KR101822090B1 - 신규한 세린계 단백질 분해효소 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 세린계 단백질 분해효소 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 신규한 세린계 단백질 분해효소는 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 유래된 세린계 단백질 분해효소로서 피브린 용해 활성 및 항응고 효과가 탁월하므로, 혈전을 강력히 저해하고 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없으므로 안전하고 효과적인 혈전 용해제로 혈관성 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다.

Description

신규한 세린계 단백질 분해효소 및 이의 용도{Novel Serine Protease and Uses Thereof}

본 발명은 신규한 세린계 단백질 분해효소 및 이의 용도에 관한 것이다.

뇌졸중은 혈관 장애의 주된 질병으로 뇌혈류의 이상으로 신경학적 결손이 일어나 뇌에 이상이 생기는 것을 말하며, 그 경우에 따라 크게 2 가지로 나뉘어질 수 있다. 뇌출혈(Cerebral hemorrhage)은 뇌 내 출혈로 인해 생기는 질병으로, 보통 고혈압과 나이, 외상에 의해 생기게 된다. 그러나, 이러한 뇌출혈은 전체 뇌졸중에 10% 밖에 차지하지 않으며, 대부분은 나머지 한 종류인 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)으로 나뉘게 된다. 허혈성 뇌졸중은 뇌출혈과 달리 뇌혈관의 폐색으로 인해 뇌혈류가 감소되어 뇌에 산소, 에너지 결핍이 일어나 뇌사상태가 유발되는 질병을 말한다. 뇌졸중은 우리나라 사망 원인에서 암에 이어 두 번째로 많은 사망률을 나타내고 있으며, 현재 Urokinase, Streptokinase, t-PA 등 많은 뇌졸중 치료제가 개발되고 있다.

현재 뇌졸중 치료제는 항응고제와 혈전분해제로 나뉘어질 수 있다. 항응고제는 혈전의 생성을 억제함으로써 뇌졸중의 질병 발생을 예방할 수 있으며, 또 다른 치료제인 혈전분해제는 이미 뇌경색이 이루어진 상태에서 그 막힌 혈관의 혈전을 용해시켜 줄 수 있다. 따라서 항응고제보다는 혈전분해제의 개발 필요성이 더욱 부각되고 있는 실정이다.

뇌졸중 치료제(혈전분해제)는 혈전을 분해하는 기작에 따라 크게 2 가지로 나뉘어 질 수 있다. 직접적 혈전용해제는 혈전에 직접적으로 작용하여 피브린 혈전(Fibrin clot)을 FDP(Fibrin Degradable Products)로 바꾸는 메카니즘을 가지고 있으며, 과거에는 Brinase, Plasmin, Trpysin 종류의 세린계 단백질 분해효소(Serine protease)가 연구되었으며, 시스테인 단백질 분해효소(Cystein protease)로는 대표적으로 파파인(papain)이 연구되었다. 그러나, 이 약물들은 독성이 매우 강하다는 단점과 체내에 필요한 응고 작용을 무분별하게 용해시키는 단점을 가지고 있다.

이를 보완한 간접적 혈전용해제는 피브린 혈전을 용해시킬 수 있는 효소를 활성화시키는 기작을 갖고 있다(Plasminogen → Plasmin). 현재 Urokinase, T-PA(Tissue plasminogen activator), streptokinase, hirudin 등의 물질들이 상용화 되었으며, 많은 연구가 이루어지고 있다. 이 방법은 효소 특이적으로 반응하기 때문에 무분별하게 단백질을 분해하는 단점을 보완할 수 있지만 그 가격이 매우 비싸고, 그 효과가 약하고 장시간 복용함에 따라 많은 부작용 (용혈현상, 발열, 알러지, 국소출혈 등)이 생긴다.

따라서, 현재 이런 단점들을 보완할 수 있는 피브린 용해성(fibrinolytic) 세린계 단백질 분해효소들이 연구 및 개발되고 있다. 최근엔 Urechis unicinctus, Cirriformia tentaculata, Antheraea pernyi, Petasites japonicas 등 많은 생물에서 추출되어 연구되고 있고 그 효능이 입증되었지만 아직도 개발단계에 머물러 있어 새로운 혈전용해제의 탐색이 필요할 것으로 생각된다.

현재까지 미국 FDA를 통과한 혈전용해제는 t-PA(tissue Plasminogen Activator)가 유일하나 이런 t-PA도 많은 부작용을 가지고 있다. 부기, 발진, 두드러기, 짧은 반감기 등을 가지고 있을 뿐만 아니라 때때로 메탈로(metallo) 단백질 분해효소를 활성화시켜서 원치 않은 단백질을 분해하기도 한다. 또한, 재폐색(Reocclusion)에 의해 ROS의 추가적인 피해가 생겨 신경에도 큰 타격을 입힌다.

