JP2003189884A - 新規ユビキチン特異プロテアーゼ - Google Patents

新規ユビキチン特異プロテアーゼ

Info

Publication number
JP2003189884A
JP2003189884A JP2002287925A JP2002287925A JP2003189884A JP 2003189884 A JP2003189884 A JP 2003189884A JP 2002287925 A JP2002287925 A JP 2002287925A JP 2002287925 A JP2002287925 A JP 2002287925A JP 2003189884 A JP2003189884 A JP 2003189884A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
ser
leu
polynucleotide
glu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2002287925A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2003189884A5 (ja
Inventor
Hiroshi Yokota
博 横田
Kazunori Sato
一紀 佐藤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to JP2002287925A priority Critical patent/JP2003189884A/ja
Publication of JP2003189884A publication Critical patent/JP2003189884A/ja
Publication of JP2003189884A5 publication Critical patent/JP2003189884A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 (修正有) 【課題】新規USPおよびこれに由来するペプチドまた
はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド
を提供し、遺伝子工学手法による、新規USP由来のペ
プチドまたはポリペプチドの製造法を提供する。 【解決手段】下記の群より選ばれるポリペプチド;特
定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、前記のポ
リペプチドを含有するポリペプチド、前記のポリペ
プチドと少なくとも約70%のアミノ酸配列上の相同性
を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチ
ド、および前記アミノ酸配列において1ないし数個の
アミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異
を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチ
ド。および該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドまたはその相補鎖。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、脱ユビキチン化活性を
有する新規なプロテアーゼ(以下USPと略称すること
もある)に関するものである。さらに詳しくは、新規U
SPのアミノ酸配列の全部または一部を含有するポリペ
プチドまたはペプチド、該ポリペプチドまたはペプチド
をコードするポリヌクレオチドまたはその相補鎖である
ポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換
えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ポ
リペプチドまたはペプチドに対する抗体、該ポリペプチ
ドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物、該
ポリペプチドもしくは該ポリヌクレオチドに作用し脱ユ
ビキチン化活性を阻害または活性化する化合物、これら
の1種以上を含む医薬組成物、該ポリペプチドまたは該
ポリヌクレオチドを検定することからなる診断手段、該
形質転換体または該組換えベクターを使ったポリペプチ
ドまたはペプチドの製造方法、該ポリペプチドまたは該
ポリヌクレオチドと相互作用する化合物のスクリーニン
グ方法に関係する。
【0002】
【従来の技術】ユビキチン(以下Ubと略称することも
ある)は76個のアミノ酸からなるペプチド鎖であり、
そのアミノ酸配列は酵母からヒトまで高度に保存されて
いる。Ubの生体内での役割は様々であり、発癌(非特
許文献1−4)、細胞周期(非特許文献5−7)、ウイ
ルス感染(非特許文献8)および神経変性疾患(非特許
文献9-11)など、多くの生体反応にUbは関与して
いる。
【0003】Ubの最も重要な機能は、26Sプロテア
ソームでの蛋白分解におけるシグナルとしての働きであ
る。ユビキチン活性化酵素(E1)、ユビキチン結合酵
素(E2)およびユビキチンリガーゼ(E3)といった
一連のユビキチン化酵素によって、Ubは標的蛋白質に
イソペプチド結合し、ポリユビキチン鎖を形成する。そ
のポリユビキチン鎖が分解シグナルとなりプロテアソー
ムに認識され、ユビキチン化された蛋白質は分解され
る。
【0004】一方、生体は、蛋白質からUbを解離さ
せ、蛋白質の分解を抑制する機能も備えている。その脱
ユビキチン化反応を担うのが脱ユビキチン化酵素(DU
B)である。DUBは、その構造から大きく2つのファ
ミリーに分類されている(非特許文献12―14)。
【0005】一つはユビキチンC末端ヒドラーゼ(Ub
iquitin C-terminal hydras
e(UCH))と呼ばれ、分子量20kDaから30k
Daのものが多く、異種間で一次構造が保存されてい
る。UCHは主にUbのC末端に低分子が結合している
場合にUbを解離する。
【0006】もう一つはユビキチン特異プロテアーゼ
(Ubiquitin specific prote
ase(USP、UBPあるいはUCHタイプII))
と呼ばれ、その分子量が40kDaから150kDaと
様々であり、アミノ酸配列の共通性が少ない。USPは
その活性ドメインとしてシステインドメイン(Cysb
oxともいう)、ヒスチジンドメイン(His box
ともいう)、およびアスパラギン酸ドメインを持ち、C
ys box内に存在するシステイン(Cys)残基を
活性部位とするシステインプロテアーゼである。USP
はUbのC末端に高分子が結合している場合にUbを解
離する。
【0007】このUSPの生体内での機能は大きく3つ
に分けることができる。1つめは、リボゾーム蛋白融合
ユビキチンやペプチド結合型ポリユビキチン鎖といった
前駆体UbからUbを生成する機能であり、Ub−CE
P52などが関与する。2つめは、イソペプチド結合を
したユビキチン化蛋白からUbを解離する機能であり、
蛋白質のユビキチン化を抑制することにより蛋白質の分
解を抑制する。3つめは、プロテアソームにより分解さ
れた後のイソペプチド結合型ポリユビキチン鎖を解体す
る機能であり、例えばUSP5として知られているイソ
ペプチターゼTがこの機能を有している(非特許文献1
5)。
【0008】UbやUSP等から構成されるユビキチン
システムの機能の一つは、生体内で生じた異常蛋白質の
除去や、転写因子、シグナル伝達因子の分解による量的
調節などであり、USPの機能障害はこのシステムの異
常をきたす。例えば、USP異常と発癌や神経変性疾患
との関連が示唆されている(非特許文献16―18)。
USPは染色体構造の維持にも関与しており、ユビキチ
ン化されたヒストンの脱ユビキチン化が染色体凝集に重
要であることが知られている(非特許文献19)。ま
た、USPファミリーの1つであるUSP16がH2A
を脱ユビキチン化することが報告されている(非特許文
献20)。
【0009】
【非特許文献1】 Honda, R., Tanak
a, H. and Yasuda, H.,「FEB
S Letter.」,1997年,420巻,25頁
【非特許文献2】 Gupta, K., Copel
and, N. G.,Gilbert, D.
J., Jenkins, N. A. andGra
y, D. A.,「Oncogene」,1993
年,8巻,2307頁―
【非特許文献3】 Gray, D. A., Ina
zawa, J., Gupta, K., Won
g, A., Ueda, R. and Takah
ashi, T.,「Oncogene」,1995
年,10巻,2179頁―
【非特許文献4】 Papa, F. R. and
Hochsrasser, M.,「Nature」,
1993年,366巻,313頁―
【非特許文献5】 Hershko, A. and
Ciechanover, A.,「Annu. Re
v. Biochem.」,1998年,67巻,42
5頁―
【非特許文献6】 Zhu, Y., Carrol
l, M., Papa,F. R., Hochst
rasser, M. and D’andrea,
A. D.,「Proc. Natl. Acad.
Sci.」,1996年、93巻,3275頁―
【非特許文献7】 Zhu, Y., Lamber
t, K., Corless, C., Copel
and, N. G., Gilbert, D.
J., Jenkins, N. A. and D’
andrea, A.D.,「J. Biol. Ch
em.」,1997年,272巻,51頁―
【非特許文献8】 Everett, R. D.,
Meredith, M., Orr, A., Cr
oss, A., Kathoria, M.and
Parkinson, J.,「EMBO J.」,1
997年,16巻,1519頁―
【非特許文献9】 Alves−Rodrigues,
A., Gregori, L. and Figu
eiredo−Pereira, ME.,「Tren
ds Neurosci.」,1998年,21巻,5
16頁―
【非特許文献10】 Leroy, E., Boye
r, R., Auburger, G., Leub
e, B., Ulm, G., Mezey,E.,
Harta, G., Brownstein,
M. J., Jonnalagada, S., C
hernova, T., Dehejia, A.,
Lavedan, C., Gasser, T.,
Steinbach, P. J., Wilkin
son, K. D. and Polymeropo
ulos, M. H.,「Nature」,1998
年,395巻,451頁―
【非特許文献11】 Saigoh, K., Wan
g. Y., Suh,J. G., Yamanis
hi, T., Sakai, Y., Kiyosa
wa, H., Harada, T., Ichih
ara, N., Wakana, S., Kiku
chi, T. and Wada,K.,「Natu
re Genet.」,1999年,23巻,47頁―
【非特許文献12】 Chung, C. H., a
nd Beak, S.H.,「Biochem. B
iophys. Res. Commun.」,199
9年,266巻,633頁―
【非特許文献13】 Wilkinson, K.
D.,「FASEB J.」,1997年,11巻,1
245頁―
【非特許文献14】 D’andrea, A. an
d Pellman,D.,「Crit. Rev.
Biochem. Mol. Biol.」,1998
年,33巻,337頁―
【非特許文献15】 Wilkinson, K.
D., Tashayev, V. L., O’Co
nnor, L. B., Larsen, C.
N., Kasperek, E. and Pick
art, C. M.,「Biochemistry」
1995年,34巻,14535頁―
【非特許文献16】 鈴木俊顕、志村秀樹、服部信孝、
「実験医学」,2000年,18巻,1478頁―
【非特許文献17】 鈴木俊顕、「実験医学」,200
1年,19巻,193頁―
【非特許文献18】 阿南正、中尾光善、「蛋白質 核
酸 酵素」1999年,44巻,776頁―
【非特許文献19】 Bradbury, E.
M.,「BioEssays」,1992年,14巻,
9頁―
【非特許文献20】 Cai, S. Y., Bab
bitt, R. W.and Marchesi,
V. T.,「Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A.」,1999年,96巻,
2828頁―
【非特許文献21】 Adamo, A.M., Mo
reno, M.A.,Carrasco, A. a
nd Pasquini, J.M.,「Neuroc
hem.Res.」,1997年,22巻,345頁―
【非特許文献22】 Figueiredo−Pere
ria, M.E.,Yakushin, S. an
d Cohen, G.,「Mol.Biol.Re
p.」,1997年,24巻,35頁―
【非特許文献23】 小原收、長瀬隆弘、野村信夫、
「蛋白質 核酸 酵素」1997年,42巻,2851頁
【非特許文献24】 Baker, R. T., W
ang, Xiao−Wen, Woollatt,
E., White, J. and Sutherl
and G. R.,「Genomics」,1999
年,59巻,264頁―
【非特許文献25】 Gilchrist, C.
A., Gray, D.A. and Baker,
R.T.,「J. Biol. Chem.」,19
97年,272巻,32280頁―
【非特許文献26】 Bachmair, A., F
inley, D. and Varshavsky,
A.,「Science」,1986年,234巻,
179頁―
【0010】
【発明が解決しようとする課題】生体内には多くのUS
Pが存在しており、それぞれ異なる基質特異性や生理機
能を有していると考えられる。従って、USPの異常が
関与する疾患、例えば発癌や神経変性疾患等の解明、な
らびにそれらの予防・治療および診断を可能とする上で
は、数多くの新たなUSPを見出し利用することが必要
である。
【0011】本発明が解決しようとする課題の一つは、
新規なUSPを見いだし、生体内における該USPの制
御を可能にすることである。より具体的には、新規な特
性をもつUSPを提供することであり、それに伴い有用
性がある新規USP由来のポリペプチドまたはペプチ
ド、これらをコードするポリヌクレオチドを提供するこ
とである。また、新規USP由来のポリペプチドまたは
ペプチドに対する抗体を提供することである。さらに新
規USPの脱ユビキチン化活性の阻害剤、拮抗剤あるい
は促進剤等の同定を行うことであり、同定された化合物
を提供することである。またこれらを利用した医薬組成
物や、診断等にも利用できる測定方法を提供することで
ある。さらにまた、上記ポリヌクレオチドを用いて遺伝
子工学手法による新規USP由来のポリペプチドまたは
ペプチドの製造法を提供することである。
【0012】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく本
発明者は、鋭意努力し、新規特性を有するUSP遺伝子
およびその蛋白質を得ることに成功した。より具体的に
は、かずさDNA研究所のヒト脳由来長鎖cDNAライ
ブラリーから選出したKIAA1594を基に、新規な
アミノ酸配列を有するUSPをコードする全長cDNA
を取得し、その配列を決定した。また、当該新規USP
が脱ユビキチン化活性を持ち、その活性発現に重要と考
えられるシステインドメインのシステイン(Cys)残
基をセリン(Ser)残基に置換することにより当該新
規USPの脱ユビキチン化活性が失活することを見出し
た。さらに本発明者は、当該新規USPの脱ユビキチン
化活性に基質選択性があることを見出した。また、本発
明者は、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結
果、本発明を完成するに至った。
【0013】すなわち、本発明は、 1. 下記の群より選ばれるポリペプチド; 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポ
リペプチド、 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポ
リペプチドを含有するポリペプチド、 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポ
リペプチドと少なくとも約70%のアミノ酸配列上の相
同性を有しかつ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチ
ド、および 前記からのいずれか1のポリペプチドにおいて、
1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿
入といった変異を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有す
るポリペプチド、 2. 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列の少な
くとも約5個の連続するアミノ酸配列を有するペプチ
ド、 3. 前項1または前項2に記載のポリペプチドまたは
ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその相補
鎖、 4. 配列表の配列番号2に記載の塩基配列からなるポ
リヌクレオチドまたはその相補鎖、 5. 配列表の配列番号2に記載の塩基配列からなるポ
リヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも約15個
の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチド、 6. 前項3から前項5のいずれかに記載のポリヌクレ
オチドまたはその相補鎖とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、 7. 前項3から前項6のいずれかに記載のポリヌクレ
オチドを含有する組換えベクター、 8. プラスミドpENT−KIAA1594comp
lete(受託番号:FERM BP−7594)、 9. 前項7または前項8に記載の組換えベクターを形
質導入された形質転換体、 10. 前項9に記載の形質転換体を培養する工程を含
む、前項1または前項2に記載のポリペプチドまたはペ
プチドの製造方法、 11. 前項1または前項2に記載のポリペプチドまた
はペプチドを免疫学的に認識する抗体、 12. 脱ユビキチン化活性を抑制する前項11に記載
の抗体、 13. 前項1に記載のポリペプチドと相互作用して脱
ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、お
よび/または前項3または前項4に記載のポリヌクレオ
チドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化
合物のスクリーニング方法であって、前項1または前項
2に記載のポリペプチドまたはペプチド、前項3から前
項6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、前項7
または前項8に記載のベクター、前項9に記載の形質転
換体、前項11または前項12に記載の抗体のうち、少
なくともいずれか1つを用いることを特徴とするスクリ
ーニング方法、 14. 前項13に記載の方法で同定される化合物、 15. 前項1に記載のポリペプチドと相互作用して脱
ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、 16. 前項3または前項4に記載のポリヌクレオチド
と相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化合
物、 17. 前項1または前項2に記載のポリペプチドまた
はペプチド、前項3から前項6のいずれか1項に記載の
ポリヌクレオチド、前項7または前項8に記載のベクタ
ー、前項9に記載の形質転換体、前項11または前項1
2に記載の抗体、前項14から前項16のいずれか1項
に記載の化合物のうち、少なくともいずれか1つを含有
することを特徴とする医薬組成物、 18. 前項1に記載のポリペプチドの発現または脱ユ
ビキチン化活性に関連した疾病の診断のための測定方法
であって、(a)該ポリペプチドをコードしている核酸
および/または(b)試料中の該ポリペプチドをマーカ
ーとして分析することを含む測定方法、 19. 前項1または前項2に記載のポリペプチドまた
はペプチド、前項3から前項6のいずれか1項に記載の
