JP2002034566A - ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 - Google Patents
ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体Info
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- JP2002034566A JP2002034566A JP2000220337A JP2000220337A JP2002034566A JP 2002034566 A JP2002034566 A JP 2002034566A JP 2000220337 A JP2000220337 A JP 2000220337A JP 2000220337 A JP2000220337 A JP 2000220337A JP 2002034566 A JP2002034566 A JP 2002034566A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ミミズ由来セリンプロテアーゼを大量生産す
る技術を確立することによって、当該酵素の経口投与に
よる血中血栓溶解活性亢進等の作用機作の解明等の詳細
な研究に寄与すると共に、本酵素の薬理、臨床応用の可
能性を開き、当該セリンプロテアーゼを安定的に供給し
て、血栓症等の治療に供すること。 【解決手段】 配列表の特定な塩基配列を有するミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −１の遺伝子、当該遺
伝子を含むプラスミドベクターおよび形質転換酵母並び
に特定な塩基配列を有するミミズ由来セリンプロテアー
ゼＦ−III −２の遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミド
ベクターおよび形質転換酵母。
る技術を確立することによって、当該酵素の経口投与に
よる血中血栓溶解活性亢進等の作用機作の解明等の詳細
な研究に寄与すると共に、本酵素の薬理、臨床応用の可
能性を開き、当該セリンプロテアーゼを安定的に供給し
て、血栓症等の治療に供すること。 【解決手段】 配列表の特定な塩基配列を有するミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −１の遺伝子、当該遺
伝子を含むプラスミドベクターおよび形質転換酵母並び
に特定な塩基配列を有するミミズ由来セリンプロテアー
ゼＦ−III −２の遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミド
ベクターおよび形質転換酵母。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ミミズ由来セリン
プロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベ
クター及び形質転換体に関する。ミミズ由来セリンプロ
テアーゼは、ミミズ（Lumbricus rubellus）に由来する
酵素で、活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼであ
り、血栓溶解（線溶）作用を触媒する血栓溶解酵素（線
溶酵素）の一種である。
プロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベ
クター及び形質転換体に関する。ミミズ由来セリンプロ
テアーゼは、ミミズ（Lumbricus rubellus）に由来する
酵素で、活性部位にセリン残基のあるプロテアーゼであ
り、血栓溶解（線溶）作用を触媒する血栓溶解酵素（線
溶酵素）の一種である。
【０００２】
【従来の技術】血栓は、末梢動静脈血栓症、肺塞栓症、
心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈
血栓症をはじめ、種々の疾患に関連し、病原因子として
大きな問題となっている。現在のところ、血栓症の治療
には、微生物由来のストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ヒト
尿から得られるウロキナーゼ（ＵＫ）あるいはメラノー
マ培養液から得られる組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（ＴＰＡ）などが点滴剤として用いられている。し
かし、いずれも血中での半減期が２０分以内と極めて短
いため、一時的な効果しか期待できなかった。しかも、
いずれも高価である。
心筋梗塞症、冠動脈閉塞症、脳血管閉塞症、網膜動静脈
血栓症をはじめ、種々の疾患に関連し、病原因子として
大きな問題となっている。現在のところ、血栓症の治療
には、微生物由来のストレプトキナーゼ（ＳＫ）、ヒト
尿から得られるウロキナーゼ（ＵＫ）あるいはメラノー
マ培養液から得られる組織プラスミノーゲンアクチベー
ター（ＴＰＡ）などが点滴剤として用いられている。し
かし、いずれも血中での半減期が２０分以内と極めて短
いため、一時的な効果しか期待できなかった。しかも、
いずれも高価である。
【０００３】近年、血栓等の治療を目的として、線溶酵
素の一つであるミミズ由来セリンプロテアーゼの薬理、
臨床応用についてその可能性を強く実証する研究結果が
報告されており（Thromb Haemostas. ，62，545 （198
9））、当該線溶酵素の経口投与による血中線溶活性亢
進等の作用機作の解明をはじめとして、当該線溶酵素の
詳細な研究に期待が寄せられている。しかしながら、ミ
ミズからセリンプロテアーゼを抽出するためには、ミミ
ズを育成するのに時間がかかると同時に、大量のミミズ
を必要とする等の問題があった。
素の一つであるミミズ由来セリンプロテアーゼの薬理、
臨床応用についてその可能性を強く実証する研究結果が
報告されており（Thromb Haemostas. ，62，545 （198
9））、当該線溶酵素の経口投与による血中線溶活性亢
進等の作用機作の解明をはじめとして、当該線溶酵素の
詳細な研究に期待が寄せられている。しかしながら、ミ
ミズからセリンプロテアーゼを抽出するためには、ミミ
ズを育成するのに時間がかかると同時に、大量のミミズ
を必要とする等の問題があった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ミミズ由来
セリンプロテアーゼを大量生産する技術を確立すること
によって、当該酵素の経口投与による血中線溶活性亢進
等の作用機作の解明等の詳細な研究に寄与することを目
的とするものである。さらに、このミミズ由来セリンプ
ロテアーゼの研究が進んで薬理、臨床応用の可能性が開
ければ、大量生産により安定的に当該酵素を供給し、血
栓症等の治療を効率よく行うことが可能となる。
セリンプロテアーゼを大量生産する技術を確立すること
によって、当該酵素の経口投与による血中線溶活性亢進
等の作用機作の解明等の詳細な研究に寄与することを目
的とするものである。さらに、このミミズ由来セリンプ
ロテアーゼの研究が進んで薬理、臨床応用の可能性が開
ければ、大量生産により安定的に当該酵素を供給し、血
栓症等の治療を効率よく行うことが可能となる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討の結果、ミミズ由来セリンプロテ
アーゼの遺伝的情報を得ることができた。すなわち、ミ
ミズから全ＲＮＡおよびｍＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡか
らディジェネレートプライマーを用いたｃＤＮＡ断片を
単離し、前記ｃＤＮＡ断片を基にして作成したプライマ
ーを用いて、前記ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡを鋳型とし
たＲＡＣＥ法によりｃＤＮＡを単離して塩基配列を決定
し（配列表の配列番号１および２）さらに、その翻訳産
物であるミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１お
よびＦ−III −２の遺伝子のアミノ酸配列を決定し（配
列表の配列番号３および４）、哺乳類におけるトリプシ
ンファミリーに属するセリンプロテアーゼとの相同性の
確認やアライメント解析を行った。
を達成すべく鋭意検討の結果、ミミズ由来セリンプロテ
アーゼの遺伝的情報を得ることができた。すなわち、ミ
ミズから全ＲＮＡおよびｍＲＮＡを抽出後、全ＲＮＡか
らディジェネレートプライマーを用いたｃＤＮＡ断片を
単離し、前記ｃＤＮＡ断片を基にして作成したプライマ
ーを用いて、前記ｍＲＮＡから得たｃＤＮＡを鋳型とし
たＲＡＣＥ法によりｃＤＮＡを単離して塩基配列を決定
し（配列表の配列番号１および２）さらに、その翻訳産
物であるミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１お
よびＦ−III −２の遺伝子のアミノ酸配列を決定し（配
列表の配列番号３および４）、哺乳類におけるトリプシ
ンファミリーに属するセリンプロテアーゼとの相同性の
確認やアライメント解析を行った。
【０００６】また、本発明者らは、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡからＰＣＲによりオ
ープンリーディングフレーム領域を単離して、これを制
限酵素発現部位を利用して酵母発現ベクターに組み込ん
だプラスミドを作製した。そして、得られたプラスミド
を用いて酵母に形質転換し、形質転換酵母がセリンプロ
テアーゼ活性を発現していることを確認した。本発明
は、これらの知見に基づいて完成された。
ロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡからＰＣＲによりオ
ープンリーディングフレーム領域を単離して、これを制
限酵素発現部位を利用して酵母発現ベクターに組み込ん
だプラスミドを作製した。そして、得られたプラスミド
を用いて酵母に形質転換し、形質転換酵母がセリンプロ
テアーゼ活性を発現していることを確認した。本発明
は、これらの知見に基づいて完成された。
【０００７】すなわち、請求項１記載の本発明は、配列
表の配列番号１に記載の塩基配列を有するミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −１の遺伝子である。請求項
２記載の本発明は、請求項１記載のミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −１の遺伝子を含むプラスミドベク
ターである。請求項３記載の本発明は、請求項２記載の
プラスミドを保有する形質転換酵母である。請求項４記
載の本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
有するミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺
伝子である。請求項５記載の本発明は、請求項４記載の
ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺伝子を
有するプラスミドベクターである。請求項６記載の本発
明は、請求項５記載のプラスミドを保有する形質転換酵
母である。
表の配列番号１に記載の塩基配列を有するミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −１の遺伝子である。請求項
２記載の本発明は、請求項１記載のミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −１の遺伝子を含むプラスミドベク
ターである。請求項３記載の本発明は、請求項２記載の
プラスミドを保有する形質転換酵母である。請求項４記
載の本発明は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
有するミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺
伝子である。請求項５記載の本発明は、請求項４記載の
ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺伝子を
有するプラスミドベクターである。請求項６記載の本発
明は、請求項５記載のプラスミドを保有する形質転換酵
母である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のミミズ由来セリンプロテアーゼに関する遺伝的
情報は、以下に示す方法により決定することができる。
本発明のミミズ由来セリンプロテアーゼに関する遺伝的
情報は、以下に示す方法により決定することができる。
【０００９】（１）原料の調製 本発明に係る酵素の原料はミミズであり、その種類は制
限されない。消化管内の糞土を排出させた後、凍結す
る。
限されない。消化管内の糞土を排出させた後、凍結す
る。
【００１０】（２）全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製 ミミズからの全ＲＮＡの調製は、公知の方法で行うこと
ができる。例えば「植物のＰＣＲ実験プロトコール」
（秀潤社、５６〜６２頁（１９９７））に記載されてい
るように、ミミズを液体窒素中で凍結粉砕し、適当な溶
媒に懸濁して遠心分離を繰り返すことにより得ることが
できる。また、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから調製できるが、
これも公知の方法で行うことができる。例えばベリタス
社の「Dynabeads Oligo (dT)25」を用い、添付されたプ
ロトコールに従ってｍＲＮＡを調製することができる。
ができる。例えば「植物のＰＣＲ実験プロトコール」
（秀潤社、５６〜６２頁（１９９７））に記載されてい
るように、ミミズを液体窒素中で凍結粉砕し、適当な溶
媒に懸濁して遠心分離を繰り返すことにより得ることが