최근에는 t-PA가 혈액뇌장벽 손상을 유도하는 기전에 대해서 발표가 되었다. t-PA는 혈액 내에 비활성 상태로 존재하는 PDGF(platelet-derived growth factor) -CC를 활성화 형태로 전환시키는데, 이러한 인자는 성상세포(astrocyte) 종말단추(endfeet)의 PDGF 알파 수용체에 작용하여 astrocyte의 극성을 저해하고 이온통로 및 물 수송 펌프의 재배치를 통해서 혈액뇌장벽 손상을 유도한다. 이렇게 혈액 뇌장벽을 약화시키고 이에 따라 출혈 부작용을 유도하게 된다. 이렇듯 혈전용해제로써 t-PA는 많은 문제점을 가지고 있고, 뇌졸중 치료가 분명히 시장성이 큰 분야임에도 불구하고 아직까지 마땅한 치료제가 없는 것을 살펴보면 개발 및 연구가 필요한 것으로 생각된다.

현재 임상실험에 있는 약물들은 NMDA 수용체 길항제, 이온 채널 조절제, 항산화제 등 다양한 약물들이 뇌졸중 치료제로 허가 받기 위해 시험 단계에 있지만, 임상적으로 치료 효과가 우수한 약물이 없을 뿐만 아니라 위의 약물들은 직접적으로 혈전을 녹이는 작용이 아닌 혈전이 생기고 난 다음 다른 외부 요인을 조절하여 뇌의 손상을 막는 치료제이기 때문에 혈전을 직접 녹일 수 있으며, t-PA가 갖고 있는 부작용을 개선한 신규 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 단백질 분해효소(protease)는 생체내에서 소화, 흡수, 방어 등의 다양한 기능을 하고 있으며 활성 자리의 구조에 따라 세린 단백질 분해효소(serine protease), 시스테인 단백질 분해효소(cystein protease), 아스파르트산 단백질 분해효소(sapartic protease) 그리고 메탈로단백질 분해효소(metalloprotease)로 구분된다. 단백질 분해효소는 그 용도가 다양하여 혈전의 용해 등과 같은 인류의 질병 치료용 이외에도 의류용 세제의 성분, 콘택트렌즈 세정제의 성분으로 이용될 뿐만 아니라 우유 단백질의 변형, 견 섬유의 고무질 제거(silk degumming), 사료의 개선, 가죽의 침지(soaking), 제모(unhairing), 올리고 펩타이드 합성 및 폐 Xray 필름으로부터 은의 회수 등에 실로 다양하게 이용되고 있다.

의료용 단백질 분해효소는 혈액 응고 및 혈전의 용해에 가장 많이 사용되고 있는데 생체 내 혈액은 응고(coagulation)와 용해(anticoagulation) 작용이 평형을 이루고 있으며 여러 가지 병적인 이유로 인하여 이러한 균형이 깨지게 되면 혈전이 형성되어 혈관을 막게 됨으로써, 그 결과로 뇌혈관이 막히게 되면 뇌 혈전증으로 반신불수나 전신 마비 증상을 일으키고, 심장혈관이 막히게 되면 심장마비가 일어나 사망하게 된다. 따라서 혈전형성을 방지하거나 생성된 혈전을 녹이는 치료제를 개발하려는 노력은 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

그러한 노력 중 하나로 갯벌에서 가장 흔히 볼 수 있는 갯지렁이를 이용하여 새로운 종의 갯지렁이로부터 혈전을 용해하는 단백질 분해효소를 추출함으로써 혈전용해제의 후보군을 넓힘과 동시에 새로운 혈전 용해제를 제시할 수 있다.

이에 본 발명자들은 신규한 혈전용해제를 개발하고자 노력하였고, 그 결과, 한국의 갯벌에 서식하고 있는 갯지렁이로부터 정제된 단백질 분해효소가 혈전 및 피브린을 용해하는 활성이 뛰어날 뿐 아니라, 세포독성에 대한 세포생존율을 향상시킨다는 것을 확인하였고, 이의 아미노산 서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 단백질 분해효소를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 분해효소를 포함하는 항응고제 또는 혈전 용해제를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 단백질 분해효소를 유효 성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 분해효소를 유효 성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 보조 식품 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 분해효소를 포함하는 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제를 제공하는 데 있다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 유래된 신규한 단백질 분해효소를 제공한다.

본 발명의 단백질 분해효소는 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 분리 및 정제된 단백질 분해효소로서 피브린 용해 활성을 갖는다.

또한, 본 발명의 단백질 분해효소는 오셔노바실러스 피크튜래(Oceanobacillus picturae) 유래 세린계 단백질 분해효소와 53.3%, 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) 및 알너스 글루티노사(Alnus glutinosa) 유래 세린계 단백질 분해효소와 46.6%의 상동성을 나타냈다. 따라서, 기존의 단백질 분해효소와 45 내지 55%의 아미노산 서열 상동성을 가지는 본 발명의 단백질 분해효소는 신규한 단백질임을 알 수 있다. 이러한, 신규한 단백질의 서열을 분석한 결과, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(EAMMDKADQLEQSLN, Glu-Ala-Met-Met-Asp-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Leu-Asn)을 갖는 단백질임을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질 분해효소를 제공하며, 이의 변이체가 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 또한, 상기 단백질 분해효소를 코딩하는 뉴클레오티드를 갖는 단백질 분해효소 유전자 또는 이의 변이체가 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.

상기 변이체란 서열번호 1의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질 분해 효소를 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다.

상기 단백질 분해효소는 pH 3 내지 pH 7의 산도 범위 및 30℃ 이상 50℃ 이하의 온도 범위에서 최적 효소 활성을 유지할 수 있다.

