JPH1132778A

JPH1132778A - 新規セリンプロテアーゼ

Info

Publication number: JPH1132778A
Application number: JP9213969A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Tsuruoka; 伸夫鶴岡; Kyoko Yamashiro; 恭子山城; Mare Yamaguchi; 希山口
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1999-02-09
Also published as: EP0949334A1; EP0949334A4; US20020160490A1; WO1999005290A1

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なヒト・セリンプロテアーゼの提供。【解決手段】図７〜図１２に示すセリンプロテアーゼ
と同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置
換したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列ま
たはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１
乃至複数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を含ん
でなるセリンプロテアーゼまたはその部分ペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規セリンプロテ
アーゼ、それをコードするＤＮＡ、及び該セリンプロテ
アーゼの製造方法、並びに該セリンプロテアーゼまたは
それをコードするＤＮＡを用いる生理活性物質のスクリ
ーニング方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】セリンプロテアーゼは、動物、植物、微
生物に広く存在し、特に、高等動物では、食物の消化、
血液凝固・線溶、補体活性化、ホルモン産生、排卵・受
精、食作用、細胞増殖、発生・分化、老化、癌転移など
極めて多くの生体反応に関与していることがわかってい
る（Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｈ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，３
５０−３５７，１９８４）。

【０００３】近年、中枢神経系においてもセリンプロテ
アーゼが生理的に重要な機能分子として働いていること
が確認されるようになった。例えば、脳内において発現
しているセリンプロテアーゼとしては、組織型プラスミ
ノーゲンアクチベーター（Sappiro,A-D.,Madani,R.,Hua
rte,J.,Belin,D.,Kiss,J.Z.,Wohlwent,A.,and Vassall
i,J-D.,J.Clin.Invest.,92,679-685,1993）、トロンビ
ン（Monard,D,Trends Neurosci.,11,541-544,1988)、ヒ
トトリプシンIV（Wiegand,U.,Corbach,S.,Minn,A.,Kan
g,J.and Muller-Hill,B.,Gene,136,167-175,1993)、ニ
ューロプシン（Chen,Z-L.,Yoshida,S.,Kato,K.,Momota,
Y.,Suzuki,J.,Tanaka,T.,Ito,J.,Nishino,H.,Aimoto,
S.,Kiyama,H.,and Shiosaka,S.,J.Neurosci.,15(7),508
8-5097,1995)、ニューロシン（Yamashiro,K.,Tsuruoka,
N.,Kodama,S.,Tsujimoto,M.,Yamamura,Y.,Tanaka,T.,Na
kazato,H.,and Yamaguchi,N.,Biochim.Biophys.Acta,13
50,11-14,1997)などが知られている。

【０００４】これら脳内におけるセリンプロテアーゼ
は、ニューロンの神経突起の伸展に関与するばかりでな
く、標的ニューロンとのシナプス形成過程に関与してい
ることが想定されている（Liu,Y.,Fields,R.D.,Fitzger
ald,S.,Festoff,B.W.,and Nelson,P.G.,J.Neurobiol,2
5,325,1994)。しかしながら、これらセリンプロテアー
ゼの脳内における生理機能についてはほとんど解明され
ていない。また、脳内に発現し重要な生理機能を担うセ
リンプロテアーゼがその他多数存在することが予想され
るがその多くは特定されていないのが現状である。

【０００５】一方、凝固線溶補体系のある種のセリンプ
ロテアーゼタンパク質は、クリングルドメイン、ＥＧＦ
−ｌｉｋｅ構造、フィンガー構造、γ−ｃａｒｂｏｘｙ
ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄドメインならびにアップル
ドメインなどの構造をＮ末端側に有している（Furie,
B.,and Furie,B.C.,Cell,53,505-518,1988）。例えば、
クリングルドメインを持つセリンプロテアーゼタンパク
質としてはウロキナーゼ、プラスミノーゲンアクチベー
ター、プラスミノーゲンなどが知られている。

【０００６】クリングルドメインは、フィブリン、ヘパ
リンおよびリシンアナログとの結合能を有し（Scanu,A.
M.and Edelstein,C.,Biochimica.Biophysica.Acta,125
6,1-12,1995）、血液線溶系においては、析出したフィ
ブリンにプラスミノーゲンアクチベーターがクリングル
ドメインを介して結合し、近傍に結合したプラスミンを
活性化することが示されている。さらに、血管新生抑制
因子アンジオスタチンが、プラスミノーゲン分子中のク
リングルドメインであることが明らかとなり（Cao,Y.,J
i,R.W.,Davidson,D.,Scaller,J.,Marti,D.,Soehndel,
S.,McCance,S.G.,O'Reilly,M.S.,Llinas,M.,and Folkma
n,J.,J.Biol.Chem.,271,29461-29467,1996）、クリング
ルドメイン構造単独の生理活性が初めて示された。

【０００７】また、マクロファージスカベンジャーレセ
プターにおいて認められたスカベンジャーレセプターシ
ステインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン構造を有する一連
のタンパク質群として、サイクロフィリンＣ結合蛋白
質、スペラクト（Ｓｐｅｒａｃｔ）レセプター、コンプ
リメントファクターＩ、ＣＤ５、ＣＤ６などの存在が知
られている（Resnick,D.,Pearson,A.,and Krieger,M.,T
rends.Biochem.Sci.,19,5-8,1994）。

【０００８】サイクロフィリンＣ結合蛋白質やコンプリ
メントファクターＩは分泌タンパク質であるのに対し
て、スペラクト（Ｓｐｅｒａｃｔ）ファクターやＣＤ５
およびＣＤ６は、膜結合型タンパク質であることが知ら
れている。このうち、膜結合型タンパク質ＣＤ６と結合
するタンパク質が活性化白血球接着分子（ＡＬＣＡＭ）
であることが見い出され、ＣＤ６のＳＲＣＲドメイン構
造に結合位置があることがわかった（Whitney,G.S.,Sta
rling,G.C.,Bowen,M.A.,Modrell,B.,Siadak,A.W.,and A
ruffo,A,J.Biol.Chem.,270,18187-18190,1995)。