ポリヌクレオチド、または前項11または12に記載の
抗体のうち、少なくとも1つを含んでなる、(a)該ポ
リペプチドまたは蛋白質をコードしている核酸および/
または(b)試料中の該ポリペプチドをマーカーとして
分析することを含む測定方法に使用する試薬キット、 20. 前項1に記載のポリペプチドと相互作用して脱
ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する化合物、お
よび/または前項3または前項4に記載のポリヌクレオ
チドと相互作用してその発現を阻害もしくは促進する化
合物のスクリーニング方法であって、前項1または前項
2に記載のポリペプチドまたはペプチド、前項3から前
項6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド、前項7
または前項8に記載のベクター、前項9に記載の形質転
換体、前項11または前項12に記載の抗体のうち、少
なくともいずれか1つを用いることを特徴とするスクリ
ーニング方法で得られる化合物を含有する神経変性疾患
の防止および/または治療剤、 21. 前項1または前項2に記載のポリペプチドまた
はペプチド、前項3から前項6のいずれか1項に記載の
ポリヌクレオチド、前項7または前項8に記載のベクタ
ー、前項9に記載の形質転換体、前項11または前項1
2に記載の抗体、前項14から前項16のいずれか1項
に記載の化合物のうち、少なくともいずれか1つを含有
することを特徴とする神経変性疾患の防止および/また
は治療剤、 22. 前項20または前項21に記載の神経変性疾患
が、アルツハイマー病および/またはパーキンソン病で
ある神経変性疾患の防止および/または治療剤、からな
る。
【0014】
【発明の実施の形態】(新規USP)本発明において提
供される新規USPは、かずさDNA研究所のヒト脳由
来長鎖cDNAライブラリーからバイオインフォマティ
クス(bioinformatics)により選出した
KIAA1594をもとに、その全長cDNA配列を決
定し得た遺伝子(KIAA1594由来遺伝子)がコー
ドするポリペプチドである。
【0015】新規USPは、配列番号1に示した979
個のアミノ酸配列を有し、プロテアーゼモチーフ検索か
ら、少なくともUSPのモチーフ配列であるシステイン
ドメインとヒスチジンドメインを有している。また、当
該新規USPをコードするKIAA1594由来遺伝子
(KIAA1594complete)は、配列番号2
に示した2940個の塩基配列からなる。
【0016】本発明者は、当該新規USPが脳で発現し
ていることを見出すとともに、当該遺伝子を大腸菌で発
現させて得られた当該新規USPが脱ユビキチン化酵素
活性を有していることを見出した。すなわち、ユビキチ
ンと結合したグルタチオンS−トランスフェラーゼ(G
ST)から当該新規USPがユビキチンを解離させるこ
とを見出した。また、当該新規USPのシステインドメ
イン内のCysをSerに置換することにより、脱ユビ
キチン化酵素活性が失活することを見出した。さらに、
GSTのN末端(ヒトユビキチンとGSTとが結合して
いるアミノ酸残基)を後述の各種アミノ酸残基に置換し
たヒトユビキチン融合蛋白質(Ub−X−GST、Xは
各種アミノ酸残基を示す)を基質として脱ユビキチン化
酵素活性を検討した結果、実施例に示す当該新規USP
の基質選択性を見出した。
【0017】(ポリペプチドまたはペプチド)本発明に
係るポリペプチドの1態様は、新規USP遺伝子(KI
AA1594complete)の遺伝子産物であり、
配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリ
ペプチドである。ここで、ポリペプチドとは、ペプチド
結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合し
ている2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のペプ
チドのうち、蛋白質等の長鎖ペプチドを意味し、オリゴ
ペプチドもしくはオリゴマーとも称する短鎖ペプチドを
単にペプチドという。
【0018】また、本発明に係るポリペプチドの別の1
態様は、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列から
なるポリペプチドを含有するポリペプチドである。
【0019】さらに、本発明に係るポリペプチドの別の
1態様は、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列か
らなるポリペプチドと、アミノ酸配列上で約40%以
上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%
以上、さらに好ましくは約90%、特に好ましくは約9
5%以上の相同性を有するポリペプチドである。この相
同性をもつポリペプチドの脱ユビキチン化活性は、例え
ば後述の実施例に示す方法により、具体的には、ヒトユ
ビキチンのC末端にグルタチオンS−トランスフェラー
ゼ(GST)を付加したものを基質として、該基質から
ユビキチンを解離させうるか否かを抗GST抗体により
イムノブロッティング法等の公知の方法で検出して、測
定することができる。また、アミノ酸配列の相同性を決
定する技術は、自体公知であり、例えばアミノ酸配列を
直接決定する方法、cDNAのヌクレオチド配列を決定
後、これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等
が可能である。
【0020】さらに、上記ポリペプチドを基にして脱ユ
ビキチン化活性の存在を指標とすることにより、1以
上、例えば1〜100個、好ましくは1〜30個、より
好ましくは1〜20個、さらに好ましくは1〜10個で
特に好ましくは1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、
付加あるいは挿入といった変異を有するアミノ酸配列か
らなるポリペプチドまたはペプチドも提供される。変異
を有するポリペプチドまたはペプチドは天然に存在する
ものであってもよく、また変異を導入したものであって
もよい。欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を
導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変
異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法また
はポリメラーゼ連鎖増幅法(PCR)を、単独または適
宜組み合わせて、例えばサムブルック等編[モレキュラ
ークローニング,ア ラボラトリーマニュアル 第2
版]コールドスプリングハーバーラボラトリー,198
9(非特許文献27)、村松正實編[ラボマニュアル遺
伝子工学]丸善株式会社,1988(非特許文献2
8)、エールリッヒ,HE.編[PCRテクノロジー,
DNA増幅の原理と応用]ストックトンプレス,198
9(非特許文献29)等の成書に記載の方法に準じて、
あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、
例えばUlmerの技術(Science,219,6
66,1983(非特許文献30))を利用することが
できる。
【0021】上記のような変異の導入において、当該蛋
白質の基本的な性質(物性、活性、または免疫学的活性
等)を変化させないという観点からは、例えば、同族ア
ミノ酸(極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ
酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミ
ノ酸、芳香族アミノ酸等)の間での相互置換は容易に想
定される。さらに、これらのポリペプチドは、その構成
アミノ基やカルボキシル基等を修飾するなど、機能の著
しい変更を伴わない程度に改変が可能である。
【0022】本発明に係るポリペプチドまたはペプチド
は、配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる
ポリペプチドの部分配列を有するポリペプチドまたはペ
プチドを包含し、これらは例えば試薬・標準物質・免疫
原として利用できる。その最小単位としては5個以上の
アミノ酸、好ましくは8個以上のアミノ酸、より好まし
くは10個以上、さらに好ましくは15個以上の連続す
るアミノ酸で構成されるアミノ酸配列からなり、好まし
くは免疫学的に同定しうるポリペプチドまたはペプチド
も本発明の対象とする。これらのペプチドは、試薬もし
くは標準物質、または後述するように新規USPに特異
的な抗体を作製するための抗原として単独またはキャリ
アと結合して使用できる。
【0023】本発明の範囲には、上記のようにキャリア
等の別種の蛋白質または物質を結合したものも包含され
る。例えば、本発明に係るポリペプチド等の検出もしく
は精製を容易にするために、または別の機能を付加する
ために、そのN末端側やC末端側に別の蛋白質、例えば
アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ig
G等の免疫グロブリンFc断片またはFLAG−tag
等のペプチドを直接またはリンカーペプチド等を介して
間接的に遺伝子工学的手法等の公知の方法を用いて付加
することもできる。
【0024】本発明においては、配列表の配列番号1に
記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドが有する生理
活性と同様の活性を有するポリペプチドまたはその最小
活性単位(領域もしくはドメイン)も提供されるが、そ
れら以外にも、活性の強度または基質特異性を変更した
ポリペプチドも提供される。これらは、例えば配列表の
配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
様物質もしくは該ポリペプチドの拮抗物質として、また
は該ポリペプチドの生理活性を調節する物質のスクリー
ニング等に使用する試薬として有用である。なお、ヒト
以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包
含される。
【0025】(ポリヌクレオチド)本発明に係るポリヌ
クレオチドは、上記ポリペプチドまたはペプチドのアミ
ノ酸配列、例えば配列表の配列番号1に記載のアミノ酸
配列をコードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖で
ある。好ましくは、配列番号2に記載の塩基配列からな
るポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドに対する
相補鎖である。これらは例えば上記新規USPの製造に
有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸
に関する試薬・標準品としても利用できる。
【0026】さらに本発明は、上記ポリペプチドまたは
ペプチドのアミノ酸配列、例えば配列表の配列番号1に
記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、好
ましくは配列表の配列番号2の塩基配列からなるポリヌ
クレオチドまたはその相補鎖の対応する領域にストリン
ジェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌ
クレオチドを提供する。ハイブリダイゼーションの条件
は、例えばサムブルック等編[モレキュラークローニン
グ,ア ラボラトリーマニュアル 第2版]コールドス
プリングハーバーラボラトリー,1989(非特許文献
27)等に従うことができる。これらのポリヌクレオチ
ドは目的のポリヌクレオチド、特に配列表の配列番号2
に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはその
相補鎖にハイブリダイゼーションするものであれば必ず
しも相補的配列でなくとも良い。例えば、配列表の配列
番号2に記載の塩基配列からなるポリペプチドまたはそ
の相補鎖に対する相同性において、少なくとも約40
%、例えば、約70%以上、好ましくは約80%以上、
より好ましくは約90%以上、さらに好ましくは約95
%以上であればよい。また本発明に係るポリヌクレオチ
ドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基の領域に
対応する連続する10個以上のヌクレオチド、好ましく
は15個以上、より好ましくは20個以上の配列からな
るポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび該相補
鎖を包含する。
【0027】これらのポリヌクレオチドは、本発明に係
るポリペプチド等の製造においても、新規USPをコー
ドする核酸、例えばその遺伝子もしくはmRNAの検出
のためのプローブもしくはプライマーとしても、または
遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレ
オチド等としても有用である。その意味で、本発明に係
るポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは翻訳領
域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。
ここで、新規USPまたは該USPと同様の活性を有す
るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの選別
は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の
確認を行い、その生理活性特に脱ユビキチン化活性を指
標にして行うことができる。蛋白質発現に無細胞蛋白質
発現系を利用する場合は、例えば胚芽、家兎網状赤血球
等由来のリボソーム系の技術を利用できる(Natur
e、179、160〜161、1957(非特許文献3
1))。
【0028】(組換えベクター)上記ポリヌクレオチド
を適当なベクターに組み込むことにより、組換えベクタ
ーを得ることができる。ベクターは、用いる宿主の種類
により選択され、発現目的の遺伝子と複製や制御に関す
る情報を担持した遺伝子、例えば、プロモーター、リボ
ソーム結合部位、ターミネーター、シグナル配列、エン
ハンサー、マーカー配列等を構成要素とし、これらを自
体公知の方法によって組み合わせて作製される。前記ベ
クターに本発明に係るポリヌクレオチド等を組み込む方
法は、自体公知の方法を適用し得る。なお、マーカー配
列としては、ヘキサ−ヒスチジンペプチドまたはHAタ
グが好適に例示される。
【0029】ベクターには、染色体、エピソームおよび
ウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、
バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エ
ピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメ
ント由来、例えばバキュロウイルス、パポバウイルス、
例えばSV40、ワクシニアウイルス、アデノウイル
ス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウ
イルス等のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを
組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよびバクテ
リオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例
えばコスミドおよびファージミド等がある。
【0030】本発明の具体例として、後述する実施例中
に示したプラスミドpENT−KIAA1594com
pleteが挙げられ、本プラスミドは、独立行政法人
産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号:
FERM BP−7594として平成13年5月17日
付けで寄託されている。なお、プラスミドpENT−K
IAA1594completeのコンストラクトを図
5に示した。
【0031】(形質転換体)上記組換えベクターを用い
て形質導入を行い、形質転換体を得ることができる。
【0032】形質転換は、自体公知の手段が応用され、
例えばレプリコンとして、プラスミド、染色体、ウイル
ス等を利用して宿主の形質転換が行われる。より好まし
い系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば、染色
体内へのインテグレート法であるが、簡便には核外遺伝
子を利用した自律複製系の利用である。
【0033】本発明は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細
胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換
え技術によっても、本発明に係る新規USPおよびその
由来物からなるペプチドおよびポリペプチドは提供可能
である。本発明の具体例においては、大腸菌を利用した
が、無論これに限定されるものではない。
【0034】形質転換体は、自体公知の各々の宿主の培
養条件に最適な条件を選択して培養される。培養は、発
現産生される新規USPおよびその由来物からなるペプ
チドおよびポリペプチドの酵素活性特に脱ユビキチン化
活性をマーカーにして行ってもよいが、培地中の形質転
換体量を指標にして継代培養またはバッチによって、生
産してもよい。
【0035】(新規USPおよびその由来物回収)培地
からの新規USPおよびその由来物からなるペプチドお
よびポリペプチドの回収は、脱ユビキチン化活性を指標
にして、分子篩、イオンカラムクロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等を組み合わせるか、
溶解度差にもとづく硫安、アルコール等の分画手段によ
り精製回収できる。好ましくは、アミノ酸配列の情報に
基づき、該アミノ酸配列に対する抗体を作成し、ポリク
ローナル抗体またはモノクロ−ナル抗体によって、特異
的に吸着回収する方法を用いる。
【0036】(抗体)抗体は、本発明に係る新規USP
およびその由来物からなるペプチドまたはポリペプチド
の抗原決定基を選別し、作製する。抗原は新規USPま
たはその断片でもよく、少なくとも8個、好ましくは少
なくとも10個、より好ましくは少なくとも12個、さ
らに好ましくは15個以上のアミノ酸で構成される。新
規USPに特異的な抗体を作製するためには、USPフ
ァミリーの保存領域以外の新規USPに固有なアミノ酸
配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域の
アミノ酸配列は、必ずしも配列表の配列番号1に記載の
ものと相同である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外
部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が
一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連
続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に新
規USPおよびその由来物からなるペプチドまたはポリ
ペプチドを結合または認識する限り特に限定されない。
この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応
によって決定される。
【0037】抗体を産生するためには、本発明に係る新
規USPおよびその由来物からなるペプチドまたはポリ
ペプチドを、アジュバントの存在または非存在下で、単
独または担体に結合して、動物に対して体液性応答およ
び/または細胞性応答等の免疫誘導を行うことによって
行われる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用を
おこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、重
合アミノ酸、アルブミン等が例示される。免疫される動
物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に
用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の血清か
らの抗体回収法によって取得される。好ましい手段とし
ては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法であ
る。
【0038】モノクロ−ナル抗体を生産するためには、