본 발명에서는 SDS-PAGE(SDSpolyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 순수 분리된 본 발명의 단백질 분해효소가 28 kDa 분자량을 가지는 것을 확인하였다.

본 발명의 단백질 분해효소는 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), PMSF(phenylmethane sulfonyl fluoride), 4-아미도페닐메틸술포닐 플루오라이드(4-amidophenylmethylsulfonylfluoride, APMSF), 벤자미딘(benzamidine), 류펩틴(leupeptin), 페닐 메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 토실라이신 클로로메틸 케톤(tosyllysine chloromethyl ketone, TLCK), 아프로티닌(aprotinin), 리마콩 트립신 억제제(limabean trypsin inhibitor, LBTI) 및 대두콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor, SBTI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 세린 단백질 분해효소 억제제 하에서 억제 활성을 유지할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "피브린 용해성 효소"는 피브린에 직접 작용하여 피브린을 용해하는 효소를 의미하며, 본질적으로는 기능상에 차이가 없으나 "피브린 분해효소", "혈전 용해효소", "프로테아제" 또는 "단백질 분해효소"라는 표현과 상호 교차적으로 사용하며 모두 상기 개념에 포함된다.

본 발명에 따른 단백질 분해효소는 피브린 용해성이며 플라스민과는 상이한 기질 특이성을 지님으로써 새로운 형태의 혈전치료제로서의 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 분해효소는 조 추출물을 그대로 사용할 수도 있고, 이를 정제하여 순도 높게 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해효소를 포함하는 항응고제 또는 혈전 용해제를 제공한다.

본 발명의 단백질 분해효소는 혈관내 혈전이 쌓이는 것을 막아주는 항응고제 효능이 우수하므로, 항응고제 또는 혈전 용해제로서 유용하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '항응고제(anticoagulants)'는 혈액응고 및 이로 인하여 유발되는 질환의 예방, 개선 및 치료용 목적으로 이용되는 조성물로서, 혈관계 내의 이물질(예컨대, 인공판막 등)이나 부정맥으로 인한 혈액응고(혈전증)를 억제 또는 예방하기 위한 약물이다. 여기에서 사용된, '응고 억제(inhibiting coagulation)'는 완전한 억제뿐만 아니라, 응혈 형성의 부분적 억제 의미도 포함한다. 이론에 제한됨 없이, 완전한 억제는 제어가 불가능한 출혈을 동반할 수 있기 때문에 부분적 억제가 바람직하다고 여겨진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 '혈전용해제(thrombolytic agent)'는 혈전을 용해하는 약제의 총칭을 의미한다. 혈소판, 적혈구, 백혈구, 피브린(fibrin) 등이 혈관의 내측에 응고한 것을 혈전이라 한다. 혈전용해제는 혈전용해효소인 플라스민의 전구체인 플라스미노겐(plasminogen)을 플라스민으로 전환하는 활성을 가지며, 이 플라스민(plasmin)이 혈전부에 추출한 피브린(fibrin)을 분해하여 혈전을 용해한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해효소를 유효성분으로 포함하는 혈전성 질환 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명의 단백질 분해효소는 피브린 용해 활성이 탁월하므로, 환자의 혈전을 용해하기 위하여 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 공지의 의약용 담체와 조합하여 제제화할 수 있다. 일반적으로는, 유효 성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하고, 또한 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등를 가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 경구제나, 주사제, 점적용제 등의 비경구제 중의 어떠한 것에 의해서도 투여할 수 있다. 의약용 담체는, 상기 투여형태 및 제형에 따라서 선택할 수 있고, 경구제의 경우는, 예를 들어 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카복시메틸셀룰로스, 콘 스타치, 무기염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다. 한편, 비경구제의 경우는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 유효성분인 프로테아제를 포함하는 조성물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜서 필요에 따라 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 가함으로써 조제된다.

적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1 일 투여량은 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 혈전성 질환은 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 뇌혈전, 뇌색전증, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증, 중심 망막정맥 폐쇄, 폐색전, 폐경색, 하지심부정맥 혈전증, 보행장애, 혈류장해성빈혈, 동맥경화성괴저증, 신경통, 고지혈증, 신성고혈합, 신장병, 신부전, 협심증, 허혈성 심장질환 및 심근경색으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 뇌혈전, 뇌색전증, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증, 중심 망막정맥 폐쇄, 허혈성 심장질환 및 심근경색으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 종 이상일 수 있고, 가장 바람직하게는 허혈성 뇌졸중이다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 단백질 분해효소를 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해효소를 유효 성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 보조 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 단백질 분해효소는 세포 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있어 혈전성 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 단백질 분해효소를 포함하는 식품에는 본 발명의 단백질 분해효소를 0.01~100 중량%로 함유하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 첨가되는 식품군에 따라 차이가 있으나 일반적으로 음료로 조제할 경우에 는 0.01~5 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 단백질 분해효소를 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴 및 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물은 100중량부 당 0.01 내지 약 5중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 단백질 분해효소를 유효성분으로 포함하는 의류용 또는 콘택트렌즈용 세제를 제공한다.

본 발명의 단백질 분해효소는 단백질 분해 효소로서 단백질을 분해할 수 있으므로 의류용 또는 콘택트렌즈용 세제로 사용될 수 있다.