【０００９】さらに、ＣＤ６のリガンドであるＡＬＣＡ
Ｍは、活性化リンパ球やニューロンに発現していること
が知られており、ＣＤ６は、ＡＬＣＡＭとの相互作用を
介して免疫系や神経系における恒常性の維持に一定の制
御機能を果たしていることが推察される。このように、
複数のドメイン構造を有するタンパク質は、各ドメイン
が固有の機能を有するばかりでなく、各ドメインの機能
が連関して特異的な認識機能を持って機能しているもの
と考えられている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の実情に
鑑みてなされたものであり、その目的は新規なセリンプ
ロテアーゼ、及びそれをコードする新規セリンプロテア
ーゼＤＮＡを提供することにある。さらに、本発明は当
該ＤＮＡを用いて当該プロテアーゼを大量に生産する方
法及び該セリンプロテアーゼまたはそれをコードするＤ
ＮＡを用いる生理活性物質のスクリーニング方法を提供
することを目的とするものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
を重ねた結果、脳内に発現するセリンプロテアーゼをコ
ードするｃＤＮＡに良く保存されている領域をプローブ
として用い、５’翻訳領域が特徴的なｃＤＮＡをスクリ
ーニングすることにより、新規機能タンパク質をコード
するｃＤＮＡを単離し、本発明を完成させるに至った。

【００１２】

【具体的な説明】マウスセリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡのクローニングは、先ず、常法に従って単離
調製したマウス脳由来ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、次に、作製したｃＤＮＡライブラリーをセ
リンプロテアーゼモチーフをもとにデザインしたＰＣＲ
プライマーを用いたＰＣＲにより行なった。ここで得ら
れたＰＣＲ産物をプローブとして、５’翻訳領域が長く
新規機能タンパク質をコードすると予想されるクローン
のスクリーニングを実施した。

【００１３】その結果、本発明者らは、マウスＢＳＳＰ
−３と命名した２．７kbのｃＤＮＡを単離することに成
功した。得られたｃＤＮＡ配列を常法により調べた結
果、マウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡは、セリンプロテア
ーゼドメインばかりでなくクリングルドメインならびに
スカベンジャーレセプターシステインリッチドメインを
含む新規機能タンパク質をコードしていることが明らか
となった。単離したマウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡは、
１つのクリングルドメイン、３つのスカベンジャーレセ
プターシステインリッチドメインおよび１つのセリンプ
ロテアーゼドメインをコードしていた。具体例を実施例
１に記載する。

【００１４】次に、単離したマウスＢＳＳＰ−３ｃＤ
ＮＡ全長をプローブとして、マウス各臓器およびマウス
脳各部位におけるマウスＢＳＳＰ−３ｍＲＮＡの発現
を確認したところ、マウス各臓器においては、特に脳に
強い発現を認め、肺および腎臓においても発現を認め
た。また、マウス脳各部位においては、大脳および脳幹
に強い発現を認め、延髄においても発現を認めた。その
大きさはいずれの場合においても約２．７kbの大きさの
みであった。検討した脳各部位のうち、マウスＢＳＳＰ
−３ｍＲＮＡの発現は小脳では認められなかった。具
体例を実施例２に記載する。このことから、マウスＢＳ
ＳＰ−３ｍＲＮＡは、実際にマウス臓器で発現してい
ることが確認された。

【００１５】さらに、マウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡを
プローブにしてヒト脳ｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングした結果、ヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡを単離す
ることに成功した。その結果、本発明者らは、ヒトＢＳ
ＳＰ−３ｃＤＮＡがマウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡの一次
構造から予想されるものとは明らかに異なり、１つのク
リングルドメイン、４つのスカベンジャーレセプターシ
ステインリッチドメインおよび１つのセリンプロテアー
ゼドメインをコードしていることを明らかにした。具体
例を実施例３に記載する。さらに、本発明者は、ヒトＢ
ＳＳＰ−３ｃＤＮＡのうちセリンプロテアーゼ成熟タ
ンパク質をコードするＤＮＡをＣＯＳ−１細胞で発現し
たところ、明らかに酵素活性を持つ機能タンパク質であ
ることを明らかにした。具体例を実施例４に記載する。

【００１６】以上の結果から、今回単離したマウスおよ
びヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡは、その一次構造上、新
規セリンプロテアーゼドメイン、新規クリングルドメイ
ンならびに新規スカベンジャーレセプターシステインリ
ッチドメインを含む新規機能タンパク質をコードしてい
ることばかりでなく、セリンプロテアーゼドメインが酵
素活性を持った機能タンパク質であることが明らかとな
った。

【００１７】本発明における新規機能タンパク質は、一
次構造上複合的な機能を有することが明らかであるばか
りでなく、その複合的な機能を通して脳内の生理機能に
一定の役割を果たしている。したがって、本発明のマウ
スＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡおよびマウスＢＳＳＰ−３
ｃＤＮＡがコードしている新規機能タンパク質は、各種
マウス疾患モデルの病態解析に有用な手段を提供するも
のである。また、病態解析を通じて得られた疾患治療の
ための有用な情報を基に、本発明のヒトＢＳＳＰ−３
ｃＤＮＡおよびヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡがコードし
ている新規機能タンパク質は、各種疾患治療剤をスクリ
ーニングする手法を提供するものであり、さらに実際の
ヒト疾患治療薬の開発に適用することも可能である。

【００１８】その治療法としては、遺伝子組換え体投与
による補充治療ならびにセンス又はアンチセンス法によ
る遺伝子発現促進又は抑制治療が挙げられる。さらに、
新規機能タンパク質の各ドメイン構造のそれぞれは、単
独で機能することもまた可能である。したがって、各ド
メイン構造を個別に発現させた後、各ドメイン構造と相
互作用を示す分子を特定することができる。また、特定
した分子群の疾患への関与を調べることにより、遺伝子
組換え体投与による補充治療ならびにセンス又はアンチ
センス法による遺伝子発現促進又は抑制治療も可能であ
る。

【００１９】以下、実施例に基づいて本発明を説明す
る。本発明においては、新規セリンプロテアーゼをコー
ドするＤＮＡのヌクレオチド配列として図１〜６および
図７〜１２に示すヌクレオチド配列を開示するが、本発
明のセリンプロテアーゼのＤＮＡはこれに限定されな
い。一旦、天然セリンプロテアーゼのアミノ酸配列が決
定されれば、コドンの縮重に基き、同じアミノ酸配列を
コードする種々のヌクレオチド配列を設計し、それを調
製することができる。この場合、使用すべき宿主により
高頻度で用いられるコドンを使用するのが好ましい。

【００２０】本発明の天然セリンプロテアーゼをコード
するＤＮＡを得るには、実施例に記載する様にしてｃＤ
ＮＡを得ることができるが、これに限定されない。すな
わち、天然セリンプロテアーゼのアミノ酸配列をコード
する１つのヌクレオチド配列が決定されれば天然セリン
プロテアーゼをコードするＤＮＡは、本発明に具体的に
開示するストラテジーとは異なるストラテジーによりｃ
ＤＮＡとしてクローニングすることができ、さらにはそ
れを生産する細胞のゲノムからクローニングすることも
できる。