できる。また、ｍＲＮＡは全ＲＮＡから調製できるが、
これも公知の方法で行うことができる。例えばベリタス
社の「Dynabeads Oligo (dT)25」を用い、添付されたプ
ロトコールに従ってｍＲＮＡを調製することができる。
【００１１】（３）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片とは、ミミ
ズ細胞中で発現している遺伝子に相補的な遺伝子断片を
意味する。ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片
の単離は、実施例に示したように、ミミズ細胞より調製
した全ＲＮＡ配列についてディジェネレートプライマー
を用いたＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polyme
rase chain reaction)法により行うことができる。
ＮＡ断片の単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片とは、ミミ
ズ細胞中で発現している遺伝子に相補的な遺伝子断片を
意味する。ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片
の単離は、実施例に示したように、ミミズ細胞より調製
した全ＲＮＡ配列についてディジェネレートプライマー
を用いたＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription-polyme
rase chain reaction)法により行うことができる。
【００１２】こうしたＲＴ−ＰＣＲ法やディジェネレー
トプライマーを用いたＰＣＲ法は、公知の方法に従って
実施することができ、例えばＰＥバイオシステムズジャ
パン社の「GeneAmp RNA PCR Kit 」に添付されたプロト
コールや、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤
社、７５〜７８頁、１０６〜１０９頁（１９９７））に
記載の方法に従って行うことができる。
トプライマーを用いたＰＣＲ法は、公知の方法に従って
実施することができ、例えばＰＥバイオシステムズジャ
パン社の「GeneAmp RNA PCR Kit 」に添付されたプロト
コールや、「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤
社、７５〜７８頁、１０６〜１０９頁（１９９７））に
記載の方法に従って行うことができる。
【００１３】例えば、ミミズ細胞全ＲＮＡから、Oligo
ｄ(T)16をプライマーとした逆転写反応により1st stran
d cDNA を作製し、この1st strand cDNA を鋳型とし
て、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部分
アミノ酸配列を基にして作製したＮ末端側ディジェネレ
ートプライマーおよびＣ末端側ディジェネレートプライ
マー（それぞれ配列表の配列番号５および６参照）を用
いたＰＣＲを行うことにより、目的のｃＤＮＡ断片を得
ることができる。
ｄ(T)16をプライマーとした逆転写反応により1st stran
d cDNA を作製し、この1st strand cDNA を鋳型とし
て、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部分
アミノ酸配列を基にして作製したＮ末端側ディジェネレ
ートプライマーおよびＣ末端側ディジェネレートプライ
マー（それぞれ配列表の配列番号５および６参照）を用
いたＰＣＲを行うことにより、目的のｃＤＮＡ断片を得
ることができる。
【００１４】なお、次の反応のためには、ＲＴ−ＰＣＲ
反応液から、４９１塩基対のミミズ由来セリンプロテア
ーゼｃＤＮＡ断片をアガロース電気泳動等で単離後、こ
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片を、プロ
メガ社の「pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems 」
を用いて、pGEM-Tに連結してプラスミドを作製しておく
ことが望ましい。
反応液から、４９１塩基対のミミズ由来セリンプロテア
ーゼｃＤＮＡ断片をアガロース電気泳動等で単離後、こ
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片を、プロ
メガ社の「pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Systems 」
を用いて、pGEM-Tに連結してプラスミドを作製しておく
ことが望ましい。
【００１５】本発明者らは、こうして得られたｃＤＮＡ
断片の塩基配列を、パーキンエルマー社「BigDye Termi
nator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」およ
びジェネティックアナライザー（パーキンエルマー社、
ABI PRISM 310 ）を用いて決定した。その結果、２種類
の異なる塩基配列を持つミミズ由来セリンプロテアーゼ
ｃＤＮＡ断片が単離されたことが明らかとなった。
断片の塩基配列を、パーキンエルマー社「BigDye Termi
nator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」およ
びジェネティックアナライザー（パーキンエルマー社、
ABI PRISM 310 ）を用いて決定した。その結果、２種類
の異なる塩基配列を持つミミズ由来セリンプロテアーゼ
ｃＤＮＡ断片が単離されたことが明らかとなった。
【００１６】（４）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡとは、ミミズ細
胞で発現している遺伝子の全長ｃＤＮＡを意味する。ミ
ミズ細胞で発現している遺伝子の全長ｃＤＮＡの単離
は、ミミズ細胞より作製したｃＤＮＡをもとに、ミミズ
由来セリンプロテアーゼプライマーを用いたＲＡＣＥ法
（rapid amplification of cDNA ends）によって行うこ
とができる。このＲＡＣＥ法は、公知の方法で行うこと
ができ、例えばクローンテック社の「Marathon cDNA Am
plification Kit 」に添付されたプロトコールに記載の
方法等で行うことができる。
ＮＡの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡとは、ミミズ細
胞で発現している遺伝子の全長ｃＤＮＡを意味する。ミ
ミズ細胞で発現している遺伝子の全長ｃＤＮＡの単離
は、ミミズ細胞より作製したｃＤＮＡをもとに、ミミズ
由来セリンプロテアーゼプライマーを用いたＲＡＣＥ法
（rapid amplification of cDNA ends）によって行うこ
とができる。このＲＡＣＥ法は、公知の方法で行うこと
ができ、例えばクローンテック社の「Marathon cDNA Am
plification Kit 」に添付されたプロトコールに記載の
方法等で行うことができる。
【００１７】例えば、ＲＡＣＥ法は以下のようにして行
うことができる。ミミズ細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合
成した後、T4 DNA Polymerase で両端を平滑末端化し
て、さらにT4 DNA Ligase を用いてｃＤＮＡアダプター
を連結する。こうして得られるアダプターが連結したｃ
ＤＮＡを鋳型として、ミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマー
（配列表の配列番号７〜１０参照）とアダプターに特異
的なプライマーとを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成す
る。
うことができる。ミミズ細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合
成した後、T4 DNA Polymerase で両端を平滑末端化し
て、さらにT4 DNA Ligase を用いてｃＤＮＡアダプター
を連結する。こうして得られるアダプターが連結したｃ
ＤＮＡを鋳型として、ミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマー
（配列表の配列番号７〜１０参照）とアダプターに特異
的なプライマーとを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成す
る。
【００１８】こうして、ＲＡＣＥ法により得られたＰＣ
Ｒ増幅断片を、ｐＧＥＭ−Ｔに連結して、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼの全長ｃＤＮＡを単離した。
Ｒ増幅断片を、ｐＧＥＭ−Ｔに連結して、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼの全長ｃＤＮＡを単離した。
【００１９】（５）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの全塩基配列および翻訳産物のアミノ酸配列の決
定） 単離されたミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩
基配列の決定は、公知の方法で行うことができる。例え
ば、パーキンエルマー社の「BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS Ready Reaction Kit」およびジェネティ
ックアナライズ（パーキンエルマー社、ABI PRISM 310
）に添付されたプロトコールに記載の方法等で行うこ
とができる。
ＮＡの全塩基配列および翻訳産物のアミノ酸配列の決
定） 単離されたミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩
基配列の決定は、公知の方法で行うことができる。例え
ば、パーキンエルマー社の「BigDye Terminator Cycle
Sequencing FS Ready Reaction Kit」およびジェネティ
ックアナライズ（パーキンエルマー社、ABI PRISM 310
）に添付されたプロトコールに記載の方法等で行うこ
とができる。
【００２０】ここで決定された２種類のミミズ由来セリ
ンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表
の配列番号１と配列番号２に示す。また、２種類の塩基
配列より推定される翻訳産物のアミノ酸配列を配列表の
配列番号３と配列番号４に示す。
ンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表
の配列番号１と配列番号２に示す。また、２種類の塩基
配列より推定される翻訳産物のアミノ酸配列を配列表の
配列番号３と配列番号４に示す。
【００２１】第一のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参
照）のうち９〜３２番目のアミノ酸配列が、ミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −１のＮ末端アミノ酸配列
（Biosci．Biotech ．Biochem.，57，1726（1993))に完
全に一致する。このことから、第一のミミズ由来セリン
プロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列
表の配列番号３参照）に相当する塩基配列を持つｃＤＮ
Ａが、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III−１の遺
伝子であることが明らかとなった。すなわち、配列番号
１記載の塩基配列を有する遺伝子が、請求項１記載の本
発明のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１の遺
伝子である。
ＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参
照）のうち９〜３２番目のアミノ酸配列が、ミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −１のＮ末端アミノ酸配列
（Biosci．Biotech ．Biochem.，57，1726（1993))に完
全に一致する。このことから、第一のミミズ由来セリン
プロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列
表の配列番号３参照）に相当する塩基配列を持つｃＤＮ
Ａが、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III−１の遺
伝子であることが明らかとなった。すなわち、配列番号
１記載の塩基配列を有する遺伝子が、請求項１記載の本
発明のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１の遺
伝子である。
【００２２】また、第二のミミズ由来セリンプロテアー
ゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番
号４参照）のうち８〜７８番目のアミノ酸配列がミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のＮ末端アミノ酸
配列（Biosci．Biotech ．Biochem.，60，293 （1996))
に完全に一致し、１０４から１３０番目のアミノ酸配列
がミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部分ア
ミノ酸配列に完全に一致する。このことから、第二のミ
ミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミ
ノ酸配列（配列表の配列番号４参照）に相当する塩基配
列を持つｃＤＮＡが、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ
−III −２の遺伝子であることが明らかとなった。すな
わち、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺
伝子が、請求項４記載の本発明のミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の遺伝子である。
ゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番
号４参照）のうち８〜７８番目のアミノ酸配列がミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のＮ末端アミノ酸
配列（Biosci．Biotech ．Biochem.，60，293 （1996))
に完全に一致し、１０４から１３０番目のアミノ酸配列
がミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部分ア
ミノ酸配列に完全に一致する。このことから、第二のミ
ミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミ
ノ酸配列（配列表の配列番号４参照）に相当する塩基配
列を持つｃＤＮＡが、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ
−III −２の遺伝子であることが明らかとなった。すな
わち、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有する遺
伝子が、請求項４記載の本発明のミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の遺伝子である。
【００２３】トリプシンファミリー酵素の活性型は、Ｎ
末端アミノ酸配列Ile Val Gly Glyが良く保存されてお
り、前駆体型は活性型のＮ末端アミノ酸に６〜８個のア
ミノ酸配列（activation peptide）が付加されている
（Biochem ．J.，307 ，471 (1995)) 。このことから、
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうちの１〜８
番目のアミノ酸配列と、配列番号４の記載のアミノ酸配
列のうちの１〜７番目のアミノ酸配列が、activation p
eptideであると考えられる。
末端アミノ酸配列Ile Val Gly Glyが良く保存されてお
り、前駆体型は活性型のＮ末端アミノ酸に６〜８個のア
ミノ酸配列（activation peptide）が付加されている
（Biochem ．J.，307 ，471 (1995)) 。このことから、
配列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうちの１〜８
番目のアミノ酸配列と、配列番号４の記載のアミノ酸配
列のうちの１〜７番目のアミノ酸配列が、activation p
eptideであると考えられる。
【００２４】また、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III −１とＦ−III −２の各ｃＤＮＡの塩基配列より推
定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３お
よび４参照）同士を比較した結果、活性型酵素のアミノ
酸配列の全長は共に２３８アミノ酸残基数であり、この
うちの２１５個のアミノ酸残基が保存されている。
III −１とＦ−III −２の各ｃＤＮＡの塩基配列より推
定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３お
よび４参照）同士を比較した結果、活性型酵素のアミノ
酸配列の全長は共に２３８アミノ酸残基数であり、この
うちの２１５個のアミノ酸残基が保存されている。
【００２５】次に、既知のアミノ酸配列と得られたミミ
ズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（配列表の配列番号３および４参
照）との相同性を比較した。その結果、このアミノ酸配
列は哺乳類においてトリプシンファミリーに属するセリ
ンプロテアーゼのアミノ酸配列と高い相同性を有してい
ることが分かった（図１の＊参照）。
ズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（配列表の配列番号３および４参
照）との相同性を比較した。その結果、このアミノ酸配
列は哺乳類においてトリプシンファミリーに属するセリ
ンプロテアーゼのアミノ酸配列と高い相同性を有してい
ることが分かった（図１の＊参照）。
【００２６】すなわち、ミミズ由来セリンプロテアーゼ
ｃＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列
表の配列番号３および４参照）は、相同性が高いウシ由
来トリプシンの活性中心アミノ酸残基である４０番目の
Ｈｉｓ、８４番目のＡｓｐ、１７７番目のＳｅｒが、配
列表の配列番号３と４における４３番目のＨｉｓ、９１
番目のＡｓｐ、１８８番目のＳｅｒとそれぞれ一致し、
保存されているものと考えられる。また、ウシ由来トリ
プシンの基質の特異的認識に関与するアミノ酸残基であ
る１７１番目のＡｓｐが、配列表の配列番号３と４の１
８２番目のＡｓｐと一致し、保存されていると考えられ
る。また、ウシ由来トリプシンのサブサイトＳ１である
１９２番目のＳｅｒ、サブサイトＳ２である１９３番目
のＴｒｐ、サブサイトＳ３である１９４番目のＧｌｙ
が、配列表の配列番号３と配列番号４に記載のアミノ酸
配列の２０８番目のＳｅｒ、２０９番目のＴｒｐ、２１
０番目のＧｌｙとそれぞれ一致し、保存されていること
が分かる。
ｃＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列
表の配列番号３および４参照）は、相同性が高いウシ由
来トリプシンの活性中心アミノ酸残基である４０番目の
Ｈｉｓ、８４番目のＡｓｐ、１７７番目のＳｅｒが、配
列表の配列番号３と４における４３番目のＨｉｓ、９１
番目のＡｓｐ、１８８番目のＳｅｒとそれぞれ一致し、
保存されているものと考えられる。また、ウシ由来トリ
プシンの基質の特異的認識に関与するアミノ酸残基であ
る１７１番目のＡｓｐが、配列表の配列番号３と４の１
８２番目のＡｓｐと一致し、保存されていると考えられ
る。また、ウシ由来トリプシンのサブサイトＳ１である
１９２番目のＳｅｒ、サブサイトＳ２である１９３番目
のＴｒｐ、サブサイトＳ３である１９４番目のＧｌｙ
が、配列表の配列番号３と配列番号４に記載のアミノ酸
配列の２０８番目のＳｅｒ、２０９番目のＴｒｐ、２１
０番目のＧｌｙとそれぞれ一致し、保存されていること
が分かる。
【００２７】さらに、ミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列表
の配列番号３および４参照）には、ウシ由来トリプシン
の自己消化領域に存在する自己消化部位であるＬｙｓや
Ａｒｇも存在しない。このことは、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件下で安
定であることをタンパク質構造的に示唆している。
ＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（配列表
の配列番号３および４参照）には、ウシ由来トリプシン
の自己消化領域に存在する自己消化部位であるＬｙｓや
Ａｒｇも存在しない。このことは、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件下で安
定であることをタンパク質構造的に示唆している。
【００２８】（６）ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ
−III −２）のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング
フレームの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤ
ＮＡの活性型オープンリーディングフレームとは、ミミ
ズ細胞で発現しているｃＤＮＡの塩基配列のうち、活性
型ミミズ由来セリンプロテアーゼのＮ末端アミノ酸のコ
ドンから終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）を含む
領域を意味する。
−III −２）のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング
フレームの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤ
ＮＡの活性型オープンリーディングフレームとは、ミミ
ズ細胞で発現しているｃＤＮＡの塩基配列のうち、活性
型ミミズ由来セリンプロテアーゼのＮ末端アミノ酸のコ
ドンから終止コドン（ＴＧＡ、ＴＡＧ、ＴＡＡ）を含む
領域を意味する。
【００２９】この領域は、ミミズ由来セリンプロテアー
ゼｃＤＮＡを鋳型とし、制限酵素切断部位配列を有する
プライマー（例えば、配列表の配列番号１１および１２
に示す配列を有するプライマー）によるＰＣＲ法を用い
た公知の方法で単離することができる。例えば、「植物
のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社、６９頁（１９９
７））に記載の条件や、クローンテック社の「Advantag
e 2 PCR Kit 」を用いて、添付されたプロトコールに従
って行うことができる。その結果、８０１塩基対のミミ
ズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活
性型オープンリーディング領域を得ることができる。
ゼｃＤＮＡを鋳型とし、制限酵素切断部位配列を有する
プライマー（例えば、配列表の配列番号１１および１２
に示す配列を有するプライマー）によるＰＣＲ法を用い
た公知の方法で単離することができる。例えば、「植物
のＰＣＲ実験プロトコール」（秀潤社、６９頁（１９９
７））に記載の条件や、クローンテック社の「Advantag
e 2 PCR Kit 」を用いて、添付されたプロトコールに従
って行うことができる。その結果、８０１塩基対のミミ
ズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活
性型オープンリーディング領域を得ることができる。
【００３０】（７）ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ
−III −２）のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング
領域の発現 ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤ
ＮＡの活性型オープンリーディング領域の発現は、酵母
発現系を用いる公知の方法で実施することができる。例
えば、インビトロジェン社の「EasySelect Pichia Expr
ession Kit」を用い、添付されたプロトコールに従って
行うことができる。
−III −２）のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング
領域の発現 ミミズ由来セリンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤ
ＮＡの活性型オープンリーディング領域の発現は、酵母
発現系を用いる公知の方法で実施することができる。例
えば、インビトロジェン社の「EasySelect Pichia Expr
ession Kit」を用い、添付されたプロトコールに従って
行うことができる。
【００３１】具体的には、前記（６）のミミズ由来セリ
ンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤＮＡの活性型オ
ープンリーディング領域を、アガロース電気泳動で単離
し、プロメガ社の「pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Sy
stems 」を用いて、pGEM-Tをベクターとしてプラスミド
を作製する。このプラスミドを、（６）で用いたものと
同じ制限酵素（例えば、Pst I とXba I)で消化した後の
断片をインビトロジェン社の「A Manual of Methods of
Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICA α in
Pichia Pastoris 」に従い、pPICZαB の制限酵素部位
に挿入する。
ンプロテアーゼ（Ｆ−III −２）のｃＤＮＡの活性型オ
ープンリーディング領域を、アガロース電気泳動で単離
し、プロメガ社の「pGEM-T and pGEM-T Easy Vector Sy
stems 」を用いて、pGEM-Tをベクターとしてプラスミド
を作製する。このプラスミドを、（６）で用いたものと
同じ制限酵素（例えば、Pst I とXba I)で消化した後の
断片をインビトロジェン社の「A Manual of Methods of
Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICA α in
Pichia Pastoris 」に従い、pPICZαB の制限酵素部位
に挿入する。
【００３２】得られたプラスミドpPICMMZ-1 を用いて、
インビトロジェン社の「Pichia EasyComp Kit (For the
preparation and transformation of competent Pichi