上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞(例え
ば、脾臓またはリンパ節由来)を回収し、自体公知の永
久増殖性細胞(例えば、P3X63Ag8株等のミエロ
ーマ株)への形質転換手段を導入することによって行わ
れる。例えば、該抗体産生細胞と永久増殖性細胞とのハ
イブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規USP
を特異的に認識する抗体を選別し、該ハイブリドーマの
培養液から抗体を回収する。
【0039】本発明に係る新規USPの活性を抑制し得
るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、直
接本発明に係る新規USPに結合し、脱ユビキチン化活
性を制御可能である。そのため、当該新規USPが関連
する各種疾患の治療・予防のために有用である。
【0040】さらにこれらの抗体は、本発明に係る新規
USPおよびその由来物であるポリペプチドまたはペプ
チドの精製用抗体、試薬、または標識マーカー等として
利用できる。
【0041】(同定・スクリーニング)かくして調製さ
れた新規USPおよびその由来物からなるペプチドまた
はポリペプチド、これらをコードするポリヌクレオチド
およびその相補鎖、これらのアミノ酸配列および塩基配
列の情報に基づき形質転換させた細胞、またはこれらを
用いる蛋白質合成系ならびに新規USPおよびその由来
物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学的に認
識する抗体は、単独または複数手段を組み合わせること
によって、新規USPおよびその由来物からなるペプチ
ドおよびポリペプチドに対する活性阻害剤または活性促
進剤の同定・スクリーニングに有効な手段を提供する。
例えば、ペプチドまたはポリペプチドの立体構造に基づ
くドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系
を利用した遺伝子レベルでの発現調整剤の選別、抗体を
利用した抗体認識物質の選別等が、自体公知の医薬品ス
クリーニングシステムにおいて、利用可能である。
【0042】また、本発明に係る新規USPおよびその
由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを用いて、
スクリーニングされる化合物とこれらペプチドまたはポ
リペプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選別
し、この相互作用の有無を検出することのできるシグナ
ル(マーカー)を使用する系を導入し、このシグナル
(マーカー)の存在・不存在を検出することにより、本
発明に係る新規USPおよびその由来物からなるペプチ
ドおよびポリペプチドの活性、例えば脱ユビキチン化活
性を活性化または阻害する化合物を同定可能である。
【0043】(化合物、医薬組成物)上記手段により同
定された化合物は、新規USPおよびその由来物からな
るペプチドおよびポリペプチドの活性、例えば脱ユビキ
チン化活性の阻害剤、拮抗剤、または活性化剤の候補化
合物として、利用可能である。また、遺伝子レベルでの
新規USPおよびその由来物の系に対する発現阻害剤、
発現拮抗剤、発現促進剤の候補化合物としても利用可能
である。その効果は、当該新規USPの発現や活性の増
加、減少または欠失等が関連する各種病的症状の防止お
よび/または治療を期待できる。後述するように、神経
変性疾患との係わりが重要であることから、同疾患の防
止および/または予防・治療剤となる。かくして選別さ
れた候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを
考慮して選別することによって、医薬組成物として調製
可能である。
【0044】また本発明に係る新規USPおよびその由
来物からなるペプチドまたはポリペプチド、これらをコ
ードするポリヌクレオチドおよびその相補鎖、これらの
塩基配列を含むベクター、ならびに新規USPおよびそ
の由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学
的に認識する抗体は、それ自体が、診断マーカーや試薬
等の疾病診断手段として、または新規USPの活性の阻
害、拮抗、もしくは促進等の機能を利用して治療薬等の
医薬手段として使用し得る。なお、製剤化にあたって
は、自体公知のペプチドまたはポリペプチド、蛋白質、
ポリヌクレオチド、抗体等各対象に応じた製剤化手段を
導入すればよい。
【0045】本発明に係る新規USPの発現およびその
活性の減少や欠失等に関連する異常な症状の治療には、
1つの方法として当該USP自体あるいはUSPをコー
ドする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物(促進
剤)を医薬上許容される担体とともに投与し、そのこと
により異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙
げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細
胞内で当該USPを生成させてもよい。上記ポリヌクレ
オチドを利用した遺伝子治療は、公知の方法が利用でき
るが、例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオ
チドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作
製して遺伝子治療に利用すればよい。また、遺伝子治療
において、治療に使用する蛋白質を対象中において生成
させることもできる。例えば、蛋白質をコードしている
DNAまたはRNAを用いて、例えばレトロウイルスプ
ラスミドベクターを用いることによりエクスビボ(ex v
ivo)において対象由来の細胞を処理し、次いで、細胞
を対象に導入することもできる。
【0046】本発明に係る新規USPの発現およびその
活性が過剰な場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上
許容される担体とともに対象に投与して、当該USPの
活性を阻害し、そのことにより異常な症状を改善するこ
ともできる。さらに、発現ブロック法を用いて内在性の
上記USPをコードしている遺伝子の発現を阻害しても
よい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された
当該遺伝子のアンチセンス配列を使用して当該遺伝子の
発現を阻害できる。これらのオリゴヌクレオチドは、上
記本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成
できる。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与するこ
とができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現さ
せることもできる。
【0047】USPの発現や活性の増加、減少もしくは
欠失等の機能障害はUSPが係るユビキチンシステムの
異常をきたし、病的症状を引き起こす。例えば、USP
の異常と発癌や神経変性疾患との関わりが示唆されてい
る。
【0048】アルツハイマー病やパーキンソン病で観察
されるタウ蛋白やα―synucleinのような蛋白
凝集体が抗ユビキチン抗体に反応すること(非特許文献
16)や、酸化ストレスで海馬や小脳顆粒細胞層におい
てユビキチン遺伝子の発現が増加すること(非特許文献
21)、インビトロ系において酸化ストレスによりユビ
キチン化蛋白質が神経細胞内に蓄積すること(非特許文
献22)が報告されている。
【0049】神経変性疾患の原因の1つが異常蛋白質の
蓄積による神経細胞死であると考えると、酸化ストレス
によって生じた異常蛋白質は、同じく酸化ストレスによ
って活性化されたユビキチンシステムにより速やかに除
去され、細胞死を防いでいると考えられる。アルツハイ
マー病、パーキンソン病、ハンチントン病などは脳内に
代謝不可能な不溶性蛋白質が蓄積する点で共通してお
り、生体内で分解されるべき蛋白質の処理ができなくな
り、凝集体を形成、生体内恒常性が乱され、神経変性に
至ると本発明者は考えている。
【0050】従って、本発明は、USPの関与する生体
機能の解明、例えば、発癌プロセスの解明、神経変性疾
患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解
明、ならびにそれらの予防および/または治療剤の開
発、およびそれらの診断手段として用いる測定方法の開
発を可能とする上で非常に有用なものである。
【0051】投与形態は、全身投与であっても局所投与
であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、
例えば静脈内注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹
腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与
の別の態様は、腸溶処方、またはカプセル処方がうまく
処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆
汁酸塩、フンジン酸、または他の界面活性剤のような浸
透剤を用いる経粘膜または経皮投与を用いることもでき
る。局所的な投与のときは、膏薬、パスタ、ゲル等の形
態を利用できる。
【0052】必要な用量範囲は、本発明に係るUSPお
よびその由来物からなるポリペプチドまたはペプチド、
これらをコードするポリヌクレオチドまたはその相補
鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクタ
ー、新規USPおよびその由来物からなるポリペプチド
またはペプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合
物、および上記医薬組成物の有効性、投与経路、処方の
性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断によ
る。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重の1
kgあたり0.1及至100μgの範囲である。しかし
ながら、当該分野においてよく知られた最適化のための
一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行な
う事ができる。
【0053】製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋
白質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、抗体、
化合物等各対象に応じた公知の製剤化手段を導入すれば
よい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル
製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リポソーム製
剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体等の製剤
化方法が利用できる。
【0054】散剤、丸剤、錠剤およびカプセル製剤は、
ラクトース、グルコース、シュークロース、マンニトー
ル等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、マ
グネシウムステアレート、タルク等の滑沢剤、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチ
ン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセ
リン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセル
を製造するには、固体の製薬担体が用いられる。
【0055】懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビト
ール、フラクトース等の糖類、PEG等のグリコール
類、油類を使用して製造できる。
【0056】注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶
液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体
を用いて調製可能である。
【0057】リポソーム化は、例えばリン脂質を有機溶
媒(クロロホルム等)に溶解した溶液に、当該物質を溶
媒(エタノール等)に溶解した溶液を加えて後、溶媒を
留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処
理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収する
ことにより行い得る。
【0058】脂肪乳化剤は、例えば、当該物質、油成分
(大豆油、ごま油、オリーブ油等の植物油、MCT
等)、乳化剤(リン脂質等)を混合、加熱して溶液とし
た後に、必要量の水を加え、乳化機(ホモジナイザー、
例えば高圧噴射型や超音波型等)を用いて、乳化・均質
化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化すること
も可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を
添加してもよく、乳化助剤としては、例えば、グリセリ
ンや糖類(例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等)が
例示される。
【0059】シクロデキストリン包接化は、例えば、当
該物質を溶媒(エタノール等)に溶解した溶液に、シク
ロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、
冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することによ
り行い得る。この際、使用されるシクロデキストリン
は、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシク
ロデキストリン(アルファ、ベータ、ガンマ型)を適宜
選択すればよい。
【0060】(診断のための測定方法および試薬)本発
明に係る新規なUSPおよびその由来物からなるペプチ
ドまたはポリペプチド、これらをコードするポリヌクレ
オチドおよびその相補鎖、ならびに当該USPおよびそ
の由来物からなるペプチドまたはポリペプチドを免疫学
的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカー
や試薬等として使用可能である。また本発明は、これら
のうちの1種またはそれ以上を充填した、1個またはそ
れ以上の容器を含んでなる試薬キットも提供する。な
お、製剤化にあたっては、自体公知のペプチドまたはポ
リペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、または抗体等
それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【0061】本発明に係る新規USPおよびその由来物
からなるペプチドまたはポリペプチドの発現または活性
に関連した疾患の診断手段は、例えば当該USPをコー
ドしている核酸との相互作用や反応性を利用して、相応
する核酸の存在量を決定すること、および/または当該
USPについて個体中の生体内分布を決定すること、お
よび/または当該USPの存在、個体由来の試料中の存
在量を決定することによって行われる。詳しくは、新規
USPを診断マーカーとして検定するのである。試料中
の当該USPの検出またはその存在量の決定に用いるこ
とができる測定法は当業者に周知である。このような測
定法には、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、
ウェスタンブロット分析およびELISAアッセイ等が
ある。また、本発明に係る新規USPをコードするポリ
ヌクレオチドの検出法および定量法としては、例えば増
幅、PCR、RTPCR、RNアーゼ保護、ノーザンブ
ロッティングおよびその他のハイブリダイゼーション法
を用いてRNAレベルで測定することができる。
【0062】測定される試料として、個体由来の細胞、
例えば血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料
等を挙げることができる。また、測定される核酸は、上
記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核
酸は、ゲノムDNAを検出に直接使用してもよく、ある
いは分析前にPCRもしくはその他の増幅法を用いるこ
とにより酵素的に増幅してもよい。RNAまたはcDN
Aを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較におい
て、増幅生成物のサイズ変化により欠失および挿入を検
出することができる。増幅DNAを標識した上記USP
をコードするDNAにハイブリダイゼーションさせるこ
とにより点突然変異を同定することができる。
【0063】上記測定により本発明に係るUSPおよび
該USPをコードするDNAの変異、減少、増加を検出
することにより、当該USPが関連する疾患、例えば、
癌あるいは神経変性疾患等、特にアルツハイマー病やパ
ーキンソン病等の診断が可能となる。
【0064】以下、本発明を実施例に基づき具体的に説
明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【0065】
【実施例】(実施例1)KIAA1594のヒト脳での
発現確認とORF(オープンリーディングフレーム)全長
構築 かずさDNA研究所より提供されたKIAA1594ク
ローン(pBluesscript II SK(+)
のSalI、NotIサイトにcDNAが挿入されたも
の)が、ヒトの脳のmRNAに存在するかどうかを見出
すため、KIAA1594を5’側から3つの領域(1
594−1、1594−2、1594−3)に分け、そ
れぞれに下記のプライマー(primer)を設計し
た。
【0066】なお、本明細書中で、(s)はセンスプライ
マーを、(a)はアンチセンスプライマーを意味する。
【0067】1594−1領域(840bp) プライマー: 1594(s)1(配列番号3):5'-TGTGGTGC
TTCGACCCAGTG-3' 1594(a)1(配列番号4):5'-CAGTTGCT
GCTGTTGGTGAGAG-3' 1594−2領域(1170bp) プライマー: 1594(s)2(配列番号5):5'-TCTTCCTC
AGCCAGTTCCTCTT-3' 1594(a)2(配列番号6):5'-TTCAGACT
TGTCAGGCTCTATTG-3' 1594−3領域(980bp) プライマー:配列表の配列番号7および配列番号8 1594(s)3(配列番号7):5'-GTGAAATG
TTAGGCAACGAACAGC-3' 1594(a)3(配列番号8):5'-TATGCAGT
GCATGCTGCCAAC-3'
【0068】ヒト脳由来poly(+)RNA(CLO
NTECH)をテンプレートとしてRNA PCR K
it(Takara)を用いて逆転写反応を行い、cD
NAを調製した。上記プライマーを用い、本cDNAを
テンプレートとしてPCR反応(Advantage
2 PCR kit,Advantage HF2PC
R kit:CLONTECH)を行い、サイズを確認
した後、各フラグメントをTAクローニング(Orig
inal TA Cloning Kit:Invit
rogen)し、配列確認を行った(Gene Rap
id:amersham pharmacia bio
tech,Long-Read TOWER:amer
sham pharmacia biotech,AB
I PRISM 310 Genetic Analy
ser:Applied Biosystems)。
【0069】さらにKIAA1594は、ORFの5’
末端側が欠けていると予想されたため、5’末端配列の
獲得を試みた。
【0070】上記のように調製したcDNAをテンプレ
ートとし、KIAA1594の5’側領域に下記のアン
チセンスプライマー(1594−race1:HpaI
サイトより下流域)を設計し、5’−race法(SM
ART RACE cDNAAmplificatio
n Kit:CLONTECH)により5’側配列を獲
得し、配列決定を行った。
【0071】プライマー: 1594−race1(配列番号9):5'-GTCAA
TAGACAAGAAGCTGTTATCTTGCAG
AG-3' 次にORF全長を構築した。