【００２１】例えば、実施例１に示すようなＤＮＡ（ヌ
クレオチド）プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応
法（ＰＣＲ）によりクローニングすることができる。本
発明のＤＮＡはさらにセリンプロテアーゼ活性を有する
蛋白または糖蛋白をコードし、図１〜６または図７〜１
２のヌクレオチド配列とハイブリダイズするＤＮＡも含
まれる。また、ハイブリダイゼーションの一般的方法は
当業者においてよく知られており（例えば、実験医学臨
時増刊号、羊土社、バイオテクノロジー実験法シリーズ
遺伝子工学総集編" 、Vol.５，No．１１，２４−６０，
１９８７）、活性測定もまた当業者によく知られてい
る。

【００２２】ゲノムからクローニングする場合、実施例
において使用した種々のプライマーヌクレオチド又はプ
ローブヌクレオチドを、ゲノムＤＮＡ断片の選択のため
プローブとして使用することができる。また、図１〜６
または図７〜１２に記載するヌクレオチド配列に基いて
設計された他のプローブを用いることもできる。ゲノム
から目的とするＤＮＡをクローニングするための一般的
方法は当業界においてよく知られている（Current Prot
ocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons社、第
５章及び第６章）。

【００２３】本発明の天然セリンプロテアーゼをコード
するＤＮＡはまた、化学合成によっても調製することが
できる。ＤＮＡの化学合成は当業界において自動ＤＮＡ
合成機、例えばアプライドバイオシステム社３９６ＤＮ
Ａ／ＲＮＡ合成機など採用して容易である。従って、当
業者は、図１〜６または図７〜１２に示されるヌクレオ
チド配列のＤＮＡを容易に合成することができる。

【００２４】本発明の天然型セリンプロテアーゼを生来
のコドンとは異なるコドンによりコードするＤＮＡは、
前記のごとく化学合成により調製することもでき、また
図１〜６または図７〜１２に示すヌクレオチド配列を有
するＤＮＡ又はＲＮＡを鋳型として変異誘発プライマー
と共に用いる部位特定変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）等常法に従って得
ることもできる（例えば、Current Protocols In Molec
ular Biology,John Wiley & Sons社、第８章を参照のこ
と）。

【００２５】こうして、一旦アミノ酸配列が決定されれ
ば、この天然アミノ酸配列に１〜複数のアミノ酸が付加
されておりなおセリンプロテアーゼ活性を維持している
ポリペプチド、前記天然アミノ酸配列から１〜複数個の
アミノ酸が除去されておりなおセリンプロテアーゼ活性
を維持しているポリペプチド、前記天然アミノ酸配列中
の１〜複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置き換え
られておりなおセリンプロテアーゼ活性を維持している
ポリペプチド、さらには、上記のアミノ酸付加変異、ア
ミノ酸除去変異及びアミノ酸置換変異が組合わされた変
異を有しなおセリンプロテアーゼ活性を維持しているポ
リペプチドなど、種々の変異型セリンプロテアーゼを設
計し、それを製造することができる。

【００２６】上記アミノ酸の付加、除去及び置換等の変
異におけるアミノ酸の数は、特に限定されないが、付加
については、例えば、本発明のセリンプロテアーゼとの
ハイブリッド蛋白に用いられる機能性蛋白のアミノ酸の
数（例えば、マルトースバインディングプロテイン（ｍ
ａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）等の
公知の抽出精製もしくは安定化用蛋白または各種生理活
性蛋白や本セリンプロテアーゼに付加されたシグナルペ
プチドのそれに依存し、すなわち、当該変異の目的に依
存して決定される。例えば、１〜５０、好ましくは、１
〜１０の付加があげられる。

【００２７】また、除去については、除去されるアミノ
酸の数は、セリンプロテアーゼ活性が維持されるように
設計、決定され、例えば、１〜３０、好ましくは１〜２
０、また、本セリンプロテアーゼの活性領域以外の領域
のアミノ酸の数があげられる。さらに、置換について
は、置換されるアミノ酸の数は、セリンプロテアーゼ活
性が維持されるように設計、決定され、例えば、１〜１
０、好ましくは、１〜５があげられる。

【００２８】また、本発明においては、図１〜６または
図７〜１２に示すそれぞれアミノ酸番号５１７から７６
１までまたは５７８から８２２までのアミノ酸配列から
なるセリンプロテアーゼドメイン、図１〜６または図７
〜１２に示すアミノ酸番号８５から１５７までまたは４
０から１１２までのアミノ酸配列からなるクリングルド
メイン、または図１〜６または図７〜１２に示すそれぞ
れアミノ酸番号１６６から番号２６６まで、番号２７３
から３７２までもしくは番号３８６から４８６までまた
は番号１１７から２１７まで、番号２２７から３２７ま
で、番号３３４から４３３まで、もしくは番号４４７か
ら５４７までのアミノ酸配列からなるスカベンジャーレ
セプターシステインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインを提供
し、これらドメインの作製は、後記する方法またはそれ
自体公知のペプチド合成法もしくは適当なプロテアーゼ
による該セリンプロテアーゼの切断により行うことがで
き、また本発明のドメインの活性を維持する変異型ドメ
インまたはそれをコードするＤＮＡも同様に作製するこ
とができる。

【００２９】上記のようにして本発明のセリンプロテア
ーゼまたはドメインのＤＮＡが得られると、これを用い
て、常用の遺伝子組換え法により組換えセリンプロテア
ーゼまたはドメインを製造することができる。すなわ
ち、本発明のセリンプロテアーゼまたはドメインをコー
ドするＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該発現ベ
クターを適当な宿主細胞に導入し、該宿主細胞を培養
し、そして得られた培養物（細胞又は培地）から目的と
するセリンプロテアーゼまたはドメインを摂取する。

【００３０】本発明のセリンプロテアーゼまたはドメイ
ンは、生化学的又は化学的な修飾、例えば、Ｎ末端アシ
ル化、例えばホルミル化、アセチル化などのＣ_1-6アシ
ル化または欠失等がされた形で得られてもよい。発現系
は、シグナル配列の付加、改良や宿主の選択によって分
泌効率及び発現量の向上を図ることもできる。シグナル
配列の付加及び改良手段としては、他の構造ペプチドの
シグナルペプチドをコードする遺伝子を本発明のセリン
プロテアーゼまたはドメインの構造遺伝子５’側上流
に、切断可能な部分ペプチドをコードする遺伝子を介す
るように連結する方法が挙げられる。具体的例示として
は、実施例４に記載したトリプシン遺伝子のシグナル配
列およびエンテロキナーゼ認識配列をコードする遺伝子
を用いる方法があげられる。