a cells)」を用い、添付されたプロトコールに従い、酵
母Pichia pastoris GS115 を形質転換し、これを培養し
てミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮ
Ａの活性型オープンリーディングフレームを発現させ
る。
インビトロジェン社の「Pichia EasyComp Kit (For the
preparation and transformation of competent Pichi
a cells)」を用い、添付されたプロトコールに従い、酵
母Pichia pastoris GS115 を形質転換し、これを培養し
てミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮ
Ａの活性型オープンリーディングフレームを発現させ
る。
【００３３】その結果、図２に示すように、ミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オ
ープンリーディングフレームを発現させた酵母培養液
（図２のＡ）は、ミミズ細胞のホモジネート（図２の
Ｂ）、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の活
性型オープンリーディングフレームを発現させた１０倍
濃度の酵母培養液（図２のＣ）と同様に、フィブリン溶
解活性が認められる。すなわち、本発明者が単離したミ
ミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの
活性型オープンリーディングフレームは、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡに確実に存在
し、遺伝子が発現していることが明らかである。
セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オ
ープンリーディングフレームを発現させた酵母培養液
（図２のＡ）は、ミミズ細胞のホモジネート（図２の
Ｂ）、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の活
性型オープンリーディングフレームを発現させた１０倍
濃度の酵母培養液（図２のＣ）と同様に、フィブリン溶
解活性が認められる。すなわち、本発明者が単離したミ
ミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの
活性型オープンリーディングフレームは、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡに確実に存在
し、遺伝子が発現していることが明らかである。
【００３４】ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −
１についても上記の方法と同様にして形質転換酵母を
得、遺伝子の発現を確認することができる。
１についても上記の方法と同様にして形質転換酵母を
得、遺伝子の発現を確認することができる。
【００３５】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ （１）ミミズの調製 ミミズ（Lumbricus rubellus）をセルロースで一昼夜飼
育して、消化管内の糞土を排出させた後、液体窒素で凍
結した。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ （１）ミミズの調製 ミミズ（Lumbricus rubellus）をセルロースで一昼夜飼
育して、消化管内の糞土を排出させた後、液体窒素で凍
結した。
【００３６】（２）ミミズ細胞の全ＲＮＡおよびｍＲＮ
Ａの調製 ミミズ細胞の全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製は、以下の
通り行った。ミミズを液体窒素中で凍結粉砕し、グアニ
ジンイソチオシアン酸溶液（４Ｍグアニジンイソチオシ
アン酸、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、０．５％ Ｎ−ラウリルザルコシンナトリウム、
０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）に懸濁して、遠
心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分、２０℃）した。
得られた上清を塩化セシウム溶液に重層し、遠心分離
（１００，０００ｒｐｍ、３時間、２０℃）した。沈殿
をＴＥＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）に溶解し、フ
ェノール・クロロホルム抽出を行った後、１／１０倍量
の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２．５倍量の
エタノールを加え、−２０℃で一晩放置した。次いで、
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した
後、沈殿を水に溶解し、全ＲＮＡサンプルとした。この
全ＲＮＡサンプルから、ベリタス社の「Dynabeads Olig
o （dT）25」を用い、添付されたプロトコールに従って
ｍＲＮＡを調製した。
Ａの調製 ミミズ細胞の全ＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製は、以下の
通り行った。ミミズを液体窒素中で凍結粉砕し、グアニ
ジンイソチオシアン酸溶液（４Ｍグアニジンイソチオシ
アン酸、２５ｍＭ クエン酸ナトリウム（ｐＨ７．
０）、０．５％ Ｎ−ラウリルザルコシンナトリウム、
０．１Ｍ ２−メルカプトエタノール）に懸濁して、遠
心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分、２０℃）した。
得られた上清を塩化セシウム溶液に重層し、遠心分離
（１００，０００ｒｐｍ、３時間、２０℃）した。沈殿
をＴＥＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ ＳＤＳ）に溶解し、フ
ェノール・クロロホルム抽出を行った後、１／１０倍量
の３Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、２．５倍量の
エタノールを加え、−２０℃で一晩放置した。次いで、
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した
後、沈殿を水に溶解し、全ＲＮＡサンプルとした。この
全ＲＮＡサンプルから、ベリタス社の「Dynabeads Olig
o （dT）25」を用い、添付されたプロトコールに従って
ｍＲＮＡを調製した。
【００３７】（３）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の単離 ここでは、ディジェネレートプライマーを用いたＲＴ−
ＰＣＲ法によりミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ
断片の単離を行った。具体的には、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼｃＤＮＡ断片の単離のためのＲＴ−ＰＣＲに
は、ＰＥバイオシステムズジャパン社の「GeneAmp RNA
PCR Kit 」を用い、添付されたプロトコールに従って、
以下のような手順で行った。
ＮＡ断片の単離 ここでは、ディジェネレートプライマーを用いたＲＴ−
ＰＣＲ法によりミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ
断片の単離を行った。具体的には、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼｃＤＮＡ断片の単離のためのＲＴ−ＰＣＲに
は、ＰＥバイオシステムズジャパン社の「GeneAmp RNA
PCR Kit 」を用い、添付されたプロトコールに従って、
以下のような手順で行った。
【００３８】上記（２）で得たミミズ細胞全ＲＮＡか
ら、Oligo ｄ(T)16をプライマーとして、逆転写反応に
より1st strand cDNA を合成した。この1st strand cDN
A を鋳型として、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−II
I −２の部分アミノ酸配列を基にして作製したＮ末端側
ディジェネレートプライマーおよびＣ末端側ディジェネ
レートプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成し
た。
ら、Oligo ｄ(T)16をプライマーとして、逆転写反応に
より1st strand cDNA を合成した。この1st strand cDN
A を鋳型として、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−II
I −２の部分アミノ酸配列を基にして作製したＮ末端側
ディジェネレートプライマーおよびＣ末端側ディジェネ
レートプライマーを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成し
た。
【００３９】ここで用いたプライマー対、すなわちＮ末
端側ディジェネレートプライマーとＣ末端側ディジェネ
レートプライマーのそれぞれの塩基配列を、配列表の配
列番号５および配列番号６に示す。なお、Ｎ末端側ディ
ジェネレートプライマー（配列表の配列番号５参照）
は、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち１
６〜２２番目に位置するProTyr Glu Phe Pro Trp Gln
に相当する部分アミノ酸配列に基づいて合成したもので
ある。また、Ｃ末端側ディジェネレートプライマー（配
列表の配列番号６参照）は、配列表の配列番号４に記載
のアミノ酸配列のうち１７３〜１７９番目に位置するTy
r Asp Asp Met Ile Cys Ala に相当する部分アミノ酸配
列を基にして合成したものである。
端側ディジェネレートプライマーとＣ末端側ディジェネ
レートプライマーのそれぞれの塩基配列を、配列表の配
列番号５および配列番号６に示す。なお、Ｎ末端側ディ
ジェネレートプライマー（配列表の配列番号５参照）
は、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列のうち１
６〜２２番目に位置するProTyr Glu Phe Pro Trp Gln
に相当する部分アミノ酸配列に基づいて合成したもので
ある。また、Ｃ末端側ディジェネレートプライマー（配
列表の配列番号６参照）は、配列表の配列番号４に記載
のアミノ酸配列のうち１７３〜１７９番目に位置するTy
r Asp Asp Met Ile Cys Ala に相当する部分アミノ酸配
列を基にして合成したものである。
【００４０】ＲＴ−ＰＣＲ反応液から、４９１塩基対の
ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片をアガロー
ス電気泳動で単離した。このミミズ由来セリンプロテア
ーゼｃＤＮＡ断片を、プロメガ社の「pGEM-T and pGEM-
T Easy Vector Systems 」を用いて、pGEM-Tに連結して
プラスミドを作製した。
ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片をアガロー
ス電気泳動で単離した。このミミズ由来セリンプロテア
ーゼｃＤＮＡ断片を、プロメガ社の「pGEM-T and pGEM-
T Easy Vector Systems 」を用いて、pGEM-Tに連結して
プラスミドを作製した。
【００４１】（４）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列の決定 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した。塩基配列の決定は、パーキンエルマー社
「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reac
tion Kit」およびジェネティックアナライザー（パーキ
ンエルマー社、ABI PRISM 310 ）を用いて行った。
ＮＡ断片の塩基配列の決定 ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片の塩基配列
を決定した。塩基配列の決定は、パーキンエルマー社
「BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reac
tion Kit」およびジェネティックアナライザー（パーキ
ンエルマー社、ABI PRISM 310 ）を用いて行った。
【００４２】ここで決定された塩基配列から、２種類の
異なる塩基配列を持つミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡ断片が単離されたことが明らかとなった。２種類
のｃＤＮＡ断片のそれぞれの塩基配列は、配列表の配列
番号１に記載の塩基配列のうち１５５〜６４５番目の塩
基配列と、配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち
１５２〜６４２番目の塩基配列に相当する。
異なる塩基配列を持つミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡ断片が単離されたことが明らかとなった。２種類
のｃＤＮＡ断片のそれぞれの塩基配列は、配列表の配列
番号１に記載の塩基配列のうち１５５〜６４５番目の塩
基配列と、配列表の配列番号２に記載の塩基配列のうち
１５２〜６４２番目の塩基配列に相当する。
【００４３】（５）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの単離 クローンテック社の「Marathon cDNA Amplification Ki