【0072】上記5’−race法で得たORF 5’
末端部位を含むプラスミドをテンプレートに、得られた
配列を元に設計した下記プライマー(1594−5't
erm)と上記プライマー(1594−race1)を用
いて、KIAA1594の欠損部分をPCR反応で増幅
した。
【0073】プライマー: 1594−5'term(配列番号10):5'-ACGC
GTCGACCATGTCTCCTCTGAAGATA
CATGGT-3'
【0074】増幅したORF 5’末端側遺伝子断片の
PCRプロダクトをHpaI、SalIで処理し、Hp
aI及びSalIで処理したKIAA1594クローン
(7.4kb)にライゲーション反応を行い、コンピテ
ントセル(Max Efficiency DH5α
Competent Cells:Invitroge
n)にトランスフォーメーションした。コロニーPCR
によりプラスミドインサートを確認し、KIAA159
4由来遺伝子のORF全長(遺伝子名:KIAA159
4complete、プラスミド名:pBS−KIAA
1594complete)を得た。
【0075】配列を決定したところ、かずさDNA研究
所のKIAA1594よりさらに上流に142bpが存
在し、ORF全長で2940bpであった。また、本遺
伝子(KIAA1594complete)産物は、9
79アミノ酸からなり、推定分子量110kDaである
ことを見出した。
【0076】(実施例2)KIAA1594compl
eteの発現系の構築 発現ベクターおよび大腸菌での発現系の構築にはGat
eway cloning Technology(I
nvitrogen)を用いた。
【0077】実施例1で調製した全長ORFを含むプラ
スミドpBS−KIAA1594completeをテ
ンプレートとして以下のプライマーを用いPCR反応を
行い、ORF領域を増幅した。得られたPCR産物をB
P Clonase Enzymeによる組換え反応に
よりエントリーベクター(pDONR201 Vect
or)に導入し、コンピテントセル(Library
EfficiencyDH5α Cells:Invi
trogen)にトランスフォーメーションした。
【0078】プライマー: 1594(s)ex(配列番号11):5'-GGGACAA
GTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAGA
AGGAGATAGAACCATGTCTCCTCTG
AAGATACATGG-3' 1594(a)ex(配列番号12):5'-GGGACCA
CTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA
GTGATGGTGATGGTGATGCGAGGCC
TGACGGGTAGT-3' コロニーPCRでORF領域が挿入されていることを確
認し、エントリークローンプラスミドpENT−KIA
A1594completeを抽出した(Wizard
Plus SV Minipreps DNA Pu
rification System:Promeg
a)。
【0079】得られたプラスミドpENT−KIAA1
594completeの配列確認を行い、PCRによ
るエラー及びコドンフレームのずれがないことを確認し
た。なお、本プラスミドは独立行政法人産業技術総合研
究所特許生物寄託センターに寄託してある(受託番号:
FERM BP−7594)。また、プラスミドpEN
T−KIAA1594completeのコンストラク
トを図5に示した。
【0080】さらに、pENT−KIAA1594co
mpleteをLR Clonase Enzymeに
より発現ベクター(pDEST14 Vector)へ
組換えた(pDEST−KIAA1594comple
te)。これをNaCl添加により発現誘導が可能なコ
ンピテントセル(BL21−SI:Invitroge
n)にトランスフォーメーションし、KIAA1594
completeのORF全長を含む組換え大腸菌を得
た。
【0081】(実施例3)KIAA1594compl
eteの変異体の作製 活性に重要と予想されるCys box内のアミノ酸残
基Cys(アミノ酸配列上で350番目)をSerに変
えた変異体(KIAA1594completeC35
0S)の作製を行った。
【0082】変異の導入は、実施例2で調製したpEN
T−KIAA1594completeをテンプレート
とし、QuikChange Site−Direct
edMutagenesis Kit(STRATAG
ENE)を用いて行った。変異の導入に用いたプライマ
ーは以下のように設計した。
【0083】プライマー: 1594(s)C350S(配列番号13):5'-TTT
GGGAAATACCTCCTAATAGAATGCT
A-3' 1594(a)C350S(配列番号14):5'-TAG
CATTCATATAGGAGGTATTTCCCAA
A-3'
【0084】変異導入後は配列確認を行い、変異が正し
く導入されていることを確認し、得られたpENT−K
IAA1594completeC350SをLR C
lonase Mixにより発現ベクター(pDEST
14 Vector)へ組換え、発現クローンpDES
T−KIAA1594completeC350Sを得
た。これをコンピテントセル(BL21−SI:Inv
itrogen)にトランスフォーメーションし、KI
AA1594completeC350Sを含む組換え
大腸菌を得た。
【0085】(実施例4)KIAA1594compl
eteの大腸菌での発現誘導 実施例2および実施例3で調製したpDEST−KIA
A1594completeあるいはpDEST−KI
AA1594completeC350Sを含む組換え
大腸菌を、アンピシリン(50μg/ml)を含みNa
Clを含まないLB培地中で、37℃で培養した。対数
増殖期(OD600nm=0.5−1.2)に達したこ
とを確認した後、NaClの最終濃度が0.3Mになる
よう添加し、さらに25℃で3時間培養した。菌体を遠
心分離により回収し、培養液の1/10量のTN bu
ffer(50mM Tris(pH7.5)/150m
MNaCl/1mM DTT/0.25mg/ml L
ysozyme)に懸濁後、氷中で10分間放置し、超
音波処理により菌体を破砕し(5秒×3)、遠心分離で
得られた上清を大腸菌抽出液(crude extra
ct)とした。また、NaClを加えないものについて
も同様に行った。
【0086】上記の大腸菌抽出液に、当量の2×(本明
細書において2倍の濃度を意味する)SDSサンプルバ
ッファー(125mM Tris−HCl(pH6.8)
/4% SDS/20% glycerol/0.01
% BPB)を加え、100℃で5分間加熱し、これを
電気泳動用サンプルとした。6% Tris−Glyゲ
ルを用いて電気泳動を行い、PVDF膜(Polysc
reen NEF−1000:第一化学)に転写後、抗
penta−His抗体(QIAGEN)で検出を行っ
た。
【0087】結果を図1に示した。KIAA1594c
ompleteの遺伝子産物が、NaClによる誘導に
より、発現量の増大を認めたが、非誘導下においても、
目的蛋白質の分子量である110kDa付近にバンドが
検出された(図1 レーン3、4)。目的蛋白質以外に
も低分子側に多くのバンドが検出され、菌体内で目的蛋
白質が分解されている可能性、および抗penta−H
is抗体による大腸菌由来蛋白質への非特異的結合の可
能性が考えられた。また、変異体(KIAA1594c
ompleteC350S)についても同様に発現の確
認を行ったところ、110kDa付近にバンドが検出さ
れ(図1 レーン5、6)、発現が確認できた。
【0088】(実施例5)インビトロ(iv vitro)系で
の脱ユビキチン化酵素活性の検出 脱ユビキチン化活性の有無を調べる大腸菌抽出液を以下
のように調製した。
【0089】陽性コントロールに使用する為、His-
tagged USP15発現プラスミドpHis−U
SP15を、ヒト脳cDNAライブラリー(非特許文献
23)から得たUSP15 cDNA(KIAA052
9クローン)を鋳型として、上記と同様にGATEWA
Y Cloning Technologyを用いて作
成した。なお、KIAA0529はUSP15のN末端
3アミノ酸残基(Met−Ala−Glu)が欠失して
いたため、Bakerらの方法(非特許文献24)に従
い、この3残基に対応するコドンをプライマー内に設計
し、完全なORFとした。pHis−USP15は上記
と同様に大腸菌BL21−SIに導入した。
【0090】また、陰性コントロールに使用する為、ヒ
スチジン付加ルシフェラーゼ(His-tagged
luciferaze)発現プラスミドpHis−Lu
cを、pGL3−Lucベクター(Promega社)
を鋳型にして、上記と同様にGATEWAY Clon
ing Technologyを用いて作成した。さら
に、pHis−USP15は上記と同様に大腸菌BL2
1−SIに導入した。
【0091】pDEST−KIAA1594compl
ete、pDEST−KIAA1594complet
eC350S、pHis−USP15、またはpHis
−Lucを保持する大腸菌BL21−SIを、実施例4
と同様に誘導培養した後、菌体を回収し、大腸菌抽出液
を調製した。
【0092】活性測定用の各基質(Ub−X−GST)を
含む大腸菌抽出液を以下のように調製した(Xは、Me
t、Pro、Ile、Argを意味する)。
【0093】Mammalian由来ユビキチンのC末
端にSchistoma japonicum由来グル
タチオンS−トランスフェラーゼ(glutathio
neS−transferase:GST)を結合させ
た基質(Ub−Met−GST)発現プラスミドpTV1
18N/Ub−GSTを、pTV118N(Takar
a)を用いて構築した。これを鋳型としてUb−Met
−GSTコード領域をPCRにより増幅させた後、GA
TEWAY Cloning Technologyを
用いて大腸菌発現用ベクター(pDEST14)に挿入
し、pDEST14Ub−Met−GSTを作成した。
次に、pDEST14Ub−Met−GSTからT7プ
ロモーターおよびUb−Met−GSTコード領域を含
む領域をSphIおよびHindIII処理により切り
出し、p15A由来の開始点(ori)を持つpACY
C184(ニッポンジーン社)のSphI−HindI
II間に組込み、pACUb−Met−GSTを作成し
た。
【0094】次に、pACUb−Met−GSTをSa
lIおよびHindIIIで処理し、T7プロモーター
およびUb−Met−GSTコード領域を含む領域をp
BluescriptII SK(+)(Strata
gene社)のSalI−HindIII間に組み込
み、pBSUb−Met−GSTを作成した。さらに、
pBSUb−Met−GSTを鋳型に、QuikCha
nge Site−Directed Mutagen
esis Kit(Stratagene社)を用いて
GSTのN末端のアミノ酸に対応するコドンをATG
〔メチオニン(Met)〕からCCG〔プロリン(Pr
o)〕、ATC〔イソロイシン(Ile)〕およびCG
T〔アルギニン(Arg)〕に変換させたpBSUb−
Pro−GST、pBSUb−Ile−GSTおよびp
BSUb−Arg−GSTを作成した。コドンの変換
は、シーケンシングにより確認した。次に、各pBSU
b−X−GSTをHindIIIおよびSphIで処理
し、T7プロモーターおよびUb−X−GSTコード領
域を含む領域をpACYC184のHindIII−S
phI間に組み込み、各共発現用Ub−X−GST発現
プラスミドpACUb−X−GSTを作成した。作成し
た4種類のpACUb−X−GSTは大腸菌BL21−
SIに導入し、塩化カルシウム法によりコンピテントセ
ル化した。
【0095】上記作成した4種類のpACUb−X−G
STを保有する各種大腸菌BL21−SIを、クロラム
フェニコール(34μg/ml)を含みNaClを含ま
ないLB培地中で、37℃で培養し、対数増殖期(OD
600nm=0.5−1.2)に達したことを確認後、N
aClを最終濃度が0.3Mになるように添加し、さら
に3時間培養した。菌体を遠心分離により回収し、実施
例4と同様に基質を含む大腸菌抽出液として調製した。
【0096】上記調製した各基質(Ub−Met−GS
T、Ub−Arg−GST、Ub−Ile−GST、あ
るいはUb−Pro−GST)を含む大腸菌抽出液10
μlに対して、KIAA1594complete発現
大腸菌抽出液10μlまたはKIAA1594comp
leteC350S発現大腸菌抽出液10μlを添加
し、37℃で16時間インキュベートした。反応後、当
量の2×SDSサンプルバッファーを加え、100℃で
5分間加熱し、これを電気泳動用サンプルとした。10
% Bis−Trisゲル(NOVEX)を用いて電気
泳動を行い、PVDF膜に転写後、抗GST抗体(Am
ersham Pharmacia Biotech)
でUb−Met−GSTより脱ユビキチン化されたGS
Tを検出した。また、陽性コントロール(USP15
(KIAA0529)発現大腸菌抽出液)、陰性コント
ロール(ルシフェラーゼ発現大腸菌抽出液)も同様に処
理した。
【0097】インビトロ系における脱ユビキチン化酵素
活性の解析結果を図2に示す。KIAA1594com
pleteを発現させた大腸菌抽出液は、Ub−Met
−GST(図2A レーン4、5)、Ub−Arg−G
ST(図2B レーン3、4)、Ub−Ile−GST
(図2C レーン3、4)に対して、脱ユビキチン化酵
素活性を有する事が知られているUSP15(KIAA
0529)をポジティブコントロールとして発現させた
大腸菌抽出液と同様に、脱ユビキチン化酵素活性を示し
た。また、Ub−Pro−GSTに対しては、USP1
5(KIAA0529)と異なり、KIAA1594c
ompleteにおいては切断活性を示さなかった(図
2D レーン3、4)。また、Cysボックス内のCy
sをSerに変えた変異体KIAA1594compl
eteC350Sを発現させた場合も同様に解析したと
ころ、Ub−Met−GST(図2A レーン6、
7)、Ub−Arg−GST(図2B レーン5、
6)、Ub−Ile−GST(図2C レーン5、
6)、Ub−Pro−GST(図2D レーン5、6の
全ての基質について切断活性を示さなかった。大腸菌は
ユビキチンシステムが存在しないことから、インビトロ
における脱ユビキチン化酵素活性は、システインプロテ
アーゼKIAA1594completeに由来するも
のであることを見出し、また、Cysボックス内のCy
sが活性に重要であることを見出した。
【0098】(実施例6)共発現系でのKIAA159
4complete発現の確認 実施例5で調製したUb−Met−GST発現プラスミ
ドpACUb―Met−GSTを保持しているコンピテ
ントセル(BL21−SI)にpDEST−KIAA15
94complete、pDEST−KIAA1594
completeC350S、pHis−USP15、
またはpHis−Lucをトランスフォーメーションし
た。コロニーはアンピシリン(50μg/ml)および
クロラムフェニコール(34μg/ml)により選択
し、両プラスミドを保持する共発現株を得た。また、U
b−Arg−GST、Ub−Ile−GST、Ub−P
ro−GSTを保持するコンピテントセル(BL21−
SI)を用いて、同様に共発現株を作成した。
【0099】上記作成したKIAA1594compl
ete/Ub−Met−GSTあるいはKIAA159
4completeC350S/Ub−Met−GST
を保持している組換え大腸菌の培養液10mlを、アン
ピシリン(50μg/ml)およびクロラムフェニコール
(34μg/ml)を含み、NaClを含まないLB培地
100mlに添加し37℃で培養し、対数増殖後期(O
D600nm=0.5−1.2)に達したことを確認後、
NaClの最終濃度が0.3Mになるように添加し、さ
らに25℃で3時間培養した。菌体を遠心分離により回
収し、Extraction/Wash Buffer
(50mM sodium phosphate(pH
7.0)/300mM NaCl/1mM PMSF)
5ml、lysozyme(10mg/ml)0.45
mlを添加し、氷中で30分間放置した。超音波処理に
より菌を破砕し、10% Triton X−100を
終濃度が1%になるように加え、4℃で15分間転倒混
和した後、遠心分離により上清を回収した。この上清に
TALON Metal Affinity Resi
ns(50% suspension、CLONTEC
H)100μlを加え、4℃で1時間転倒混和した。R
esinをBuffer B(50mM sodium
phosphate(pH7.0)/300mM Na
Cl/1mM PMSF/1% Triton X−1
00)で洗浄し、Elution Buffer(50
mM sodium phosphate(pH7.0)
/300mM NaCl/1% Triton X−1
00/150mM imidazole)50μlを加
え、室温で3分間放置後、遠心により上清を回収し、こ
れを溶出液とした。また、NaClを添加しないものに
ついても同様に行った。
【0100】上記の溶出液に当量の2×SDSサンプル
バッファーを加え、100℃で5分間加熱し、これを電
気泳動用サンプルとした。6% Tris−Glyゲル
を用いて電気泳動を行い、PVDF膜に転写後、抗pe
nta−His抗体で検出を行った。
【0101】結果を図3に示す。KIAA1594co
mplete/Ub−Met−GSTを保持している組
換え大腸菌は、NaClによる誘導の有無に関わらず、
目的蛋白質である110kDa付近にバンドが検出され
た(図3 レーン1、2)。また変異体であるKIAA
1594completeC350S/Ub−Met−
GSTを保持している組換え大腸菌についても、同様に
110kDa付近にバンドが検出された(図レーン3、
4)。従って、Ub−Met−GSTを保持している組
換え大腸菌に、KIAA1594completeある
いはKIAA1594completeC350Sが発
現していることが確認できた。
【0102】(実施例7) 共発現系での脱ユビキチン
化活性の検出 実施例6で調製した各共発現株(KIAA1594co
mplete/Ub−X−GST)を、アンピシリン(5
0μg/ml)及びクロラムフェニコール(34μg/m
l)を含みNaClを含まないLB培地中で、37℃で
培養し、対数増殖後期(OD600nm=0.5−1.2)
に達したことを確認後、さらに25℃で3時間培養し
た。菌体を遠心分離により回収し、培養液の1/10量
のPBSを加えて懸濁し、当量の2×SDSサンプルバ
ッファーを加え、100℃で5分間加熱後、超音波処理
を行った。このサンプルを10%Bis−Trisゲル
(NOVEX)で電気泳動を行い、PVDF膜に転写
後、抗GST抗体で各Ub−X−GSTより脱ユビキチ
ン化されたGSTを検出した(Xは、Met、Pro、
Ile、Argを意味する)。
【0103】結果を図4に示した。各基質を発現してい
る大腸菌株にKIAA1594completeを発現
させたところ、基質がUb−Met−GST(図4A
レーン3、4)、Ub−Arg−GST(図4B レー
ン3、4)、Ub−Ile−GST(図4C レーン
3)の場合はGSTの解離が認められ、大腸菌内で生産
されたKIAA1594complete遺伝子産物が
脱ユビキチン化酵素活性を示すことを見出した。一方、
基質がUb−Pro−GSTの場合は活性を示さなかっ
た(図4D レーン3、4)。
【0104】一方、陽性コントロールであるUSP15
を発現させたところ、いずれの基質においても脱ユビキ
チン化酵素活性が認められた(図4A、4B、4Cおよ
び4Dのレーン1)。
【0105】一般にUb−Pro−GSTは切れにくい
基質であることが知られており、酵母に存在するUSP
は全てUb−Pro−GSTに対する活性が低い(非特
許文献25、非特許文献26)。Ub−Pro−GST
に活性を示すヒトのUSPとしてUSP4(非特許文献
25)とUSP15(非特許文献24)が報告されてお
り、KIAA1594completeはこれらのUS
Pとは生体内で異なる基質選択性を持つものと考えられ
る。
【0106】また、変異体であるKIAA1594co
mpleteC350Sを発現させたところ、切断活性
は認められなかった(図4A レーン5、6、図4C
レーン4、5)ことから、Cys box内に存在する
Cys残基が活性に重要であることが見出された。
【0107】
【発明の効果】本発明は、USPの関与する生体機能の
解明、とりわけ、発癌プロセスの解明や、神経変性疾
患、例えばアルツハイマー病やパーキンソン病等の解
明、ならびにそれらの予防、治療および診断を可能とす
る上で非常に有用なものである。