【００３１】宿主としては原核生物又は真核生物を用い
ることができる。原核生物としては細菌、特に大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、バシルス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌、例えばバシルス・ズブチリ
ス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を用いることができる。
真核生物としては酵母、例えばサッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母、例えばサッカロミセス
・セレビシエー（Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、等の真
核性微生物、昆虫細胞、例えば、ヨガ細胞（Ｓｐｏｄｏ
ｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、キャベツルーパ
ー細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、カイコ細
胞（Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ）、動物細胞、例えばヒト
細胞、サル細胞、マウス細胞等、具体的には、ＣＯＳ−
１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｌ細胞、ミエロー
マ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｓｐ
−２／Ｏ細胞等を使用することができる。本発明におい
てはさらに、生物体それ自体、例えば昆虫、例えばカイ
コ、キャベツルーパー等を用いることもできる。

【００３２】発現ベクターとしては、プラスミド、ファ
ージ、ファージミド、ウィルス（バキュロ（昆虫）、ワ
クチニア（動物細胞））等が使用できる。発現ベクター
中のプロモーターは宿主細胞に依存して選択され、例え
ば細菌用プロモーターとしてはｌａｃプロモーター、ｔ
ｒｐプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターと
しては、例えば、ａｄｈＩプロモーター、ｐｑｋプロモ
ーター等が使用される。

【００３３】また、昆虫用プロモーターとしてはバキュ
ロウィルスポリヘドリンプロモーター等、動物細胞とし
てはＳｉｍｉａｎＶｉｒｕｓ４０のｅａｒｌｙもしく
はｌａｔｅプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ
−ＴＫプロモーターまたはＳＲαプロモーター等があげ
られる。また、発現ベクターには、以上の他にエンハン
サー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、
選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メ
トトレキセート耐性）、ｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８耐性）
等）等を含有しているのを用いるのが好ましい。なお、
エンハンサーを使用する場合、例えばＳＶ４０のエンハ
ンサー等を遺伝子の上流または下流に挿入する。

【００３４】発現ベクターによる宿主の形質転換は、当
業界においてよく知られている常法により行うことがで
き、これらの方法は例えば、Current Protocols in Mol
ecular Biology,John Wiley & Sons社、に記載されてい
る。形質転換体の培養も常法に従って行うことができ
る。培養物からのセリンプロテアーゼまたはドメインの
精製は、タンパク質を単離・精製するための常法に従っ
て、例えば、限外濾過、各種カラムクロマトグラフィ
ー、例えばセフアロースを用いるクロマトグラフィー等
により行うことができる。

【００３５】このようにして得られる本発明のセリンプ
ロテアーゼまたはドメインは、機能的タンパク質である
ことから、病態解析に有用な手段を提供し、本タンパク
質を用いる生理活性物質のスクリーニングを可能とし、
当該スクリーニング方法は、各種疾患治療剤の探索研究
に有用である。スクリーニング方法の具体例として、例
えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合
成化合物、発酵生産物のような、または、各種細胞培養
上清等より得られる天然成分、各種合成化合物等の人工
成分のような被験試料の生理活性の測定を行なうことに
より、例えばセリンプロテアーゼ阻害物質の場合は、実
施例４と同様にして、行うことができる。また、本発明
のセリンプロテアーゼ、ドメインもしくはそれらの部分
ペプチドまたは前記したセリンプロテアーゼ、ドメイン
もしくはそれらの部分ペプチドをコードするＤＮＡで形
質転換された宿主もしくはその細胞膜画分を使用する上
記生理活性測定、結合親和性測定等も本発明のスクリー
ニング方法の好ましい実施態様である。また、本発明の
セリンプロテアーゼ、ドメインまたはその部分ペプチド
をコードするＤＮＡは、遺伝子組換体投与による補充治
療ならびにセンスまたはアンチセンス法による遺伝子発
現促進または抑制治療や生体的生理機能解析の有用な手
段として提供され、解明された情報を基に新規医薬のス
クリーニングにも用いられる。

【００３６】さらにまた、本発明のセリンプロテアー
ゼ、ドメインもしくはその部分ペプチドまたはそれらを
コードするＤＮＡは、上記スクリーニング方法を実施す
る際に用いうる形態でもキットとして提供できる。部分
ペプチドとしては、活性部位のセリン残基の近傍に存在
するペプチド断片および本発明のセリンプロテアーゼま
たはドメインに特異的な抗体の認識部位となり得るペプ
チド断片などの本発明のセリンプロテアーゼに特有の領
域からなるペプチド断片を挙げることができる。なお、
該部分ペプチドの作成は、本発明のセリンプロテアーゼ
またはドメインについて前記した方法またはそれ自体公
知のペプチドの合成法もしくは適当なプロテアーゼによ
る該セリンプロテアーゼまたはドメインの切断により行
なうことができる。

【００３７】また、上記の細胞膜画分は、本発明のセリ
ンプロテアーゼ、ドメインまたはその部分ペプチドをコ
ードするＤＮＡを発現し得る宿主細胞を、発現が可能な
条件下培養し、得られたセリンプロテアーゼ、ドメイン
またはその部分ペプチドを含有する宿主細胞をそれ自体
公知の方法で破砕した後、得られる細胞膜が多く含まれ
る画分のことをいう。

【００３８】本発明のセリンプロテアーゼ、ドメインま
たはその部分ペプチドを用いる生理活性物質のスクリー
ニング方法は、本発明のセリンプロテアーゼ、ドメイン
もしくはその部分ペプチドもしくはそれをコードするＤ
ＮＡまたは該セリンプロテアーゼ、ドメインもしくはそ
の部分ペプチドを含有する宿主細胞もしくはその細胞膜
画分を用いて、被検試料をスクリーニングすることによ
り行なわれる。具体的方法として、本発明のセリンプロ
テアーゼ、ドメインおよびその部分ペプチドの基質、例
えば、発色基質等の合成基質、放射性核種により標識さ
れた基質等、を用いる酵素活性測定法や結合親和性測定
法により行なわれる。

【００３９】なお、セリンプロテアーゼ、ドメインまた
はそれらの部分ペプチドを含有する宿主細胞を用いる場
合、それ自体公知の方法で細胞を固定化（グルタルアル
デヒド、ホルムアルデヒド等で）して用いることができ
る。また、該プロテアーゼ、ドメインまたはそれらの部
分ペプチドをコードするＤＮＡを用いる場合、遺伝子発
現促進または抑制を評価する手法、例えばルシフュラー
ゼ等のレポーター遺伝子を用いて、行うことができる。