t 」を用いて、ミミズ由来セリンプロテアーゼの全長ｃ
ＤＮＡを単離した。
ＮＡの単離 クローンテック社の「Marathon cDNA Amplification Ki
t 」を用いて、ミミズ由来セリンプロテアーゼの全長ｃ
ＤＮＡを単離した。
【００４４】まず、上記（２）で得たミミズ細胞ｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成した後、T4 DNA Polymerase で両
端を平滑末端化した。平滑末端化したｃＤＮＡの両端
に、T4 DNA Ligase を用いてｃＤＮＡアダプターを連結
した。アダプターが連結したｃＤＮＡを鋳型として、上
記（３）で得られたミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマーと
アダプターに特異的なプライマーとを用いて、ＰＣＲ法
により増幅合成した。ここで用いたプライマーのうち、
ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片の塩基配列
をもとにして作製したプライマー対の塩基配列を、配列
表の配列番号７〜１０に示す。
ＡからｃＤＮＡを合成した後、T4 DNA Polymerase で両
端を平滑末端化した。平滑末端化したｃＤＮＡの両端
に、T4 DNA Ligase を用いてｃＤＮＡアダプターを連結
した。アダプターが連結したｃＤＮＡを鋳型として、上
記（３）で得られたミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマーと
アダプターに特異的なプライマーとを用いて、ＰＣＲ法
により増幅合成した。ここで用いたプライマーのうち、
ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ断片の塩基配列
をもとにして作製したプライマー対の塩基配列を、配列
表の配列番号７〜１０に示す。
【００４５】なお、ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマー対
のうちの、一方のプライマー対（配列表の配列番号７、
８記載の塩基配列参照）は、それぞれ後述の第一のｃＤ
ＮＡの塩基配列（配列表の配列番号１参照）のうちの３
６１〜３８３番目の部分配列および当該部分配列に相補
的な配列に相当する。また、他方のプライマー対（配列
表の配列番号９、１０記載の塩基配列参照）は、それぞ
れ後述の第二のｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号
２参照）の塩基配列のうちの３７２〜３９４番目の部分
配列および当該部分配列に相補的な配列に相当する。
ＮＡ断片の塩基配列をもとにして作製したプライマー対
のうちの、一方のプライマー対（配列表の配列番号７、
８記載の塩基配列参照）は、それぞれ後述の第一のｃＤ
ＮＡの塩基配列（配列表の配列番号１参照）のうちの３
６１〜３８３番目の部分配列および当該部分配列に相補
的な配列に相当する。また、他方のプライマー対（配列
表の配列番号９、１０記載の塩基配列参照）は、それぞ
れ後述の第二のｃＤＮＡの塩基配列（配列表の配列番号
２参照）の塩基配列のうちの３７２〜３９４番目の部分
配列および当該部分配列に相補的な配列に相当する。
【００４６】こうして、ＲＡＣＥ法により得られたＰＣ
Ｒ増幅断片を、pGEM-Tに連結して、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼの全長ｃＤＮＡを単離した。
Ｒ増幅断片を、pGEM-Tに連結して、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼの全長ｃＤＮＡを単離した。
【００４７】（６）ミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの全塩基配列および翻訳産物のアミノ酸配列の決定 上記（５）でＲＡＣＥ法により得られたＰＣＲ増幅断片
の塩基配列を解明することにより、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列
の決定は、パーキンエルマー社の「BigDye Terminator
Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」およびジェ
ネティックアナライザー（パーキンエルマー社、ABI PR
ISM 310 ）を用いて行った。
ＮＡの全塩基配列および翻訳産物のアミノ酸配列の決定 上記（５）でＲＡＣＥ法により得られたＰＣＲ増幅断片
の塩基配列を解明することにより、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼｃＤＮＡの全塩基配列を決定した。塩基配列
の決定は、パーキンエルマー社の「BigDye Terminator
Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit」およびジェ
ネティックアナライザー（パーキンエルマー社、ABI PR
ISM 310 ）を用いて行った。
【００４８】ここで決定された２種類のミミズ由来セリ
ンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表
の配列番号１と配列番号２に示す。また、２種類の塩基
配列より推定される翻訳産物のアミノ酸配列を、それぞ
れ配列表の配列番号３と配列番号４に示す。なお、第一
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物の
アミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）は、第一のミ
ミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配列番
号１記載参照）の塩基配列のうち、開始コドン（１０７
〜１０９番目のＡＴＧ）から終止コドン（８４５〜８４
７番目のＴＡＡ）までの塩基配列に相当するアミノ酸配
列である。また、第二のミミズ由来セリンプロテアーゼ
ｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号
４参照）は、第二のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ（配列表の配列番号２参照）の塩基配列のうち、開
始コドン（１０７〜１０９番目のＡＴＧ）から終止コド
ン（８４２〜８４４番目のＴＡＡ）までの塩基配列に相
当するアミノ酸配列である。
ンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ配列表
の配列番号１と配列番号２に示す。また、２種類の塩基
配列より推定される翻訳産物のアミノ酸配列を、それぞ
れ配列表の配列番号３と配列番号４に示す。なお、第一
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの翻訳産物の
アミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）は、第一のミ
ミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配列番
号１記載参照）の塩基配列のうち、開始コドン（１０７
〜１０９番目のＡＴＧ）から終止コドン（８４５〜８４
７番目のＴＡＡ）までの塩基配列に相当するアミノ酸配
列である。また、第二のミミズ由来セリンプロテアーゼ
ｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号
４参照）は、第二のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡ（配列表の配列番号２参照）の塩基配列のうち、開
始コドン（１０７〜１０９番目のＡＴＧ）から終止コド
ン（８４２〜８４４番目のＴＡＡ）までの塩基配列に相
当するアミノ酸配列である。
【００４９】第一のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤ
ＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参
照）のうち９〜３２番目のアミノ酸配列が、ミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −１のＮ末端アミノ酸配列
（Biosci．Biotech ．Biochem.，57，1726（1993））に
完全に一致する。このことから、第一のミミズ由来セリ
ンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配列番号１参照）を
有する遺伝子が、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−II
I −１の遺伝子であることが明らかとなった。すなわ
ち、配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子が、請求
項１記載の本発明のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III−１の遺伝子である。
ＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番号３参
照）のうち９〜３２番目のアミノ酸配列が、ミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −１のＮ末端アミノ酸配列
（Biosci．Biotech ．Biochem.，57，1726（1993））に
完全に一致する。このことから、第一のミミズ由来セリ
ンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配列番号１参照）を
有する遺伝子が、ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−II
I −１の遺伝子であることが明らかとなった。すなわ
ち、配列番号１記載の塩基配列を有する遺伝子が、請求
項１記載の本発明のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III−１の遺伝子である。
【００５０】また、第二のミミズ由来セリンプロテアー
ゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番
号４参照）のうち８〜７８番目のアミノ酸配列がミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のＮ末端アミノ酸
配列（Biosci．Biotech ．Biochem.，60，293 （199
6））に完全に一致し、１０４〜１３０番目のアミノ酸
配列がミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部
分アミノ酸配列に完全に一致する。このことから、第二
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配
列番号２参照）を持つｃＤＮＡが、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −２の遺伝子であることが明らかと
なった。すなわち、配列表の配列番号２記載の塩基配列
を有する遺伝子が、請求項４記載の本発明のミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺伝子である。
ゼｃＤＮＡの翻訳産物のアミノ酸配列（配列表の配列番
号４参照）のうち８〜７８番目のアミノ酸配列がミミズ
由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のＮ末端アミノ酸
配列（Biosci．Biotech ．Biochem.，60，293 （199
6））に完全に一致し、１０４〜１３０番目のアミノ酸
配列がミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の部
分アミノ酸配列に完全に一致する。このことから、第二
のミミズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡ（配列表の配
列番号２参照）を持つｃＤＮＡが、ミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −２の遺伝子であることが明らかと
なった。すなわち、配列表の配列番号２記載の塩基配列
を有する遺伝子が、請求項４記載の本発明のミミズ由来
セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺伝子である。
【００５１】トリプシンファミリー酵素の活性型は、Ｎ
末端アミノ酸配列Ile Val Gly Glyが良く保存されてお
り、前駆体型は、活性型のＮ末端アミノ酸に６〜８個の
アミノ酸配列（activation peptide）が付加されている
（Biochem. J., 307, 471 (1995)）。このことから、配
列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうちの１〜８番
目のアミノ酸配列と、配列番号４の記載のアミノ酸配列
のうちの１〜７番目のアミノ酸配列が、activation pep
tideであると考えられる。
末端アミノ酸配列Ile Val Gly Glyが良く保存されてお
り、前駆体型は、活性型のＮ末端アミノ酸に６〜８個の
アミノ酸配列（activation peptide）が付加されている
（Biochem. J., 307, 471 (1995)）。このことから、配
列表の配列番号３記載のアミノ酸配列のうちの１〜８番
目のアミノ酸配列と、配列番号４の記載のアミノ酸配列