【0108】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI PHARMACEUTICAL CO., LTD <120> Novel Ubiquitin specific protease <130> S02093002A <140> <141> <150> JP P2001-301580 <151> 2001-09-28 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 979 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Pro Leu Lys Ile His Gly Pro Ile Arg Ile Arg Ser Met Gln 1 5 10 15 Thr Gly Ile Thr Lys Trp Lys Glu Gly Ser Phe Glu Ile Val Glu Lys 20 25 30 Glu Asn Lys Val Ser Leu Val Val His Tyr Asn Thr Gly Gly Ile Pro 35 40 45 Arg Ile Phe Gln Leu Ser His Asn Ile Lys Asn Val Val Leu Arg Pro 50 55 60 Ser Gly Ala Lys Gln Ser Arg Leu Met Leu Thr Leu Gln Asp Asn Ser 65 70 75 80 Phe Leu Ser Ile Asp Lys Val Pro Ser Lys Asp Ala Glu Glu Met Arg 85 90 95 Leu Phe Leu Asp Ala Val His Gln Asn Arg Leu Pro Ala Ala Met Lys 100 105 110 Pro Ser Gln Gly Ser Gly Ser Phe Gly Ala Ile Leu Gly Ser Arg Thr 115 120 125 Ser Gln Lys Glu Thr Ser Arg Gln Leu Ser Tyr Ser Asp Asn Gln Ala 130 135 140 Ser Ala Lys Arg Gly Ser Leu Glu Thr Lys Asp Asp Ile Pro Phe Arg 145 150 155 160 Lys Val Leu Gly Asn Pro Gly Arg Gly Ser Ile Lys Thr Val Ala Gly 165 170 175 Ser Gly Ile Ala Arg Thr Ile Pro Ser Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro 180 185 190 Leu Arg Ser Gly Leu Leu Glu Asn Arg Thr Glu Lys Arg Lys Arg Met 195 200 205 Ile Ser Thr Gly Ser Glu Leu Asn Glu Asp Tyr Pro Lys Glu Asn Asp 210 215 220 Ser Ser Ser Asn Asn Lys Ala Met Thr Asp Pro Ser Arg Lys Tyr Leu 225 230 235 240 Thr Ser Ser Arg Glu Lys Gln Leu Ser Leu Lys Gln Ser Glu Glu Asn 245 250 255 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Pro Leu Gln Ser Ser Ser Phe Tyr Gly Ser 260 265 270 Arg Ala Gly Ser Lys Glu His Ser Ser Gly Gly Thr Asn Leu Asp Arg 275 280 285 Thr Asn Val Ser Ser Gln Thr Pro Ser Ala Lys Arg Ser Leu Gly Phe 290 295 300 Leu Pro Gln Pro Val Pro Leu Ser Val Lys Lys Leu Arg Cys Asn Gln 305 310 315 320 Asp Tyr Thr Gly Trp Asn Lys Pro Arg Val Pro Leu Ser Ser His Gln 325 330 335 Gln Gln Gln Leu Gln Gly Phe Ser Asn Leu Gly Asn Thr Cys Tyr Met 340 345 350 Asn Ala Ile Leu Gln Ser Leu Phe Ser Leu Gln Ser Phe Ala Asn Asp 355 360 365 Leu Leu Lys Gln Gly Ile Pro Trp Lys Lys Ile Pro Leu Asn Ala Leu 370 375 380 Ile Arg Arg Phe Ala His Leu Leu Val Lys Lys Asp Ile Cys Asn Ser 385 390 395 400 Glu Thr Lys Lys Asp Leu Leu Lys Lys Val Lys Asn Ala Ile Ser Ala 405 410 415 Thr Ala Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Met Gln Asn Asp Ala His Glu Phe 420 425 430 Leu Ser Gln Cys Leu Asp Gln Leu Lys Glu Asp Met Glu Lys Leu Asn 435 440 445 Lys Thr Trp Lys Thr Glu Pro Val Ser Gly Glu Glu Asn Ser Pro Asp 450 455 460 Ile Ser Ala Thr Arg Ala Tyr Thr Cys Pro Val Ile Thr Asn Leu Glu 465 470 475 480 Phe Glu Val Gln His Ser Ile Ile Cys Lys Ala Cys Gly Glu Ile Ile 485 490 495 Pro Lys Arg Glu Gln Phe Asn Asp Leu Ser Ile Asp Leu Pro Arg Arg 500 505 510 Lys Lys Pro Leu Pro Pro Arg Ser Ile Gln Asp Ser Leu Asp Leu Phe 515 520 525 Phe Arg Ala Glu Glu Leu Glu Tyr Ser Cys Glu Lys Cys Gly Gly Lys 530 535 540 Cys Ala Leu Val Arg His Lys Phe Asn Arg Leu Pro Arg Val Leu Ile 545 550 555 560 Leu His Leu Lys Arg Tyr Ser Phe Asn Val Ala Leu Ser Leu Asn Asn 565 570 575 Lys Ile Gly Gln Gln Val Ile Ile Pro Arg Tyr Leu Thr Leu Ser Ser 580 585 590 His Cys Thr Glu Asn Thr Lys Pro Pro Phe Thr Leu Gly Trp Ser Ala 595 600 605 His Met Ala Ile Ser Arg Pro Leu Lys Ala Ser Gln Met Val Asn Ser 610 615 620 Cys Ile Thr Ser Pro Ser Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Phe Lys Ser 625 630 635 640 Lys Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asp Ser Asp Ser Glu Asp Glu Leu 645 650 655 Lys Arg Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Leu Cys Glu Met Leu Gly Asn 660 665 670 Glu Gln Gln Gln Glu Asp Leu Glu Lys Asp Ser Lys Leu Cys Pro Ile 675 680 685 Glu Pro Asp Lys Ser Glu Leu Glu Asn Ser Gly Phe Asp Arg Met Ser 690 695 700 Glu Glu Glu Leu Leu Ala Ala Val Leu Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ala 705 710 715 720 Ser Pro Ser Leu Ser His Glu Asp Asp Asp Lys Pro Thr Ser Ser Pro 725 730 735 Asp Thr Gly Phe Ala Glu Asp Asp Ile Gln Glu Met Pro Glu Asn Pro 740 745 750 Asp Thr Met Glu Thr Glu Lys Pro Lys Thr Ile Thr Glu Leu Asp Pro 755 760 765 Ala Ser Phe Thr Glu Ile Thr Lys Asp Cys Asp Glu Asn Lys Glu Asn 770 775 780 Lys Thr Pro Glu Gly Ser Gln Gly Glu Val Asp Trp Leu Gln Gln Tyr 785 790 795 800 Asp Met Glu Arg Glu Arg Glu Glu Gln Glu Leu Gln Gln Ala Leu Ala 805 810 815 Gln Ser Leu Gln Glu Gln Glu Ala Trp Glu Gln Lys Glu Asp Asp Asp 820 825 830 Leu Lys Arg Ala Thr Glu Leu Ser Leu Gln Glu Phe Asn Asn Ser Phe 835 840 845 Val Asp Ala Leu Gly Ser Asp Glu Asp Ser Gly Asn Glu Asp Val Phe 850 855 860 Asp Met Glu Tyr Thr Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Lys Arg Asn Ala 865 870 875 880 Glu Thr Gly Asn Leu Pro His Ser Tyr Arg Leu Ile Ser Val Val Ser 885 890 895 His Ile Gly Ser Thr Ser Ser Ser Gly His Tyr Ile Ser Asp Val Tyr 900 905 910 Asp Ile Lys Lys Gln Ala Trp Phe Thr Tyr Asn Asp Leu Glu Val Ser 915 920 925 Lys Ile Gln Glu Ala Ala Val Gln Ser Asp Arg Asp Arg Ser Gly Tyr 930 935 940 Ile Phe Phe Tyr Met His Lys Glu Ile Phe Asp Glu Leu Leu Glu Thr 945 950 955 960 Glu Lys Asn Ser Gln Ser Leu Ser Thr Glu Val Gly Lys Thr Thr Arg 965 970 975 Gln Ala Ser <210> 2 <211> 2940 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(2940) <400> 2 atg tct cct ctg aag ata cat ggt cct atc aga att cga agt atg cag 48 Met Ser Pro Leu Lys Ile His Gly Pro Ile Arg Ile Arg Ser Met Gln 1 5 10 15 act ggg att aca aag tgg aaa gaa gga tcc ttt gaa att gta gaa aaa 96 Thr Gly Ile Thr Lys Trp Lys Glu Gly Ser Phe Glu Ile Val Glu Lys 20 25 30 gag aat aaa gtc agc cta gta gtt cac tac aat act gga gga att cca 144 Glu Asn Lys Val Ser Leu Val Val His Tyr Asn Thr Gly Gly Ile Pro 35 40 45 agg ata ttt cag cta agt cat aac att aaa aat gtg gtg ctt cga ccc 192 Arg Ile Phe Gln Leu Ser His Asn Ile Lys Asn Val Val Leu Arg Pro 50 55 60 agt gga gcg aaa caa agc cgc cta atg tta act ctg caa gat aac agc 240 Ser Gly Ala Lys Gln Ser Arg Leu Met Leu Thr Leu Gln Asp Asn Ser 65 70 75 80 ttc ttg tct att gac aaa gta cca agt aag gat gca gag gaa atg agg 288 Phe Leu Ser Ile Asp Lys Val Pro Ser Lys Asp Ala Glu Glu Met Arg 85 90 95 ttg ttt cta gat gca gtc cat caa aac aga ctt cct gca gcc atg aaa 336 Leu Phe Leu Asp Ala Val His Gln Asn Arg Leu Pro Ala Ala Met Lys 100 105 110 ccg tct cag ggg tct ggt agt ttt gga gcc att ctg ggc agc agg acc 384 Pro Ser Gln Gly Ser Gly Ser Phe Gly Ala Ile Leu Gly Ser Arg Thr 115 120 125 tca cag aag gaa acc agc agg cag ctt tct tac tca gac aat cag gct 432 Ser Gln Lys Glu Thr Ser Arg Gln Leu Ser Tyr Ser Asp Asn Gln Ala 130 135 140 tct gca aaa aga gga agt ttg gaa act aaa gat gat att cca ttt cga 480 Ser Ala Lys Arg Gly Ser Leu Glu Thr Lys Asp Asp Ile Pro Phe Arg 145 150 155 160 aaa gtt ctt ggt aat ccg ggt aga gga tcg att aag act gta gca gga 528 Lys Val Leu Gly Asn Pro Gly Arg Gly Ser Ile Lys Thr Val Ala Gly 165 170 175 agt gga ata gct cgg acg att cct tct ttg aca tct act tca aca cct 576 Ser Gly Ile Ala Arg Thr Ile Pro Ser Leu Thr Ser Thr Ser Thr Pro 180 185 190 ctt aga tca ggg ttg cta gaa aat cgt act gaa aag agg aaa aga atg 624 Leu Arg Ser Gly Leu Leu Glu Asn Arg Thr Glu Lys Arg Lys Arg Met 195 200 205 ata tca act ggc tca gaa ttg aat gaa gat tac cct aag gaa aat gat 672 Ile Ser Thr Gly Ser Glu Leu Asn Glu Asp Tyr Pro Lys Glu Asn Asp 210 215 220 tca tca tcg aac aac aag gcc atg aca gat ccc tcc aga aag tat tta 720 Ser Ser Ser Asn Asn Lys Ala Met Thr Asp Pro Ser Arg Lys Tyr Leu 225 230 235 240 acc agc agt aga gaa aag cag ctg agt ttg aaa cag tca gaa gag aat 768 Thr Ser Ser Arg Glu Lys Gln Leu Ser Leu Lys Gln Ser Glu Glu Asn 245 250 255 agg aca tca ggg ctt tta cct tta cag tca tca tcc ttt tat ggt agc 816 Arg Thr Ser Gly Leu Leu Pro Leu Gln Ser Ser Ser Phe Tyr Gly Ser 260 265 270 aga gct gga tcc aag gaa cac tct tct ggt ggc act aac tta gac agg 864 Arg Ala Gly Ser Lys Glu His Ser Ser Gly Gly Thr Asn Leu Asp Arg 275 280 285 act aat gtt tca agc cag act ccc tct gcc aaa aga agt ttg gga ttt 912 Thr Asn Val Ser Ser Gln Thr Pro Ser Ala Lys Arg Ser Leu Gly Phe 290 295 300 ctt cct cag cca gtt cct ctt tct gtt aaa aaa ctg agg tgt aac cag 960 Leu Pro Gln Pro Val Pro Leu Ser Val Lys Lys Leu Arg Cys Asn Gln 305 310 315 320 gat tac act ggc tgg aat aaa cca aga gtg ccc ctt tcc tct cac caa 1008 Asp Tyr Thr Gly Trp Asn Lys Pro Arg Val Pro Leu Ser Ser His Gln 325 330 335 cag cag caa ctg cag ggc ttc tcc aat ttg gga aat acc tgc tat atg 1056 Gln Gln Gln Leu Gln Gly Phe Ser Asn Leu Gly Asn Thr Cys Tyr Met 340 345 350 aat gct att cta caa tct cta ttt tca ctc cag tca ttt gca aat gac 1104 Asn Ala Ile Leu Gln Ser Leu Phe Ser Leu Gln Ser Phe Ala Asn Asp 355 360 365 ttg ctt aaa caa ggt atc cca tgg aag aaa att cca ctc aat gca ctt 1152 Leu Leu Lys Gln Gly Ile Pro Trp Lys Lys Ile Pro Leu Asn Ala Leu 370 375 380 atc aga cgc ttt gca cac ttg ctt gtt aaa aaa gat atc tgt aat tca 1200 Ile Arg Arg Phe Ala His Leu Leu Val Lys Lys Asp Ile Cys Asn Ser 385 390 395 400 gag acc aaa aag gat tta ctc aag aag gtt aaa aat gcc att tca gct 1248 Glu Thr Lys Lys Asp Leu Leu Lys Lys Val Lys Asn Ala Ile Ser Ala 405 410 415 aca gca gag aga ttc tct ggt tat atg cag aat gat gct cat gaa ttt 1296 Thr Ala Glu Arg Phe Ser Gly Tyr Met Gln Asn Asp Ala His Glu Phe 420 425 430 tta agt cag tgt ttg gac cag ctg aaa gaa gat atg gaa aaa tta aat 1344 Leu Ser Gln Cys Leu Asp Gln Leu Lys Glu Asp Met Glu Lys Leu Asn 435 440 445 aaa act tgg aag act gaa cct gtt tct gga gaa gaa aat tca cca gat 1392 Lys Thr Trp Lys Thr Glu Pro