【００４０】

【実施例】実施例１．プローブ用新規セリンプロテアーゼモチー
フｃＤＮＡのクローニング（１）セリンプロテアーゼ保存領域を用いたＰＣＲマウス脳ｍＲＮＡの調製は、ＲＴＧ−Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ
ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を用いて添付の文書に従って行った。得られたｍ
ＲＮＡ５μｌ（約６mg）にオリゴｄＴプライマー２μｌ
（１μｇ）を加え、７０℃で１０分間熱した後、氷中で
急冷した。

【００４１】この熱変性ｍＲＮＡに、４μｌの５ｘＦｉ
ｒｓｔｓｔｒａｎｄｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，３７５ｍＭＫＣｌ，１
５ｍＭＭｇＣｌ₂），１μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ，
２μｌの０．１ＭＤＴＴ，ジオチルピロカーボネート
（ＤＥＰＣ）処理した蒸留水および５μｌ（１０００
Ｕ）のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔIIＲＴを加え、３７℃
で１時間反応させた。こうして得られたＦｉｒｓｔｓ
ｔｒａｎｄｃＤＮＡをテンプレートとしてセリンプロ
テアーゼ保存領域を用いたＰＣＲを行なった。

【００４２】プライマーとして、活性残基（Ｈｉｓ）近
傍のアミノ酸保存領域（Ｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−
Ａｌａ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ）を基に配列番号：１
に示すオリゴマーＫＹ１８５（５’−ＧＴＧＣＴＣ
ＡＣＮＧＣＮＧＣＢＣＡＹＴＧ−３’）および
活性残基（Ｓｅｒ）近傍のアミノ酸保存領域（Ｎ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ）を基に配列番号：２に示すオリゴマーＫＹ１８９
（３’−ＣＣＶＣＴＲＡＧＤＣＣＮＣＣＮＧＧ
ＣＧＡ−５）をそれぞれ合成したものを用いた。Ｔａ
ｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社）を用いてＰＣＲを行った後、ＰＣＲ反応液をｐＣＲ
IIベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニ
ングした。

【００４３】（２）スクリーニング用マウス脳ｍＲＮＡ
の単離精製マウス脳ｍＲＮＡの調製は、ＦａｓｔＴｒａｃｋｍ
ＲＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社）を用いて添付の文書に従って行った。すなわ
ち、摘出したマウスの全脳に１５mlのＬｙｓｉｓＢｕ
ｆｆｅｒを加え、テフロンホモジナイザーでただちにホ
モジナイズした。ホモジナイズした組織は、注射筒を用
いて２１ゲージの注射針に３回通したのち、５０mlの遠
心管に入れ、４５℃の水浴中で１時間インキュベーショ
ンした。

【００４４】インキュベーション後、４０００×ｇで５
分間遠心して得られた上清を別の５０mlの遠心管に入
れ、そこに５ＭＮａＣｌ溶液を９５０μｌ加えた後、
再び注射筒を用いて２１ゲージの注射針に３回通した。
次に、この溶液にオリゴ（ｄＴ）セルロースを１錠加
え、２分間膨潤させた後、１時間ゆっくり振動させた。
１時間後、２，０００×ｇで５分間遠心し、上清を吸引
した後、２０mlの結合緩衝液に懸濁後、遠心した沈渣を
さらに１０mlの結合緩衝液で洗浄した。

【００４５】次に、１０mlの低塩濃度洗浄液で３回洗浄
した。最終洗浄後、オリゴ（ｄＴ）セルロースを８００
μｌの低塩濃度洗浄液に懸濁し、スピンカラムに入れ、
５０００×ｇで１０秒間の遠心洗浄を３回繰り返した。
洗浄後、２００μｌの溶離緩衝液を加え、５０００×ｇ
で１０秒間の遠心を２回繰り返すことにより４００μｌ
のｍＲＮＡ溶液を得た。ｍＲＮＡ溶液から常法に従い、
エタノール沈殿によりｍＲＮＡを回収し、２０μｌのＤ
ＥＰＣ処理した蒸留水に溶解した。

【００４６】（３）ｃＤＮＡライブラリーからのスクリ
ーニング〈工程１〉ｃＤＮＡの合成実施例１（２）で得られたｍＲＮＡ５μｌ（約６μｇ）
にオリゴｄＴＮｏｔＩプライマー２μｌ（１μｇ）を
加え、７０℃で１０分間熱した後、氷中で急冷した。こ
の熱変性ｍＲＮＡに、４μｌの５ｘ第一鎖緩衝液（２
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３，３７５ｍＭ
ＫＣｌ，１５ｍＭＭｇＣｌ₂），１μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰ，２μｌの０．１ＭＤＴＴ，ＤＥＰＣ処理
した蒸留水および５μｌ（１０００Ｕ）のＳｕｐｅｒ
ＳｃｒｉｐｔIIＲＴを加え、３７℃で１時間反応させ
た。

【００４７】次に、この反応液に９１μｌのＤＥＰＣ処
理した蒸留水、３０μｌの５ｘ第二鎖緩衝液（１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ６．９，４５０ｍＭＫＣ
ｌ，２３ｍＭＭｇＣｌ₂，０．７５ｍＭ β−ＮＡＤ
＋，５０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄），３μｌの１０ｍＭ
ｄＮＴＰ，１μｌ（１０Ｕ）の大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼ、４μｌ（４０Ｕ）の大腸菌ＤＮＡポリメラー
ゼおよび１μｌ（２Ｕ）の大腸菌ＲＮａｓｅＨを加
え、１６℃で２時間反応後、２μｌ（１０Ｕ）のＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを加え１６℃で５分間反応させ
た。

【００４８】さらに、この溶液に１０μｌの０．５ＭＥ
ＤＴＡを加えて混合した後、１５０μｌのフェノール：
クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：
１）を加え、撹拌後１５，０００rpm で５分間遠心し、
上清を回収した。得られた上清に、１０μｌの５ＭＫ
ＯＡｃ，４００μｌのエタノールを加え撹拌し、１５，
０００rpm で１０分間遠心した。遠心して得られた沈殿
物を５００μｌの７０％エタノールで洗い、軽く風乾
後、２５μｌのＤＥＰＣ処理した蒸留水に溶解した。

