。
10.一种降解塑料的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：将权利要求1所述的甲酸酯脱氢酶铁硫亚基、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的重组菌株、权利要求7所述的方法制备得到甲酸酯脱氢酶铁硫亚基和权利要求8所述的酶制剂中的至少一种作为降解剂，与塑料进行接触；
优选地，所述接触的过程包括：将所述降解剂分批次添加至含有所述塑料的溶液中进行孵育；
优选地，所述降解剂相邻批次的间隔时间为20-28h，所述孵育的条件包括：温度为4-40℃。
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