Val Ser Gly Glu Glu Asn Ser Pro Asp 450 455 460 att tca gct acc aga gca tac act tgc cct gtt att act aat ttg gag 1440 Ile Ser Ala Thr Arg Ala Tyr Thr Cys Pro Val Ile Thr Asn Leu Glu 465 470 475 480 ttt gag gtt cag cac tcc atc att tgt aaa gca tgt gga gag att atc 1488 Phe Glu Val Gln His Ser Ile Ile Cys Lys Ala Cys Gly Glu Ile Ile 485 490 495 ccc aaa aga gaa cag ttt aat gac ctc tct att gac ctt cct cgt agg 1536 Pro Lys Arg Glu Gln Phe Asn Asp Leu Ser Ile Asp Leu Pro Arg Arg 500 505 510 aaa aaa cca ctc cct cct cgt tca att caa gat tct ctt gat ctt ttc 1584 Lys Lys Pro Leu Pro Pro Arg Ser Ile Gln Asp Ser Leu Asp Leu Phe 515 520 525 ttt agg gcc gaa gaa ctg gag tat tct tgt gag aag tgt ggt ggg aag 1632 Phe Arg Ala Glu Glu Leu Glu Tyr Ser Cys Glu Lys Cys Gly Gly Lys 530 535 540 tgt gct ctt gtc agg cac aaa ttt aac agg ctt cct agg gtc ctc att 1680 Cys Ala Leu Val Arg His Lys Phe Asn Arg Leu Pro Arg Val Leu Ile 545 550 555 560 ctc cat ttg aaa cga tat agc ttc aat gtg gct ctc tcg ctt aac aat 1728 Leu His Leu Lys Arg Tyr Ser Phe Asn Val Ala Leu Ser Leu Asn Asn 565 570 575 aag att ggg cag caa gtc atc att cca aga tac ctg acc ctg tca tct 1776 Lys Ile Gly Gln Gln Val Ile Ile Pro Arg Tyr Leu Thr Leu Ser Ser 580 585 590 cat tgc act gaa aat aca aaa cca cct ttt acc ctt ggt tgg agt gca 1824 His Cys Thr Glu Asn Thr Lys Pro Pro Phe Thr Leu Gly Trp Ser Ala 595 600 605 cat atg gca att tct aga cca ttg aaa gcc tct caa atg gtg aat tcc 1872 His Met Ala Ile Ser Arg Pro Leu Lys Ala Ser Gln Met Val Asn Ser 610 615 620 tgc atc acc agc cct tct aca cct tca aag aaa ttc acc ttc aaa tcc 1920 Cys Ile Thr Ser Pro Ser Thr Pro Ser Lys Lys Phe Thr Phe Lys Ser 625 630 635 640 aag agc tcc ttg gct tta tgc ctt gat tca gac agt gag gat gag cta 1968 Lys Ser Ser Leu Ala Leu Cys Leu Asp Ser Asp Ser Glu Asp Glu Leu 645 650 655 aaa cgt tct gtg gcc ctc agc cag aga ctt tgt gaa atg tta ggc aac 2016 Lys Arg Ser Val Ala Leu Ser Gln Arg Leu Cys Glu Met Leu Gly Asn 660 665 670 gaa cag cag cag gaa gac ctg gaa aaa gat tca aaa tta tgc cca ata 2064 Glu Gln Gln Gln Glu Asp Leu Glu Lys Asp Ser Lys Leu Cys Pro Ile 675 680 685 gag cct gac aag tct gaa ttg gaa aac tca gga ttt gac aga atg agc 2112 Glu Pro Asp Lys Ser Glu Leu Glu Asn Ser Gly Phe Asp Arg Met Ser 690 695 700 gaa gaa gag ctt cta gca gct gtc ttg gag ata agt aag aga gat gct 2160 Glu Glu Glu Leu Leu Ala Ala Val Leu Glu Ile Ser Lys Arg Asp Ala 705 710 715 720 tca cca tct ctg agt cat gaa gat gat gat aag cca act agc agc cca 2208 Ser Pro Ser Leu Ser His Glu Asp Asp Asp Lys Pro Thr Ser Ser Pro 725 730 735 gat acc gga ttt gca gaa gat gat att caa gaa atg cca gaa aat cca 2256 Asp Thr Gly Phe Ala Glu Asp Asp Ile Gln Glu Met Pro Glu Asn Pro 740 745 750 gac act atg gaa act gag aag ccc aaa aca atc aca gag ctg gat cct 2304 Asp Thr Met Glu Thr Glu Lys Pro Lys Thr Ile Thr Glu Leu Asp Pro 755 760 765 gcc agt ttt act gag ata act aaa gac tgt gat gag aat aaa gaa aac 2352 Ala Ser Phe Thr Glu Ile Thr Lys Asp Cys Asp Glu Asn Lys Glu Asn 770 775 780 aaa act cca gaa gga tct cag gga gaa gtt gat tgg ctc cag cag tat 2400 Lys Thr Pro Glu Gly Ser Gln Gly Glu Val Asp Trp Leu Gln Gln Tyr 785 790 795 800 gat atg gag cgt gaa agg gaa gag caa gag ctt cag cag gca ctg gct 2448 Asp Met Glu Arg Glu Arg Glu Glu Gln Glu Leu Gln Gln Ala Leu Ala 805 810 815 cag agc ctt caa gag caa gag gct tgg gaa cag aaa gaa gat gat gac 2496 Gln Ser Leu Gln Glu Gln Glu Ala Trp Glu Gln Lys Glu Asp Asp Asp 820 825 830 ctc aaa aga gct acc gag tta agt ctt caa gag ttt aac aac tcc ttt 2544 Leu Lys Arg Ala Thr Glu Leu Ser Leu Gln Glu Phe Asn Asn Ser Phe 835 840 845 gtg gat gca ttg ggt tct gat gag gac tct gga aat gag gat gtt ttt 2592 Val Asp Ala Leu Gly Ser Asp Glu Asp Ser Gly Asn Glu Asp Val Phe 850 855 860 gat atg gag tac aca gaa gct gaa gct gag gaa ctg aaa aga aat gct 2640 Asp Met Glu Tyr Thr Glu Ala Glu Ala Glu Glu Leu Lys Arg Asn Ala 865 870 875 880 gag aca gga aat ctg cct cat tcg tac cgg ctc atc agt gtt gtc agt 2688 Glu Thr Gly Asn Leu Pro His Ser Tyr Arg Leu Ile Ser Val Val Ser 885 890 895 cac att ggt agc act tct tct tca ggt cat tac att agt gat gta tat 2736 His Ile Gly Ser Thr Ser Ser Ser Gly His Tyr Ile Ser Asp Val Tyr 900 905 910 gac att aag aag caa gcg tgg ttt act tac aat gac ctg gag gta tca 2784 Asp Ile Lys Lys Gln Ala Trp Phe Thr Tyr Asn Asp Leu Glu Val Ser 915 920 925 aaa atc caa gag gct gcc gtg cag agt gat cga gat cgg agt ggc tac 2832 Lys Ile Gln Glu Ala Ala Val Gln Ser Asp Arg Asp Arg Ser Gly Tyr 930 935 940 atc ttc ttt tat atg cac aag gag atc ttt gat gag ctg ctg gaa aca 2880 Ile Phe Phe Tyr Met His Lys Glu Ile Phe Asp Glu Leu Leu Glu Thr 945 950 955 960 gaa aag aac tct cag tca ctt agc acg gaa gtg ggg aag act acc cgt 2928 Glu Lys Asn Ser Gln Ser Leu Ser Thr Glu Val Gly Lys Thr Thr Arg 965 970 975 cag gcc tcg tga 2940 Gln Ala Ser 980 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as primer <400> 3 tgtggtgctt cgacccagtg 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 4 cagttgctgc tgttggtgag ag 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polyncleotide for using as a primer <400> 5 tcttcctcag ccagttcctc tt 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 6 ttcagacttg tcaggctcta ttg 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 7 gtgaaatgtt aggcaacgaa cagc 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 8 tatgcagtgc atgctgccaa c 21 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 9 gtcaatagac aagaagctgt tatcttgcag ag 32 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 10 acgcgtcgac catgtctcct ctgaagatac atggt 35 <210> 11 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 11 gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctta gaaggagata gaaccatgtc tcctctgaag 60 atacatgg 68 <210> 12 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 12 gggaccactt tgtacaagaa agctgggtcc tagtgatggt gatggtgatg cgaggcctga 60 cgggtagt 68 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 13 tttgggaaat acctcctaat agaatgcta 29 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed polynucleotide for using as a primer <400> 14 tagcattcat ataggaggta tttcccaaa 29
【0109】
【図面の簡単な説明】
【図1】 KIAA1594completeおよびK
IAA1594completeC350Sの大腸菌に
おける蛋白質の発現を、抗penta−His抗体で検
出し、確認した図である。レーン1は脱ユビキチン化酵
素活性を有するUSP15(KIAA0529)発現プ
ラスミド(pHis−USP15)を有する大腸菌をN
aClで誘導した大腸菌抽出物、レーン2はLucif
erase発現プラスミド(pHis−Luc)を有す
る大腸菌をNaClで誘導した大腸菌抽出物、レーン3
はKIAA1594complete発現プラスミド
(pDEST−KIAA1594complete)を
有する大腸菌をNaClで誘導した大腸菌抽出物、レー
ン4はpDEST−KIAA1594complete
を有する大腸菌をNaClで誘導しない大腸菌抽出物、
レーン5はKIAA1594completeC350
S発現プラスミド(pDEST−KIAA1594co
mpleteC350S)を有する大腸菌をNaClで
誘導した大腸菌抽出物、レーン6はpDEST−KIA
A1594completeC350Sを有する大腸菌
をNaClで誘導しない大腸菌抽出物、である。
【図2】 インビトロ系における脱ユビキチン化酵素活
性を確認した図である。基質として、AはUb−Met
−GSTを、BはUb−Arg−GSTを、CはUb−
Ile−GSTを、DはUb−Pro−GSTを用い
た。 A レーン1:基質抽出液のみ、レーン2:陽性コント
ロール(USP15)、レーン3:陰性コントロール
(ルシフェラーゼ)、レーン4および5:KIAA15
94complete、レーン6および7:変異体(K
IAA1594completeC350S)である。 B レーン1:基質抽出液のみ、レーン2:陽性コント
ロール(USP15)、レーン3および4:KIAA1
594complete、レーン5および6:変異体
(KIAA1594completeC350S)であ
る。 C レーン1:基質抽出液のみ、レーン2:陽性コント
ロール(USP15)、レーン3および4:KIAA1
594complete、レーン5および6:変異体
(KIAA1594completeC350S)であ
る。 D レーン1:基質抽出液のみ、レーン2:陽性コント
ロール(USP15)、レーン3および4:KIAA1
594complete、レーン5および6:変異体
(KIAA1594completeC350S)であ
る。
【図3】 プラスミドpACUb−Met−GST保有
大腸菌におけるKIAA1594completeおよ
びKIAA1594completeC350Sの発現
を、抗penta−His抗体で検出し、確認した図で
ある。レーン1はKIAA1594complete発
現プラスミド(pDEST−KIAA1594comp
lete)を共発現させた大腸菌をNaClで誘導した
大腸菌抽出物、レーン2はpDEST−KIAA159
4completeを共発現させた大腸菌をNaClで
誘導しない大腸菌抽出物、レーン3はKIAA1594
completeC350S発現プラスミド(pDES
T−KIAA1594completeC350S)を
共発現させた大腸菌をNaClで誘導した大腸菌抽出
物、レーン4はpDEST−KIAA1594comp
leteC350Sを共発現させた大腸菌をNaClで
誘導しない大腸菌抽出物、である。
【図4】 Ub−X−GST共発現系における脱ユビキ
チン化酵素活性を確認した図である。大腸菌に共発現し
ている基質は、AはUb−Met−GSTを、BはUb
−Arg−GSTを、CはUb−Ile−GSTを、D
はUb−Pro−GSTである。 A レーン1:陽性コントロール(USP15)を発現
した場合、レーン2:陰性コントロール(ルシフェラー
ゼ)を発現させた場合、レーン3および4:KIAA1
594completeを発現させた場合、レーン5お
よび6:変異体(KIAA1594completeC
350S)を発現させた場合、である。 B レーン1:陽性コントロール(USP15)を発現
した場合、レーン2:陰性コントロール(ルシフェラー
ゼ)を発現させた場合、レーン3および4:KIAA1
594completeを発現させた場合、である。 C レーン1:陽性コントロール(USP15)を発現
した場合、レーン2:陰性コントロール(ルシフェラー
ゼ)を発現させた場合、レーン3:KIAA1594c
ompleteを発現させた場合、レーン4および5:
変異体(KIAA1594completeC350
S)を発現させた場合、である。 D レーン1:陽性コントロール(USP15)を発現
した場合、レーン2:陰性コントロール(ルシフェラー
ゼ)を発現させた場合、レーン3および4:KIAA1
594completeを発現させた場合、である。
【図5】 プラスミドpENT−KIAA1594co
mpleteのコンストラクトを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61K 45/00 A61P 25/00 4C084 48/00 25/16 4C085 A61P 25/00 25/28 4C086 25/16 31/12 4H045 25/28 35/00 31/12 43/00 111 35/00 C07K 16/40 43/00 111 C12N 1/15 C07K 16/40 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 9/64 Z 1/21 C12Q 1/02 5/10 1/37 9/64 1/68 A C12Q 1/02 G01N 33/15 Z 1/37 33/50 Z 1/68 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/15 5/00 A 33/50 A61K 37/54 Fターム(参考) 2G045 AA25 AA40 BB03 BB20 CA25 CB01 CB03 CB07 CB13 CB21 DA12 DA13 DA20 DA36 DA77 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA14 CA04 CA05 CA06 CA09 CA11 DA06 EA04 GA11 GA18 GA19 HA03 HA08 HA12 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ20 QQ26 QQ36 QQ42 QR02 QR08 QR14 QR16 QR22 QR32 QR38 QR41 QR42 QR48 QR55 QR57 QR59 QR62 QR69 QR75 QR80 QR82 QS16 QS24 QS25 QS28 QS34 QS39 QX01 QX07 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 DC02 MA01 NA14 ZA012 ZA162 ZA182 ZB262 ZB332 ZC412 4C085 AA13 AA14 CC32 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA16 ZA18 ZB26 ZB33 ZC41 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA45 DA75 DA86 DA89 EA21 EA50 FA72 FA74