【００４９】〈工程２〉ＥｃｏＲＩアダプターの付加前工程で得られた２本鎖ｃＤＮＡ２５μｌに１０μｌの
５×Ｔ４ＤＮＡ連結緩衝液（２５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌｐＨ７．６，５０ｍＭＭｇＣｌ₂，５ｍＭ
ＡＴＰ，５ｍＭＤＴＴ，２５％（ｗ／ｖ），ＰＥＧ８
０００），ＥｃｏＲＩアダプター溶液１０μｌ（１０μ
ｇ）および５μｌ（５Ｕ）のＴ４ＤＮＡｌｉｇａｓ
ｅを加え、１６℃にて１６時間反応後、５０μｌのフェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：
２４：１）を加え、撹拌後１５，０００rpm で５分間遠
心し、上清を回収した。回収した上清に、５μｌの５Ｍ
ＫＯＡｃ，１２５μｌのエタノールを加え撹拌し、−８
０℃，２０分間冷却後、１５，０００rpm で１０分間遠
心した。遠心して得られた沈殿物を２００μｌの７０％
エタノールで洗い、軽く風乾後、４０μｌのＤＥＰＣ処
理した蒸留水に溶解した。

【００５０】〈工程３〉λｇｔ１０とのライゲーショ
ンサイズ分画したｃＤＮＡ溶液３mlにλｇｔ１０（Ｅｃ
ｏＲＩ切断）１μｌ（５０ng）を加え、１１μｌのＤ
ＥＰＣ処理した蒸留水、４μｌの５×Ｔ４ＤＮＡ連
結緩衝液、１μｌの５×Ｔ４ＤＮＡリガーゼを加え
室温で３時間反応させた。フェノール：クロロホルム：
イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を行い、
５μｌ（５μｇ）のｙｅａｓｔｔＲＮＡ，５μｌの５
ＭＫＯＡｃおよび１２５μｌのエタノールを加え撹拌
し、−８０℃２０分間冷却後、１５，０００rpm で１０
分間遠心した。遠心して得られた沈殿物を２００μｌの
７０％エタノールで洗い、軽く風乾後、５μｌのＴＥ
（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０，１ｍＭＥ
ＤＴＡ）に溶解した。

【００５１】〈工程４〉パッケージング工程３で得られたライゲーション後ｃＤＮＡをＧｉｇａ
ｐａｃｋＰａｃｋａｇｉｎｇＥｘｔｒａｃｔｓ（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージングした。す
なわち、０．１μｇ／μｌのライゲーション後ｃＤＮＡ
溶液１μｌにキット添付のＦｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗＥ
ｘｔｒａｃｔ１０μmlを加えた後、さらに、キット添
付のＳｏｎｉｃＥｘｔｒａｃｔ１５μｌを直ちに加
えよく撹拌した。室温で２時間放置後、５００μｌのフ
ァージ希釈緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ，１０ｍＭＭ
ｇＳＯ₄，５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５，
０．０１％ゼラチン）を加え、さらに、２０μｌのク
ロロホルムを加えた。よく混和した後、室温で１５００
０rpm ，５分間遠心した上清を回収し、ファージ液を得
た。常法に従い、このファージ液はクイトレーション
後、ホスト大腸菌に感染させた。

【００５２】〈工程５〉ライブラリーのスクリーニング実施例１（１）で得られたＤＮＡ断片をＢｃａＢｅｓｔ
ＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）
を用いてα−³²ＰｄＣＴＰで標識し、プローブを作製
した。このプローブを用い、前工程で得られた約４０万
クローンのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし
た。その結果、約４０万個のクローンから、挿入ＤＮＡ
断片の最も良いクローンｐＵＣ１８／ｍＢＳＳＰ−３／
１−１を得た。

【００５３】ｐＵＣ１８／ｍＢＳＳＰ−３／１−１のｃ
ＤＮＡの全長は２，５９７塩基対で、２４４塩基対の
５’非翻訳領域、２２８３塩基対の翻訳領域、７０塩基
対の３’非翻訳領域から成り、その翻訳領域はセリンプ
ロテアーゼドメイン（アミノ酸番号：５１７〜７６６）
をコードするばかりでなくクリングルドメイン（アミノ
酸番号：８５〜１５７）ならびにスカベンジャーレセプ
ターシステインリッチドメイン（アミノ酸番号ドメイ
ン１：１６６−２６６、ドメイン２：２７３−３７２、
ドメイン３：３８６〜４８６）を含む新規機能タンパク
質をコードしていることが明らかとなった。ｐＵＣ１８
／ｍＢＳＳＰ−３／１−１のｃＤＮＡの塩基配列および
予想されるアミノ酸配列を図１〜６に示した。

【００５４】実施例２．ｍＢＳＳＰ−３のＮｏｒｔｈ
ｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇによる発現部位の検討マウス脳のｔｏｔａｌＲＮＡは、トリゾル試薬（ライ
フテクノロジー）を用いて添付の文書に従って調製し
た。すなわち、マウスの大脳、脳幹、小脳および延髄を
摘出したのちポリトロンでただちにホモジナイズし、組
織容量の１０倍量（約３ml）のトリゾル試薬を加えるこ
とにより組織を溶解した。さらに、クロロホルム６００
μｌを加えて撹拌し、１５，０００rpm ，４℃で１５分
間遠心した。遠心後、水相を回収し、回収した水相に１
５００μｌのイソプロパノールを加えて撹拌し、１５，
０００rpm ，４℃で３０分間遠心した。

【００５５】得られたマウスの脳の各部位の全ＲＮＡの
沈殿を４００μｌのＤＥＰＣ処理した後、常法に従いメ
ンブランフィルターにブロットした。次に、ｐＵＣ１８
／ｍＢＳＳＰ−３／１−１を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
し、約２．７kbp のＤＮＡ断片を単離・精製し、前述の
方法でα-³²ＰｄＣＴＰで標識することによりプロー
ブを作製した。このプローブを前述のマウス脳各部位か
ら調製したｔｏｔａｌＲＮＡをブロットしたメンブラ
ンフィルターおよび市販の各種臓器から調製したｍＲＮ
Ａをブロットしたメンブランフィルター（クロンテック
社）と５５℃で一晩ハイブリダイズさせた後、それぞれ
のメンブランフィルターを０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳ
ＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ，１５ｍＭＳｏｄｉｕｍ
ｃｉｔｒａｔｅ）で室温、２０分間、続いて、０．１
ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳに替え６５℃，３０分間で２
回洗い、ＢＡＳ２０００用イメージングプレート（富士
写真フィルム）に３０分間露光させた。その結果を図１
３に示した。各臓器の発現では、脳、肺および腎臓で発
現していることが確認された。脳の各部位では、大脳お
よび脳幹で強い発現を認め、また、延髄でも弱い発現を
認めたが、小脳での発現は認められなかった。発現は、
いずれの場合も約２．７kbp の大きさのみであった。

