JP2007289196A - 癌組織でディファレンシャルに発現される核酸配列 - Google Patents

癌組織でディファレンシャルに発現される核酸配列 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明は、癌細胞でディファレンシャルに発現される新規核酸配列に関する。
【解決手段】癌細胞でディファレンシャルに発現される新規核酸配列にコードされるタンパク質およびペプチド、当該配列およびタンパク質に基づく診断アッセイならびに治療薬、ならびに当該配列およびタンパク質またはペプチドに由来するプローブ、アンチセンス構築物および抗体に関する。対象核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織でディファレンシャルに発現されることが見出された。
【選択図】なし

Description

本発明は、癌組織でディファレンシャルに（differentially）発現される核酸配列、およびそれにコードされるタンパク質、ならびに上記核酸配列に由来するプローブ、コードされたタンパク質に対する抗体、ならびに癌性細胞、特に結腸癌細胞の存在および状態を決定するための診断方法を提供する。
結腸直腸癌腫は、悪性腫瘍性疾患である。西洋世界、特にアメリカ合衆国では、結腸直腸癌腫の発生率が高い。この型の腫瘍は、多くの場合、リンパ管および血管を通して転移する。結腸直腸癌腫の患者の多くは、最終的にはこの疾患により死亡する。実際に、アメリカ合衆国だけで、毎年６２，０００人の人々が結腸直腸癌腫で死亡していると推定される。
しかしながら、初期に診断されれば、癌性組織の外科的除去により、結腸癌は効果的に治療され得る。結腸直腸癌は、結腸直腸上皮に源を発し、典型的に、発達の初期段階中には広範囲に血管新生しない（したがって、浸潤性ではない）。結腸直腸癌は、結腸または直腸の上皮内層での単一突然変異細胞のクローン増殖に起因すると考えられる。身体全体にわたって拡がる、高度に血管新生し、浸潤性で、最終的には転移性の癌への移行には、通常は１０年以上かかる。癌が浸潤前に検出されれば、癌性組織の外科的除去は効果的な療法である。しかしながら、結腸直腸癌は、痛みおよび真っ黒な糞便のような臨床的症状の発現時にのみ検出されることが多い。一般に、かかる症状は、多くの場合転移が起こった後、疾患が十分に確立されている場合にのみ見られ、患者についての予後は、癌性組織の外科的切除の後でさえも乏しい。したがって、結腸直腸癌の初期の検出は、検出がその罹患率を有意に減少させ得るという点で重要である。
内視鏡検査のような侵襲性診断方法により、ポリープのような潜在的に癌性増殖の直接的な視覚による特定、除去、および生検が可能である。内視鏡は、費用が高く、不快であり、本質的に危険であるため、結腸直腸癌の人々を特定するための集団スクリーニング用の実践的なツールではない。結腸直腸癌または前癌の存在を示す特徴のための糞便試料の非侵襲製の分析が初期診断の好ましい代替法であるが、この目標を信頼性高く達成するような既知の診断方法は、利用可能でない。
本発明は、核酸配列、およびそれにコードされるタンパク質、ならびに上記核酸配列に由来するプローブ、コードされたタンパク質に対する抗体、ならびに癌性細胞、特に結腸癌細胞を検出するための診断方法を提供する。本明細書中に開示する配列は、結腸癌細胞系および／または結腸癌組織でディファレンシャルに発現されることが見出されている。
一態様では、本発明は、配列番号１〜５０３を含む単離核酸配列、またはそれらに相補的な配列を提供する。
別の態様では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェント（stringent）な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。
別の態様では、上記核酸は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの、完全長以下の、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したヌクレオチドに相当する配列に対して少なくとも約８０％〜約１００％同一である。
別の態様では、本発明は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸を提供する。関連実施形態では、上記核酸は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの、完全長以下の、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したヌクレオチドに相当する配列に対して少なくとも約８０％〜約１００％同一である。
一実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、および上記ヌクレオチド配列を発現ベクターとして使用するのに適切とするように、上記ヌクレオチド配列に操作可能に連結される転写調節配列を含む核酸を提供する。別の実施形態では、上記核酸は、原核または真核細胞で複製することが可能な発現ベクターに含まれてもよい。関連実施形態では、本発明は、上記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸の導入遺伝子を細胞に組み込まれたトランスジェニック動物を提供する。上記導入遺伝子は、上記核酸の発現レベル、上記核酸のｍＲＮＡ転写体の安定性、または上記核酸のコード産物の活性を改変させる。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３のヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列を含む実質的に純粋な核酸を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３の配列、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの、完全長以下の、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする実質的に純粋な核酸を提供する。
本発明はまた、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列の１つの、完全長以下の、少なくとも１２個、少なくとも２５個、または少なくとも５０個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼ、好ましくは内因性エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に耐性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド類縁体も提供する。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３、またはそれらに相補的な配列の少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したヌクレオチドを含む実質的に精製されたオリゴヌクオレチドを含むプローブ／プライマーを提供する。
別の実施形態では、本発明は、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーであって、配列番号１〜１１０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの完全長以下の、配列番号１〜１１０３から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したオリゴヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有するプローブ／プライマーを提供する。好ましい実施形態では、上記プローブは、標的核酸と選択的にハイブリダイズする。別の実施形態では、上記プローブは、それらに結合され、かつ検出可能な標識基を含んでもよい。上記標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子から選択され得る。本発明はさらに、固体支持体に結合された上述の少なくとも約１０個、少なくとも約２５個、少なくとも約５０個、または少なくとも約１００個の異なるプローブを有するアレイを提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の少なくとも１つの核酸の、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含み、細胞の表現型の決定方法に関し、ここで上記核酸は、少なくとも２つだけ、少なくとも５つだけ、少なくとも２０だけ、または少なくとも５０だけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。
さらなる別の実施形態では、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４からなる群から選択される配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされる少なくとも１つのタンパク質の、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法に関し、ここで上記タンパク質は、少なくとも２つだけ、少なくとも５つだけ、少なくとも２０だけ、少なくとも５０までだけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。
本発明はさらに、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法を提供し、ここで上記ポリペプチドは、少なくとも２つだけ、少なくとも５つだけ、少なくとも２０だけ、少なくとも５０までだけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１つの核酸の、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法に関し、ここで上記核酸は、少なくとも２つだけ、少なくとも５つだけ、少なくとも２０だけ、少なくとも５０だけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。
別の態様では、本発明は、対象核酸にコードされるポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはそれら少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個のアミノ酸を含む断片に関する。さらに、これらのポリペプチドと免疫反応性のある抗体を提供する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の配列の１つまたは複数にコードされるポリペプチドに関する。
さらなる態様では、本発明は、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のうちの１つの配列を有するポリペプチドに関する。
さらなる別の態様では、本発明は診断方法を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列の１つの完全長以下の、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の配列で表される少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを供給することと、患者からの細胞の試料を獲得することと、任意に、実質的に全てが非癌性である第２の細胞試料を供給することと、上記プローブを、ストリンジェントな条件下で、上記第１および第２の細胞試料それぞれのｍＲＮＡと接触させることと、（ａ）上記第１の細胞試料のｍＲＮＡとの上記プローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）上記第２の細胞試料のｍＲＮＡとの上記プローブのハイブリダイゼーションの量と比較することであって、該比較において、上記第２の細胞試料の上記ｍＲＮＡとの上記ハイブリダイゼーションの量と比較した場合の上記第１の細胞試料の上記ｍＲＮＡとの上記ハイブリダイゼーションの量における少なくとも２つだけ、少なくとも５つだけ、少なくとも２０だけ、または少なくとも５０だけからなるファクターの差異が、上記第１の細胞試料中の細胞の該表現型であることを示していることによって、比較することとによる、患者からの細胞の表現型の決定方法に関する。表現型の決定には、その用語が本明細書中で使用される場合に遺伝子型の決定が包含される。
別の実施形態では、本発明は、患者から単離される細胞試料中の、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のレベルを測定するための、上述のプローブ／プライマーを含む、癌性細胞または組織の存在を同定するための試験キットを提供する。ある実施形態では、上記キットは、キットを使用するための指示書、上記細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、核酸にハイブリダイゼーションを受けやすくさせるための溶液、細胞を溶解させるための溶液、または核酸精製用の溶液をさらに含んでもよい。
別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされる少なくとも１つのタンパク質の、正常または対照細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法を提供し、ここで上記タンパク質は、少なくとも２だけ、少なくとも５だけ、少なくとも２０だけ、少なくとも５０だけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。一実施形態では、上記タンパク質レベルは、イムノアッセイで検出される。本発明はまた、配列番号１〜１１０３のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸（例えばｍＲＮＡ）の細胞中の存在または非存在の決定方法であって、上記細胞を上述のプローブと接触させることを含む方法に関する。本発明はさらに、配列番号１〜１１０３のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされる対象ポリペプチドの細胞中の存在または非存在の決定方法であって、上記細胞を上述の抗体と接触させることを含む方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜１１０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列中の異常突然変異（例えば、核酸の欠失、挿入、または置換）または異常メチル化の存在の決定方法であって、患者から細胞の試料を収集することと、上記試料の上記細胞から核酸を単離することと、上記核酸のハイブリダイゼーションおよび／または増幅が起きるような条件下で、上記核酸を、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列の核酸配列と、ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプローブ／プライマーと接触させることと、増幅産物の存在、非存在またはサイズを、正常な細胞の増幅産物と比較することとを含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のいずれか１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるタンパクに特異的な抗体を含む、癌細胞の存在を同定するための試験キットを提供する。ある実施形態では、上記キットは、キットを使用するための指示書をさらに含む。ある実施形態では、上記キットは上記細胞を懸濁または固定するための溶液、検出可能なタグまたは標識、ポリペプチドに抗体の結合を受けやすくさせるための溶液、細胞を溶解させるための溶液、またはポリペプチド精製用の溶液をさらに含んでもよい。
さらに別の態様では、本発明は、対象核酸を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中の発現レベルを変更させる作用物質は、細胞を供給することと、上記細胞を試験作用物質で処理することと、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の上記細胞中のレベルを決定することと、処理細胞中の上記核酸の発現レベルを、未処理細胞中の核酸の発現レベルと比較することであって、該比較において、未処理細胞中の上記核酸の該発現レベルに対する処理細胞中の上記核酸の該発現レベルの変化が、細胞中の上記核酸の該発現レベルを変更させる作用物質であることを示していることによって、比較することとにより同定される。本発明はさらに、この方法により同定される作用物質を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸にコードされるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸を含む薬学的組成物に関する。
さらに別の態様では、本発明は、対象核酸を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中の発現レベルを変更させる作用物質は、細胞を供給することと、上記細胞を試験作用物質で処理することと、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の上記細胞中の発現レベルを決定することと、処理細胞中の上記核酸の発現レベルを、未処理細胞中の核酸の発現レベルと比較することであって、該比較において、未処理細胞中の上記核酸の該発現レベルに対する処理細胞中の上記核酸の該発現レベルの変化が、細胞中の上記核酸の該発現レベルを変更させる作用物質であることを示していることによって、比較することとにより同定される。
本発明はさらに、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３の配列を有するポリペプチドの細胞中の発現レベルを変更させる作用物質の同定方法であって、細胞を供給することと、上記細胞を試験作用物質で処理することと、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチドの１つまたは複数に特異的な抗体と上記細胞を反応させることにより、上記細胞中の配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３の１つまたは複数のポリペプチドの発現レベルを決定することと、処理細胞中の上記ポリヌクレオチドの上記発現レベルを、未処理細胞中の同じポリペプチドの発現レベルと比較することとであって、該比較において、未処理細胞中の上記核酸の上記発現レベルに対する処理細胞中の上記核酸の上記発現レベルの変化が、細胞中の上記ポリペプチドの上記発現レベルを変更させる作用物質であることを示していることによって、比較することとを含む方法を提供する。
本発明はさらに、上記方法により同定される作用物質を含む薬学的組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸にコードされるポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の１つまたは複数にコードされるポリペプチドに結合する１つまたは複数の抗体を含む薬学的組成物を提供する。さらなる実施形態で、本発明は、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３の１つまたは複数のポリペプチドに結合する１つまたは複数の抗体を含む薬学的組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸を含む薬学的組成物に関する。
一実施形態では、本発明は、患者試料における癌の検出方法に関し、ここで配列番号１〜４４７０にコードされるタンパク質に対する抗体が、上記患者試料中のタンパク質と反応するのに使用される。さらなる実施形態では、本発明は患者試料における癌の検出方法に関し、ここで配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の１つまたは複数にコードされるタンパク質に対する抗体が、上記患者試料中のタンパク質と反応するのに使用される。さらなる実施形態では、本発明は、患者試料における癌の検出方法を提供し、ここで配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３の配列を有するタンパク質に対する抗体が、上記患者試料中のタンパク質と反応するのに使用される。
本発明は、開示するヌクレオチド配列（配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４）を有する核酸、ならびにこれらの配列に相当する完全長ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、および遺伝子、ならびにこれらの核酸および遺伝子にコードされるポリペプチドおよびタンパク質、およびそれらの断片に関する。特に、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の完全長ｃＤＮＡ配列、およびそれらにコードされ、それぞれ配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３で示されるポリペプチド配列に関する。本明細書中に開示する４４９４配列は、この配列を、公的に利用可能なデータベースに開示されるものと比較することで分析した。検索結果に基づいて、配列番号１〜５０３は新規配列を含有し、配列番号５０４〜１１０３は既知のＥＳＴ配列を含有し、配列番号１１０４〜４４９４は既知の配列を含有することを見出した。
配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の核酸にコードされるポリペプチドおよびタンパク質、特に配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチド配列も、本発明に包含される。これらのポリペプチド及び核酸をコードすることができる様々な核酸は、ほとんどのアミノ酸が１つ以上のトリプレットコドンにコードされるという理由で、遺伝コードの縮重により異なる。かかるコドンの独自性は、当該技術分野で既知であり、この情報は、本発明の範囲内の核酸を構築するのに使用することができる。一実施形態では、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチド配列は、それぞれ配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の完全長ｃＤＮＡ配列にコードされる。
本発明の核酸ならびに関連ｃＤＮＡおよび遺伝子にコードされるポリペプチドおよびタンパク質の変異体であるポリペプチドおよびタンパク質をコードする核酸もまた、本発明の範囲内である。変異体は、野生型タンパク質の生物活性を増強、追加、または減少させる１つまたは複数のアミノ酸置換を有する点で、野生型タンパク質と異なる。いったんアミノ酸変更が選択されれば、変異体をコードする核酸は、本発明により構築される。
以下の詳細な説明は、上記核酸に相当する完全長ｃＤＮＡおよびヒト遺伝子を獲得または作製する方法、これらの核酸および遺伝子を発現させる方法、上記遺伝子の構造モチーフを特定する方法、核酸に相当する遺伝子にコードされるタンパク質の機能を特定する方法、マッピングおよび組織プロファイリングでプローブとして核酸を使用する方法、抗体を産生させるために相当するポリペプチドおよびタンパク質を使用する方法、および上記核酸、ポリペプチド、およびタンパク質を診断の目的で使用する方法を開示する。
本明細書中に開示する配列は、結腸癌細胞系および／または結腸癌組織でディファレンシャルに発現されることが見出されており、したがって、細胞または組織試料中の結腸癌の存在を決定するのに有用である。本配列は、他の型の癌の存在または状態を決定するのにも有用である。
したがって、本発明の好ましい態様は、腫瘍細胞または組織、特に結腸癌組織または細胞中でディファレンシャルに発現される核酸、かかる核酸にコードされるポリペプチド、これらのポリペプチドと免疫反応性のある抗体、およびかかる組成物の調製物に関する。さらに、本発明は、例えば対象核酸の発現を含む障害を検出および治療するための診断用および治療用アッセイならびに試薬を提供する。
Ｉ．概説 本発明は、ヒト腫瘍、特に固形腫瘍、例えば癌腫および肉腫（例えば乳癌または結腸癌のような）に存在する癌性細胞を同定および／または類別するための組成物および方法に関する。その最も広い態様では、上記方法は、関連性正常細胞または組織と比較して、癌細胞系および／または癌組織中でディファレンシャルに発現される核酸を使用し、それらを用いて、腫瘍形成に関与する事象である特定遺伝子の発現のアップレギュレーションおよび／またはダウンレギュレーションにより腫瘍細胞を同定または類別する。
癌遺伝子のようなある種の遺伝子のアップレギュレーションまたは増加した発現は、悪性の増殖を促進するように作用する。腫瘍サプレッサー遺伝子のような遺伝子のダウンレギュレーションまたは減少した発現も、悪性の増殖を促進する。したがって、遺伝子のいずれかの型の発現の変更は、被験体が癌、例えば結腸癌を発達させる危険性があるかどうかを決定するための潜在的な診断指標である。