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記の群より選ばれるポリペプチド; 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるポ
    リペプチド、 前記のポリペプチドを含有するポリペプチド、 前記のポリペプチドと少なくとも約70%のアミノ
    酸配列上の相同性を有し、かつ脱ユビキチン化活性を有
    するポリペプチド、および 前記アミノ酸配列において1ないし数個のアミノ酸の
    欠失、置換、付加あるいは挿入といった変異を有し、か
    つ脱ユビキチン化活性を有するポリペプチド。
  2. 【請求項2】 配列表の配列番号1に記載のアミノ酸配
    列の少なくとも約5個の連続するアミノ酸配列を有する
    ペプチド。
  3. 【請求項3】 請求項1または請求項2に記載のポリペ
    プチドまたはペプチドをコードするポリヌクレオチドま
    たはその相補鎖。
  4. 【請求項4】 配列表の配列番号2に記載の塩基配列か
    らなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖。
  5. 【請求項5】 配列表の配列番号2に記載の塩基配列か
    らなるポリヌクレオチドまたはその相補鎖の少なくとも
    約15個の連続する塩基配列からなるポリヌクレオチ
    ド。
  6. 【請求項6】 請求項3から請求項5のいずれか1項に
    記載のポリヌクレオチドまたはその相補鎖とストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイゼーションするポリヌク
    レオチド。
  7. 【請求項7】 請求項3から請求項6のいずれか1項に
    記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
  8. 【請求項8】 プラスミドpENT−KIAA1594
    complete(受託番号:FERM BP−759
    4)。
  9. 【請求項9】 請求項7または請求項8に記載の組換え
    ベクターを形質導入された形質転換体。
  10. 【請求項10】 請求項9に記載の形質転換体を培養す
    る工程を含む、請求項1または請求項2に記載のポリペ
    プチドまたはペプチドの製造方法。
  11. 【請求項11】 請求項1または請求項2に記載のポリ
    ペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体。
  12. 【請求項12】 脱ユビキチン化活性を抑制する請求項
    11に記載の抗体。
  13. 【請求項13】 請求項1に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物、および/または請求項3または請求項4に記載
    のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もし
    くは促進する化合物のスクリーニング方法であって、請
    求項1または請求項2に記載のポリペプチドまたはペプ
    チド、請求項3から請求項6のいずれか1項に記載のポ
    リヌクレオチド、請求項7または請求項8に記載のベク
    ター、請求項9に記載の形質転換体、請求項11または
    請求項12に記載の抗体のうち、少なくともいずれか1
    つを用いることを特徴とするスクリーニング方法。
  14. 【請求項14】 請求項13に記載の方法で同定される
    化合物。
  15. 【請求項15】 請求項1に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物。
  16. 【請求項16】 請求項3または請求項4に記載のポリ
    ヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もしくは促
    進する化合物。
  17. 【請求項17】 請求項1または請求項2に記載のポリ
    ペプチドまたはペプチド、請求項3から請求項6のいず
    れか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項7または請
    求項8に記載のベクター、請求項9に記載の形質転換
    体、請求項11または請求項12に記載の抗体、請求項
    14から請求項16のいずれか1項に記載の化合物のう
    ち、少なくともいずれか1つを含有することを特徴とす
    る医薬組成物。
  18. 【請求項18】 請求項1に記載のポリペプチドの発現
    または脱ユビキチン化活性に関連した疾病の診断のため
    の測定方法であって、(a)該ポリペプチドをコードし
    ている核酸および/または(b)試料中の該ポリペプチ
    ドをマーカーとして分析することを含む測定方法。
  19. 【請求項19】 請求項1または請求項2に記載のポリ
    ペプチドまたはペプチド、請求項3から請求項6のいず
    れか1項に記載のポリヌクレオチド、または請求項11
    または12に記載の抗体のうち、少なくとも1つを含ん
    でなる、(a)該ポリペプチドまたは蛋白質をコードし
    ている核酸および/または(b)試料中の該ポリペプチ
    ドをマーカーとして分析することを含む測定方法に使用
    する試薬キット。
  20. 【請求項20】 請求項1に記載のポリペプチドと相互
    作用して脱ユビキチン化活性を阻害もしくは活性化する
    化合物、および/または請求項3または請求項4に記載
    のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害もし
    くは促進する化合物のスクリーニング方法であって、請
    求項1または請求項2に記載のポリペプチドまたはペプ
    チド、請求項3から請求項6のいずれか1項に記載のポ
    リヌクレオチド、請求項7または請求項8に記載のベク
    ター、請求項9に記載の形質転換体、請求項11または
    請求項12に記載の抗体のうち、少なくともいずれか1
    つを用いることを特徴とするスクリーニング方法で得ら
    れる化合物を含有する神経変性疾患の防止および/また
    は治療剤。
  21. 【請求項21】 請求項1または請求項2に記載のポリ
    ペプチドまたはペプチド、請求項3から請求項6のいず
    れか1項に記載のポリヌクレオチド、請求項7または請
    求項8に記載のベクター、請求項9に記載の形質転換
    体、請求項11または請求項12に記載の抗体、請求項
    14から請求項16のいずれか1項に記載の化合物のう
    ち、少なくともいずれか1つを含有することを特徴とす
    る神経変性疾患の防止および/または治療剤。
  22. 【請求項22】 請求項20または請求項21に記載の
    神経変性疾患が、アルツハイマー病および/またはパー
    キンソン病である神経変性疾患の防止および/または治
    療剤。
JP2002287925A 2001-09-28 2002-09-30 新規ユビキチン特異プロテアーゼ Pending JP2003189884A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002287925A JP2003189884A (ja) 2001-09-28 2002-09-30 新規ユビキチン特異プロテアーゼ