상기 단백질 분해효소를 포함하는 세제는 일반적인 의류용 또는 콘택트렌즈용 세제의 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 또한, 상기 단백질 분해효소는 SDS, 옥틸글루코시드(octylglucoside), 트리톤 X-100, 트윈 20(Tween 20), Brij-35 등 공지의 합성 계면활성제 또는 천연 계면활성제와 함께 상기 세제의 성분으로 포함될 수 있다.

본 발명의 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 유래된 세린계 단백질 분해효소는 피브린 용해 활성 및 항응고 효과가 탁월하므로, 혈전을 강력히 저해하고 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라, 세포독성이 거의 없으므로 안전하고 효과적인 혈전 용해제로 혈관성 질환의 예방 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a 내지 도 1f는 플라스미노겐-미첨가(plasminogen-free) 피브린 플레이트(A, B, C, D) 및 플라스미노겐-풍부(plasminogen-rich) 피브린 플레이트(E, F)에서의 본 발명의 정제된 세린계 단백질 분해효소 및 양성 대조군(u-PA)의 피브린 용해 활성 결과를 보여준다. (A) PBS(대조군), (B, E) 본 발명의 정제된 세린 단백질 분해효소, (C, F) u-PA, (D) 플라스민. 도 1g는 540 nm에서의 흡광도에 기초하여 30 분, 1 시간, 2 시간 및 4 시간 째에서 효소의 피브린 용해능을 측정한 결과를 보여준다. 도 1h는 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 추출 정제한 본 발명의 세린 단백질 분해효소의 SDS-PAGE 결과를 보여준다. 레인 1: 샘플(추출 효소); 레인 M: 표준 단백질 크기 마커.
도 2는 정제된 효소의 반응 최적 온도(A) 및 pH(B) 범위를 측정한 결과를 보여준다. 도 2a는 온도에 따른 혈전 용해 효소 활성을 pH 7.5에서 측정한 결과를 보여준다. 반응 활성은 아조카세인(azocasein) 분석에 의해 측정하였다(반응 활성=(단백질 분해효소 OD 값 - 대조군 OD 값)/ 대조군 OD 값). 도 2b는 pH에 따른 혈전 용해 효소 활성을 37℃에서 측정한 결과를 보여준다. 반응 활성은 아조카세인(azocasein) 분석에 의해 측정하였다.
도 3은 MTT 분석에 의한 배양 세포주(hCMEC/D3)에서의 세포 독성 결과를 보여준다. 사용된 세린 단백질 분해효소의 양은 0, 5, 10, 20, 50 및 100 ㎍/㎖이었다. 세린 단백질 분해효소의 기본은 PBS 완충액이므로 PBS 완충액을 대조군 시료로 사용하였다.
도 4a는 탁도 분석 결과를 보여준다. 다양한 농도의 효소를 추가한 후 피브린 혈전의 용해로 인해 탁도가 향상된다. 탁도는 405 nm에서 분광 분석법으로 측정 하였다. 사용된 세린 단백질 분해효소의 농도는 0, 5, 10 및 20 ㎍/㎖이었다. 도 4b는 DVT 모델 SD 랫트의 신장 내 대정맥에 u-PA 또는 세린 단백질 분해효소 10 ㎍을 주사한 지 1 시간 후의 혈전 무게를 비교한 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명의 하기 실시예에서는 일원 변량 분석(One-way analysis of variance, ANOVA)을 실시하여 피브린 플레이트의 용해 정도, 최적 온도 및 pH, 세포 독성 및 탁도를 평가하였다. 모든 실험은 삼중으로 실시하였고, 통계적 유의성은 p 값으로 간주하였다(* < 0.05, ** < 0.01, or *** < 0.001). 모든 데이터는 표준 편차(S.D.) ± 평균 값으로 표현된다.

실시예 1. 신규한 세린계 단백질 분해효소의 분리, 동정 및 확인

본 발명자들은 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 본 발명의 세린계 단백질 분해효소(단백질 분해효소)를 다음과 같이 순수 분리 및 동정하였다.

1-1. 갯지렁이( Polychaeta )의 분리

본 실시예에서 진행되는 모든 분리(Purification) 과정은 4℃에서 진행하였다.

먼저, 갯지렁이의 장내 물질을 배출해내기 위해 48 시간 동안 먹이 없이 배양시켰다. 배양 후 갯지렁이 50 g을 깨끗이 씻은 작은 사이즈로 자른 다음 100 ml의 20mM 포스페이트 버퍼(Na₂HPO₄ 0.68 g, KH₂PO₄ 0.133 g, pH 7.0)에 담가 놓고 2 시간 동안 자가분해(auto-lysis)시켰다. 이렇게 얻은 샘플을 대용량 초고속 원심분리기를 사용하여 원심분리(8000 g, 30 min)하였다. 원심분리 후, 펠렛(Pellet)을 제거한 상층액에 암모늄 설페이트(Ammonium sulfate) 포화침전법을 이용하여 20% 포화될 때 까지 4 시간 동안 샘플을 포화시켰다. 20% 암모늄 설페이트 포화 침전법 실시 후, 10000 g에서 20 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 펠렛을 제거한 상층액에 암모늄 설페이트 포화침전법을 이용하여 50% 포화될 때까지 4 시간 동안 샘플을 포화시켰다. 55% 암모늄 설페이트 포화침전법 후 같은 방법으로 대용량 원심분리기에 10000 g, 15 분 동안 원심분리를 실시하였다. 펠렛을 획득하기 위하여 남은 상층액을 제거한 뒤 펠렛을 20mM 포스페이트 버퍼 5ml에 녹인 다음 냉동 보관하였다.