したがって、一態様では、本発明はまた、ヒト腫瘍細胞および組織、特に結腸癌細胞および組織のための、核酸マーカーのようなバイオマーカーを提供する。本発明はまた、これらの核酸マーカーにコードされるタンパク質を提供する。本発明はまた、かかる癌細胞の治療、および結腸癌のような癌性状態の治療に有用な薬剤の同定方法を特色とする。従来の方法と異なり、本発明は、発達の初期段階に癌細胞を同定する手段を提供し、その結果、前悪性細胞をそれらがヒトの身体全体に拡がる前に同定することができる。これにより、潜在的に癌性の状態の初期検出、および身体全体に癌性細胞が拡がる前のまたは回復不能の癌性状態へ発達する前の癌性状態の治療が可能である。
ＩＩ．定義 便宜上、明細書、実施例、および併記の特許請求の範囲で使用する特定の用語および語句の意味を以下に提供する。
本発明の核酸に適用する場合、「異常発現」という用語は、健常組織中の当該核酸の発現レベルと異なるか、または健常被験体中に存在するポリペプチドの活性と異なる当該核酸の発現レベルを指す。ポリペプチドの活性は、それがその天然対応物の活性よりも強力であるため異常であり得る。あるいは、活性は、それがその天然対応物の活性に対して弱いか、または存在しないために異常であり得る。異常活性はまた、活性の変化であり得る。例えば、異常ポリペプチドは、異なる標的ペプチドと相互作用することができる。細胞は、当該遺伝子の過剰発現および過小発現に起因して、異常発現レベルの遺伝子を有することができる。
本明細書で使用する場合、「アゴニスト」という用語は、タンパク質の生理活性を模倣するか、またはアップレギュレートする（増強または補足する）作用物質を指すことを意味する。アゴニストは、野生型タンパク質、または野生型タンパク質の少なくとも１つの生理活性を有するそれらの誘導体であり得る。アゴニストはまた、遺伝子の発現をアップレギュレートするか、またはタンパク質の少なくとも１つの生理活性を増加させる化合物であり得る。アゴニストは、ポリペプチドの、別の分子、例えば標的ペプチドまたは核酸との相互作用を増加させる化合物であり得る。
「対立遺伝子」という用語は、本明細書中では「対立遺伝子変異体」と交換可能に使用され、遺伝子またはその一部の代替形態を指す。対立遺伝子は、相同染色体上の同じ遺伝子座または位置を占める。被験体が遺伝子の２つの同一対立遺伝子を有する場合、その被験体は、当該遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合性であると言える。被験体が遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、その被験体は、当該遺伝子に関してヘテロ接合性であると言える。特定遺伝子の対立遺伝子は、単一ヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドが互いに異なることがあり、ヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を含むことがある。遺伝子の対立遺伝子はまた、突然変異を含有する遺伝子の形態であり得る。
「遺伝子の多型領域の対立遺伝子変異体」という用語は、他の個体中の遺伝子の領域に見出される数個のヌクレオチド配列の１つを有する遺伝子の領域を指す。
本明細書で使用する場合、「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質の少なくとも１つの生理活性をダウンレギュレートする（例えば、抑制または阻害する）作用物質を指すことを意味する。アンタゴニストは、タンパク質と別の分子（例えば、標的ペプチドまたは酵素基質）との間の相互作用を阻害または減少させる化合物であり得る。アンタゴニストはまた、遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、または存在する発現タンパク質の量を減少させる化合物であり得る。
本明細書で使用する場合「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）の全抗体を包含し、また脊椎動物（例えば、哺乳類）のタンパク質と特異的に反応性を有するそれらの断片を包含することを意図する。抗体は、従来の技法を用いて断片化することができ、断片は、全抗体に関して上述するのと同じ様式で有用性に関してスクリーニングすることができる。したがって、この用語は、あるタンパク質と選択的に反応することが可能な抗体分子のタンパク質分解的切断部分または組換え的調製部分のセグメントを包含する。かかるタンパク質分解性断片および／または組換え断片の非限定的な例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、およびペプチドリンカーにより連結されるＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）が挙げられる。ｓｃＦｖは、共有結合または非共有結合されて、２つまたはそれ以上の結合部位を有する抗体を形成する。本発明は、抗体および組換え抗体のポリクローナル、モノクローナル、または他の精製調製物を包含する。
「アポトーシス」の現象は、既知であり、プログラムされた細胞死として記載することができる。既知であるように、アポトーシスは、毒性物質または他の外部の影響により死滅される結果として細胞が死亡する現象である「ネクローシス」と対比される。アポトーシスは、核凝縮、膜小胞形成、およびＤＮＡの断片化を伴い、それらは全て、一般的に顕微鏡検査で目にすることができる。
核酸の異常発現「に関連する」もしくは「を特徴とする」疾患、障害、または状態とは、核酸の発現と統計学的に相関させることができる被験体における疾患、障害、または状態を指す。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチドの生理活性断片」という用語は、完全長のポリペプチドの断片であって、野生型ポリペプチドの活性を特異的に作動する(agonize)（模倣する）か、または拮抗する（阻害する）断片を指す。生理活性断片は、好ましくは、完全長タンパク質が結合することができる少なくとも１つの他の分子、例えばタンパク質、小分子、またはＤＮＡと相互作用することが可能な断片である。
「生物活性」または「生理活性」または「活性」または「生物学的機能」は、本明細書中では交換可能に使用され、ポリペプチド（その自然立体配座であろうと変性立体配座であろうと）により、またはそれらの任意の部分配列により、直接的または間接的に実施されるエフェクターあるいは抗原機能を意味する。生物活性としては、ポリペプチドへの結合、他のタンパク質または分子への結合、ＤＮＡ結合タンパク質としての、転写調節因子としての活性、損傷したＤＮＡを結合する能力等が挙げられる。生理活性は、対象ポリペプチドに直接影響を及ぼすことで調節することができる。あるいは、生理活性は、例えば相当する遺伝子の発現を調節することで、ポリペプチドレベルを調節することにより変化させることができる。
「バイオマーカー」という用語は、生物学的分子、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡを含む核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホルモン等を指し、それらの存在または濃度を検出し、疾患状態のような既知の状態と相関させることができる。
「細胞」、「宿主細胞」、または「組換え宿主細胞」は、本明細書中で交換可能に使用される用語である。かかる用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または潜在的子孫を指すことが理解されよう。突然変異または環境的影響により、続く世代ではある種の改変が起こり得るため、かかる子孫は、実際には親細胞とは同一でない場合があるが BR>A依然として本明細書中で使用される用語の範囲内に包含される。
「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、対象ペプチドの１つをコードする第１のアミノ酸配列と、対象ポリペプチドの任意のドメインにとって外来性であり、かつそれとは実質的に相同的でないドメイン（例えば、ポリペプチド部分）を規定する第２のアミノ酸配列との融合である。キメラポリペプチドは、第１のポリペプチドも発現する生物中に見出される（異なるポリペプチドであろうとも）外来ドメインを提供し得る。あるいは、キメラポリペプチドは、種々の種類の生物により発現されるポリペプチド構造の「種間」、「遺伝子間」等の融合であってもよい。一般に、融合ポリペプチドは、一般式（Ｘ）ｎ−（Ｙ）ｍ−（Ｚ）ｎ（式中、Ｙは、対象ポリペプチドの一部を表し、ＸおよびＺはそれぞれ独立して、存在しないか、あるいは生物中に見出される天然配列に関連しないか、または対象配列と近接したポリペプチド鎖として見出されないアミノ酸配列を表し、ｍは、１以上の整数であり、各存在のｎは独立して、１以上の整数である（ｎおよびｍは、好ましくは５または１０以下である））で表すことができる。
「送達複合体」は、ターゲッティング手段（例えば、核酸、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの標的細胞表面への高度の親和性結合、および／または標的細胞による細胞または核の増加した取り込みをもたらす分子）を意味するものとする。ターゲッティング手段の例としては、ステロール（例えばコレステロール）、脂質（例えばカチオン脂質、ビロソームまたはリポソーム）、ウイルス（例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルス）、または標的細胞特異的結合作用物質（例えば、標的細胞特異的受容体に認識されるリガンド）が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内在化の前にかなりの脱共役を防止するのに試験管内で（ｉｎ ｖｉｖｏで）で十分に安定である。しかしながら、複合体は、細胞内の適切な条件下で切断可能であり、その結果、核酸、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが、機能的形態で放出される。
既知であるように、遺伝子または特定のポリペプチドは、個体ゲノム内の単一または複数コピーに存在してもよい。かかる複製遺伝子は、同一であってもよく、あるいはヌクレオチド置換、付加または欠失を含むある種の改変（それらは全て、実質的に同じ活性を有するポリペプチドを依然としてコードする）を有してもよい。したがって、「ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列」という用語は、特定の個体内の１つまたは複数の遺伝子を指してもよい。さらに、ヌクレオチド配列中のある種の差異は、個々の生物間に存在してもよく、それは対立遺伝子と呼ばれる。かかる対立遺伝子の差異は、コードされるポリペプチドのアミノ酸のアミノ酸配列に差異を生じても生じなくてもよいが、依然として同じ生物活性を有するポリペプチドをコードする。
「等価な」という用語は、機能的に等価なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含すると解釈される。等価なヌクレオチド配列は、対立遺伝子変異体のような１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列を包含し、したがって、遺伝コードの縮重により配列番号１〜４４９４で示される核酸にヌクレオチド配列とは異なる配列を包含する。
本明細書中で使用する場合、「遺伝子」、「組換え遺伝子」、および「遺伝子構築物」は、エキソン配列、および任意にイントロン配列の両方を含む、オープンリーディングフレームと結合される本発明の核酸を指す。
「組換え遺伝子」は、ポリペプチドをコードし、エキソン配列を含む核酸を指すが、それは、例えば関連または未関連染色体遺伝子に由来するイントロン配列を任意に含んでもよい。「イントロン」という用語は、タンパク質に翻訳されず、一般にエキソンの間に見出される所定の遺伝子に存在するＤＮＡ配列を指す。
細胞の「増殖」または「増殖状態」という用語は、細胞の増殖性状態、ならびにその分化状態を指す。したがって、この用語は、細胞が例えばＧ０、Ｇ１、Ｇ２、または前期、中期、または終期、もしくは後期である細胞周期の期、ならびにその分化状態（例えば未分化、部分的分化、または完全分化）を指す。限定されることは望まないが、細胞の分化は、通常、細胞の増殖速度の減少により達成される。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間、または２つの核酸分子間の配列類似性を指し、同一性は、より厳格な比較である。相同性および同一性はそれぞれ、比較の目的で整列され得る各配列中の位置を比較することで決定することができる。比較した配列中の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一である。核酸配列間の相同性または類似性または同一性度は、核酸配列により共有される位置での同一または適合ヌクレオチドの数の関数である。アミノ酸配列の同一性度は、アミノ酸配列により共有される位置での同一アミノ酸の数の関数である。アミノ酸配列の相同性または類似性度は、アミノ酸配列により共有される位置でのアミノ酸、すなわち構造的に関連するアミノ酸の数の関数である。「未関連」または「非相同性」配列は、本発明の配列の１つと、４０％未満の同一性であるが、好ましくは少なくとも２５％未満の同一性を共有する。
「％同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列間、または２つのヌクレオチド配列間の配列同一性を指す。同一性はそれぞれ、比較の目的で整列され得る各配列中の位置を比較することで決定することができる。比較した配列中の等価な位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一である。等価な部位が同じかまたは類似のアミノ酸残基（例えば、立体的性質および／または電子的性質が類似）により占められる場合、分子はその位置で相同である（類似である）と呼ぶことができる。相同性、類似性、または同一性のパーセントとしての表現は、比較した配列により共有される位置での同一または類似のアミノ酸の数の関数である。ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺを含む様々なアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが使用され得る。ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴは、ＧＣＧ配列分析パッケージ(Universityof Wisconsin, Madison, Wis.)の一部として入手可能であり、例えばデフォルト設定を用いて使用することができる。ＥＮＴＲＥＺは、NationalCenter for Biotechnology Information, National Library of Medicine, NationalInstitutes of Health, Bethesda, Md.から入手可能である。一実施形態では、２つの配列の％同一性は、例えばギャップウェイト１を用いてＧＣＧプログラムにより決定することができ、各アミノ酸ギャップには、２つの配列間で単一のアミノ酸またはヌクレオチドミスマッチが存在するかのように重みをかける。
アラインメント用の他の技法は、Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods forMacromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., adivision of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calfornia, USAに記載されている。好ましくは、配列中のギャップを容認するアラインメントプログラムが、配列を整列するのに利用される。Smith-Watermanは、配列アラインメントにおいてギャップを容認するアルゴリズムの１つの型である。Meth.Mol. 70-187 (1997)を参照されたい。また、NeedlemanとWunschのアラインメント方法を用いたＧＡＰプログラムも、配列を整列するのに利用することができる。代替的検索戦略は、ＭＰＳＲＣＨソフトウェアを使用し、それはＭＡＳＰＡＲコンピュータ上で作動する。ＭＰＳＲＣＨは、超並列コンピュータ上で配列をスコア付けするためにSmith-Watermanアルゴリズムを使用する。このアプローチは、関連性が遠いマッチを取得する能力を改善し、小さなギャップおよびヌクレオチド配列誤差に特に寛容である。核酸コードアミノ酸配列を用いて、タンパク質およびＤＮＡデータベースを検索することができる。
個々の配列を有するデータベースは、上述のMethods in Enzymology. ed. Doolottleに記載されている。データベースとしては、例えば、Genbank、ＥＭＢＬ、およびDNADatabase of Japan（ＤＤＢＪ）が挙げられる。
好ましい核酸は、配列番号１〜４４９４のうちの１つで示される配列の核酸配列に対して少なくとも７０％、より好ましくは８０％同一の、さらに好ましくは９０％、よりいっそう好ましくは少なくとも９５％同一の配列を有する。配列番号１〜４４９４のうちの１つで表される核酸配列と少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９８〜９９％同一の核酸も当然のことながら本発明の範囲内である。好ましい実施形態では、核酸は、哺乳類のものである。
本明細書中で使用する場合「相互作用する」という用語は、本質的にタンパク質−タンパク質間の、タンパク質−核酸間の、核酸−核酸間の、およびタンパク質−小分子間または核酸−小分子間の相互作用のような、分子間の検出可能な相互作用（例えば、生化学的相互作用）を包含することを意味する。タンパク質−タンパク質間の、タンパク質−核酸間の、核酸−核酸間の、およびタンパク質−小分子間または核酸−小分子間の相互作用の例としては、結合、修飾、切断、プロセシング、または触媒を挙げることができる。
ＤＮＡまたはＲＮＡのような核酸に関して本明細書中で使用する場合「単離」という用語は、高分子の天然源に存在する、それぞれ他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子を指す。本明細書中で使用する場合、単離という用語はまた、組換えＤＮＡ技法で産生される場合には細胞物質、ウイルス物質、または培地を、あるいは化学的に合成される場合には化学前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドを指す。さらに、「単離核酸」は、断片としては天然に存在せず、自然状態では見出されない核酸断片を包含することを意味する。「単離」という用語はまた、他の細胞タンパク質から単離されるポリペプチドを指すために本明細書中で使用され、精製および組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。
本明細書中で使用する場合「調節される」および「ディファレンシャルに調節される」という用語は、アップレギュレーション（すなわち、活性化または刺激、例えば作動することまたは増強することによる）およびダウンレギュレーション（すなわち、阻害または抑制、例えば拮抗すること、減少させること、または阻害することによる）の両方を指す。
「突然変異遺伝子」という用語は、突然変異遺伝子をもたない被験体に対して、突然変異遺伝子を有する被験体の表現型を変更させることが可能である遺伝子の対立遺伝子形態を指す。被験体が改変した表現型を有するためにこの突然変異に関してホモ接合性でなくてはならない場合、突然変異は、劣性であると言える。突然変異遺伝子の１つのコピーが被験体の遺伝子型を変更させるのに十分である場合、突然変異は、優性であると言える。被験体が突然変異遺伝子の１つのコピーを有し、ホモ接合性の被験体の表現型とヘテロ接合性の被験体の表現型（当該遺伝子に関して）の中間の表現型を有する場合、突然変異は、共優性であると言える。
「Ｎ」の称号は、それが添付の配列表中に見られる場合、相当するヌクレオチドの同一性が未知であることを示す。したがって、「Ｎ」は、必ずしも任意のヌクレオチド、例えばＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧによる置換が可能であると解釈されず、むしろその同一性が最終的に決定されたヌクレオチドの位置を保持するものと解釈される。
本発明の「非ヒト動物」には、げっ歯類、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタのような哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等が包含される。好ましい非ヒト動物は、ラットおよびマウスを含むげっ歯類ファミリー、最も好ましくはマウスから選択されるが、アフリカツメガエル属の成員のようなトランスジェニック両性類、およびトランスジェニック鳥類もまた、例えば胚形成および組織形成に影響を及ぼすことができる作用物質を認識および同定するための重要なツールを提供することができる。「キメラ動物」という用語は、動物の幾つかの細胞であるが全てではない細胞において、組換え遺伝子が見出されるか、または組換え遺伝子が発現される動物を指すのに本明細書中で使用される。「組織特異的キメラ動物」という用語は、組換え遺伝子の１つが、ある組織では存在し、かつ／または発現もしくは崩壊されるが、他の組織ではそうではないことを示す。
本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチドを指す。この用語はまた、等価体、ヌクレオチド類縁体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡの類縁体、ならびに記載する実施形態に適用可能である場合、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを包含することが理解されるはずである。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、核酸と称され得る分子の代表例である。
「配列番号ｘのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列」という用語は、配列番号ｘを有する核酸鎖の相補鎖のヌクレオチド配列を指す。「相補鎖」という用語は、「相補体」という用語と交換可能に本明細書中で使用される。核酸鎖の相補体は、コード鎖の相補体または非コード鎖の相補体であり得る。本明細書中で使用する場合、配列番号ｘに対する「相補鎖」は、配列番号ｘに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列である。
「多型」という用語は、遺伝子またはその一部（例えば、対立遺伝子変異体）の１つを超える形態の共存を指す。少なくとも２つの異なる形態、すなわち２つの異なるヌクレオチド配列が存在する遺伝子の一部を「遺伝子の多型領域」と呼ぶ。多型領域は、単一ヌクレオチドであり得る。その独自性は、異なる対立遺伝子で異なる。多型領域はまた、数個のヌクレオチド長であり得る。
「多型遺伝子」とは、少なくとも１つの多型領域を有する遺伝子を指す。
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」という用語は、プロモーターに操作可能に連結される選択ＤＮＡ配列の発現を調節し、細胞で選択ＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡ配列を意味する。この用語は、「組織特異的」プロモーター、すなわち、特定細胞（例えば、特定組織の細胞）でのみ選択ＤＮＡ配列の発現を達成するプロモーターを包含する。この用語はまた、主としてある組織で選択ＤＮＡの発現を調節するが、他の組織でも同様に発現を引き起こす、いわゆる「漏出(leaky)」プロモーターを包含する。この用語はまた、非組織特異的プロモーター、および構成的に発現されるプロモーターまたは誘導性のプロモーター（すなわち、発現レベルが制御され得る）を包含する。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物を言及する場合に、本明細書中で交換可能に使用される。
「組換えタンパク質」という用語は、組換えＤＮＡ技法により産生される本発明のポリペプチドを指し、この技法では概して、ポリペプチドをコードするＤＮＡを適切な発現ベクターに挿入し、続いてそれを用いて宿主細胞を形質転換して、異種タンパク質を産生する。さらに、組換え遺伝子に関して、「に由来する」という語句は、天然ポリペプチドのアミノ酸配列、または天然に存在する形態のポリペプチドの置換および欠失（切断を含む）を含む突然変異により生成されるそれらに類似したアミノ酸配列を有するタンパク質を、「組換えタンパク質」の意味の内部に包含することを意味する。
本明細書中で使用する場合「小分子」は、約５ｋＤ未満、最も好ましくは約４ｋＤ未満の分子量を有する成分を指すことを意味する。小分子は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似体、炭水化物、脂質または他の有機（炭素含有）もしくは無機分子であり得る。多くの製薬会社は、化学的および／または生物学的混合物、多くの場合は真菌、細菌または藻類抽出物の広範なライブラリーを有しており、それらを本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングして、生理活性を調節する化合物を同定することができる。