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001301580 2001-09-28
JP2001-301580 2001-09-28
JP2002287925A JP2003189884A (ja) 2001-09-28 2002-09-30 新規ユビキチン特異プロテアーゼ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2003189884A true JP2003189884A (ja) 2003-07-08
JP2003189884A5 JP2003189884A5 (ja) 2005-10-27

Family

ID=27615206

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2002287925A Pending JP2003189884A (ja) 2001-09-28 2002-09-30 新規ユビキチン特異プロテアーゼ

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2003189884A (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1540015A4 (en) * 2002-08-30 2006-11-29 Rigel Pharmaceuticals Inc ASSAYS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING THE ACTIVITY OF DEUBIQUITINATING AGENTS MODULATING AGENTS

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1540015A4 (en) * 2002-08-30 2006-11-29 Rigel Pharmaceuticals Inc ASSAYS AND COMPOSITIONS FOR IDENTIFYING THE ACTIVITY OF DEUBIQUITINATING AGENTS MODULATING AGENTS

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5955306A (en) Genes encoding proteins that interact with the tub protein
JPH10501135A (ja) 免疫抑制剤標的蛋白質
JP2007289196A (ja) 癌組織でディファレンシャルに発現される核酸配列
JP2002525058A (ja) プロテインキナーゼkiaa0551の薬剤としての使用
JP4383170B2 (ja) ヒストン脱アセチル化酵素9
JP2002523029A (ja) ヒトヒストンデアセチラーゼ遺伝子hd4
US20070117138A1 (en) Splice variant cannabinoid receptor (cb1b)
CA2281674A1 (en) Parg, a gtpase activating protein which interacts with ptpl1
US7193053B2 (en) Hypoxia-inducible factor 1alpha variants and methods of use
CA2391594A1 (en) Trefoil domain-containing polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP2003523723A (ja) ヘルマンスキー−パドラック症候群タンパク質相互作用タンパク質およびその使用の方法
JP2003517821A (ja) 2786、ヒトアミノペプチダーゼ
JP2003210183A (ja) ヒトIκB−β
JP2003189884A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
JP4232423B2 (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
US20060110769A1 (en) Regulation of novel human prolyl 4-hydroxylases
US20040072268A1 (en) Methods for regulating BRCA1-BRCA2-containing complex activity
US6180384B1 (en) Compounds
WO2000079267A2 (en) Use of hte ubiquitin specific protease usp25 in the treatment, prophylaxis and diagnosis of cancer
JP2003189883A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
JP2002523045A (ja) ヒトrna関連タンパク質
US20040171105A1 (en) Compositions and methods for cleaving IAP
JP4634302B2 (ja) テトラヒドロ葉酸合成酵素遺伝子
JP2002300880A (ja) 新規ユビキチン特異プロテアーゼ
JPWO2004019983A1 (ja) 糖代謝関連遺伝子の転写因子の分解方法、分解阻害方法および分解阻害剤

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050906

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050906

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080930

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090217