【００５６】実施例３．ヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡ
のクローニングヒト脳ｃＤＮＡライブラリーは、クロンテック社より購
入した。マウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡ断片をグルター
ルアルデヒドを用いて蛍光標識し、プローブを作製し
た。このプローブを用い、約４０万クローンのヒト脳ｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、ｐＵＣ
１８／ｈＢＳＳＰ−３を得た。

【００５７】ｐＵＣ１８／ｈＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡの
翻訳領域は、マウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡと同様にセリ
ンプロテアーゼドメイン（アミノ酸番号：５７８〜８２
２）をコードするばかりでなくクリングルドメイン（ア
ミノ酸番号：４０〜１１２）ならびにスカベンジャーレ
セプターシステインリッチドメイン（アミノ酸番号ドメ
イン１：１１７〜２１７、ドメイン２：２２７〜３２
７、ドメイン３：３３４〜４３３、ドメイン４：４４７
〜５４７）を含む機能タンパク質をコードしていること
が明らかとなった。

【００５８】しかしながら、マウスＢＳＳＰ−３ｃＤ
ＮＡの一次構造から予想されるものとは明らかに異な
り、スカベンジャーレセプターシステインリッチドメイ
ンがマウスＢＳＳＰ−３では３つであるのに対して、ヒ
トＢＳＳＰ−３は４つであることが明らかとなった。ｐ
ＵＣ１８／ｈＢＳＳＰ−３の塩基配列および対応するア
ミノ酸配列を図７〜１２に示す。

【００５９】実施例４．ヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡ
がコードする新規セリンプロテアーゼ成熟タンパク質の
酵素活性の測定（１）発現プラスミドの構築ｐＵＣ１８／ｈＢＳＳＰ−３のＤＮＡ断片とｐｄＫＣＲ
ベクターＤＮＡ断片を常法に従いライゲーションし、大
腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、生じたコロニーをＰＣ
Ｒ法により解析して目的とするセリンプロテアーゼｈＢ
ＳＳＰ−３発現プラスミドｐｄＫＣＲ／ｈＢＳＳＰ−３
を得た。

【００６０】次に、トリプシンIIの開始メチオニンに続
くシグナル配列ならびにエンテロキナーゼ認識配列をコ
ードする遺伝子を増幅し、かつ５’側上流にＥｃｏＲ
Ｉ，３側下流にＢｓｐＭＩ制限酵素認識部位を付加する
ようにプライマーを設計した。これらプライマーを用
い、ｐＣＲ／ＴｒｙｐｓｉｎIIプラスミドをテンプレー
トとしたＰＣＲを行い、その産物を制限酵素（Ｅｃｏ
ＲＩおよびＢｓｐＭＩ）で消化後、約７５bpのＤＮＡ
断片を単離・精製した。同様に、ヒトＢＳＳＰ−３の成
熟タンパク質をコードするＤＮＡの上流にＢｓｐＭＩ
制限酵素認識部位を付加するようにデザインしたプライ
マーを用い、ｐｄＫＣＲ／ｈＢＳＳＰ−３をテンプレー
トとしたＰＣＲを行い、その産物を制限酵素（Ｂｓｐ
ＭＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉ）で消化後、ＤＮＡ断片
を単離・精製した。

【００６１】次に、得られたトリプシンIIのシグナル配
列ならびにエンテロキナーゼ認識配列をコードするＤＮ
Ａ断片とヒトＢＳＳＰ−３の成熟タンパク質をコードす
るＤＮＡ断片を、常法に従い、制限酵素（ＢｓｐＭＩ
およびＢｐｕ１１０２Ｉ）で前消化したｐｄＫＣＲ／
ｈＢＳＳＰ−３ベクターにライゲーションし、大腸菌Ｊ
Ｍ１０９を形質変換させた。形質変換したコロニーのう
ち目的とするキメラＤＮＡを含むコロニーをＰＣＲ法に
より確認し、発現プラスミド（ｐｄＫＣＲ／Ｔｒｐ−ｈ
ＢＳＳＰ−３）を得た。

【００６２】（２）ＣＯＳ−１細胞における発現実施例４（１）で作製したキメラ遺伝子ＤＮＡをリポフ
ェクチン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い
てＣＯＳ−１細胞にトランスフェクションした。すなわ
ち、直径１０cmの培養用ディシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，４
３０１６７）に１０％ウシ胎児血清を含むダルベコの最
少必須培地（ＤＭＥＭ，日水製薬）でＣＯＳ−１細胞を
５×１０⁵細胞植え込んだ。翌日、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培
地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）５mlで細胞
をリンスした後、新しい５mlのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を
加え、３７℃で２時間培養した。

【００６３】培養後、ディシュ１枚あたり、上述のプラ
スミド１μｇおよびリポフェクチン５μｇの混液を加
え、３７℃で５時間培養した。培養後、Ｏｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ培地を５ml加え、合計１０mlとし、３７℃で７２時間
培養した。培養後、遠心操作により培養上清を集め、酵
素活性の測定サンプルとした。また、コントロールとし
て、発現プラスミドｐｄＫＣＲのみをＣＯＳ−１細胞に
トランスフェクションした培養上清も調製した。

【００６４】（３）酵素活性の測定実施例４（１）で得られた培養上清中の酵素活性を測定
した。すなわち、ＣＯＳ−１細胞の培養上清４５μｌに
エンテロキナーゼ（１０mg／ml，ＢｉｏｚｙｍｅＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５μｌを混和し、３７℃で２時
間反応させた。次に、ＤＭＳＯに溶解した合成基質Ｂｏ
ｃ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＭＰＡ（ペプチド研究
所）を０．１ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ８．０で希釈
した０．２Ｍ基質溶液を５０μｌ加え、４℃で１６時間
反応させた。反応後、励起波長４８５nm、蛍光波長５３
５nmにおける蛍光を測定した。その結果、Ｔｒｐ−ｈＢ
ＳＳＰ−３を発現したＣＯＳ−１細胞の培養上清をエン
テロキナーゼ消化した時にのみ、酵素活性を認めた。以
上の結果から、ヒトＢＳＳＰ−３のセリンプロテアーゼ
ドメインは、酵素活性を持つ機能タンパク質であること
が明らかとなった。

【００６５】

【発明の効果】本発明者らは、マウス脳ｃＤＮＡライブ
ラリーから新規セリンプロテアーゼドメインばかりでな
く新規クリングルドメインならびに新規スカベンジャー
レセプターシステインリッチドメインを含む新規機能タ
ンパク質をコードするマウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡを
単離した。単離したマウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡは、
１つのクリングルドメイン、３つのスカベンジャーレセ
プターシステインリッチドメインおよび１つのセリンプ
ロテアーゼドメインをコードしていた。また、単離した
マウスＢＳＳＰ−３ｍＲＮＡの発現部位の検討結果か
ら、本発明者らは、マウスＢＳＳＰ−３ｍＲＮＡが脳
に強く発現していること、脳のうち特に大脳および脳幹
で強く発現していることを明らかにした。