本明細書中で使用する場合、「特異的にハイブリダイズする」または「特異的に検出する」という用語は、配列番号１〜４４９４、またはそれらに相補的な配列、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体のうちのいずれかで示される核酸の、例えば約６個、１２個、１５個、２０個、３０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、３５０個、４００個、５００個、７５０個、または１０００個の連続したヌクレオチドの少なくとも一部にハイブリダイズする、本発明の核酸分子の能力を指し、したがって、本発明の核酸分子は、異なるタンパク質をコードする細胞核酸（例えばｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）には１５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満のバックグラウンドハイブリダイゼーションを有する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、特定核酸のみを検出し、例えばそれは、類似もしくは関連核酸、またはその相補体に、実質的にハイブリダイズしない。
「転写調節配列」は、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサー、およびプロモーターのようなＤＮＡ配列を指すために、明細書全体にわたって使用される包括的な用語である。好ましい実施形態では、遺伝子の１つの転写は、発現が意図される細胞型での組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下にある。また、組換え遺伝子は、天然に存在する形態のポリペプチドの転写を制御する配列と同じであるか、または異なる転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されよう。
本明細書中で使用する場合、「トランスフェクション」という用語は、核酸媒介性遺伝子移入によりレシピエント細胞に、例えば発現ベクターを介して、核酸を導入することを意味する。本明細書中で使用する場合、「形質転換」は、細胞の遺伝子型が外因性ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞取り込みの結果として変更されるプロセスを指し、形質転換細胞は、組換え形態のポリペプチドを発現し、または移入される遺伝子からのアンチセンス発現の場合には、標的遺伝子の発現は崩壊される。
本明細書中で使用する場合「治療すること」という用語は、状態または疾患の少なくとも１つの症状を治癒または回復することを包含することを意図する。
「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターの他の型は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、それらが連結される核酸の自己複製および／または発現が可能なものである。ベクターが操作的に結合される遺伝子の発現を誘導することが可能なベクターを、本明細書中では「発現ベクター」と称する。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用な発現ベクターは、概して、ベクターの形態では染色体に結合しない環状二重鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」の形態であることが多い。本明細書中では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」は、交換可能に使用される。しかしながら、本発明は、等価な機能を供し、その後に当該技術分野で既知になっているような他の型の発現ベクターも包含することが意図される。
「野生型対立遺伝子」という用語は、被験体中に２つのコピーが存在する場合に野生型の表現型をもたらす遺伝子の対立遺伝子を指す。遺伝子中のあるヌクレオチドの変化が、ヌクレオチド変化を有する遺伝子の２つのコピーを有する被験体の表現型に影響を及ぼし得ないため、特定遺伝子の幾つかの異なる野生型対立遺伝子は存在し得る。
ＩＩＩ．本発明の核酸 以下に記載するように、本発明の一態様は、単離核酸、かかる核酸の変異体、および／または等価体に関する。
本発明の核酸は、腫瘍細胞、例えば結腸癌由来細胞系、および結腸癌組織でディファレンシャルに発現される（正常細胞または組織、例えば正常結腸組織および／または正常非結腸組織での発現レベルに対して）と同定された。このディファレンシャルに発現される配列は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列を含む。別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４９４の配列のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む。好ましい態様では、本発明の配列は、約５０％同一性、好ましくは約７０％同一性、より好ましくは約９０％同一性、よりいっそう好ましくは約１００％同一性で、配列番号１〜４４９４にハイブリダイズする。好ましい実施形態では、対象核酸は、少なくとも２だけ、好ましくは少なくとも５だけ、より好ましくは少なくとも２０だけ、よりいっそう好ましくは少なくとも５０だけからなるファクターがディファレンシャルに発現される。好ましい核酸は、結腸癌組織および結腸癌細胞系の両方でディファレンシャルに発現されると同定される配列である。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織および／または結腸癌由来細胞系でアップレギュレートされる。別の実施形態では、本発明の核酸は、腫瘍細胞、特に結腸癌組織および／または結腸癌由来細胞系でダウンレギュレートされる。
異常増殖性の細胞において、癌遺伝子のようなアップレギュレートされる遺伝子、または腫瘍サプレッサーのようなダウンレギュレートされる遺伝子は、診断用途または治療用途のための標的として使用することができる。例えば、ｃｄｃ２遺伝子のアップレギュレーションは、有糸分裂を誘発する。有糸分裂不活性化因子であるｍｙｔ１遺伝子の過剰発現は、ｃｄｃ２の活性を負に調節する。したがって、ｃｄｃ２をアップレギュレートするか、またはｍｙｔ１をダウンレギュレートすることで、異常増殖が誘発され得る。同様に、ｐ５３およびＲｂのような腫瘍サプレッサーのダウンレギュレーションは、腫瘍形成に関与している。
特に好ましいポリペプチドは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の核酸配列に対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９７％、または９８％類似の核酸配列にコードされるポリペプチドである。好ましくは、核酸は、配列番号１〜１１０３、最も好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な核酸に相当するヌクレオチド配列の全てまたは一部（例えば、少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２５個、または少なくとも約４０個のヌクレオチド）を包含する。
本発明のさらなる他の好ましい核酸は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のうちの１つにコードされるポリペプチドの少なくとも一部を含むポリペプチドをコードする。例えば、プローブ／プライマーまたはアンチセンス分子として使用するのに好ましい核酸分子（すなわち、非コード核酸分子）は、配列番号１〜４４９４のいずれかの完全配列長以下の長さで、少なくとも約１０個、２０個、３０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個の塩基対を含むことができる。コード核酸分子は、例えば、約５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個の塩基対から、配列番号１〜４４９４のいずれかの全配列の完全長以下を含むことができる。
本発明の別の態様は、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の１つで表される核酸配列に、低、中または高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェントな条件は、例えば、約４５℃で約６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、続く約５０℃で約２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に既知であるか、またはCurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989),6.3.1-12.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程中の塩濃度は、約５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェント性から、約５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェント性までから選択することができる。さらに、洗浄工程の温度は、室温（約２２℃）での低ストリンジェントな条件から、約６５℃の高ストリンジェントな条件まで増加させることができる。温度および塩の両方を変更させてもよく、あるいは温度または塩濃度は、他方の変数を変化させながら一定に保ってもよい。好ましい実施形態では、本発明の核酸は、中程度のストリンジェントな条件（例えば、約２．０×ＳＳＣおよび約４０℃）下で、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに結合する。特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、高ストリンジェントな条件下で、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに結合する。
一実施形態では、本発明は、約室温で約６×ＳＳＣ、続く約室温で約２×ＳＳＣの洗浄の低ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
別の実施形態では、本発明は、約６５℃で約２×ＳＳＣ、続く約６５℃で約０．２×ＳＳＣの洗浄の高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を提供する。
遺伝コードでの縮重により、配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つで示されるヌクレオチド配列と異なる配列を有する核酸も本発明の範囲内である。かかる核酸は、機能的に等価なペプチド（すなわち、等価なまたは類似の生物活性を有するペプチド）をコードするが、遺伝コードでの縮重により、配列表に示す配列からの配列とは異なる。例えば、多数のアミノ酸が、１つ以上のトリプレットで割り当てられる。同じアミノ酸、または同義のものを指定するコドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはそれぞれヒスチジンをコードする）は、ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらし得る。しかしながら、対象ポリペプチドのアミノ酸配列の変化を引き起こすＤＮＡ配列多型が哺乳類間に存在することが予想される。当業者は、ポリペプチドの活性を有するポリペプチドをコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチドでのこれらの変更（例えば、ヌクレオチドの約３〜５％以下）が、天然対立遺伝子変更により規定種の個体間に存在し得ることを理解されよう。
配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の核酸にコードされるタンパク質、あるいはかかるタンパク質の天然相同体のスプライシング変異体をコードする核酸も本発明の範囲内である。かかる相同体は、本明細書中にさらに記載するように、ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲによりクローニングすることができる。
ポリヌクレオチド配列はまた、対象ポリペプチドのための、リーダー配列、例えば天然リーダー配列または異種リーダー配列をコードしてもよい。例えば、所望のＤＮＡ配列を、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を助長するＤＮＡ配列、例えば細胞からのポリペプチド輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に、同じリーディングフレームで融合させてもよい。リーダー配列を有するタンパク質は、プレタンパク質であり、成熟型のタンパク質を形成するために宿主細胞により切断されるリーダー配列を有してもよい。
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のマーキングおよび／または精製を可能にする、「タグポリペプチド」をコードする「タグ配列」とも本明細書において呼ばれるマーカー配列に、インフレームで融合させてもよい。好ましい実施形態では、マーカー配列は、例えばＰＱＥ−９ベクターにより供給されるヘキサヒスチジンタグである。数多くの他のタグポリペプチドが、市販されている。他の頻繁に使用されるタグとしては、ｃ−ｍｙｃ由来の１０残基配列を含むｍｙｃエピトープ（例えば、Ellisonet al., (199) J Biol hem 266:21150-211567を参照)、ｐＦＬＡＧ系(InternationalBiotechnologies, Inc.)、ｐＥＺＺ−タンパク質Ａ系(Pharmacia, NJ)、およびインフルエンザ菌血球凝集素タンパク質の１６アミノ酸部分が挙げられる。さらに、タグポリペプチドと特異的に相互作用する試薬（例えば抗体）が入手可能であるか、または調製もしくは同定することができる限りは、任意のポリペプチドをタグとして使用することができる。
以下に記載の実施例により示されるように、核酸は、例えば多数の真核細胞または組織のいずれかに存在するｍＲＮＡから得ることができ、好ましくは、後生動物細胞または組織、より好ましくは脊椎動物細胞または組織、よりいっそう好ましくは哺乳類細胞および組織、最も好ましくはヒト細胞または組織から得られる。成体および胚の両方からのゲノムＤＮＡから本発明の核酸を得ることも可能である。例えば、遺伝子は、当業者に一般に既知のプロトコルに従って、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのいずれかからクローニングすることができる。ｃＤＮＡは、細胞、例えば脊椎動物細胞、哺乳類細胞、またはヒト細胞（胚細胞を含む）から全ｍＲＮＡを単離することにより得ることができる。続いて、全ｍＲＮＡから二重鎖ｃＤＮＡを調製することができ、次に多数の既知の技法のいずれか１つを用いて、適切なプラスミドまたはバクテリオファージベクターに挿入することができる。遺伝子はまた、本発明により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、確立されたポリメラーゼ連鎖反応技法を用いてクローニングすることもできる。
本発明は、その範囲内に、この生物学的物質から得られる核酸のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを包含し、この核酸は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の少なくとも１つの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドと、ストリンジェントな条件（６５℃で少なくとも約４×ＳＳＣ、または４２℃で少なくとも約４×ＳＳＣ、例えば参照により本明細書中に援用される米国特許第５，７０７，８２９号を参照）下でハイブリダイズする。このことは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の１つの少なくとも１５個の連続したヌクレオチドをプローブとして使用する場合、そのプローブは、相補配列を含む（生物学的物質の）遺伝子またはｍＲＮＡと優先的にハイブリダイズし、選択プローブに比類なくハイブリダイズする生物学的物質の核酸の同定および回収を可能とすることを意図する。配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の１つを超えるもの由来のプローブは、それらが由来するｃＤＮＡが１つのｍＲＮＡに相当する場合に、同じ遺伝子またはｍＲＮＡとハイブリダイズする。１５個を超えるヌクレオチドのプローブを使用することができるが、１５個のヌクレオチドは、特有の同定に十分な配列を表している。
本核酸は、部分的ｍＲＮＡ転写体を表すｃＤＮＡであるため、本発明の２つまたはそれ以上の核酸は、同じｍＲＮＡ転写体および同じ遺伝子の異なる領域を表し得る。したがって、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の２つまたはそれ以上が同じクローンに属すると同定される場合、一方の配列は、完全長ｍＲＮＡまたは遺伝子を得るのに使用することができる。核酸関連ポリヌクレオチドはまた、ｃＤＮＡライブラリーから単離することができる。これらのライブラリーは、好ましくはヒト結腸細胞、より好ましくはヒト結腸癌特異的組織から調製され、表１で１００〜１０１、および１０３〜１１２クローンと称されている。別の実施形態では、核酸は、正常な結腸特異的組織から調製されるライブラリーから単離され、本明細書中では表１で１０２クローンと称されている。上述のように、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のアラインメントは、関連タンパク質もしくはポリヌクレオチドの細胞系または組織供給源を、核酸関連ｃＤＮＡの供給源としても使用することができることを示す。
核酸配列ライブラリーを生産およびプローブする技法は、例えば、Sambrook et al., 「Molecular Cloning: ALaboratory Manual」(New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載されている。ｃＤＮＡは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４からの配列に基づいたプライマーを用いることで調製することができる。一実施形態では、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリアデニル化ｍＲＮＡのみから作製することができる。したがって、ポリＴプライマーは、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製するのに使用することができる。配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のアラインメントは、関連ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同定をもたらすことができる。本明細書中に開示するポリヌクレオチドの幾つかは、検索手順中にマスキングを受けやすい反復領域を含有する。反復領域に関する情報を以下に議論する。
配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の配列を有するポリヌクレオチドの構築物は、合成的に生成することができる。あるいは、非常に多数のオリゴデオキシリボヌクレオチドからの遺伝子および全プラスミドの一段階構築が、Stemmeret al., Gene (Amsterdam) (1995) 164(i):49-53に記載されている。この方法では、アセンブリＰＣＲ（非常に多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド（ｏｌｉｇｏ）からの長いＤＮＡ配列の合成）について記載している。この方法は、ＤＮＡシャッフリングに由来し(Stemmer,Nature (1994) 370:389-391)、ＤＮＡリガーゼによるものではなく、代わりにアセンブリプロセス中にさらに長いＤＮＡ断片を構築するためにＤＮＡポリメラーゼに依存する。例えば、ＴＥＭ−１β−ラクタマーゼコード遺伝子（ｂｌａ）を含有する１．１ｋｂ断片は、それぞれが４０ヌクレオチド（ｎｔ）長である合計５６個のｏｌｉｇｏから単一反応で構築することができる。合成遺伝子を、ＰＣＲ増幅し、唯一の選択マーカーとしてテトラサイクリン＋耐性遺伝子（Ｔｃ−Ｒ）を含有するベクターにクローニングすることができる。アンピシリン（Ａｐ）選択に依存せずに、Ｔｃ−Ｒコロニーの７６％がＡｐ−Ｒであり、このアプローチを、任意の遺伝子の迅速かつ対費用効果の高い合成のための一般法としている。
ＩＶ．当該技術分野で認識されている方法を用いた新規遺伝子の機能的および構造的モチーフの同定 核酸、ｃＤＮＡ、または完全遺伝子のヌクレオチド配列の翻訳物は、個々の既知の配列と整列させることができる。個々の配列との類似性は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの活性を決定するのに使用することができる。例えば、ケモカイン配列との類似性を示す配列は、ケモカイン活性を示し得る。また、１つを超える個々の配列との類似性を示す配列は、一方または両方の個々の配列に特徴的な活性を示し得る。
隣接物のポリヌクレオチド配列の完全長配列および断片は、核
酸の完全長配列を同定および単離するためのプローブならびにプライマーとして使用することができる。隣接物は、核酸の完全長配列に関するライブリーを構築するための使用されるべき組織または細胞型を示すことができる。
典型的に、核酸は、個々の配列との最良のアラインメントを決定するために、６個全てのフレームで翻訳される。本明細書中で配列表において開示する配列は、５’から３’配向にあり、３つのフレームでの翻訳が十分であり得る（実施例に記載するような数少ない特定の例外を除く）。これらのアミノ酸配列は、一般にクエリー配列と呼ばれ、個々の配列と整列させる。
核酸配列は、上述の方法のいずれかにより既知の遺伝子と比較することができる。個々の配列とクエリー配列のアラインメントの結果は、３つのカテゴリー：高類似性、弱類似性、および類似性なしに分けることができる。高類似性から弱類似性に及ぶ個々のアラインメントの結果は、ポリペプチド活性および／構造を決定するための基礎を提供する。
個々の結果を分類するためのパラメータとしては、最強のアラインメントが見出されるアラインメント領域長％、％配列同一性、およびｐ値が挙げられる。
アラインメント領域長％は、最強のアラインメント領域に見出される個々の配列の残基数を計数することで算出される。この数をクエリー配列の全残基長で除算して、％を得る。
％配列同一性は、クエリー配列と個々の配列との間のアミノ酸マッチ数を計数し、マッチの総数を最強のアラインメント領域中に見出される個々の配列の残基数で除算することで算出される。上記の例について、％同一性は、１０個のマッチを、１１個のアミノ酸で除算したものであり、すなわち約９０．０％である。
ｐ値は、アラインメントが偶然により生産される蓋然性である。単一アラインメントに関しては、ｐ値は、Karlrin et al., Proc. Natl.Acad. Sci. 87: 2264 (1990)、およびKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90: (1993)に従って算出することができる。同じクエリー配列を用いたマルチプルアラインメントのｐ値は、Altschuletal., Genet. 6:119 (1994)に記載されるヒューリスティックアプローチを用いて算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムのようなアラインメントプログラムは、ｐ値を算出することができる。
配列が整列する領域の境界は、上述のDoolittle, Methods in Enzymology、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡプログラムに従って、あるいは配列同一性が最も高い区域を決定することで決定することができる。
同一性または類似性を決定するのに考慮すべき別の要因は、類似性または同一性の位置である。強力な局所アラインメントは、アラインメントの長さが短い場合でも類似性を示すことができる。クエリー配列の長さ全体にわたって散在する配列同一性もまた、クエリー配列とプロフィール配列との間に類似性を示すことができる。
高類似性 高類似性とみなされるアラインメントの結果に関して、アラインメント領域長％は典型的に、全長クエリー配列の少なくとも約５５％、クエリー配列の全残基長のより典型的には少なくとも約５８％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％である。通常、アラインメント領域長％は、約６２％程度、より通常的には約６４％程度、よりいっそう通常的には６６％程度の大きさであり得る。
さらに、高類似性に関して、アラインメント領域は典型的に、少なくとも約７５％の配列同一性、より典型的には少なくとも約７８％、よりいっそう典型的には少なくとも約８０％の配列同一性を示す。通常、％配列同一性は、約８２％程度、より通常的には約８４％程度、よりいっそう通常的には約８６％程度の大きさであり得る。
ｐ値は、これらの方法と併せて使用される。高類似性が見出される場合、ｐ値が約１０−２以下、より通常的には約１０−３以下、よりいっそう通常的には１０−４以下である場合に、クエリー配列はプロフィール配列と高類似性を有するとみなされる。より典型的には、ｐ値は、高類似性とみなされるクエリー配列に関して、約１０−５以下、より典型的には約１０−１０以下、よりいっそう典型的には約１０−１５以下である。