1-2. 피브린 용해성 효소( Fibrinolytic enzyme)의 분획, 정제 및 확인

상기 갯지렁이 조추출물(Crude extract)을 vivaspin 2 (50,000 Dalton) PES(poly ether sulfone) 울트라-정제 막(Sartorius)에 통과시켜 분획 및 침전된 추출물을 획득하였다. 상기 추출물에 친화 컬럼(affinity column)인 Hitrap Benzamidine FF column(GE healthcare life science)를 사용하였다. 이 컬럼에 대한 결합 완충액(binding buffer)으로 0.5 M NaCl 버퍼를 사용하였고 pH는 7.4로 맞췄다. 또한, 용출 완충액(Elution buffer)으로 0.05 M 글리신을 사용하였으며, pH는 3.0으로 맞췄다. 먼저, peristic pump안에 증류수를 채워준 다음 전-작동(pre-operating)하였다. 컬럼 배출부의 한 부분을 제거한 후 컬럼 안에 차있는 보관 완충액(Storage buffer)을 증류수로 제거하였다. 보관 완충액을 제거한 후 결합 완충액을 이용하여 컬럼의 레진을 평형화(Equilibrium)하였다. 이어서, 펌프나 주사기를 이용하여 샘플을 로딩한 후 샘플링하였다. 분획(Fractionation) 과정이 끝난 후, 결합 완충액으로 세척하고 용출 완충액을 이용하여 레진에 결합되어 있는 세린계 단백질 분해효소를 정제(purification)하였다. 이 때 용출제의 양은 컬럼의 5-10 배 로 이용하였다.

1-3. SDS-PAGE를 통한 피브린 용해성 세린계 단백질 분해효소( Fibrinolytic Serine protease)의 순수 분리 확인 및 분자량의 결정

상기 분획 과정을 거쳐 획득된 정제된 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 먼저 스테이킹 겔(Stacking gel)과 러닝 겔(Running gel)을 준비한 다음 단백질 샘플을 각 겔에 차례로 넣고 전기영동방법으로 겔에 로딩하였다. 전기영동 후 단백질 밴드는 코마시 블루로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 28 kDa 크기로 추청되는 단일 밴드가 나타났으므로, 본 발명의 단백질 분해효소 활성을 갖는 단백질이 순수하게 정제되었음을 확인하였다(도 1h).

또한, 본 발명의 단백질 분해효소가 어떤 계열의 단백질 분해효소로 분류될 수 있는지 밝히기 위해, 다양한 억제제(EGTA, EDTA 및 PMSF)를 처리하여 단백질 분해효소 활성을 조사한 결과, 본 발명의 단백질 분해효소는 세린계 단백질 분해효소임이 확인되었다.

한편, 일련의 정제 과정을 이용하여, 총 단백질, 특이 활성 및 총 활성을 이용하여 수율을 측정하였다(표 1). 총 활성 및 단백질 농도를 기반으로 한 상기 특이활성의 측정은 각 정제 단계마다 증가한 것으로 나타났다. 최종 정제 단계인 이온 교환의 특이 활성은 95.2 units/mg이었고, 이는 조 추출 단계의 특정 활성에 비해 약 1.6 배가 높았다. 마지막으로, 정제 수율은 공지된 다른 참조 화합물과 유사하게 12.7%였다.

정제 단계	총단백질 (mg)	총 활성(unit)	특이 활성(unit/mg)	수율 (%)
조추출물(Crude extracts)	96.24	5712.3	59.3	100%
암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)	32.04	2318.2	72.6	40.6%
친화 컬럼(Affinity column)	9.43	1329.1	140.9	23.3%
이온 교환 컬럼(Ion exchange column)	7.64	727.3	95.2	12.7%

정제 단계에 따른 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 정제된 세린계 단백질 분해효소의 특이 활성 및 수율. 총 단백질의 양은 BCA 어세이로 확인하였고 세린계 단백질 분해효소의 총 활성은 피브린 평판법으로 측정하였다.

1-5. 본 발명의 피브린 용해성 세린계 단백질 분해효소( Fibrinolytic Serine protease)의 아미노산 서열 분석

본 발명자들은 본 발명의 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)-유래 세린계 단백질 분해효소의 N-말단 아미노산 서열을 분석하고자 하였다.

상기 1-3에서 획득한 밴드가 있는 젤을 작은 사이즈로 자른 다음 H₂O₂로 세척 후 단백질 활성을 유지시켜 주기 위해 1mM DTT과 15 분간 반응시켰다. 이어서 호모게나이져를 통해 겔 조각을 균질화시키고 용출 완충액을 넣어주었다. 용출 완충액(5 mM DTT, 50 mM Tris-Cl, 0.1% SDS, 0.15 M NaCl, 0.1 mM EDTA)을 넣은 후, 12 시간 동안 상온에서 인큐베이션하였다. 이어서 겔 잔해물(debris)을 제거하기 위해 원심분리한 후 상층액을 제거하여 펠렛을 획득하였다.