のうちの１〜７番目のアミノ酸配列が、activation pep
tideであると考えられる。
【００５２】（７）ホモロジー検索 上記（６）で得られたミミズ由来セリンプロテアーゼＦ
−III −１とＦ−III−２の各ｃＤＮＡの塩基配列より
推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３
および４参照）同士を比較した。その結果、活性型酵素
のアミノ酸配列の全長は共に２３８アミノ酸残基数であ
り、このうちの２１５個のアミノ酸残基が保存されてい
ることがわかった。
−III −１とＦ−III−２の各ｃＤＮＡの塩基配列より
推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３
および４参照）同士を比較した。その結果、活性型酵素
のアミノ酸配列の全長は共に２３８アミノ酸残基数であ
り、このうちの２１５個のアミノ酸残基が保存されてい
ることがわかった。
【００５３】次に、既知のアミノ酸配列と得られたミミ
ズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３およ
び４参照）との相同性を比較した。その結果、このアミ
ノ酸配列は哺乳類においてトリプシンファミリーに属す
るセリンプロテアーゼのアミノ酸配列と高い相同性を有
していた。具体的には、ヒツジ由来プラスミン（Protei
n Seq ．Data Anal.，5 ，21（1992））、ウシ由来トリ
プシン（Biochem. Biophys．Res. Commun.，24，346 (1
966)）、ウシ由来キモトリプシン（Biochem. J., 101，
214 (1966)）と比較して３７〜４２％のホモロジーが認
められた。
ズ由来セリンプロテアーゼｃＤＮＡの塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号３およ
び４参照）との相同性を比較した。その結果、このアミ
ノ酸配列は哺乳類においてトリプシンファミリーに属す
るセリンプロテアーゼのアミノ酸配列と高い相同性を有
していた。具体的には、ヒツジ由来プラスミン（Protei
n Seq ．Data Anal.，5 ，21（1992））、ウシ由来トリ
プシン（Biochem. Biophys．Res. Commun.，24，346 (1
966)）、ウシ由来キモトリプシン（Biochem. J., 101，
214 (1966)）と比較して３７〜４２％のホモロジーが認
められた。
【００５４】（８）アライメント解析 上記（６）で得られたミミズ由来セリンプロテアーゼｃ
ＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（それぞ
れ配列表の配列番号３および４参照）を、相同性が高い
ウシ由来トリプシンのアミノ酸配列とアライメント解析
した。その結果を図１に示す。図１中、上段はミミズ由
来セリンプロテアーゼＦ−III −１の塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）、中段
はミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の塩基配
列より推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号４参
照）、下段はウシ由来トリプシンのアミノ酸配列を示
す。また、＊は３種類のアミノ酸配列の間に保存されて
いるアミノ酸残基を示す。
ＤＮＡの塩基配列より推定されるアミノ酸配列（それぞ
れ配列表の配列番号３および４参照）を、相同性が高い
ウシ由来トリプシンのアミノ酸配列とアライメント解析
した。その結果を図１に示す。図１中、上段はミミズ由
来セリンプロテアーゼＦ−III −１の塩基配列より推定
されるアミノ酸配列（配列表の配列番号３参照）、中段
はミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の塩基配
列より推定されるアミノ酸配列（配列表の配列番号４参
照）、下段はウシ由来トリプシンのアミノ酸配列を示
す。また、＊は３種類のアミノ酸配列の間に保存されて
いるアミノ酸残基を示す。
【００５５】その結果、ウシ由来トリプシンの活性中心
アミノ酸残基である４０番目のHis、８４番目のAsp 、
１７７番目のSer が、配列表の配列番号３および４の４
３番目のHis 、９１番目のAsp 、１８８番目のSer とそ
れぞれ一致し、保存されているものと考えられる。ま
た、ウシ由来トリプシンの基質の特異的認識に関与する
アミノ酸残基である１７１番目のAsp が、配列表の配列
番号３および４の１８２番目のAsp と一致しており、保
存されているものと考えられる。さらに、ウシ由来トリ
プシンのサブサイトＳ１である１９２番目のSer 、サブ
サイトＳ２である１９３番目のTrp 、サブサイトＳ３で
ある１９４番目のGly が、配列表の配列番号３と配列番
号４記載の両アミノ酸配列の２０８番目のSer 、２０９
番目のTrp 、２１０番目のGlyとそれぞれ一致し、保存
されていることがわかった。
アミノ酸残基である４０番目のHis、８４番目のAsp 、
１７７番目のSer が、配列表の配列番号３および４の４
３番目のHis 、９１番目のAsp 、１８８番目のSer とそ
れぞれ一致し、保存されているものと考えられる。ま
た、ウシ由来トリプシンの基質の特異的認識に関与する
アミノ酸残基である１７１番目のAsp が、配列表の配列
番号３および４の１８２番目のAsp と一致しており、保
存されているものと考えられる。さらに、ウシ由来トリ
プシンのサブサイトＳ１である１９２番目のSer 、サブ
サイトＳ２である１９３番目のTrp 、サブサイトＳ３で
ある１９４番目のGly が、配列表の配列番号３と配列番
号４記載の両アミノ酸配列の２０８番目のSer 、２０９
番目のTrp 、２１０番目のGlyとそれぞれ一致し、保存
されていることがわかった。
【００５６】ウシ由来トリプシンのアミノ酸配列のうち
１２３番目のAsn から１３３番目のAsp は自己消化領域
であり、自己消化されるアミノ酸残基が１２５番目のLy
s である。一方、配列表の配列番号３と配列番号４のア
ミノ酸配列のうちの自己消化領域と推定される１３１番
目のThr から１４１番目のAla の間には、自己消化され
るLys やArg が存在しない。このことは、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件
下で安定であることをタンパク質構造的に示唆するもの
である。
１２３番目のAsn から１３３番目のAsp は自己消化領域
であり、自己消化されるアミノ酸残基が１２５番目のLy
s である。一方、配列表の配列番号３と配列番号４のア
ミノ酸配列のうちの自己消化領域と推定される１３１番
目のThr から１４１番目のAla の間には、自己消化され
るLys やArg が存在しない。このことは、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件
下で安定であることをタンパク質構造的に示唆するもの
である。
【００５７】（９）ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディングフレ
ームの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡ
の活性型オープンリーディングフレームの単離は、以下
のようにして行った。上記（５）で作製したミミズ細胞
ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号２に記載の１２６〜９１
８番目の遺伝子断片を、制限酵素Pst I 切断配列を含む
プライマーと制限酵素Xba I 切断配列を含むプライマー
とを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成した。ここで用い
たプライマー対の塩基配列を配列番号１１および配列番
号１２に示す。なお、プライマー（配列表の配列番号１
１記載の塩基配列参照）の配列は、配列表の配列番号２
に記載の塩基配列のうち１２６〜１４４番目の配列に相
当する配列を持ち、１２６番目の５’側にＣＣＣＴＧＣ
ＡＧの塩基配列が付加されたものである。他方のプライ
マー（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）は、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの８９１番目から９
１８番目の配列に相補的であり、９０４番目のＧがＣ
に、９０５番目のＣがＴにそれぞれ置換されたものであ
る。
III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディングフレ
ームの単離 ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡ
の活性型オープンリーディングフレームの単離は、以下
のようにして行った。上記（５）で作製したミミズ細胞
ｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号２に記載の１２６〜９１
８番目の遺伝子断片を、制限酵素Pst I 切断配列を含む
プライマーと制限酵素Xba I 切断配列を含むプライマー
とを用いて、ＰＣＲ法により増幅合成した。ここで用い
たプライマー対の塩基配列を配列番号１１および配列番
号１２に示す。なお、プライマー（配列表の配列番号１
１記載の塩基配列参照）の配列は、配列表の配列番号２
に記載の塩基配列のうち１２６〜１４４番目の配列に相
当する配列を持ち、１２６番目の５’側にＣＣＣＴＧＣ
ＡＧの塩基配列が付加されたものである。他方のプライ
マー（配列表の配列番号１２記載の塩基配列参照）は、
配列番号２に記載の塩基配列のうちの８９１番目から９
１８番目の配列に相補的であり、９０４番目のＧがＣ
に、９０５番目のＣがＴにそれぞれ置換されたものであ
る。
【００５８】上記ＰＣＲ反応は、クローンテック社の
「Advantage 2 PCR Kit 」を用いて、添付されたプロト
コールに従って行った。また、反応条件は［９４℃１５
秒、６５℃１５秒、７２℃６０秒］を３０サイクル行っ
た後、７２℃で５分間反応させた。上記ＰＣＲ反応液か
ら、８０１塩基対のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング領域
を、アガロース電気泳動で単離した。ミミズ由来セリン
プロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープン
リーディング領域から、プロメガ社の「pGEM-T and pGE
M-T Easy Vector Systems 」を用いて、pGEM-Tをベクタ
ーとしてプラスミドを作製した。
「Advantage 2 PCR Kit 」を用いて、添付されたプロト
コールに従って行った。また、反応条件は［９４℃１５
秒、６５℃１５秒、７２℃６０秒］を３０サイクル行っ
た後、７２℃で５分間反応させた。上記ＰＣＲ反応液か
ら、８０１塩基対のミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−
III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング領域
を、アガロース電気泳動で単離した。ミミズ由来セリン
プロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープン
リーディング領域から、プロメガ社の「pGEM-T and pGE
M-T Easy Vector Systems 」を用いて、pGEM-Tをベクタ
ーとしてプラスミドを作製した。
【００５９】（１０）ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ
−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング領
域の発現 上記（９）において単離されたミミズ由来セリンプロテ
アーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーデ
ィング領域を酵母発現ベクターに導入したプラスミドを
作製し、タンパク質の発現誘導を行った。具体的には、
この発現プラスミドの作製とタンパク質の発現誘導に
は、インビトロジェン社の「EasySelect Pichia Expres
sion Kit」を用い、添付されたプロトコールに従って行
った。
−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーディング領
域の発現 上記（９）において単離されたミミズ由来セリンプロテ
アーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリーデ
ィング領域を酵母発現ベクターに導入したプラスミドを
作製し、タンパク質の発現誘導を行った。具体的には、
この発現プラスミドの作製とタンパク質の発現誘導に
は、インビトロジェン社の「EasySelect Pichia Expres
sion Kit」を用い、添付されたプロトコールに従って行
った。
【００６０】まず、上記で作製したミミズ由来セリンプ
ロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリ
ーディング領域をpGEM-Tに導入したプラスミドを、制限
酵素Pst I とXba I とで消化した。Pst I とXba I 消化
後の断片を、インビトロジェン社の「A Manual of Meth
ods of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICA
α in Pichia Pastoris 」に従い、pPICZ αB のPst I
とXba I に挿入した。
ロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリ
ーディング領域をpGEM-Tに導入したプラスミドを、制限
酵素Pst I とXba I とで消化した。Pst I とXba I 消化
後の断片を、インビトロジェン社の「A Manual of Meth
ods of Recombinant Proteins Using pPICZ and pPICA
α in Pichia Pastoris 」に従い、pPICZ αB のPst I
とXba I に挿入した。
【００６１】次に、インビトロジェン社の「Pichia Eas
yComp Kit (For the preparation and transformation
of competent Pichia cells)」を用い、添付されたプロ
トコールに従い、得られたプラスミドpPICMMZ-1 を用い
てPichia pastoris GS115 を形質転換し、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オー
プンリーディングフレームを発現させた。具体的には、
形質転換 P．pastoris GS115を、ＢＭＧＹ培地で６００
ｎｍの吸光度が３になるまで３０℃で生育させた。その
後、菌体を遠心分離により集め、６００ｎｍの吸光度が
１になるようにＢＭＭＹ培地に懸濁した。メタノールを
０．５％（ｗ／ｗ) になるように菌体懸濁液に加え、３
０℃で２４時間振盪培養した。その後、遠心分離により
菌体を取り除いた培養上清を限外濾過膜で濃縮し、発現
誘導されたタンパク質のフィブリン溶解活性の測定をフ
ィブリン平板法（３７℃、１０時間）で行った。その結
果を図２に示す。
yComp Kit (For the preparation and transformation
of competent Pichia cells)」を用い、添付されたプロ
トコールに従い、得られたプラスミドpPICMMZ-1 を用い
てPichia pastoris GS115 を形質転換し、ミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オー
プンリーディングフレームを発現させた。具体的には、
形質転換 P．pastoris GS115を、ＢＭＧＹ培地で６００
ｎｍの吸光度が３になるまで３０℃で生育させた。その
後、菌体を遠心分離により集め、６００ｎｍの吸光度が
１になるようにＢＭＭＹ培地に懸濁した。メタノールを
０．５％（ｗ／ｗ) になるように菌体懸濁液に加え、３
０℃で２４時間振盪培養した。その後、遠心分離により
菌体を取り除いた培養上清を限外濾過膜で濃縮し、発現
誘導されたタンパク質のフィブリン溶解活性の測定をフ
ィブリン平板法（３７℃、１０時間）で行った。その結
果を図２に示す。
【００６２】図２において、Ａは精製したミミズ由来セ
リンプロテアーゼＦ−III −２（タンパク質量２０μ
ｇ）の結果を、Ｂはミミズ細胞のホモジネート（タンパ
ク質量２０μｇ）の結果を、Ｃはミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の活性型オープンリーディングフ
レームを発現させた１０倍濃度の酵母培養液（タンパク
質量２０μｇ）の結果を示すものである。
リンプロテアーゼＦ−III −２（タンパク質量２０μ
ｇ）の結果を、Ｂはミミズ細胞のホモジネート（タンパ
ク質量２０μｇ）の結果を、Ｃはミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の活性型オープンリーディングフ
レームを発現させた１０倍濃度の酵母培養液（タンパク
質量２０μｇ）の結果を示すものである。
【００６３】図２に示すとおり、ミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリー
ディングフレームを発現させた酵母培養液には、フィブ
リン溶解活性が認められる。このことは、上記において
単離されたミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２
のｃＤＮＡの活性型オープンリーディングフレームがミ
ミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡに
確実に存在することを示すものである。
テアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡの活性型オープンリー
ディングフレームを発現させた酵母培養液には、フィブ
リン溶解活性が認められる。このことは、上記において
単離されたミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２
のｃＤＮＡの活性型オープンリーディングフレームがミ
ミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２のｃＤＮＡに
確実に存在することを示すものである。
【００６４】
【発明の効果】近年、血栓症等の治療を目的としたミミ
ズ由来セリンプロテアーゼの薬理、臨床応用について、
その可能性を強く実証する研究結果が報告されており
（ThrombHaemostas., 62, 545 (1989））、本酵素の経
口投与による血中血栓溶解活性亢進等の作用機作の解明
をはじめとして、本酵素の詳細な研究に期待が寄せられ
ている。本発明により、ミミズ由来セリンプロテアーゼ
の遺伝的情報が提供され、かつ本酵素の大量生産の実現
が可能であることから、上記の研究に供することができ
る。
ズ由来セリンプロテアーゼの薬理、臨床応用について、
その可能性を強く実証する研究結果が報告されており
（ThrombHaemostas., 62, 545 (1989））、本酵素の経
口投与による血中血栓溶解活性亢進等の作用機作の解明
をはじめとして、本酵素の詳細な研究に期待が寄せられ
ている。本発明により、ミミズ由来セリンプロテアーゼ
の遺伝的情報が提供され、かつ本酵素の大量生産の実現
が可能であることから、上記の研究に供することができ
る。
【００６５】さらに、本発明のミミズ由来セリンプロテ
アーゼ遺伝子の有する塩基配列（配列表の配列番号１、
２参照）から推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表
の配列番号３および４参照）には、ウシ由来トリプシン
の自己消化領域に存在する自己消化部位であるLys やAr
g も存在しない。このことは、ミミズ由来セリンプロテ
アーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件下で安定で
あることをタンパク質構造的に示唆している。それ故、
ミミズ由来セリンプロテアーゼは、血栓症等の治療に対
する安定した効果が十分に期待できる。
アーゼ遺伝子の有する塩基配列（配列表の配列番号１、
２参照）から推定されるアミノ酸配列（それぞれ配列表
の配列番号３および４参照）には、ウシ由来トリプシン
の自己消化領域に存在する自己消化部位であるLys やAr
g も存在しない。このことは、ミミズ由来セリンプロテ
アーゼが、少なくとも１年間以上、室温条件下で安定で
あることをタンパク質構造的に示唆している。それ故、
ミミズ由来セリンプロテアーゼは、血栓症等の治療に対
する安定した効果が十分に期待できる。
【００６６】本発明に係るミミズ細胞で発現しているミ
ミズ由来セリンプロテアーゼ遺伝子の利用により、活性
型ミミズ由来セリンプロテアーゼを遺伝子工学技術によ
って生産することが可能である。そのため、パルプ工
場、食品工業、畜産業等から排出される有機性廃棄物の
処理に貢献することが期待される。また、本酵素の安定
性に関するタンパク質構造を、他のトリプシンファミリ
ー酵素の構造に導入することにより、安定な酵素の開
発、改良に大きく寄与することが期待される。
ミズ由来セリンプロテアーゼ遺伝子の利用により、活性
型ミミズ由来セリンプロテアーゼを遺伝子工学技術によ
って生産することが可能である。そのため、パルプ工
場、食品工業、畜産業等から排出される有機性廃棄物の
処理に貢献することが期待される。また、本酵素の安定
性に関するタンパク質構造を、他のトリプシンファミリ
ー酵素の構造に導入することにより、安定な酵素の開
発、改良に大きく寄与することが期待される。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 株式会社横浜国際バイオ研究所 <120> ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミド ベクター及び形質転換体 <130> P121117K <160> 12 <210> 1 <211> 973 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 1 gttacttctc gctcttgcat cgctcgtagc ggtgggcttt gcccaaccac cagtctggta 60 ccccggtggt caatgcggtg tcagccagta ctcagatgct ggtgacatgg aacttcctcc 120 cggaacaaaa attgtcggag gaattgaagc cagaccatac gagttcccat ggcaggtgtc 180 cgtccgaagg aagtcttccg attcccattt ctgcggaggt agcatcatca acgatcgttg 240 ggttgtctgc gctgctcact gcatgcaggg agaggccccc gctctggttt cattggtcgt 300 gggtgagcac gacaggagtg cagcgagtac agtacgtcag actcatgacg ttgatagcat 360 cttcgtccac gaggactaca acgcaaatac cctagagaac gacgtttctg tcatcaagac 420 atctgttgcc atcactttcg acatcaacgt tggtccaatc tgcgccccag atccggctaa 480 cgactacgtc taccgtaaga gccagtgttc cggatgggga actatcaatt caggtggaat 540 ctgctgtccc aacgttctgc gatacgtgac gctgaatgtc acaaccaacc aattctgcga 600 agatgtatac ccactaaatt caatctacga cgatatgatt tgcgcgtcgg acaacactgg 660 gggtaacgac agagactcct gccagggtga ctccggcggc cctctgagcg tcaaggatgg 720 cagtggaatc ttcagcctga ttggtattgt gtcttgggga attggttgcg cttctggcta 780 tccaggagtc tactcccgcg tcggattcca tgctgcatgg atcaccgaca tcatcaccaa 840 caactaaacc ggagttatcc agtcgactat aactggaacg actttaccat cacgaacgac 900 acattaatta aaattattgt attaaacata aaataaaatc tctctactca cagatcgttt 960 gtagaacaattgt 973 <210> 2 <211> 1011 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 2 gttacttctc gctcttgcat cgctggtagc ggtgggcttt gcccaaccac ctgtctggta 60 ccccggtggt caatgcggtg tcagccagta ttcagatgct ggcgacatgg aacttcctcc 120 cggaaagatt gtcggaggaa ttgaagccag accatacgag ttcccatggc aggtgtccgt 180 ccgaaggaag tcttctgatt cccatttctg cggaggtagc atcatcaacg atcgttgggt 240 tgtctgcgct gctcactgca tgcagggaga gagccctgcc ctggtctcat tggtcgtcgg 300 cgagcacgat agcagcgctg cgagtacagt acgtcagact catgatgttg atagcatctt 360 cgtcaacgaa aactacgatc cccgtacact agaaaacgac gtttctgtca tcaagacagc 420 tatcgctatc accttcgaca tcaacgttgg accaatctgt gctccagatc cggctaacga 480 ctacgtctac cgtaagagcc agtgttccgg atggggaact atcaattcag gtggaatctg 540 ctgtcccgca gttttgcgat atgttacact gaacatcacg accaacgcct tctgcgacgc 600 cgtctacaca tcggacacta tctacgacga tatgatctgc gccacagaca acactgggat 660 gaccgacaga gactcctgcc agggtgactc cggcggccct ctgagcgtca aggatggcag 720 cggaatcttc agtctgggtg gcattgtgtc ttggggaatt ggttgcgcct ctggctatcc 780 aggagtttac tcccgcgtcg gatttcatgc tggatggatc accgacacga tcaccaacaa 840 ctaaaccgac gatggccagt caactataac ggactcttat tacctgcagt taacgttgct 900 catgcagaac gaacatgcac tttcatcgcc tataggtcca ctaaacacag