弱類似性 弱いとみなされるアラインメントの結果に関して、アラインメント領域長％は最小でなく、すなわちアラインメントの長さは最小でない。アラインメント領域が典型的に、少なくとも約１５個のアミノ酸残基長、より典型的には少なくとも約２０個、よりいっそう典型的には少なくとも約２５個のアミノ酸残基長である場合に、弱類似性を良好に示すとみなされる。通常、アラインメント領域の長さは、約３０個程度の大きさのアミノ酸残基、より通常的には約４０個程度、よりいっそう通常的には約６０個程度のアミノ酸残基であり得る。
さらに、弱類似性に関して、アラインメント領域は典型的に、少なくとも約３５％の配列同一性、より典型的には少なくとも約４０％、よりいっそう典型的には少なくとも約４５％の配列同一性を示す。通常、％配列同一性は、約５０％程度、より通常的には約５５％程度、よりいっそう通常的には約６０％程度であり得る。
低類似性が見出される場合、ｐ値が約１０−２以下、より通常的には約１０−３以下、よりいっそう通常的には１０−４以下である場合に、クエリー配列はプロフィール配列と弱類似性を有するとみなされる。より典型的には、ｐ値は、弱類似性とみなされるクエリー配列に関して、１０−５以下、より典型的には約１０−１０以下、よりいっそう典型的には約１０−１５以下である。
配列同一性により決定される類似性 配列同一性単独は、個々の配列に対するクエリー配列の類似性を決定するのに使用することができ、配列の活性を示すことができる。かかるアラインメントは好ましくは、配列を整列するためにギャップを容認する。典型的に、全クエリー配列にわたる配列同一性が少なくとも約１５％、より典型的に少なくとも約２０％、よりいっそう典型的に少なくとも約２５％、さらにいっそう典型的に少なくとも約５０％である場合に、クエリー配列は、プロフィール配列に関連する。類似性の尺度としての配列同一性単独は、クエリー配列が通常少なくとも８０残基長、より通常的には９０残基長、よりいっそう通常的には少なくとも９５アミノ酸残基長である場合に最も有用である。より典型的には、類似性は、クエリー配列が好ましくは１００残基長、より好ましくは１２０残基長、よりいっそう好ましくは１５０アミノ酸残基長である場合に、類似性は、配列同一性単独に基づいて断定することができる。
プロフィール配列と複数整列配列とのアラインメントからの活性の決定 核酸の翻訳物は、タンパク質ファミリーまたは共通モチーフのいずれかを規定するアミノ酸プロフィールと整列させることができる。また、核酸の翻訳物は、タンパク質ファミリーまたはモチーフの成員のポリペプチド配列を含む複数配列アラインメント（ＭＳＡ）に整列させることができる。プロフィール配列もしくはＭＳＡとの類似性または同一性は、核酸または相当するｃＤＮＡもしくは遺伝子にコードされるポリペプチドの活性を決定するのに使用することができる。例えば、ケモカインプロフィールもしくはＭＳＡと同一性または類似性を示す配列は、ケモカイン活性を示すことができる。
プロフィールは、（１）ファミリーに属する成員のアミノ酸配列のアラインメントであるＭＳＡを創出すること、および（２）アラインメントの統計学的表示を構築することにより手動で設計することができる。かかる方法は、例えば、Birneyet al., Nucl. Acid Res. 25(14):2730-2739 (1996）に記載されている。
いくつかのタンパク質ファミリーおよびモチーフのＭＳＡは、公的に利用可能である。例えば、これらには、５４７個の異なるファミリーおよびモチーフのＭＳＡが含まれている。これらのＭＳＡは、Sonnhammeret al., Proteins 28: 405-420 (1997)にも記載されている。他の供給源もまた、ワールドワイドウェブ上で利用可能である。これらのＭＳＡの簡単な説明は、Pascarellaet al., Prot.Eng. 9(3):249-251 (1996)に報告されている。
ＭＳＡからプロフィールを構築するための技法は、上述のSonnhammer等、上述のBirney等、およびMethods in Enzymology,vol. 266: 「Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis」, 1996, ed.Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., SanDiego, California, USAに記載されている。
クエリー配列とタンパク質ファミリーまたはモチーフとの間の類似性は、（ａ）プロフィールに対してクエリー配列を比較すること、および／または（ｂ）ファミリーまたはモチーフの成員とクエリー配列を整列させることにより決定することができる。
典型的に、Ｓｅａｒｃｈｗｉｓｅのようなプログラムを用いて、プロフィールとしても既知であるマルチプルアラインメントの統計学的表示とクエリー配列を比較することができる。プログラムは、上述のBirney等に記載されている。配列とプロフィールを比較する他の技法は、上述のSonnhammer等、および上述のDoolittleに記載されている。
次に、Feng et al., J. Mol., Evol. 25:351-360 (1987)、およびHiggins et al., CABIOS5:151-153 (1989)に記載される方法を使用して、クエリー配列を、ＭＳＡとしても既知のファミリーまたはモチーフの成員と整列させることができる。ＰＩＬＥＵＰのようなコンピュータプログラムを使用することができる。以下のFeng等を参照されたい。
クエリー配列とプロフィールまたはＭＳＡとの間に類似性が存在するかどうかを、以下の要因を用いて決定することができる：（１）クエリー配列中に見出される保存残基数、（２）クエリー配列中に見出される保存残基の％、（３）フレームシフト数、および（４）保存残基間のスペーシング。
配列を翻訳および整列させる幾つかのアラインメントプログラムは、最良のアラインメントを生産するために、ヌクレオチド配列を翻訳する場合に任意数のフレームシフトを作製することができる。アラインメントを生産するのに必要なフレームシフトが少ないほど、クエリーとプロフィールまたはＭＳＡとの間の類似性または同一性は強力である。例えば、フレームシフトが全くないものから生じる弱類似性は、２個のフレームシフトから生じる強力な類似性よりも、クエリー配列の活性または構造のより良好な目安であり得る。
好ましくは、３個以下のフレームシフトがアラインメント中に見出される。より好ましくは２個以下のフレームシフト、よりいっそう好ましくは１個以下のフレームシフトが、クエリーとプロフィールまたはＭＳＡのアラインメント中に見出され、さらにいっそう好ましくは、フレームシフトが全く見出されない。
保存残基は、ファミリーまたはモチーフの成員の全てまたは幾つかの特定位置で見出されるアミノ酸である。例えば、最も知られているケモカインは、４個の保存システインを含有する。あるいは、ある種のアミノ酸クラスのみが、ファミリー成員の全てまたは幾つかの特定位置に見出される場合に、位置は保存されているとみなされる。例えば、Ｎ末端位置は、リシン、アルギニン、またはヒスチジンのような正荷電アミノ酸を含有してもよい。
典型的に、ポリペプチド残基は、アミノ酸クラスまたは単一アミノ酸が、全てのクラスの成員の少なくとも約４０％、より典型的には成員の少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％において特定位置で見出される場合に保存される。通常、残基は、アミノ酸クラスまたは単一アミノ酸が、ファミリーまたはモチーフの成員の少なくとも約７０％、より通常的には少なくとも約８０％、よりいっそう通常的には少なくとも約９０％、さらにいっそう通常的には少なくとも約９５％において見出される場合に保存される。
残基は、３つの未関連アミノ酸が成員の幾つかまたは全て、より通常には２つの未関連アミノ酸において特定位置で見出される場合に保存される。これらの残基は、全てのクラスの成員の少なくとも約４０％、より典型的には成員の少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約６０％において特定位置で見出される場合に保存される。通常、残基は、ファミリーまたはモチーフの成員の少なくとも約７０％、より通常的には少なくとも約８０％、よりいっそう通常的には少なくとも約９０％、さらにいっそう通常的には少なくとも約９５％である場合に保存される。
クエリー配列が、プロフィールまたはＭＳＡの保存残基の少なくとも約２５％、より通常的には少なくとも約３０％、よりいっそう通常的には少なくとも約４０％を含む場合に、クエリー配列は、プロフィールまたはＭＳＡに対して類似性を有する。典型的に、クエリー配列がプロフィールまたはＭＳＡの保存残基の少なくとも約４５％、より典型的には少なくとも約５０％、よりいっそう典型的には少なくとも約５５％を含む場合に、クエリー配列は、プロフィール配列またはＭＳＡに対してより強力な類似性を有する。
Ｖ．プローブおよびプライマー 腫瘍細胞、特に結腸癌細胞系および組織由来の遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列はさらに、他の細胞型の、例えば他の組織由来の相同体、ならびに他の哺乳類生物由来の相同体を同定かつ／またはクローニングするように設計したプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーとして有用なヌクレオチド配列は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４に列挙される配列、またはそれらに相補的な配列、あるいは配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の全てまたは一部に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列の全てまたは一部を包含し得る。例えば、本発明はまた、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供し、そのオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらの相補的な配列、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体からなる群から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の、完全長以下の、少なくとも約１２個、好ましくは２５個、より好ましくは、４０個、５０個、または７５個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、さらにいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列で表される核酸に基づくプライマーは、当該配列の相同体をクローニングするためにＰＣＲ反応で使用することができる。
さらなる別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらの天然に存在する突然変異体からなる群から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の、完全長以下の、少なくとも約１２個、１６個、２５個、４０個、５０個、または７５個の連続したヌクレオチドに、中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むプローブ／プライマーを提供する。
特に、これらのプローブは、本発明の野生型遺伝子中の突然変異を検出する方法を提供するという理由で有用である。本発明の野生型遺伝子に相補的であり、かつ突然変異遺伝子とミスマッチを形成することができる核酸プローブを提供し、酵素的もしくは化学的切断により、または電気泳動移動度のシフトにより検出が可能である。同様に、対象配列に基づくプローブを用いて、例えば予後または診断アッセイにおける使用のために、同じタンパク質または相同タンパク質をコードする転写体またはゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブは、それらに結合され、かつ検出することが可能な標識基をさらに含み、例えば標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素、および酵素補因子から選択される。
開示する核酸を含む完全長ｃＤＮＡ分子は、以下のように得られる。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の完全長ｃＤＮＡ配列を提供する。配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列で表される配列の、完全長以下の、少なくとも約１２個、１５個、１８個、または２０個のヌクレオチドを含む対象核酸またはその一部を、米国特許第５，６５４，１７３号、「分泌タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチド(SecretedProteins and PolynucleotidesEncoding Them)」（参照により本明細書に援用される）に記載されるように、プローブ設計方法、クローニング方法、およびクローン選択技法を用いて、ｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイズする成員を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよい。ｃＤＮＡライブラリーは、正常または腫瘍組織のような選択組織、あるいは例えば医薬品で処置した哺乳類の組織から作製してもよい。好ましくは、組織は、核酸とｃＤＮＡの両方が発現遺伝子を表すため、核酸を生成するのに使用するものと同じである。最も好ましくは、ｃＤＮＡライブラリーは、実施例にて本明細書中に記載する生物学的物質から作製される。あるいは、多くのｃＤＮＡライブラリーが市販されている(Sambrooket al., NolecularCloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring HarborPress, Cold Spring Harbor, NY 1989))。ライブラリー構築のための細胞型の選択は、核酸関連遺伝子にコードされるタンパク質の独自性がわかった後になされ得る。このことは、組織および細胞型が、関連遺伝子を発現する可能性が高く、それによりｃＤＮＡを生成するためにｍＲＮＡを含有することを示している。
核酸、好ましくは自然メッセージの全配列を含有する核酸より大きなライブラリーの成員が得られ得る。全ｃＤＮＡが得られたことを確認するために、ＲＮＡ保護実験を以下のように実施してもよい。ｍＲＮＡへの完全長ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションは、ＲＮＡ分解酵素分解からｍＲＮＡを保護し得る。ｃＤＮＡが完全長でない場合、ハイブリダイズされないｍＲＮＡの一部がＲＮＡ分解酵素分解を受けやすい場合がある。これを、ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動移動度の変化により、または放出されたモノリボヌクレオチドの検出により、当該技術分野で既知であるようにアッセイしてもよい。Sambrooket al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (Cold Spring HarborPress, ColdSpring Harbor, NY 1989)。部分的ｃＤＮＡの末端に５’でさらなる配列を得るために、５’ＲＡＣＥ(PCR Protocols: AGuide to Methods and Applications (Academic Press, Inc. 1990))を実施してもよい。
ゲノムＤＮＡは、完全長ｃＤＮＡの単離と同様の方法で核酸を用いて単離し得る。簡潔に述べると、核酸またはその一部を、ゲノムＤＮＡのライブラリーに対するプローブとして使用してもよい。好ましくは、ライブラリーは、核酸を生成するのに使用した細胞型から得られる。最も好ましくは、ゲノムＤＮＡは、本明細書中で実施例にて記載する生物学的試料から得られる。かかるライブラリーは、Sambrooket al., 9.4-9.30に詳述されるように、Ｐ１またはＹＡＣのようなゲノムの大きなセグメントを保有するのに適切なベクター中に存在し得る。さらに、ゲノム配列は、例えばヒトＢＡＣライブラリー（これは、ResearchGenetics, Inc., Huntville, Alabama, USAから市販されている）から単離することができる。さらなる５’または３’配列を得るために、Sambrook等に記載されるように、染色体歩行を実施してもよく、その結果、ゲノムＤＮＡの隣接および重複断片が単離される。当該技術分野で既知のように、制限消化酵素およびＤＮＡリガーゼを用いて、これらをマッピングおよびつなぎ合わせてもよい。
本発明の核酸を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築および探索するために、古典的な方法およびＰＣＲ方法の両方を用いて、相当する完全長遺伝子を単離することができる。いずれかの方法を用いて、好ましくはノーザンブロットを多数の細胞型に実施して、どの細胞系が最高の割合で所定の遺伝子を発現するかを決定してもよい。
上述のSambrook等におけるｃＤＮＡライブラリーを構築する古典的な方法。これらの方法により、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから産生し、ウイルスベクターまたは発現ベクターに挿入することができる。典型的に、ポリ（Ａ）テイルを含むｍＲＮＡライブラリーは、ポリ（Ｔ）プライマーを用いて産生することができる。同様に、ｃＤＮＡライブラリーは、プライマーとして本配列を用いて産生することができる。
ＰＣＲ方法を用いて、所望の挿入物を含むｃＤＮＡライブラリーの成員を増幅してもよい。この場合では、所望の挿入物は、本核酸に相当する完全長ｃＤＮＡからの配列を含有し得る。かかるＰＣＲ方法には、遺伝子トラッピングおよびＲＡＣＥ方法が含まれる。
遺伝子トラッピングは、ｃＤＮＡライブラリーの成員をベクターに挿入することを伴い得る。続いて、ベクターを変性させて、一本鎖分子を産生し得る。次に、ビオチン化ｏｌｉｇｏのような基質結合プローブを用いて、所定のｃＤＮＡ挿入物をトラップする。ビオチン化プローブをアビジン結合固体基材に連結させることができる。ＰＣＲ方法を用いて、トラップしたｃＤＮＡを増幅することができる。完全長遺伝子に相当する配列をトラップするために、標識プローブ配列は、本発明の核酸、例えば配列番号１〜１１０３、好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列に基づき得る。ランダムプライマーまたはライブラリーベクターに特異的なプライマーを用いて、トラップしたｃＤＮＡを増幅することができる。かかる遺伝子トラッピング技法は、Gruberet al., ＰＣＴ国際公開第９５／０４７４５号、およびGruber et al., 米国特許第５，５００，３５６号に記載されている。遺伝子トラッピング実験を実施するためのキットが、例えばLifeTechnologies, Gaithersburg, Maryland, USAから市販されている。
「ｃＤＮＡ末端の迅速増幅」、すなわちＲＡＣＥは、多数の異なるＲＮＡからｃＤＮＡを増幅するＰＣＲ方法である。ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドリンカーに連結させて、２つのプライマーを用いてＰＣＲで増幅してもよい。一方のプライマーは、本核酸由来の配列に基づいてもよく、それに関しては完全長配列が望ましく、第２のプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドリンカーにハイブリダイズする配列を含んでもよい。この方法の詳細については、例えばＰＣＴ国際公開公報第９７／１９１１０号に報告されている。
ＲＡＣＥの好ましい実施形態では、一般的プライマーは、ｃＤＮＡ末端に連結される任意のアダプター配列にアニーリングするように設計され得る(Apte andSiebert, Biotechniques, 15:890-893, 1993; Edwards et al., Nuc. Acids Res.,19:5227-5232, 1991)。単一遺伝子特異的ＲＡＣＥプライマーは、一般的プライマーと対をなし、単一遺伝子特異的プライマーと一般的プライマーとの間の配列の優先的増幅が起きる。ＲＡＣＥで使用するために修飾された市販のｃＤＮＡプールが利用可能である。
別のＰＣＲベースの方法は、ｃＤＮＡ配列の特定の知見なしで、固着末端を有する完全長ｃＤＮＡライブラリーを生成する。この方法は、ロックドッキング(lock-docking)プライマー（Ｉ〜ＶＩ）を使用し、ここで一方のプライマーであるポリＴＶ（Ｉ〜ＩＩＩ）は、真核ｍＲＮＡのポリＡテイルにわたってロックして、第１鎖合成をもたらし、第２のプライマーであるポリＧＨ（ＩＶ〜ＶＩ）は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により付加されるポリＣ尾上にロックする。この方法は、例えば、ＰＣＴ国際公開広報第９６／４０９９８号に記載されている。
遺伝子のプロモーター領域は一般に、ＲＮＡポリメラーゼＩＬのための開始部位に対して５’に位置している。無数のプロモーター領域が、ＴＡＴＴＡまたはＴＡＴＡＡのような配列である「ＴＡＴＡ」ボックスを含有し、それは突然変異に対して感受性が高い。プロモーター領域は、遺伝子のコード領域から、プライマーを用いて５’ＲＡＣＥを実施することで得ることができる。あるいは、ｃＤＮＡをゲノム配列用のプローブとして使用することができ、コード領域に対して５’の領域を「歩行(walkingup)」で同定する。
遺伝子が高度に発現されるか、またはディファレンシャルに発現される場合、遺伝子からのプロモーターは、異種遺伝子用の調節構築物での使用に有用であり得る。
完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子がいったん得られれば、変異体をコードするＤＮＡは、Sambrook15.3-15.63に詳述される部位特異的突然変異誘発により調製することができる。置き換えられるべきコドンまたはヌクレオチドの選択は、変更されるタンパク質構造および／または機能を達成するためのアミノ酸の任意の変化に関する本明細書中での開示に基づくことができる。
生物学的物質からＤＮＡまたはＲＮＡを得るための代替的方法として、本発明の１つまたは複数の核酸の配列を有するヌクレオチドを含む核酸を合成することができる。したがって、本発明は、１２ヌクレオチド長（配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の１つで表される核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、あるいは当該核酸に対して、少なくとも８０％同一である少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに相当する）から、核酸分子の複製および発現を含む１つまたは複数の生物学的操作に適切な最大長までの範囲の核酸分子を包含する。本発明は、（ａ）完全サイズを有し、かつ配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の少なくとも１つを含む核酸、（ｂ）融合タンパク質の発現を可能にするように操作可能に連結される少なくとも１つのさらなる遺伝子も含む、（ａ）の核酸、（ｃ）（ａ）または（ｂ）を含む発現ベクター、（ｄ）（ａ）または（ｂ）を含むプラスミド、および（ｅ）（ａ）または（ｂ）を含む組換えウイルス粒子を包含するが、これらに限定されない。（ｃ）の構築は、パートＶＩで以下に記載するように達成することができる。
本発明の核酸の配列は限定されず、Ａ、Ｔ、Ｇ、および／またはＣ（ＤＮＡに関して）、およびＡ、Ｕ、Ｇ、および／またはＣ（ＲＮＡに関して）、またはイノシンおよびプソイドウリジンを含むそれらの修飾塩基の任意の配列であり得る。配列の選択は、所望の機能に依存し、所望のコード領域、所望のイントロン様領域、および所望の調節領域により指示され得る。
ＶＩ．本発明の核酸を保有するベクター 本発明は、宿主細胞で遺伝子を発現させるのに使用することができるプラスミドおよびベクターをさらに提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であってもよい。したがって、タンパク質の全てまたは選択部分をコードする、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、さらにいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、またはそれらに相補的な配列のいずれか１つに由来するヌクレオチド配列を用いて、微生物または真核細胞プロセスにより組換え形態のポリペプチドを産生することができる。ポリヌクレオチド配列を、発現ベクターのような遺伝子構築物に連結すること、および真核（酵母、鳥類、昆虫または哺乳類）または原核（細菌細胞）の宿主に形質転換またはトランスフェクトすることは、当該技術分野で既知の標準的な手段である。
細胞での核酸の発現を可能にするベクターを発現ベクターと称する。典型的に、発現ベクターは、少なくとも１つの転写調節配列に操作可能に連結される核酸を含有する。調節配列は、当該技術分野で認識されており、対象核酸の発現を誘導するように選択される。転写調節配列は、Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990)に記載されている。一実施形態では、発現ベクターは、対象ポリペプチドのアゴニスト活性を有するペプチドをコードするか、あるいは対象ポリペプチドのアンタゴニスト形態であるペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