메탄올:아세톤(1:1)과 용출 완충액을 상기 펠렛에 넣은 후 -20℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이렇게 얻은 샘플을 12,000 g 에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하는 과정을 2 회 반복하였다. 상기 샘플을 -20℃에서 보관한 후 한국기초과학지원연구원에 의뢰하여 본 발명의 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)-유래 세린계 단백질 분해효소의 아미노산 서열을 에드만 (Edman degradation) 방법으로 분석하고, NCBI 블라스트 알고리즘을 이용하여 다양한 종의 세린계 단백질 분해효소와 비교 평가하였다,

그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세린계 단백질 분해효소는 오셔노바실러스 피크튜래(Oceanobacillus picturae) 유래 세린계 단백질 분해효소와 높은 상동성(53.3%)을 갖고, 비브리오 메치니코비(Vibrio metschnikovii) 및 알너스 글루티노사(Alnus glutinosa) 유래 세린계 단백질 분해효소와 46.6%의 상동성을 갖는 것으로 관찰되었다.

따라서, 본 발명의 세린계 단백질 분해효소는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열(서열번호 1; EAMMDKADQLEQSLN, Glu-Ala-Met-Met-Asp-Lys-Ala-Asp-Gln-Leu-Glu-Gln-Ser-Leu-Asn)로 구성되며, 신규한 단백질 분해효소임을 확인하였다.

효소	아미노산 서열	유사성	등재번호(Accession number)
본발명의 효소	EAMMDKADQLEQSLN
Oceanobacillus picturae	FAIOMDTALPIMDQLEQNGR	53.3	Sequence ID: ref[ WP _036577518.1]
Vibrio metschnikovii	GYFAVKADQLEDSQA	46.6	Sequence ID: dbj [ BAI50017 .1]
Alnus glutinosa	SAMMTTANPLDNTLN	46.6	Sequence ID: emb [ CAA59964 .1]
Caedibacter varicaedens	LLKPLKDYQLEQALN	40	Sequence ID: dbj [ GAO98215 .1]

실시예 2. 신규한 세린계 단백질 분해효소의 피브린 용해능 확인

본 발명자들은 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규한 단백질 분해효소인 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)유래-세린계 단백질 분해효소의 피브린 용해성을 확인하기 위하여 피브린 평판법(Fibrin Plate Assay)을 다음과 같이 이용하였다.

2-1. 플라스미노젠 ( Plasminogen )-미첨가 피브린 평판법

피브린 평판법을 이용하여 피브린 용해 활성을 확인하였다. 피브린 플레이트는 피브리노젠(Fibrinogen)과 트롬빈(Thrombin)의 반응에 의해서 형성된다. 피브리노젠은 1.5% 인간 피브리노젠(20mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4) 0.6 ml을 사용하였고, 트롬빈은 1 BP U/ml(20mM Tris-HCl 완충액, pH 7.4) 0.3 ml을 사용하였다. 위의 모든 조건은 1 시간 동안 상온에서 조절하였으며, 피브린 용해 활성을 테스트 하기 위해 10 ul의 작은 구멍을 만들었다. 이 후 세린계 단백질 분해효소 및 대조군(Urokinase, Plasmin)을 구멍에 넣고 37℃에서 10 시간 동안 반응시켰다. 모든 샘플의 피브린 용해 효소 활성은 피브린 플레이트의 용해 면적을 측정하여 평가하였다.

2-2. 플라스미노젠 -풍부(첨가) 피브린 평판법

상기 2-1과 동일한 방법으로 피브린 플레이트를 만든 다음 5 units의 플라스미노젠(Sigma Aldrich)를 추가로 첨가하였다. 상기 2-1과 동일하게 1 시간 동안 상온에서 조절하였으며, 피브린 용해 활성을 테스트 하기 위해 10 ul의 작은 구멍을 만들었다. 이 후 세린계 단백질 분해효소 및 대조군(Urokinase, Plasmin)을 구멍에 넣고 37℃에서 10 시간 동안 반응시켰다. 플라스미노젠 미첨가한 경우와 첨가한 경우의 피브린 용해 효소 활성도 차이를 피브린 플레이트의 용해 면적을 측정하여 비교하였다.

즉, 정제된 세린 단백질 분해효소의 피브린 용해 활성은 피브린 플레이트에서 나타나는 투명한 부위를 측정하여 분석하였다. 플라스민은 양성 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 정제된 세린계 단백질 분해효소의 피브린 용해 활성은 대조군보다 1.3 배 높았다.

또한, 본 연구에서는 플라스미노겐-미첨가 피브린 및 플라스미노겐-풍부(첨가) 피브린 플레이트를 이용하여 세린계 단백질 분해효소가 두 기능 활성을 갖는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 도 1 b 및 도 1c에 나타낸 바와 같이, 플라스미노겐-풍부 및 플라스 미노겐-미첨가 플레이트 각각에서 간접 및 직접 메커니즘이 활성화된 것을 확인하였다.

또한, 도 1d 및 도 1e에 나타낸 바와 같이, 플라스미노겐-풍부 및 플라스 미노겐-미첨가 플레이트에 의해 u-PA의 피브린 용해 활성이 확인되었다. u-PA의 직접 피브린 용해 활성은 정제된 세린 단백질 분해효소보다 3.0 배 높았다. 그러나, 정제된 세린 단백질 분해효소의 간접 피브린 용해 활성은 u-PA보다 1.2 배 높았다. 최적 용해 시간은 2 시간과 4 시간 (도 2f) 사이인 것으로 확인되었다. 정제된 세린 단백질 분해효소는 일반적으로 4 시간에 활성화되었다.