catggatgac 960 atatgagtta aaagtatcgt ggtgacacga aataaaaatc tatctactgg g 1011 <210> 3 <211> 246 <212> peptide <213> Lumbricus rubellus <400> 3 Met Glu Leu Pro Pro Gly Thr Lys Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg 1 5 10 15 Pro Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp 20 25 30 Ser His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys 35 40 45 Ala Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ala Pro Ala Leu Val Ser Leu Val 50 55 60 Val Gly Glu His Asp Arg Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His 65 70 75 80 Asp Val Asp Ser Ile Phe Val His Glu Asp Tyr Asn Ala Asn Thr Leu 85 90 95 Glu Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ser Val Ala Ile Thr Phe Asp 100 105 110 Ile Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val 115 120 125 Tyr Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly 130 135 140 Ile Cys Cys Pro Asn Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Val Thr Thr 145 150 155 160 Asn Gln Phe Cys Glu Asp Val Tyr Pro Leu Asn Ser Ile Tyr Asp Asp 165 170 175 Met Ile Cys Ala Ser Asp Asn Thr Gly Gly Asn Asp Arg Asp Ser Cys 180 185 190 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile 195 200 205 Phe Ser Leu Ile Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly 210 215 220 Tyr Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Ala Trp Ile Thr 225 230 235 240 Asp Ile Ile Thr Asn Asn 245 246 <210> 4 <211> 245 <212> peptide <213> Lumbricus rubellus <400> 4 Met Glu Leu Pro Pro Gly Lys Ile Val Gly Gly Ile Glu Ala Arg Pro 1 5 10 15 Tyr Glu Phe Pro Trp Gln Val Ser Val Arg Arg Lys Ser Ser Asp Ser 20 25 30 His Phe Cys Gly Gly Ser Ile Ile Asn Asp Arg Trp Val Val Cys Ala 35 40 45 Ala His Cys Met Gln Gly Glu Ser Pro Ala Leu Val Ser Leu Val Val 50 55 60 Gly Glu His Asp Ser Ser Ala Ala Ser Thr Val Arg Gln Thr His Asp 65 70 75 80 Val Asp Ser Ile Phe Val Asn Glu Asn Tyr Asp Pro Arg Thr Leu Glu 85 90 95 Asn Asp Val Ser Val Ile Lys Thr Ala Ile Ala Ile Thr Phe Asp Ile 100 115 110 Asn Val Gly Pro Ile Cys Ala Pro Asp Pro Ala Asn Asp Tyr Val Tyr 115 120 125 Arg Lys Ser Gln Cys Ser Gly Trp Gly Thr Ile Asn Ser Gly Gly Ile 130 135 140 Cys Cys Pro Ala Val Leu Arg Tyr Val Thr Leu Asn Ile Thr Thr Asn 145 150 155 160 Ala Phe Cys Asp Ala Val Tyr Thr Ser Asp Thr Ile Tyr Asp Asp Met 165 170 175 Ile Cys Ala Thr Asp Asn Thr Gly Met Thr Asp Arg Asp Ser Cys Gln 180 185 190 Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Val Lys Asp Gly Ser Gly Ile Phe 195 200 205 Ser Leu Gly Gly Ile Val Ser Trp Gly Ile Gly Cys Ala Ser Gly Tyr 210 215 220 Pro Gly Val Tyr Ser Arg Val Gly Phe His Ala Gly Trp Ile Thr Asp 225 230 235 240 Thr Ile Thr Asn Asn 245 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <220> <222> 3 <223> A,C,G又はT <220> <222> 15 <223> A,C,G又はT <400> 5 ccntaygart tyccntggca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 6 gcrcadatca trtcrtcrta 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 7 cttcgtccac gaggactaca acg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 8 cgttgtagtc ctcgtggacg aag 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 9 actacgatcc ccgtacacta gaa 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 10 ttctagtgta cggggatcgt agt 23 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 11 ccctgcagag attgtcggag gaattga 27 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Lumbricus rubellus <400> 12 gcatgttcgt tctagatgag caacgtta 28
【図１】 ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１
とＦ−III −２の塩基配列より推定されるアミノ酸配列
を、ウシ由来トリプシンのアミノ酸配列とアライメント
解析したものである。
とＦ−III −２の塩基配列より推定されるアミノ酸配列
を、ウシ由来トリプシンのアミノ酸配列とアライメント
解析したものである。
＊は３種類のアミノ酸配列の間に保存されているアミ
ノ酸残基を示す。
ノ酸残基を示す。
【図２】 ミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２
のｃＤＮＡオープンリーディングフレームを発現させた
酵母培養液をフィブリン平板で測定したものである。
のｃＤＮＡオープンリーディングフレームを発現させた
酵母培養液をフィブリン平板で測定したものである。
Ａはミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２（タ
ンパク質量２０μｇ）、Ｂはミミズ細胞のホモジネート
（タンパク質量２０μｇ）、Ｃはミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の活性型オープンリーディングフ
レームを発現させた１０倍濃度の酵母培養液（タンパク
質量２０μｇ）を示す。
ンパク質量２０μｇ）、Ｂはミミズ細胞のホモジネート
（タンパク質量２０μｇ）、Ｃはミミズ由来セリンプロ
テアーゼＦ−III −２の活性型オープンリーディングフ
レームを発現させた１０倍濃度の酵母培養液（タンパク
質量２０μｇ）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/19 (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｚ Ｃ１２Ｒ 1:84） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 杉本 学 岡山県倉敷市中央町２−20−１ 岡山大学 資源生物科学研究所内 (72)発明者 浜田 博喜 岡山県岡山市理大町１−１ 岡山理科大学 内 (72)発明者 三国 克彦 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 株式 会社横浜国際バイオ研究所内 (72)発明者 原 耕三 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13−46 株式 会社横浜国際バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA12 EA04 GA11 GA19 HA01 HA14 4B050 CC03 DD11 LL01 4B065 AA77X AA99Y AB01 AC14 BA02 BA24 CA33 CA44
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載の塩基配列を
有するミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −１の遺
伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載のミミズ由来セリンプロテ
アーゼＦ−III −１の遺伝子を含むプラスミドベクタ
ー。 - 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドを保有する形
質転換酵母。 - 【請求項４】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列を
有するミミズ由来セリンプロテアーゼＦ−III −２の遺
伝子。 - 【請求項５】 請求項４記載のミミズ由来セリンプロテ
アーゼＦ−III −２の遺伝子を有するプラスミドベクタ
ー。 - 【請求項６】 請求項５記載のプラスミドを保有する形
質転換酵母。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP2000220337A JP2002034566A (ja) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 |
Applications Claiming Priority (1)
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| JP2000220337A JP2002034566A (ja) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002034566A true JP2002034566A (ja) | 2002-02-05 |
Family
ID=18714959
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000220337A Pending JP2002034566A (ja) | 2000-07-21 | 2000-07-21 | ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002034566A (ja) |
Cited By (5)
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| CN103146788A (zh) * | 2013-02-28 | 2013-06-12 | 珠海博康药业有限公司 | 一种大豆肽的酶法制备方法 |
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-
2000
- 2000-07-21 JP JP2000220337A patent/JP2002034566A/ja active Pending
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| JPN6010024143, 岡山県立短期大学研究紀要（１９９１），Ｖｏｌ．３６，ｐ．７７−８１ * |
| JPN6010024145, 岡山県立短期大学研究紀要（１９９１），Ｖｏｌ．３６，ｐ．７１−７６ * |
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