プラスミドの選択は、繁殖が望ましい細胞型、および繁殖の目的に依存する。あるベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列を増幅および作製するのに有用である。他のベクターは、培養中での細胞における発現に適している。さらなる他のベクターは、動物またはヒト全体での細胞における移入および発現に適している。適切なベクターの選択は、十分に当業者の範囲内である。多くのかかるベクターが市販されている。核酸または完全長遺伝子を、典型的にはベクター中の切断された制限酵素部位へのＤＮＡリガーゼ結合を用いてベクターに挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えにより挿入してもよい。典型的に、このことは、所望のヌクレオチド配列の隣接物上に、ベクターに対して相同性の領域を結合することで達成される。相同性の領域は、オリゴヌクレオチドの連結によるか、または相同性の領域と所望のヌクレオチド配列の一部の両方を含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により付加される。
核酸または完全長遺伝子は、所望の発現特性を得るのに適切なように調節配列に連結される。これらとしては、プロモーター（センス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端に結合される）、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、レプレッサー、およびインデューサーが挙げられ得る。プロモーターは、調節されてもよく、または構成的であってもよい。ある状況においては、組織特異的または発達段階特異的プロモーターのような条件的に活性なプロモーターを使用することが望ましい場合がある。これらは、ベクターに連結するための上述の技法を用いて、所望のヌクレオチド配列に連結される。当該技術分野で既知の任意の方法を使用し得る。
上記宿主細胞のいずれか、または他の適切な宿主細胞または生物が、本発明のポリヌクレオチドまたは核酸を複製かつ／または発現するのに使用される場合、得られる複製核酸、ＲＮＡ、発現タンパク質またはポリペプチドは、宿主細胞または生物の産物として本発明の範囲内である。産物は、当該技術分野で既知の任意の適切な手段により回収される。
核酸に相当する遺伝子がいったん同定されれば、遺伝子が天然である細胞において、その発現を調節することができる。例えば、細胞の内因性遺伝子は、米国特許第５，６４１，６７０号の「タンパク質産生およびタンパク質送達(ProteinProduction and Protein Delivery)」に開示されるように、外因性調節配列により調節することができる。
酵母において組換えタンパク質を発現するための多数のベクターが存在する（例えば、参照により本明細書に援用される、Broach et al (1983) inExperimental Manipulation of Gene Expression, ed., M. Inouye, Academic Press,p. 83を参照、）。さらに、アンピシリンのような薬剤耐性マーカーを使用することができる。例示的実施形態では、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の１つで表される核酸の１つをサブクローニングすることで生成される発現ベクターを組換え的に利用して、ポリペプチドを産生する。
好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌でのベクターの繁殖を容易にするための原核細胞の配列、および真核細胞で発現される１つまたは複数の真核細胞の転写ユニットの両方を含有する。プラスミドの調製、および宿主生物の形質転換に用いられる様々な方法が当該技術分野で既知である。原核細胞および真核細胞の両方に適した発現系、ならびに一般的な組換え手順に関しては、MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2'Ed., ed. By Sambrook, Fritsch and Maniatis(ColdSpring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17を参照されたい。
遺伝子の一部(例えば、切断突然変異体）のみを発現することが望ましい場合、発現されるべき所望の配列を含有するオリゴヌクレオチド断片に開始コドン（ＡＴＧ）を付加することが必要な場合がある。Ｎ末端位置のメチオニンは、酵素メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を用いて酵素的に切断することができることが当該技術分野で既知である。ＭＡＰは、大腸菌(Ben-Bassatet al., (1987) J. Bacteriol. 169:751-757)、およびネズミチフス菌からクローニングされ、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性が、組換えタンパク質で実証された(Milleret al., (1987) PNAS 84:2718-1722)。したがって、望ましい場合、Ｎ末端メチオニンの除去は、ＭＡＰを産生する宿主（例えば、大腸菌またはＣＭ８９またはＳ．セレビシエ(S.cerevisiae)）でポリペプチドを発現することでｉｎ ｖｉｖｏで、または精製ＭＡＰを用いて（例えば上述のMiller等の手順）ｉｎ ｖｉｔｒｏで達成することができる。
さらに、本発明の核酸構築物は、アンチセンス核酸のような核酸を送達するための遺伝子治療プロトコルの一部として使用することができる。したがって、本発明の別の態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションのための発現ベクターを特色とする。
ウイルス移入方法のほかに、非ウイルス方法も、対象核酸、例えば配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の１つで表される配列を、動物組織に導入するのに使用することができる。遺伝子移入のほとんどの非ウイルス方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳類細胞により使用される標準的な機構によるものである。好ましい実施形態では、本発明の非ウイルスターゲッティング手段は、標的細胞による対象核酸の取り込みに関するエンドサイトーシス経路に依存する。この型の例示的なターゲッティング手段としては、リポソーム由来の系、ポリリシン複合体、および人工ウイルスエ BR>塔xロープが挙げられる。
配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列、対応するｃＤＮＡ、あるいは完全長遺伝子のいずれかの核酸を使用して、部分的または完全遺伝子産物を発現してもよい。例えばSambrooket al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold SpringHarbor Press, Cold Spring Harbor, New York)に記載されるような標準的な組換えＤＮＡ技法を用いて、かつ組換えＤＮＡ検索に関するUnitedStates Dept. of HHS, National Institute of Health(NIH) Guidelinesに記載される現在の規制の下で、適切な核酸構築物を精製する。核酸にコードされるポリペプチドは、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類および哺乳類系を含む任意の発現系で発現させてもよい。適切なベクターおよび宿主細胞は、例えば米国特許第５，６５４，１７３号に記載されている。
細菌 細菌における発現系としては、Chang et al., Nature (1978) 275:615、Goeddelet al., Nature (1979)281: 544、Goeddel et al., Nucleic Acids Rec. (1980) 8:4057、欧州特許第００３６，７７６号、米国特許第４，５５１，４３３号、DeBoeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1983) 80:2125、およびSiebenlist et al., Cell(1980) 20:269に記載されるものが挙げられる。
酵母 酵母における発現系としては、Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1978) 75:1929、Itoet al., J. Bacteriol. (1983) 153:163、Krutzet al.,Mol. Cell. Biol. (1986) 6:142、Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141、Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132:3459、Roggenkampet al.,Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302、Das et al., J. Bacteriol. (1984)158:1165、De Louvencourtet al., J. Bacteriol. (1983) 154:737、Van den Berg etal., Bio/Technology (1990) 8:135、Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985)25:141、Cregget al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5:3376、米国特許第４，８３７，１４８号および第４，９２９，５５５号、Beachand Nurse, Nature (1981) 300:706、Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10:380、Gaillardinetal., Curr. Genet. (1985) 10:49、Ballanceet al., Biochem. Biophys. Res. Commun.(1983) 112:284289、Tilburnet al., Gene (1983) 26:205221、Yelton et al., Proc.Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:14701474、Kelly and Hynes, EMBO J. (1985)4:475479、欧州特許第０２４４，２３４号、および国際公開第９１／００３５７号に記載されるものが挙げられる。
昆虫細胞 昆虫における異種遺伝子の発現は、米国特許第４，７４５，０５１号、Friesen et al., (1986) 「The Regulation ofBaculovirusGene Expression」, in: The Molecular Biology Of Baculoviruses(W.Doerfler, ed.)、欧州特許第０１２７，８３９号、欧州特許第０１５５，４７６号、ならびにVlak et al., J. Gen. Virol.(1988) 69:765776、Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42:177、Carbonell etal., Gene (1988) 73:409、Maeda et al., Nature (1985)315:592594、Lebacq Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8:3129、Smith etal., Proc. Nail. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:8404、Miyajima et al., Gene (1987)58:273、およびMartin et al., DNA (1988) 7:99に記載されているように達成される。数多くのバキュロウイルス株および変異体、および宿主由来の相当する許容昆虫宿主細胞は、Luckowet al., Bio/Technology (1988) 6:4755、Miller et al., Generic Engineering(Setlow, J.K. et al. eds.), Vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277279、およびMaedaet al., Nature, (1985) 315:592-594に記載されている。
哺乳類細胞 哺乳類発現は、Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4:761、Gorman et al., Proc. Natl. Acad.Sci. (USA) (1982) 79:6777、Boshart et al., Cell (1985) 41:52 1、および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されるように達成される。哺乳類発現の他の特徴は、Hamand Wallace, Meth. Enz. (1979) 58:44、Barnes and Sato, Anal. Biochem. (1980)102:255、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号、国際公開第９０／１０３４３０号、国際公開第８７／００１９５号、および米国特許再審査第３０，９８５号に記載されるように促進される。
ＶＩＩ．治療用核酸構築物 本発明の一態様は単離核酸、例えば配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列の、アンチセンス療法での使用に関する。本明細書中で使用する場合、アンチセンス療法とは、細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと、細胞条件下で特異的にハイブリダイズ（例えば結合）するオリゴヌクレオチド分子またはその誘導体の投与または原位置での生成を指し、それにより遺伝子の転写および／または翻訳を阻害する。結合は、従来の塩基対相補性によるものであってもよく、または例えばＤＮＡ二重鎖に結合する場合に二重らせんの深いほうの溝での特異的な相互作用によるものであってもよい。一般に、アンチセンス療法とは、当該技術分野で一般に使用される技法範囲を指し、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合による任意の療法を包含する。
本発明のアンチセンス構築物は、例えば細胞で転写されると、細胞ｍＲＮＡの少なくとも特有部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして送達することができる。あるいは、アンチセンス構築物は、ｅｘ ｖｉｖｏで生成され、細胞に導入されると、対象核酸のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とハイブリダイズすることで発現を阻害するオリゴヌクレオチドプローブである。かかるオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼに耐性であり、したがってｉｎ ｖｉｖｏで安定な修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための例示的核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホロチオエート、およびメチルホスホネート類縁体である（米国特許第５，１７６，９６６号、第５，２６４，５６４号、および第５，２５６，７７５号も参照）。さらに、アンチセンス療法で有用なオリゴマーを構築するための一般的アプローチは、例えば、Vander Krol et al. (1988) Bio Techniques 6:958-976、およびStein et al. (1988) CancerRes 48:2659-2668に概説されている。アンチセンスＤＮＡに関しては、転写開始部位（例えば所定のヌクレオチド配列の−１０〜１０領域）から得られるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
アンチセンスアプローチは、ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の設計を包含する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ転写体に結合し、翻訳を防止するであろう。絶対的な相補性が好ましいが、必要であるわけではない。したがって、二重鎖アンチセンス核酸の場合では、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験してもよく、あるいは三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性度と長さの両方に依存するであろう。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、ＲＮＡとのより多くの塩基ミスマッチを含有する可能性があり、依然として安定な二重鎖（または場合によっては三重鎖）を包含する。当業者は、ハイブリダイズした複合体の融点を測定するための標準的な手順を用いて、許容可能なミスマッチ度を確認することができる。
ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンを含むＡＵＧ開始コドンまでの５’非翻訳配列に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害する際に最も効率的に作動すべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列に相補的な配列も同様に、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する際に効果的であることが最近わかってきた(Wagner,R. 1994. Nature 372:333)。したがって、遺伝子の５’または３’非翻訳非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、内因性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチに使用することができる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの相補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的に、効率の悪い翻訳の阻害剤であるが、本発明によっても使用することができる。対象ｍＲＮＡの５’、３’またはコード領域にハイブリダイズするように設計されようと、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチド長であるべきであり、好ましくは約１００未満、より好ましくは約５０未満、２５未満、１７未満または１０未満のヌクレオチド長である。
標的核酸の選択に関係なく、アンチセンスオリゴヌクレオチドの、遺伝子発現を阻害する能力を定量化するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究がまず実施されることが好ましい。これらの研究は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス遺伝子阻害と非特異的生物学的効果とを区別する対照を利用することが好ましい。またこれらの研究は、内部対照ＲＮＡまたはタンパク質のレベルと、標的ＲＮＡまたはタンパク質のレベルを比較することも好ましい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて得られる結果を、対照オリゴヌクレオチドを用いて得られる結果と比較することが想定される。対照オリゴヌクレオチドが試験オリゴヌクレオチドとほぼ同じ長さであり、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、標的配列に特異的にハイブリダイズするのを防止するのに必要とされる分だけアンチセンス配列と異なることが好ましい。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、あるいはそれらのキメラ混合物または誘導体または改変型であり得る。オリゴヌクレオチドは、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸バックボーンで修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、宿主細胞受容体を標的とするために）、または細胞膜（例えば、Letsingeret al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556、Lemaitre et al., 1987,Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652、１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ国際公開広報第８８／０９８１０号を参照）もしくは血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ国際公開広報第８９／１０１３４号を参照）を通過しての輸送を促進する作用物質、ハイブリダイゼーション誘発切断剤（例えば、Krolet al., 1988, BioTechniques6:958-976を参照)、またはインターカレート剤（例えば、Zon, 1988,Pharm. Res. 5:539-549を参照）のような他の付随基を含んでもよい。この目的で、オリゴヌクレオチドを、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発切断剤等に結合させてもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシトリエチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロキシウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾塩基部分を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが挙げられるが、これらに限定されない群から選択される少なくとも１つの修飾糖部分を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチド様バックボーンを含有することもできる。かかる分子は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーと呼ばれ、例えばPeny-O'Keefeet al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14670、およびEglom et al. (1993)Nature 365:566に記載されている。ＰＮＡオリゴマーの利点の１つは、ＤＮＡの中性バックボーンに起因して、培地のイオン強度とは本質的に無関係に相補ＤＮＡに結合するそれらの能力である。さらに別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびそれらのホルムアセタールまたは類縁体からなる群から選択される少なくとも１つの修飾リン酸バックボーンを含む。
さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、α−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補ＲＮＡとの特異的二重鎖ハイブリッドを形成し、そこでは通常のβユニットと逆方向に、鎖は、互いに平行している(Gautieret al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641)。オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド(Inoueet al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-12148)、またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類縁体(Inoue et al.,1987, FEBS Lett. 215: 327-330)である。
本発明のオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡ合成機（Biosearch、Applied Biosystems等により市販されているもののような）を用いて合成してもよい。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein等の方法(1998,Nucl. Acids Res. 16:3209)により合成してもよく、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御多孔質ガラスポリマー支持体などを用いて調製することができる(Stainet al., 1988, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451)。