실시예 3. 신규한 세린계 단백질 분해효소의 최적 조건 확인

본 발명자들은 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규한 단백질 분해효소인 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)유래-세린계 단백질 분해효소에 대한 최적 조건을 확인하기 위하여 아조카세인(azocasein) 분석법을 이용하여 측정하였다.

먼저, 본 세린계 단백질 분해효소의 최적 온도를 확인하기 위하여 4℃, 10℃, 24℃, 30℃, 37℃, 50℃, 60℃ 및 70℃ 총 8 개 온도 범위에서 피브린 용해 효소에 대한 아조카세인 분석법을 실시하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 세린 단백질 분해효소 활성의 최적 온도는 37℃ 보다 높은 반면, 50℃ 이상 또는 30℃ 이하에서 감소하는 것으로 나타났다.

또한, 본 세린계 단백질 분해효소의 최적 pH를 확인하기 위하여 각각 pH 범위에 따라 실험하였다(pH 3.0 내지 10.0). pH 3에서 6까지에서의 용액은 50 mM 시트레이트 용액을 사용하였으며, pH 7에서 9까지에서의 용액은 50 mM Tris-HCl 용액을 사용하였다. pH 10에서 11까지에서의 용액은 50 mM 글리신-NaOH 용액을 사용하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 세린 단백질 분해효소가 낮고 중성인 pH(pH 3.0-pH 7.0)에서 활성을 유지하는 반면, 높은 pH(pH 8.0-10.0)에서 낮은 pH 범위에서보다 활성이 낮았다. 이러한 발견을 기반으로 하여, 정제된 세린 단백질 분해효소는 산성 세린 단백질 분해효소인 것으로 확인되었다.

실시예 4. 인 비트로 세포 독성 테스트( In vitro Cell Toxicity Test)

본 발명자들은 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규한 단백질 분해효소인 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)유래-세린계 단백질 분해효소의 세포에 대한 독성을 확인하기 위하여, HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)인 hCMEC/D3 세포주를 이용하여 MTT 어세이를 실시하고 세포 생존율을 분석하였다.

HUVEC은 사람 태아의 탯줄의 혈관 벽에 있는 내피세포(Endothelial Cell)로서 인체 뇌에 있는 혈관 세포의 대체용으로 독성 테스트가 가능하다. 세포 독성 테스트는 다양한 농도의 세린계 단백질 분해효소를 배지(DMEM high glucose media)에 첨가한 후 배양하여 실시하였다. 이 실험은 온도는 37℃, 기간은 1 주 동안 관찰하였으며, 피브린 용해 효소 농도 별로 실시하였다. 총 4 가지 대조군을 사용하였으며, 5, 10, 20, 50 및 100 ㎍/ml의 농도로 실험하였다. HUVEC의 세포수는 MTT 어세이를 이용하였으며, 이를 통해 피브린 용해 효소가 HUVEC의 접착, 생존율 등에 미치는 영향을 측정하였다. MTT 어세이에서 포르마잔의 형성은 ELISA로 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세린 단백질 분해효소는 세포 독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다. hCMEC/D3의 세포 활성 수준은 대조군과 비교하여 떨어지지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 세린 단백질 분해효소는 세포에 대하여 독성을 나타내지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5. 탁도 용해 어세이 ( Turbidimetric lysis assay)

본 발명자들은 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규한 단백질 분해효소인 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)유래-세린계 단백질 분해효소의 혈전에 대한 용해 정도를 분석하였다.

인하대학교 의과전문대학에 의뢰해 인간 혈액 혈장(Human blood plasma)을 얻었다. 인간 혈액 혈장과 응고 인자로써 트롬빈(3.54 U/ml), 2 ml의 PBS 완충액을 참가한 후 2 시간 동안 25℃에서 응고시켰다. 이어서 세린계 단백질 분해효소와 양성 대조군인 플라스민(Plasmin), 음성 대조군인 PBS를 첨가하고 총 8 시간 동안 인큐베이션 한 후, 얻은 결과물인 샘플들을 350 nm의 흡광도에서 분광기를 이용하여 탁도를 측정하였다.

인간 혈장의 탁도는 세린 단백질 분해효소 활성의 정도를 측정 할 수 있는 CaCl₂와 트롬빈의 반응에 의해 변화되었다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 인간 혈장 혈전의 탁도는 세린 단백질 분해효소의 농도에 따라 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 세린 단백질 분해효소가 인간 혈장에 대하여 단백질 분해효소 활성의 손실없이 구배 농도에서 활성을 유지하고 있음을 나타낸다.

실시예 6. 생체 DVT 모델

본 발명자들은 실시예 1에서 분리한 본 발명의 신규한 단백질 분해효소인 짧은다리송곳갯지렁이(Lumbrineris nipponica)유래-세린계 단백질 분해효소가 항응고제로서 작용할 수 있는 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여, DVT 모델에서 혈전 형성을 분석하였다.