【００６６】次に、マウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡをプ
ローブにして、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからヒトＢ
ＳＳＰ−３ｃＤＮＡを単離することに成功した。その
結果、本発明者らは、ヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡがマ
ウスＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡの一次構造から予想される
ものとは明らかに異なり、１つのクリングルドメイン、
４つのスカベンジャーレセプターシステインリッチドメ
インおよび１つのセリンプロテアーゼドメインをコード
していることを明らかにした。

【００６７】さらに本発明者らは、ヒトＢＳＳＰ−３
ｃＤＮＡのうちセリンプロテアーゼ成熟タンパク質をコ
ードするＤＮＡをＣＯＳ−１細胞で発現したところ、明
らかに酵素活性を持つ機能タンパク質であることを明ら
かにした。本発明における新規機能タンパク質は、一次
構造上複合的な機能を有することが明らかであるばかり
でなく、その複合的な機能を通して脳内の生理機能に一
定の役割を果たしている。したがって、本発明のマウス
ＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡおよびマウスＢＳＳＰ−３ｃ
ＤＮＡがコードしている新規機能タンパク質は、各種マ
ウス疾患モデルの病態解析に有用な手段を提供するもの
である。

【００６８】また、病態解析を通じて得られた疾患治療
のための有用な情報を基に、本発明のヒトＢＳＳＰ−３
ｃＤＮＡおよびヒトＢＳＳＰ−３ｃＤＮＡがコード
している新規機能タンパク質は、各種疾患治療剤をスク
リーニングする手法を提供するものであり、さらに実際
のヒト疾患治療薬の開発に適用することも可能である。
その治療法としては、遺伝子組換え体投与による補充治
療ならびにセンス又はアンチセンス法による遺伝子発現
促進又は抑制治療が挙げられる。

【００６９】さらに、新規機能タンパク質の各ドメイン
構造のそれぞれは、単独で機能することもまた可能であ
る。したがって、各ドメイン構造を個別に発現させた
後、各ドメイン構造と相互作用を示す分子を特定するこ
とができる。また、特定した分子群の疾患への関与を調
べることにより、遺伝子組換え体投与による補充治療な
らびにセンス又はアンチセンス法による遺伝子発現促進
又は抑制治療も可能である。

【００７０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤＮＡ配列 GTGCTCACNG CNGCBCAYTG

【００７１】配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＳｙｎｔｈｅｔｉｃＤＮＡ配列 AGCGGNCCNC CDGARTCVCC

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図２】図２はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図３】図３はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図４】図４はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図５】図５はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図６】図６はマウス・セリンプロテアーゼをコードす
るｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するア
ミノ酸配列を示す。

【図７】図７はヒト・セリンプロテアーゼをコードする
ｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するアミ
ノ酸配列を示す。

【図８】図８はヒト・セリンプロテアーゼをコードする
ｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するアミ
ノ酸配列を示す。

【図９】図９はヒト・セリンプロテアーゼをコードする
ｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応するアミ
ノ酸配列を示す。

【図１０】図１０はヒト・セリンプロテアーゼをコード
するｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応する
アミノ酸配列を示す。

【図１１】図１１はヒト・セリンプロテアーゼをコード
するｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応する
アミノ酸配列を示す。

【図１２】図１２はヒト・セリンプロテアーゼをコード
するｃＤＮＡの塩基配列の一部分、及びそれに対応する
アミノ酸配列を示す。

【図１３】図１３は、マウスの各臓器におけるセリンプ
ロテアーゼ遺伝子の転写を示すNothern blottingの結果
を示す電気泳動図であり、図面代用写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＧ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/566 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】図７〜１２に示すセリンプロテアーゼと
同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換
したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１乃
至複数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を含んで
なるセリンプロテアーゼまたはその部分ペプチド。
【請求項２】図７〜１２に示すアミノ酸番号５７８か
ら８２２までのアミノ酸配列からなるセリンプロテアー
ゼドメインと同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失
もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミ
ノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ
酸配列に１乃至複数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸
配列を含んでなるセリンプロテアーゼドメインまたはそ
の部分ペプチド。
【請求項３】図７〜１２に示すアミノ酸番号４０から
１１２までのアミノ酸配列からなるクリングルドメイン
と同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置
換したアミノ酸配列、あるいは該同一のアミノ酸配列ま
たはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１
乃至複数個のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列を含ん
でなるクリングルドメインまたはその部分ペプチド。
【請求項４】図７〜１２に示すアミノ酸番号１１７か
ら２１７まで、番号２２７から３２７まで、番号３３４
から４３３までまたは番号４４７から５４７までのアミ
ノ酸配列からなるスカベンジャーレセプターシステイン
リッチ（ＳＲＣＲ）ドメインと同一のアミノ酸配列また
はその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、ある
いは該同一のアミノ酸配列またはその一部が欠失もしく
は置換したアミノ酸配列に１乃至複数個のアミノ酸が付
加されたアミノ酸配列を含んでなるＳＲＣＲドメインま
たはその部分ペプチド。
【請求項５】請求項１から４のいずれか１項に記載の
セリンプロテアーゼ、ドメインまたはそれらの部分ペプ
チドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】請求項１から４のいずれか１項に記載の
セリンプロテアーゼ、ドメインまたはそれらの部分ペプ
チドをコードするＤＮＡとストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつ、セリンプロテアーゼ、ドメイ
ンまたはそれらの部分ペプチド活性を有するペプチドを
コードするＤＮＡ。
【請求項７】請求項５または６に記載のＤＮＡを含ん
でなる発現ベクター。
【請求項８】請求項７に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。
【請求項９】請求項８に記載の宿主を培養または飼育
し、セリンプロテアーゼ、ドメインまたはそれらの部分
ペプチドを採取することを特徴とするセリンプロテアー
ゼ、ドメインまたはそれらの部分ペプチドの製造法。
【請求項１０】請求項１から４のいずれか１項に記載
のセリンプロテアーゼ、ドメインまたはそれらの部分ペ
プチドを抗原とする抗体。
【請求項１１】請求項１から４のいずれか１項に記載
のセリンプロテアーゼ、ドメインもしくはそれらの部分
ペプチドまたは請求項５または６に記載のＤＮＡを用い
る生理活性物質のスクリーニング方法。