コード領域配列に相補的なアンチセンスヌクレオチドを使用することができるが、転写される非翻訳領域および開始メチオニンを含む領域に相補的なものが最も好ましい。
アンチセンス分子を、ｉｎ ｖｉｖｏで標的核酸を発現する細胞に送達することができる。アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に送達するための多数の方法が開発されており、例えば、アンチセンス分子を、組織部位に直接注射することができ、または所望の細胞を標的とするように設計した改変アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上で発現される受容体または抗原を特異的に結合するペプチドあるいは抗体に連結させたアンチセンス）を全身投与することができる。
しかしながら、内因性ｍＲＮＡ上での翻訳を抑制するのに十分な細胞内濃度のアンチセンスを達成するのは困難であることが多い。したがって、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｔＩＩプロモーターの制御下に置かれている組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者において標的細胞をトランスフェクトするためのかかる構築物の使用は、内因性転写体との相補的塩基対を形成する十分量の一本鎖ＲＮＡの転写をもたらし、それにより標的ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、ベクターは、細胞に取り込まれてアンチセンスＲＮＡの転写を誘導するように、ｉｎ ｖｉｖｏで導入することができる。かかるベクターは、転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを産生する限りは、エピソームにとどまってもよく、あるいは染色体的に組み込まれてもよい。かかるベクターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術により構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、または哺乳類細胞における複製および発現のための当該技術分野で既知の他のものであり得る。アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒト細胞で作用するために当該技術分野で既知の任意のプロモーターによるものであり得る。かかるプロモーターは、誘導性であっても構成的であってもよい。かかるプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoistand Chambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoet al., 1980, Cell 22:787-797)、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., 1981, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinster et al. 1982,Nature 296:39-42)等が挙げられるが、これらに限定されない。任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、またはウイルスべクターを使用して、組織部位（例えば、脈絡叢または視床下部）に直接導入することができる組換えＤＮＡ構築物を調製することができる。あるいは、所望の組織を選択的に感染するウイルスベクターを使用することができ（例えば、脳に関しては、ヘルペスウイルスベクターが使用され得る）、その場合は、投与は別の経路で達成されてもよい（例えば全身的に）。
本発明の別の態様では、標的ｍＲＮＡ転写体を触媒的に切断するように設計したリボザイム分子を用いて、標的ｍＲＮＡの翻訳および標的タンパク質の発現を防止することができる（例えば、１９９０年１０月４日に公開されたＰＣＴ国際公開広報第９０／１１３６４号、Sarveret al., 1990, Science 247:1222-1225、および米国特許第５，０９３，２４６号を参照）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを用いて標的ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補塩基対を形成するフランキング領域により影響される位置でｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが次の２塩基配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および生産は、当該技術分野で既知であり、Haseloffand Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591により完全に記載されている。好ましくは、リボザイムは、切断認識部位が標的ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち効率を高めて、非機能的ｍＲＮＡ転写体の細胞内蓄積を最小限に抑えるように操作される。
本発明のリボザイムはまた、テトラヒメナ(Tetrahymena thermophila)中に天然で存在し（ＩＶＳまたはＬ−１９ＩＶＳ ＲＮＡとして既知）、ThomasCechと共同研究者により広範に記載されているのものようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（これ以降、「Cech型リボザイム」）を包含する(Zaug, etal., 1984, Science, 224:574-578、Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475、Zaug,etal. 1986, Nature, 324:429-433、国際特許出願公報第８８／０４３００号(University Patents Inc.)、Beenand Cech, 1986, Cell, 47:207-216）。Cech型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズする８塩基対の活性部位を有し、それ以降で標的ＲＮＡの切断が起きる。本発明は、標的遺伝子中に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とするCech型リボザイムを包含する。
アンチセンスアプローチと同様に、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成することができ（例えば、安定性、ターゲッティング等の改善のために）、ｉｎ ｖｉｖｏで標的遺伝子を発現する細胞に送達されるべきである。好ましい送達方法は、強力な構成的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いることを包含し、その結果トランスフェクトした細胞は、十分量のリボザイムを産生し、内因性メッセージを破壊して、翻訳を阻害するであろう。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒的であるため、より低い細胞内濃度が効率のために要される。
本発明のアンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡおよびリボザイム分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成のための当該技術分野で既知の任意の方法により調製され得る。これらとしては、例えば固相ホスホルアミダイト化学合成のような当該技術分野で既知の、オリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技法が挙げられる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ転写により生成してもよい。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様のベクターに組み込まれてもよい。あるいは、使用するプロモーターに依存して、構成的にまたは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を、細胞系に安定に導入することができる。
さらに、細胞内安定性および半減期を増加させるための手段として、核酸分子に対する様々な既知の修飾を導入してもよい。考え得る修飾としては、分子の５’および／または３’末端にリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内のホスホジエステラーゼ連結でなくホスホロチオエートまたは２’−Ｏ−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
ＶＩＩＩ．本発明の完全長ｃＤＮＡ配列 本発明はまた、配列番号１〜４４７０の１つまたはそれ以上の部分配列に相当する完全長ｃＤＮＡ配列に関する。特に本発明は、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の完全長ｃＤＮＡ配列を提供する。完全長配列は、上記と同様に得られる。これらの配列は図２に示されており、下記の表２に要約されている。表２には、完全長ｃＤＮＡ配列によりコードされ、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３に相当するポリペプチドに関する配列番号およびGenBank寄託番号も示されている。
[表]
ＩＸ．本発明のポリペプチド 本発明は、普通はポリペプチドと関連し得るその他の細胞タンパク質、特にその他のシグナル伝達因子および／または転写因子から単離され、あるいはそうでなければ実質的にそれらを含有しない利用可能な単離ポリペプチドを作製する。本発明の対象ポリペプチドとしては、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、さらにいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４またはそれらに相補的な配列の核酸にコードされるポリペプチド、あるいは配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３の配列またはそれらに相補的な配列がその断片である遺伝子にコードされるポリペプチドが挙げられる。好ましい実施形態では、本発明において有用なポリペプチドは、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のうちの１つまたはそれ以上のアミノ酸配列を有する。本発明のポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞系（正常細胞、例えば正常結腸組織および非結腸組織と比較して）においてディファレンシャルに調節されるタンパク質を包含する。好ましい実施形態では、ディファレンシャル調節ポリペプチドは、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３で記述される配列を有する１つまたはそれ以上のポリペプチドである。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、腫瘍細胞中、特に結腸癌由来細胞系中でアップレギュレートされる。他の実施形態では、ポリペプチドは、腫瘍細胞、特に結腸癌由来細胞系中でダウンレギュレートされる。アップレギュレートされるタンパク質、例えば癌遺伝子、あるいはダウンレギュレートされるタンパク質、例えば腫瘍サプレッサーは、異常増殖性細胞中では、診断または治療技術のための標的であり得る。例えばｃｄｃ２遺伝子のアップレギュレーションは、有糸分裂を誘発する。有糸分裂不活性化因子であるｍｙｔｌ遺伝子の過剰発現は、ｃｄｃ２の活性を負に調節する。したがって異常増殖は、ｃｄｃ２をアップレギュレートすることにより、またはｍｙｔｌをダウンレギュレートすることにより、誘導され得る。
「他の細胞タンパク質（本明細書中では「夾雑タンパク質」としても称される）を実質的に含まない」または「実質的に純粋なまたは精製された調製物」という用語は、約２０重量％（乾燥重量）未満の夾雑タンパク質を有する、好ましくは約５％未満の夾雑タンパク質を有するポリペプチドの調製物を包含すると定義される。機能的形態の対象ポリペプチドは、本明細書中に記載されたようなクローン化核酸を用いることにより精製調製物として初めて調製され得る。完全長タンパク質または１つまたはそれ以上の特定のモチーフおよび／またはドメインに、あるいは任意のサイズ、例えば少なくとも約５個、１０個、２５個、５０個、７５個または１００個のアミノ酸長に相当する断片は、本発明の範囲内である。
例えば単離ポリペプチドは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、最も好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、またはその相補的配列のいずれかで示される核酸配列全部あるいは一部によりコードされ得る。タンパク質の単離ペプチジル部分は、このようなペプチドをコードする核酸の相当する断片から組換え的に産生されたペプチドをスクリーニングすることにより得られる。さらに、断片は、当該技術分野で既知の技法、例えば慣用的メリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学を用いて化学的に合成され得る。例えば本発明のポリペプチドは、任意に、断片の重複を伴わない所望長の断片に分けられるし、あるいは好ましくは所望長の重複断片に分けられ得る。断片は、野生型（例えば「真正」）タンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能し得るペプチジル断片を同定するために産生され（組換え的にまたは化学合成により）、試験され得る。
本発明の別の態様は、組換え形態の対象タンパク質に関する。上記のように本発明により選好される組換えポリペプチドが、天然タンパク質のほかに、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４にコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％同一である核酸にコードされる。配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の配列と少なくとも約９８〜９９％同一である核酸にコードされるポリペプチドも、本発明の範囲内である。このようなタンパク質の少なくとも一部を含むペプチド断片も本発明に包含される。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは哺乳類ポリペプチド、さらに好ましくはヒトポリペプチドである。特に好ましい実施形態では、ポリペプチドは野生型生理活性を保有する。ある種の翻訳後修飾、例えばリン酸化等は、非修飾ポリペプチド鎖と比較してポリペプチドの見掛けの分子量を増大し得ると理解される。
本発明はさらに、組換え形態の対象ポリペプチドの１つに関する。このような組換えポリペプチドは好ましくは、添付の配列表の野生型（「真正」）ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストの役割のうちの１つにおいて機能することができる。タンパク質のアミノ酸配列に関して、「〜に進化的に関連した」という用語は、天然に生じていたアミノ酸配列を有するポリペプチドと、例えば組合せ突然変異誘発由来のヒトポリペプチドの突然変異体とを指す。
概して、タンパク質の活性を有する（例えば「生理活性的」である）と本明細書中で言及されるポリペプチドは、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、より好ましくは配列番号１〜５０３、最も好ましくは配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のうちの１つで示される核酸配列またはそれらと相補的な配列の全部または一部にコードされるアミノ酸配列を包含し、天然に存在するタンパク質の生物学的／生化学的活性の全部または一部を模倣するかまたはそれと拮抗するポリペプチドと定義される。本発明によれば、ポリペプチドは、それが天然に存在する形態のタンパク質の特異的アゴニストまたはアンタゴニストである場合、生物学的活性を有する。
化合物、例えばタンパク質またはその変異体が１つまたはそれ以上の上記の生物学的活性を有するか否かを決定するためのアッセイは、当該技術分野で既知である。ある種の実施形態では、本発明のポリペプチドは上で略記したものと同様の活性を有する。
別の実施形態では、ポリペプチドに関するコード配列は、異なるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含めて、融合遺伝子の一部として組み込まれ得る。この種類の発現系は、ポリペプチドの免疫原断片を産生するのが望ましい条件下で有用であり得る（例えばＥＰ公開第０２５９１４９号；ならびにEvansetal. (1989)Nature 339:3 85; Huang et al. (1988) J. Virol. 62:3 855;およびSchliengeret al., (1992) J. Virol. 66:2参照）。免疫原性を強化するために融合タンパク質を利用するほかに、融合タンパク質はタンパク質の発現を促し、したがって本発明のポリペプチドの発現に用いられ得ると広範に理解される（例えばCurrentProtocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al.(N.Y. John Wiley & Sons,1991)参照）。別の実施形態では、精製リーダー配列をコードする融合タンパク質、例えば組換えタンパク質の所望の部分のＮ末端のポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列は、Ｎｉ２＋金属樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーによる発現融合タンパク質の精製を可能にし得る。精製リーダー配列は次に、エンテロキナーゼを用いた処理によりその後除去されて、精製タンパク質を提供し得る（例えばHochuliet al. (1987) J. Chromatography 411: 177;およびJanknecht et al. PNAS 88:8972参照）。
融合遺伝子の作製技法は、当業者に既知である。本質的には、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡ断片の連結は、連結のための平滑末端または付着末端、適切な末端を提供するための制限酵素消化、適切な場合には粘着末端の充填、望ましくない連結を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、ならびに酵素的連結を用いて、慣用的技法にしたがって実施される。別の実施形態では、融合遺伝子は、慣用的技法、例えば自動ＤＮＡ合成機により合成され得る。あるいは、その後アニーリングされてキメラ核酸配列を生じ得る２つの連続した核酸断片間に相補的オーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて、核酸断片のＰＣＲ増幅が実施され得る（例えばCurrentProtocols in Molecular Biology, eds. Ausubelet al. John Wiley & Sons: 1992参照）。
本発明はさらに、対象ポリペプチドの製造方法に関する。例えば、対象ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を指図する核酸ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞は、適切な条件下で培養されて、ペプチドの発現を起こさせる。細胞培養のための適切な培地は、当該技術分野で既知である。組換えポリペプチドは、タンパク質を精製するための当該技術分野で既知の技法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動およびこのようなペプチドに特異的な抗体を用いたイムノアフィニティー精製を用いて、細胞培地、宿主細胞またはその両方から単離され得る。好ましい実施形態では、組換えポリペプチドは、その精製を促すドメインを含有する融合タンパク質、例えばＧＳＴ融合タンパク質である。
さらに、ある状況下では、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットのみを促進または阻害するために、アゴニスト（模倣的）またはアンタゴニストのうちの１つとして限定能力で機能する対象ポリペプチドの１つの相同体を提供することが有益であり得ると一般に理解される。したがって特定の生物学的作用は、限定機能の相同体を用いた処理により、および天然に存在する形態の対象タンパク質の生物学的活性のすべてに向けられるアゴニストまたはアンタゴニストを用いた処理と比較してより少ない副作用を有する処理により特定の生物学的作用が引き出され得る。
対象ポリペプチドの各々の相同体は、突然変異誘発により、例えば別個の点突然変異（単数または複数）により、または切断により生成され得る。例えば突然変異は、それが得られたポリペプチドの実質的に同一のまたは単にサブセットの生物学的活性を保有する相同体を生じ得る。あるいは例えば受容体と競合的に結合することにより、天然に存在する形態のタンパク質の機能を抑制することができるアンタゴニスト形態のポリペプチドが生成され得る。
本発明の組換えポリペプチドは、例えばタンパク質に関連した普遍性またはその他の酵素的ターゲッティングを変更する突然変異のために、野生型タンパク質の相同体、例えばタンパク質分解的切断に耐性である種類のタンパク質も包含する。
ポリペプチドは、グリコシル基、脂質、ホスフェート、アセチル基等のようなその他の化学的部分との共有結合的または凝集結合体を形成することにより誘導体を作製するために化学的に修飾され得る。タンパク質の共有結合的誘導体は、タンパク質のアミノ酸側鎖上のまたはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の官能基と化学部分を連結することにより調製され得る。
対象ポリペプチドの構造の修飾は、治療的または予防的効力、安定性（例えばｅｘ ｖｉｖｏ貯蔵寿命およびタンパク質分解的分解に対する耐性）、あるいは翻訳後修飾（例えばタンパク質のリン酸化パターンを変更するために）を強化するといったような目的のためであり得る。このような修飾ペプチドは、天然に存在する形態のタンパク質の少なくとも１つの活性を保持するように、またはその特異的アゴニストを産生するように設計された場合、本明細書中でより詳細に記載されたポリペプチドの機能的等価物と考えられる。このような修飾ペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失または付加により生成され得る。置換的変異体は、置換保存アミノ酸または置換非保存アミノ酸であり得る。
例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの、グルタミン酸による BR>Aスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの単離置換、あるいは構造的に関連したアミノ酸による類似の置換（すなわち等電子配置性および／または等電性突然変異）は、その結果生じる分子の生物学的活性に大きな影響を及ぼさないと予測するのは理にかなっている。保存的置換は、それらの側鎖において関連があるアミノ酸のファミリー内で起こるものである。遺伝子コードアミノ酸は、４つのファミリーに分けられ得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、ならびに（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。同様の方式で、アミノ酸類は以下のように群別され得る：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニンで、任意にセリンおよびスレオニンは脂肪族−ヒドロキシルとして別個に分類される、（４）芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン、ならびに（６）硫黄含有＝システインおよびメチオニン（例えばBiochemistry,2 ed., Ed. by L. Stryer, WH Freeman and Co.:1981参照）。ペプチドのアミノ酸配列中の変化が機能的相同体を生じる（例えばその結果生じるポリペプチドが野生型形態を模倣するかまたは拮抗するという意味で機能的である）か否かは、野生型タンパク質と同様の方式で細胞中での応答を生じるかまたはこのような応答を競合的に抑制する変異体ペプチドの能力を査定することにより容易に決定され得る。
１つより多い置換が起きたポリペプチドは、同一方式で容易に試験され得る。変異体は、タンパク質の特定領域の生物学的活性を保持するよう設計され得る。非限定例において、Osawaet al., 1994, Biochemistry and Molecular International 34:1003-1009は、いくつかの異なる種からのタンパク質のアクチン結合領域を考察している。これらの種のアクチン結合領域は、それらが「相同残基群」内にあるアミノ酸を有するという事実に基づいて相同であると考えられる。相同残基は、以下の群（一文字アミノ酸名を使用）にしたがって判定される：ＳＴＡＧ；ＩＬＶＭＦ；ＨＲＫ；ＤＥＱＮ；およびＦＹＷ。例えばＳ、Ｔ、ＡまたはＧは一位置にあり、その機能（この場合はアクチン結合）が保持される。