DVT(deep vein thrombosis) 동물 모델은 Zhang 등에 의해 공지된 방법을 사용하여 제작하였다. 간략하게는, 8 주령 SD 랫트의 복부를 절개한 후, 요추, 신장, 장골와 같은 위대정맥(Sub vena cava)을 봉합하고 본 발명의 피브린 용해성 효소인 세린계 단백질 분해효소(10 ㎍/㎖)을 꼬리 정맥으로 주입하였다. 15 초 후 대정맥을 1 시간 동안 완전히 봉합하고, 혈전의 수를 확인하기 위해서 절단하였다. u-PA는 DVT 모델에서 양성 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 세린 단백질 분해효소 처리의 경우, DVT 모델의 대정맥에서 u-PA보다 적은 혈액 응고를 포함하는 것으로 확인되었다. 즉, 본 발명의 세린계 단백질 분해효소는 항응고제로서 작용하는 능력을 가지고 있음을 보여 주었다.

따라서, 본 발명의 세린계 단백질 분해효소는 산성 환경에서도 활성에 영향을 받지 않을 뿐 아니라, 탁월한 피브린 용해 및 항응고 효과를 유지하고, 강력한 피브린 용해 활성을 가지고 있으므로, 본 발명의 단백질 분해효소는 항응고제, 혈전 용해제, 세제, 콘택트 렌즈 세척제 등의 다양한 용도로 사용할 수 있다.

<제제예 1> 약학적 제제

본 발명의 단백질 분해효소 50 mg

락토오스 80 mg

전분 17 mg

스테아르산 마그네슘 3 mg

결정성 셀룰로오스 10 mg

본 발명의 한 실시 형태는 그 예를 상기에 나타낸 정제의 유효 성분으로써 상기 단백질 분해효소의 용도이다. 정제는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 한 바람직한 실시형태는 통상의 장용성 피복(예를 들면, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트), 당코팅 또는 피막 코팅을 갖는 정제이다.

<제제예 2> 건강기능식품 제조

본 발명의 단백질 분해효소 분말 (20,000FU/g) 50 ㎎(1000FU)

달맞이꽃 종자유(감마리놀레인산) 250 ㎎

D-알파-토코페롤 15 ㎎

구연산 5 ㎎

치옥토산아미드 2 ㎎

니코틴산아미드 3 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

대두레시틴 1 ㎎

대두경화유 24 ㎎

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캡슐제형으로 제조하였다.

<제제예 3> 건강기능식품 제조

본 발명의 단백질 분해효소 분말 (20,000FU/g) 100 ㎎ (2000FU)

락토바실루스 람노서스 500 ㎎ (10 x 108cfu/g)

락토바실루스 아시도필루스 100 [0073] ㎎ (10 x 108cfu/g)

비피도박테리움 롱검 100 ㎎ (10 x 108cfu/g)

유당 50 ㎎

백당 50 ㎎

만니톨 80 ㎎

포도당가공품(prim) 18 ㎎

구연산 1.5 ㎎

PVP K-30 0.3 ㎎

황색4호 0.2 ㎎

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 세립제형으로 제조하였다.

<110> Korea Institute of Coastal Ecology, Inc. <120> Novel Serine Protease and Uses Thereof <130> INHA1-168p-1 <150> KR 10-2015-0124758 <151> 2015-09-03 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Lumbrineris nipponica <400> 1 Glu Ala Met Met Asp Lys Ala Asp Gln Leu Glu Gln Ser Leu Asn 1 5 10 15

Claims (8)

1. 짧은다리송곳 갯지렁이(Lumbrineris nipponica)로부터 분리되고, 피브린 용해 활성을 갖는 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질 분해효소(Protease).
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 EGTA(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid), EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), PMSF(phenylmethane sulfonyl fluoride), 4-아미도페닐메틸술포닐 플루오라이드(4-amidophenylmethylsulfonylfluoride, APMSF), 벤자미딘(benzamidine), 류펩틴(leupeptin), 페닐 메틸술포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), 토실라이신 클로로메틸 케톤(tosyllysine chloromethyl ketone, TLCK), 아프로티닌(aprotinin), 리마콩 트립신 억제제(limabean trypsin inhibitor, LBTI) 및 대두콩 트립신 억제제(soybean trypsin inhibitor, SBTI)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 세린 단백질 분해효소 억제제 하에서 억제 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소.
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 pH 3 내지 pH 7의 산도 범위 및 30℃ 이상 50℃ 이하의 온도 범위에서 최적 효소 활성을 유지하는 것을 특징으로 하는 단백질 분해효소.
4. 제1항의 단백질 분해효소를 포함하는 항응고제 또는 혈전 용해제.
5. 제1항의 단백질 분해효소를 유효 성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 혈전성 질환은 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 뇌혈전, 뇌색전증, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증, 중심 망막정맥 폐쇄, 폐색전, 폐경색, 하지심부정맥 혈전증, 보행장애, 혈류장해성빈혈, 동맥경화성괴저증, 신경통, 고지혈증, 신성고혈합, 신장병, 신부전, 협심증, 허혈성 심장질환 및 심근경색으로 이루어지는 군으로부터 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 제1항의 단백질 분해효소를 유효 성분으로 포함하는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 보조 식품 조성물.
8. 제1항의 단백질 분해효소를 포함하는 의류용 또는 콘택트 렌즈용 세제.

Images