アミノ酸置換に関する付加的指針は、タンパク質進化の研究から得られる。Goet al., 1980, Int. J. Peptide Protein Res. 15:211-224は、アミノ酸残基部位を、それらの接近可能性によって、内部または外部と分類した。外部部位におけるより高頻度の置換は、それらの生物学的機能および補欠分子族の存否に関係なく、８組の相同タンパク質ファミリーにおいて一般的であることが確証された。事実上すべての種類のアミノ酸残基が内部より外部においてより高い変異可能性を有した。変異可能性と極性との間の相関は、内部および外部のそれぞれにおけるアミノ酸残基について観察されなかった。アミノ酸残基は、それらの極性によって３群のうちの１つに分類された：極性（Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＡｓｐおよびＧｌｕ）；弱極性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＴｈｒおよびＳｅｒ）；ならびに非極性（Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）。タンパク質進化中のアミノ酸置換は非常に保存的であった：内部または外部におけるそれらのそれぞれ８８％および７６％が３つのうちの同一群内であった。群内置換は、弱極性残基が内部においては多くの場合非極性残基により、また外部に関しては多くの場合極性残基により置き換えられる。
Querol et al., 1996, Prot. Eng. 9:265-271は、タンパク質熱安定性を強化するためのアミノ酸置換に関する一般規則を提供する。新しいグリコシル化部位は、Olsenand Thomsen, 1991, J. Gen. Microbiol. 137:579-585に考察されているように導入され得る。付加的ジスルフィド架橋は、Perryand Wetzel, 1984, Science 226:555-557; Pantoliano et al., 1987, Biochemistry26:2077-2082; Matsumura et al., 1989, Nature 342:291-293; Nishikawa et al.,1990, Protein Eng. 3:443-448; Takagi et al., 1990, J. Biol. Chem,265:6874-6878; Clarke et al., 1993, Biochemistry 32:4322-43299;およびWakarchuk etal., 1994, Protein Eng. 7:1379-1386により考察されているように導入され得る。
付加的金属結合部位は、Toma et al., 1991, Biochemistry 30:97-106およびHaezerbrouck et al.,1993, Protein Eng. 6:643-649にしたがって導入され得る。ループ中のプロリンによる置換は、Masul et al., 1994,Appl Env. Microbiol. 60:3579-3584およびHardy et al., FEBS Lett. 317:89-92にしたがってなされ得る。
システイン枯渇突然変異タンパク質は、本発明の範囲内の変異体と考えられる。これらの変異体は、システインを他のアミノ酸に置換する方法および置換の生物学的活性および作用を決定する方法を開示する米国特許第４，９５９，３１４号に開示された方法にしたがって構築され得る。このような方法は、例えばジスルフィド結合形成を排除するための、このような置換に適したシステイン残基を有する本発明によるタンパク質に適している。
核酸と相関する遺伝子の同一性および機能を知るために、核酸または相当するアミノ酸配列がタンパク質ファミリーのプロフィールに対してスクリーニングされ得る。このようなプロフィールは、各ファミリーのタンパク質の間の共通の構造的モチーフに焦点をあわせる。公的に利用可能なプロフィールは上記のとおりである。
新規の核酸と既知の配列との比較に際して、数個のアラインメントツールが利用可能である。例としては、マルチプル配列アラインメントを作製するＰｉｌｅＵｐが挙げられ、Fenget al., J. Mol. Evol.(1987)25:35 1-360に記載されている。別の方法ＧＡＰは、Needleman et al., J.Mol. Biol. (1970) 48:443-453のアラインメント方法を用いる。ＧＡＰは、配列の包括的アラインメントに最も適している。第三の方法ＢｅｓｔＦｉｔは、Smithand Waterman, Adv. Appl.Math. (1981) 2:482-489の局所相同アルゴリズムを用いてマッチ数を最大にするためにギャップを挿入することにより機能する。
Ｘ．診断的および予後的アッセイならびに薬剤スクリーニング方法 本発明は、開示されたバイオマーカー、すなわちそれにコードされる結腸癌に関する本発明の核酸（配列番号１〜４４９４）および／またはポリペプチドマーカー（好ましくは配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３）を検出することにより、望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患または症状を被験体が発現する危険があるか否かを決定するための方法を提供する。
臨床用途では、本明細書中で同定されたバイオマーカーの存在および／または非存在に関して、ヒト組織試料がスクリーニングされ得る。このような試料は、針生検コア、外科的切除試料、リンパ節組織または血清から成る。例えばこれらの方法は、総細胞集団の約８０％に腫瘍細胞を濃化するためにクリオスタット切断により任意に分別される生検を得ることを包含する。ある種の実施形態では、これらの試料から抽出される核酸は、当該技術分野で既知の技法により増幅され得る。検出された選定マーカーのレベルは、転移、非転移、悪性、良性または正常結腸組織試料の統計学的有効群と比較される。
一実施形態では、診断方法は、例えばノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫沈降、ウエスタンブロットハイブリダイゼーションまたは免疫組織化学により、被験体が異常ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質レベルの開示マーカーを有するか否かを決定することを含む。当該方法によって、細胞が被験体から得られ、開示バイオマーカーのレベル、タンパク質またはｍＲＮＡレベルが決定され、健常被験体におけるこれらのマーカーのレベルと比較される。異常レベルのバイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡレベルは、癌、例えば結腸癌を示すと思われる。
したがって一態様において、本発明は、本明細書中に開示された独特の核酸マーカーに対して特異的であるプローブおよびプライマーを提供する。したがって核酸プローブは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド長、さらに好ましくは２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、核酸配列が配列番号１〜４４９４またはそれらに相補的な配列により表されるマーカー核酸配列のコード配列の一部と相補的であるすべてのまたはほとんどすべてのコード配列までのヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、本方法は、患者からの組織中の癌性細胞の存在を決定するために核酸プローブを用いることを包含する。特に本方法は、以下の： １．少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、および配列番号１〜４４９４またはそれらに相補的な配列のコード配列により表される核酸配列の一部と相補的であり、腫瘍細胞、例えば結腸癌細胞中でディファレンシャルに発現されるすべてのまたはほとんどすべてのコード配列までのヌクレオチド配列を含む核酸プローブを供給することと、 ２．癌性細胞を含む可能性のある患者から組織試料を獲得することと、 ３．実質的にすべてが非癌性である細胞を含有する第２の組織試料を提供することと、 ４．核酸プローブをストリンジェントな条件下で上記の第１のおよび第２の組織試料のそれぞれのＲＮＡとを接触させること（例えばノーザンブロットまたはin situハイブリダイゼーションアッセイにおいて）と、 ５．（ａ）第１の組織試料のＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションの量を（ｂ）第２の組織試料のＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションの量と比較することであって、該比較において、第２の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量と比較した場合の第１の組織試料のＲＮＡとのハイブリダイゼーションの量の統計学的有意差は、第１の組織試料中の癌性細胞の存在を示していることによって、比較することとを包含する。
一態様において、本方法は、核酸が配列番号１〜４４９４により表される所定のマーカー核酸配列またはそれらに相補的な配列に由来するプローブとのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを包含する。本方法は、標識ハイブリダイゼーションプローブと癌細胞または前癌性細胞を含有する可能性のある所定の種類の組織の試料ならびに正常細胞とを接触させることと、プローブが、それが同一組織型の他の細胞を標識する程度と有意に異なる程度に（例えば少なくとも２つだけ、または少なくとも５つだけ、または少なくとも２０だけ、または少なくとも５０だけからなるファクター）所定組織のいくつかの種類を標識するか否かを決定することとを包含する。
試験細胞のｍＲＮＡを、少なくとも１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも１５ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも４０ヌクレオチド、および配列番号１〜４４９４、またはそれらに相補的な配列により表される核酸配列のコード配列の一部分と相補的であり、所定の組織型の正常細胞と比較した場合に腫瘍細胞中でディファレンシャルに発現されるすべてのまたはほとんどすべての配列までの核酸プローブと接触させること、およびｍＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションのおよその量、試験細胞が癌性または前癌性であることを示す組織型の正常細胞のｍＲＮＡを用いて観察されるよりも多いかまたは少ないハイブリダイゼーションの量を決定することにより、所定のヒト組織からの試験細胞の表現型を、例えば細胞が（ａ）正常であるかあるいは（ｂ）癌性または前癌性であるかを決定する方法も本発明の範囲内である。
あるいは、上記の診断アッセイは、核酸が配列番号１〜４４９４、またはそれらに相補的な配列により表されるマーカー核酸配列にコードされるタンパク質産物を検出するために抗体を用いて実行され得る。したがって一実施形態では、アッセイは、配列番号１〜４４９４、好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、またはそれらに相補的な配列により表される核酸の遺伝子産物に特異的な抗体と試験細胞のタンパク質とを接触させ（マーカー核酸は試験細胞と同一組織型の正常細胞中で所定制御レベルで発現されるものである）、抗体および試験細胞のタンパク質による免疫複合体形成のおよその量を決定することを含み、同一組織型の正常細胞と比較した場合の試験細胞のタンパク質を用いて形成される免疫複合体の量における統計学的有意差は、試験細胞が癌性または前癌性であることの指標である。好ましくは抗体は、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のうちの１つに対して特異的である。
本発明において有用なポリペプチドと特異的に結合するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体の産生方法は当業者に既知であり、例えば、Dymecki etal., 1992, J. Biol. Chem., 267:4815; Boersma & Van Leeuwen, 1994, J.Neurosci. Methods, 51:317; Green et al., 1982, Cell, 28:477;およびArnheiteret al.,1981, Nature, 294:278に見出され得る。
別のこのような方法は、以下の：配列番号１〜４４９４により表されるマーカー核酸配列の遺伝子産物に特異的な抗体を提供する工程であって、遺伝子産物は、同一組織型の非癌性組織中の遺伝子産物のレベルより多いかまたは少ないレベルで所定の組織型の癌性組織（例えば結腸組織）中に存在する、供給する工程と；所定の組織型の組織の第１の試料を患者から採取する工程であって、試料は、癌性細胞を含む可能性がある、採取する工程と；同一組織型の組織（同じ患者または正常な対照からのもの、例えば他人または培養細胞であってよい）の第２の試料を提供する工程であって、この第２の試料は、正常細胞および本質的非癌性細胞を含有する、供給する工程と；抗体と第１のおよび第２の試料のタンパク質（溶解された、しかし非分画細胞中で、または原位置で部分的に精製され得る）とを、抗体と試料中に存在するマーカー核酸配列産物との間の免疫複合体形成を可能にする条件下で接触させる工程と；（ａ）第１の試料中の免疫複合体形成の量を（ｂ）第２の試料中の免疫複合体形成の量と比較する工程であって、第２の試料中での免疫複合体形成の量と比較した場合に、低い第１の試料中の免疫複合体形成の量における統計学的有意差が、組織の第１の試料中の癌性細胞の存在を示していることによって、比較することとを含む方法である。
本発明はさらに、被験体から得られる細胞試料が異常量のマーカーポリペプチドを保有するか否かを決定する方法であって、（ａ）被験体から細胞試料を採取することと、（ｂ）そのようにして得られた試料中のマーカーポリペプチドの量を定量的に決定することと、（ｃ）そのようにして決定されたマーカーポリペプチドの量を既知の標準と比較することであって、それにより被験体から得られた細胞試料が異常量のマーカーポリペプチドを保有するか否かを決定するために比較することと、を包含する方法を提供する。このようなマーカーポリペプチドは、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出され得る。
イムノアッセイは細胞試料中のタンパク質のレベルを定量するために一般的に用いられ、多数のその他のイムノアッセイ技法が当該技術分野で既知である。本発明は特定のアッセイ手法に限定されず、したがって同種および異種手法の両方を包含するよう意図される。本発明にしたがって実行され得るイムノアッセイの例としては、蛍光分極イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁分析的阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が挙げられる。指標部分または標識基は対象抗体に取り付けられ、アッセイ装備および適合性イムノアッセイ手法の利用可能性によりしばしば決定される方法の種々の用途の要求を満たすよう選択される。上記の種々のイムノアッセイを実施する場合に使用される一般的技法は、当業者に既知である。
別の実施形態では、コード産物、すなわち配列番号１〜４４９４またはそれらに相補的な配列にコードされる産物のレベル、あるいは患者の生物学的液体（例えば血液または尿）中の配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のポリペプチドのレベルは、その患者の細胞中のマーカー核酸配列の発現のレベルをモニタリングすることにより決定され得る。このような方法は、患者から生物学的液体の試料を獲得する工程と、試料（または試料からのタンパク質）をコードマーカーポリペプチドに特異的な抗体と接触させる工程と、抗体による免疫複合体形成の量を、試料中のマーカーコード産物のレベルを示す免疫複合体形成の量を用いて決定する工程とを包含する。この決定は特に、正常個体から採取された対照試料におけるあるいは同一人から予めまたはその後得られる１つまたはそれ以上の試料における同一抗体による免疫複合体形成の量と比較される場合に有益である。
別の実施形態では、本方法は、細胞中に存在するマーカーポリペプチドの量を決定するために用いられるが、この量は次に、過増殖性障害、例えば結腸癌の進行と相関され得る。マーカーポリペプチドのレベルは、細胞の試料が、形質転換されるかまたは前もって形質転換される細胞になるようにされる細胞を含有するか否かを評価するために予測的に用いられ得る。さらに本発明の方法は、形質転換されることが既知である細胞の表現型を査定するために用いられ、表現型分類結果は、特定の治療レジメンを計画するのに有用である。例えば試料細胞中の極高レベルのマーカーポリペプチドは、癌、例えば結腸癌に関する強力な診断および予後マーカーである。マーカーポリペプチドレベルの観察は、例えばより攻撃的な療法の使用に関する決定に利用され得る。
上記のように本発明の一態様は、患者から単離された細胞の情況において、マーカーポリペプチドのレベルが試料細胞中で有意に低減されるか否かを決定するための診断アッセイに関する。「有意に低減される」という用語は、同様の組織起源の正常細胞と比較して、細胞がマーカーポリペプチドの細胞量低減を示す細胞表現型を指す。例えば細胞は、正常対照細胞より約５０％、２５％、１０％または５％少ないマーカーポリペプチドを有し得る。特に本アッセイは、試験細胞中のマーカーポリペプチドのレベルを評価し、好ましくは、測定レベルを、少なくとも１つの対照細胞、例えば既知の表現型の正常細胞および／または形質転換細胞中で検出されるマーカーポリペプチドと比較する。
本発明に対して特に重要なのは、正常または異常マーカーポリペプチドレベルに関連した細胞の数により決定される場合、マーカーポリペプチドのレベルを定量する能力である。特定マーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数は次に、患者予後と相関され得る。本発明の一実施形態では、病変のマーカーポリペプチド表現型は、異常に高い／低いレベルのマーカーポリペプチドを有することが見出されている生検における細胞のパーセンテージとして決定される。このような発現は、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ等により検出され得る。
組織試料が用いられる場合、免疫組織化学的染色が用いられて、マーカーポリペプチド表現型を有する細胞の数が決定され得る。このような染色のために、組織の多ブロックが生検またはその他の組織試料から採取され、プロテアーゼＫまたはペプシンのような作用物質を用いてタンパク質分解的加水分解に付される。ある種の実施形態では、試料細胞から核分画を単離し、核分画中のマーカーポリペプチドのレベルを検出するのが望ましい。
組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデヒド、メタノール等のような試薬を用いた処理により固定される。次に試料は、マーカーポリペプチドに対する結合特異性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体とともにインキュベートされる。この抗体は、結合のその後の検出のための標識と接合され得る。試料は、免疫複合体の形成に十分な時間、インキュベートされる。その後、この抗体と接合した標識により、抗体の結合が検出される。抗体が標識されていない場合、例えば抗マーカーポリペプチド抗体のアイソタイプに特異的な二次標識抗体が用いられ得る。用いられ得る標識の例としては、放射性核種、蛍光体、化学発光体、酵素等が挙げられる。
酵素が用いられる場合、酵素のための基質が試料に添加されて、着色または蛍光産物を提供する。結合体中に用いるための適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ等が挙げられる。市販されていない場合、このような抗体−酵素接合体は、当業者に既知の技法により容易に産生される。
一実施形態では、アッセイはドットブロットアッセイとして実施される。ドットブロットアッセイは、所定数の細胞から産生される無細胞抽出物中のマーカーポリペプチドの量と相関させることにより、それが単一細胞と関連したマーカーポリペプチドの平均量の決定を可能にするので、組織試料が用いられる場合に特に用途を見出す。
同一種類の腫瘍細胞（例えば乳癌および／または結腸癌細胞）が個々の癌遺伝子の発現の均一増大または個々の腫瘍抑制遺伝子の発現の均一低減を示さないということは、癌文献中で十分に確立されている。所定の種類の癌の細胞間でさえ所定マーカー遺伝子の種々のレベルの発現が存在し、単一試験よりむしろ一組の試験に対する信頼の必要性をさらに強調する。したがって一態様において、本発明は、診断試験の信頼性および／または精度を改良するために、多数の本発明のプローブを利用する一組の試験を提供する。
一実施形態では、本発明は、核酸プローブが組織化アレイ中のＤＮＡチップ上に固定される方法も提供する。オリゴヌクレオチドは、種々の方法、例えばリソグラフィーにより固体支持体に結合され得る。例えばチップは、２５０，０００個のオリゴヌクレオチドまでを保持し得る（GeneChip,Affymetrix）。これらの核酸プローブは、少なくとも約１２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド配列、および配列番号１〜４４９４により表されるマーカー核酸配列のコード配列の一部と相補的であり、腫瘍細胞、例えば結腸癌細胞中でディファレンシャルに発現されるすべてのまたはほぼすべての配列までを包含する。本発明は、単一チップ上に核酸マーカーのアレイを提供することにより試験の信頼性を増大するため、種々の癌、例えば結腸癌に関して利用可能な試験を上回る有意の利点を提供する。
本方法は、総細胞集団の約８０％に腫瘍細胞を濃化するためにクリオスタット切断により任意に分別される生検を得ることを包含する。次にＤＮＡまたはＲＮＡが抽出され、増幅され、ＤＮＡチップを用いて分析されて、マーカー核酸配列の存在または非存在を決定する。
一実施形態では、核酸プローブは二次元マトリックスまたはアレイ中の支持体上にスポッティングされる。核酸の試料は標識され、次にプローブとハイブリダイズされる。プローブ核酸に結合された標識試料核酸を含む二本鎖核酸は、いったん試料の非結合部分が洗い落とされれば、検出され得る。
プローブ核酸は、支持体、例えばガラス、ニトロセルロース等の上にスポッティングされ得る。プローブは、共有結合によるかまたは非特異的相互作用、例えば疎水性相互作用により支持体に結合され得る。試料核酸は、放射性標識、蛍光団、発色団等を用いて標識され得る。
アレイの構築のための技法およびこれらのアレイを用いる方法は、例えば欧州特許第０，７９９，８９７号、ＰＣＴ国際公開第９７／２９２１２号、ＰＣＴ国際公開第９７１２７３１７号、欧州特許第０，７８５，２８０号、ＰＣＴ国際公開第９７／０２３５７号、米国特許第５，５９３，８３９号、米国特許第５，５７８，８３２号、欧州特許第０，７２８，５２０号、米国特許第５，５９９，６９５号、欧州特許第０，７２１，０１６号、米国特許第５，５５６，７５２号、ＰＣＴ 国際公開第９５／２２０５８号、および米国特許第５，６３１，７３４号に記載されている。
さらに、アレイは、遺伝子のディファレンシャルな発現を検査するために用いられ得るし、遺伝子機能を決定するために用いられ得る。例えば当該核酸配列のアレイは、任意の核酸配列が例えば正常細胞および癌細胞間でディファレンシャルに発現されるか否かを決定するために用いられ得る。相当する正常細胞中では観察されない癌細胞中の特定のメッセージの高発現は、癌特異的タンパク質を示し得る。
一実施形態では、本発明において有用な核酸分子、例えば配列番号１〜４４９４のもの、好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のものは、整列させた核酸分子を用いて任意の核酸が正常細胞または組織および癌性細胞または組織間でディファレンシャルに発現されるか否かを決定し得るよう、膜のような固体表面にマクロアレイを生成するために用いられ得る。一実施形態では、本発明の核酸分子は、ｃＤＮＡであるか、またはその後ＰＣＲにより増幅され、ナイロン膜上にスポッティングされるｃＤＮＡ分子を生成するために用いられ得る。膜は次に、癌性および正常組織または細胞の等価試料から得られた放射能標識標的核酸分子と反応させられる。ｃＤＮＡ生成およびマクロアレイ調製の方法は当業者に既知であり、例えばBertucciet al., 1999 Hum.Mol. Genet. 8:2129、Nguyen et al., 1995, Genomics, 29:207、Zhao et al.,Gene, 156:207、Gress et al., 1992, Mammalian Genome, 3:609、Zhumabayevaet al., 2001, Biotechniques, 30:158;およびLennon et al., 1991, Trends Genet. 7:314に見出され得る。
さらに別の実施形態では、本発明は、本発明のマーカーポリペプチドに対して生成される抗体のパネルを用いることを意図し、このポリペプチドは、配列番号１〜４４９４、好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のうちの１つまたは複数にコードされる。好ましくは抗体は、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３の配列を有する１つまたは複数のポリペプチドに対して生成される。このような抗体のパネルは、結腸癌に関する信頼できる診断プローブとして用いられ得る。本発明のアッセイは、細胞、例えば結腸細胞を含有する生検試料を、１つまたは複数のコード産物に対する抗体のパネルと接触させて、マーカーポリペプチドの存在または非存在を決定することを包含する。
本発明の診断方法は、治療に対する追跡調査としても用いられ、例えばマーカーポリペプチドのレベルの定量は、現在用いられているかまたは前に用いられた癌療法の有効性、ならびに患者の予後におけるこれらの治療の効果を示し得る。
したがって本発明は、例えば細胞の腫瘍形成性形質転換から生じる増殖性障害の診断および表現型分類を助けるために、細胞からのマーカーポリペプチドの獲得および／または損失を検出するための診断アッセイおよび試薬を利用可能にする。
上記の診断アッセイは、同様に予後アッセイとして用いられるよう適合され得る。このような用途は、腫瘍の進行に特徴的な段階で起こる事象に対する本発明のアッセイの感度を利用する。例えば所定のマーカー遺伝子は、ごく初期に、おそらくは細胞が不可逆的に悪性疾患に発達する前に、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得るが、一方、別のマーカー遺伝子はごく後期にのみ、特徴的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。このような方法は、試験細胞のｍＲＮＡを、腫瘍進行の異なる段階での癌性または前癌性細胞中で異なる特徴的レベルで発現される所定のマーカー核酸由来の核酸プローブと接触させ、細胞のｍＲＮＡとのプローブのハイブリダイゼーションのおよその量（このような量は細胞中の遺伝子の発現レベルの指標であり、したがって細胞の腫瘍進行の段階の指標である）を決定する工程を包含し、あるいはアッセイは、試験細胞のタンパク質と接触された所定のマーカー核酸の遺伝子産物に特異的な抗体を用いて実行され得る。一組のこのような試験は、腫瘍の存在および位置を開示するだけでなく、腫瘍に最も適した治療の方式を医師に選択させ、その治療の成功の見込みを予測させる。
本発明の方法は、腫瘍の臨床経過を追跡するためにも用いられ得る。例えば本発明のアッセイは、患者からの組織試料に適用され得る。癌に対する患者の治療後、別の組織試料が採取され、試験が反復される。首尾よい治療は、癌性または前癌性細胞に特徴的なディファレンシャルな発現を実証するすべての細胞の除去を、あるいはおそらくは正常レベルに近づくかまたはそれを超えることさえあるそれらの細胞中の遺伝子の発現の実質的増大を生じる。
さらに別の実施形態では、本発明は、被験体が、配列番号１〜４４９４の核酸にコードされるポリペプチドのいずれか１つ、好ましくは配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチドのいずれか１つの異常活性に関連した疾患を発症する危険にさらされている、例えば癌、例えば結腸癌を発症する素因があるか否かを決定するための方法を提供するが、この場合、ポリペプチドの異常活性は、（ｉ）マーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼす変化、または（ｉｉ）コード核酸の誤発現のうちの少なくとも１つにより特性化される遺伝子病変の存在または非存在を検出することにより特性化される。例示するために、このような遺伝子病変は、（ｉ）核酸配列からの１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）核酸配列への１つまたは複数のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）核酸配列の１つまたは複数のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）核酸配列の全体的染色体再配列、（ｖ）核酸配列のメッセンジャーＲＮＡ転写体のレベルにおける全体的変化、（ｖｉ）核酸配列の、例えばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常修飾、（ｖｉｉ）遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写体の非野生型スプライシングパターンの存在、（ｖｉｉｉ）非野生型レベルのマーカーポリペプチド、（ｉｘ）遺伝子の対立遺伝子損失、および／または（ｘ）マーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾のうちの少なくとも１つの存在を確証することにより検出され得る。
本発明は、コード核酸配列中の病変を検出するためのアッセイ技法を提供する。これらの方法としては、配列分析、サザンブロットハイブリダイゼーション、制限酵素部位マッピングを包含する方法、ならびに分析される核酸とプローブとの間のヌクレオチド対合の非存在の検出を包含する方法が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の疾患または障害、例えば遺伝子疾患または障害は、突然変異化タンパク質を必ずしもコードしないある種の遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体に関連する。したがって、被験体における遺伝子の多型領域の特定の対立遺伝子変異体の存在は、被験体が特定の疾患または障害を発症し易くし得る。遺伝子中の多型領域は、個体の集団中での遺伝子のヌクレオチド配列を決定することにより同定され得る。多型領域が同定された場合には、特定疾患との関連は、個体、例えば結腸癌のような特定の疾患を発症した個体である固体の特定集団を研究することにより決定され得る。多型領域は、エキソン、イントロンおよびプロモーター領域のコードまたは非コード領域における遺伝子の任意の領域、例えばエキソンで位置付けられ得る。
例示的実施形態では、遺伝子またはその天然突然変異体のセンスまたはアンチセンス配列、もしくは対象遺伝子またはその天然突然変異体と天然に関連した５‘または３’フランキング配列あるいはイントロン配列とハイブリダイズし得るヌクレオチド配列の領域を包含する核酸プローブを含む核酸組成物が提供される。細胞の核酸はハイブリダイゼーションのために接近可能にされ、プローブは試料の核酸と接触され、試料核酸とのプローブのハイブリダイゼーションが検出される。このような技法は、欠失、置換等を含めたゲノムまたはｍＲＮＡレベルでの病変または対立遺伝子変異体を検出するために、ならびにｍＲＮＡ転写体レベルを決定するために用いられ得る。
好ましい検出方法は、突然変異または多型部位に重複し、突然変異または多型部位周囲に約５個、１０個、２０個、２５個または３０個のヌクレオチドを有するプローブを用いる対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の好ましい実施形態では、対立遺伝子変異体と特異的にハイブリダイズし得る数個のプローブが固相支持体、例えば「チップ」に取り付けられる。「ＤＮＡプローブアレイ」とも呼ばれるオリゴヌクレオチドを含むこれらのチップを用いた突然変異検出分析は、例えばCroninet al.(1996) Human Mutation 7:244に記載されている。一実施形態では、チップは遺伝子の少なくとも１つの多型領域のすべての対立遺伝子変異体を含む。次に固相支持体は試験核酸と接触され、特定プローブへのハイブリダイゼーションが検出される。したがって、１つまたは複数の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体の同一性は、簡単なハイブリダイゼーション実験において同定され得る。
ある種の実施形態では、病変の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号参照）、例えばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲにおいて、あるいはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばLandegranet al. (1988) Science 241:1077-1080、およびNakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364参照）において、プローブ／プライマーを利用することを包含し、これらのうちの後者は、遺伝子中の点突然変異を検出するために特に有用であり得る（Abravayaet al. (1995) Nuc Acid Res 23:675-682参照）。単なる例示的実施形態では、本方法は、（ｉ）患者から細胞の試料を収集する工程と、（ｉｉ）試料の細胞から核酸（例えばゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離する工程と、（ｉｉｉ）核酸（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーと核酸試料を接触させる工程と、（ｉｖ）増幅産物の存在または非存在を検出する工程、あるいは増幅産物のサイズを検出して、対照試料と長さを比較する工程とを包含する。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書中に記載された突然変異を検出するために用いられる任意の技法とともに予備増幅工程として用いるのが望ましいと予測される。
代替的増幅方法としては、自己持続性配列複製（Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA87:1874-1878）、転写増幅系（Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197）または任意のその他の核酸増幅方法と、その後に、当業者に既知の技法を用いた増幅分子の検出が挙げられる。これらの検出方式は、核酸分子がごく少数で存在する場合に、このような分子の検出のために特に有用である。
本発明のアッセイの好ましい実施形態では、試料細胞からの遺伝子の突然変異またはその対立遺伝子変異体は、制限酵素切断パターンの変化により同定される。例えば試料および対照ＤＮＡが単離され、増幅され（任意に）、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼで消化され、かつゲル電気泳動により断片長サイズが決定される。さらに、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第５，４９８，５３１
号参照）の使用は、リボザイム切断部位の発達または損失により特定の突然変異の存在に関して採点するために用いられ得る。
本発明の別の態様は、異常増殖により特性化される細胞の分化および増殖を調整し得る作用物質の同定に関する。これに関して、本発明は、マーカー核酸（配列番号１〜４４９４、好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４）の発現を調整し、かつ／または配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のようなコードされたポリペプチドの生理活性を変更する（例えば阻害する）化合物を決定するためのアッセイを提供する。
いくつかのｉｎ ｖｉｖｏ方法を用いて、マーカー核酸（配列番号１〜４４９４）の発現を調整し、かつ／またはコードポリペプチドの生理活性を変更する、例えば阻害する化合物を同定し得る。
薬剤スクリーニングは、試験化合物を細胞の試料に添加し、かつその作用をモニタリングすることにより実施される。試験化合物を受入れない平行試料も、対照としてモニタリングされる。次に、任意の適切な表現型判定基準、例えば顕微鏡的分析、生育可能性試験、複製する能力、組織学的検査、細胞に関連した特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解産物により発現される酵素活性のレベル、ならびに他の細胞または化合物と相互作用する細胞の能力（これらに限定されない）により、処理細胞と非処理細胞が比較される。処理細胞と非処理細胞との間の差は、試験化合物に起因する作用を示す。
試験化合物の望ましい作用としては、癌関連マーカー核酸配列により付与された任意の表現型に及ぼす作用が挙げられる。例としては、ｍＲＮＡの過多を制限し、コードタンパク質の産生を制限し、またはタンパク質の機能的作用を制限する試験化合物が挙げられる。試験化合物の作用は、処理細胞と非処理細胞との間の結果を比較すると明らかになる。
したがって本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの核酸マーカー（配列番号１〜４４９４、好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４）の発現を阻害する作用物質に関するスクリーニング方法であって、作用物質がｍＲＮＡの産生を阻害し得るか否かを決定するために、マーカー核酸ｍＲＮＡが培養細胞中で検出可能である細胞または組織を作用物質に曝露し、かつ曝露細胞または組織中のｍＲＮＡのレベルを決定することを含む方法も包含するが、この場合、作用物質への細胞系の曝露後のｍＲＮＡのレベルの低下は、マーカー核酸ｍＲＮＡ産生の阻害を示す。
あるいはスクリーニング方法は、マーカータンパク質の産生を阻害すると思われる作用物質に対してマーカータンパク質が培養細胞中で検出可能である細胞または組織をｉｎ ｖｉｔｒｏでスクリーニングし、かつ細胞または組織中のマーカータンパク質のレベルを決定することを包含し得るが、この場合、作用物質への細胞系または組織曝露後のマーカータンパク質のレベルの低減は、マーカータンパク質産生の阻害を示す。
本発明は、マーカー核酸の発現を阻害する作用物質に関するｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング方法であって、マーカーｍＲＮＡまたはタンパク質が検出可能である腫瘍細胞を有する哺乳類を、マーカー核酸ｍＲＮＡまたはタンパク質の産生を阻害すると思われる作用物質に曝露し、かつ曝露哺乳類の腫瘍細胞中のｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルを決定することを含む方法も包含する。作用物質への哺乳類の曝露後のマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルの低減は、マーカー核酸発現の阻害を示す。
したがって本発明は、マーカー核酸（配列番号１〜４４９４）を発現する細胞を試験化合物とともにインキュベートすることと、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定することとを包含する方法を提供する。本発明はさらに、細胞集団中のマーカー核酸の発現レベルを定量的に決定する方法、ならびに作用物質が細胞集団中のマーカー核酸の発現レベルを増大し得るかまたは低減し得るかを決定する方法を提供する。作用物質が細胞集団中のマーカー核酸の発現レベルを増大し得るかまたは低減し得るかを決定する方法は、（ａ）対照および作用物質処理細胞集団から細胞抽出物を調製する工程と、（ｂ）細胞抽出物からマーカーポリペプチドを単離する工程と、（ｃ）マーカーポリペプチドと上記ポリペプチドに特異的な抗体との間に形成される免疫複合体の量を（平行して）定量する工程とを包含する。本発明のマーカーポリペプチドは、その生理活性に関してアッセイすることによっても定量され得る。マーカー核酸発現増大を誘導する作用物質は、対照細胞中に形成される免疫複合体の量と比較した場合に、処理細胞中で形成される免疫複合体の量を増大するそれらの能力により同定され得る。同様にして、マーカー核酸の発現を低減する作用物質は、対照細胞と比較した場合に、処理細胞抽出物中に形成される免疫複合体の量を低減するそれらの能力により同定され得る。
ｍＲＮＡレベルは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションにより決定され得る。ｍＲＮＡレベルは、ＰＣＲを包含する方法によっても決定され得る。高スループットアッセイに用いられ得るｍＲＮＡを測定するためのその他の感受性方法、例えばＤＥＬＦＩＡ終点検出を用いる方法および定量方法は、例えばWebband Hurskainen (1996) Journal of Biomolecular Screening 1:119に記載されている。マーカータンパク質レベルは、配列番号１〜４４９４、好ましくは配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３の配列を有するタンパク質のうちの１つまたは複数にコードされるタンパク質産物を特異的に認識する抗体を用いた免疫沈降または免疫組織化学により決定され得る。
薬剤スクリーニングアッセイにおいて活性であると同定される作用物質は、細胞増殖活性を遮断するそれらの能力に関して試験される候補である。これらの作用物質は、細胞、特に結腸細胞の細胞異常増殖を包含する障害を治療するために有用である。
種々のアッセイ方式が十分であり、本発明の開示を鑑みて、本明細書中にはっきりと記載されていないものは、それにもかかわらず当業者に理解される。例えばアッセイは多数の異なる方式で生成され得て、その例としては、無細胞系、例えば精製タンパク質または細胞溶解物に基づいたアッセイ、ならびに無傷細胞を利用する細胞ベースのアッセイが挙げられる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬剤スクリーニングプログラムにおいて、所定期間に検査される化合物の数を最大にするためには、ハイスループットアッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質を用いて、あるいは溶解物を用いて得ることができるような無細胞系で実施される本発明のアッセイは、試験化合物により媒介される分子標的における変化の迅速な発達および比較的容易な検出を可能にするためにそれらが生成され得るという点において「一次」スクリーニングとして、しばしば選択される。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的利用能の作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系においては一般的に無視され、それに代わるアッセイは、他のタンパク質との結合親和性の変化または分子標的の酵素特性の変化において明白であり得る分子標的に及ぼす薬剤の作用に主として集中している。
Ａ．マッピングおよび組織プロファイリングプローブにおけるプローブとしての核酸の使用 例えば、ヌクレオチド配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、さらにいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４またはそれらに相補的な配列から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含む上記のようなポリペプチドプローブは、種々の目的のために、例えばヒト染色体の同定ならびに転写レベルの決定のために用いられる。核酸配列の好ましい領域についての付加的開示は、添付の表に見出される。
ヌクレオチドプローブは、例えば放射性、蛍光、ビオチン化または化学発光標識を用いて標識され、選定された特定の標識に適した既知の方法により検出される。ヌクレオチドプローブを中期染色体の調製物とハイブリダイズするためのプロトコルも、当該技術分野で既知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列と相補的である染色体調製物中のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。核酸と特異的にハイブリダイズするプローブは、他の非関連配列を用いて提供されるバックグラウンドハイブリダイゼーションより少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供するはずである。
非限定例では、癌のような疾患と一般的に関連した染色体の領域を同定するためには、市販のプログラムが利用可能である。本発明の核酸を用いて、これらの領域をプローブし得る。例えばプロフィール探索により、核酸が、キナーゼをコードする遺伝子に相当すると同定された場合、癌関連染色体領域と結合するその能力は、腫瘍細胞発達／増殖の１つまたは複数の段階におけるキナーゼとしてのその役割を示唆する。役割を明らかにする必要がある実験もあるが、核酸は、癌診断または治療を開発するための可能性を有する特定タンパク質を単離するための新規の物質を構成する。
ヌクレオチドプローブは、核酸に相当する遺伝子の発現を検出するために用いられる。例えばノーザンブロットにおいては、ｍＲＮＡは電気泳動的に分離され、プローブと接触される。特定サイズのｍＲＮＡ種とハイブリダイズする場合に、プローブは検出される。ハイブリダイゼーションの量は、例えば特定条件下で発現の相対量を決定するために定量される。プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応による増幅の産物を検出するためにも用いられる。反応産物はプローブとハイブリダイズされて、ハイブリッドが検出される。プローブは、発現を検出するための細胞とのｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために用いられる。プローブは、ハイブリダイズしている配列の診断的検出のためにｉｎ ｖｉｖｏでも用いられ得る。プローブは、典型的には放射性同位元素を用いて標識される。他の種類の検出可能標識、例えば発色団、蛍光団および酵素が用いられ得る。
特定のｍＲＮＡの発現は、異なる細胞型において変化し、組織特異的であり得る。異なる細胞型におけるｍＲＮＡレベルのこの変化は、核酸プローブアッセイとともに利用されて、組織型を決定し得る。例えば、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、さらに好ましくは配列番号１〜５０３、さらに好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４またはそれらに相補的な配列の核酸と実質的に同一であるかまたは相補的である核酸プローブを利用するＰＣＲ、分枝鎖ＤＮＡプローブアッセイ、またはブロッティング技法は、標的ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在または非存在を決定し得る。
ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの例は、ＰＣＴ国際公開第９２／０２５２６号（Urdea等）および米国特許第５，１２４，２４６号（Urdea等）（これらの記載内容はともに、参照により本明細書中に援用される）に記載されている。当該参考文献は、サンドイッチヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイの一例を記載する。
あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Mullis et al., Met/i. Enzymol. (1987) 155:335-350、米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される）に記載されているように、少量の標的核酸を検出するための別の手段である。２つのプライマーポリヌクレオチドは、標的核酸とハイブリダイズし、反応を用意するために用いられる。プライマーは、配列表のポリヌクレオチド内のまたはそれに対して３’および５’の配列から成る。あるいは、プライマーがこれらのポリヌクレオチドに対して３’および５’である場合、それらはそれらとまたは相同体とハイブリダイズする必要はない。熱安定性ポリメラーゼは、鋳型としてオリジナル標的核酸を用いて、プライマーから標的核酸のコピーを作製する。大量の標的核酸がポリメラーゼにより生成された後、それは、サザンブロットのような方法により検出される。サザンブロット法を用いる場合、標識プローブは、配列表のポリヌクレオチドまたは相同体とハイブリダイズする。
さらに、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”(NewYork, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載された伝統的ブロッティング技法により検出され得る。ポリメラーゼ酵素を用いてｍＲＮＡから生成されたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、ゲル電気泳動を用いて精製され、分離され得る。ゲル上の核酸は次に、固体支持体、例えばニトロセルロース上にブロットされる。固体支持体は標識プローブに曝露され、次に洗浄されて、あらゆるハイブリダイズしていないプローブを除去する。次に、標識プローブを含有する二重鎖が検出される。典型的には、プローブは放射能で標識される。
マッピング 本発明の核酸は、相当する遺伝子が存在する染色体を同定するために用いられる。正常中期展開物上で蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、比較ゲノムハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ配列の相対コピー数の変化の全体的ゲノム評価を可能にする（Schwartzand Samad, Current Opinions in Biotechnology (1994) 8:70-74; Kallioniemi etal., Seminars in Cancer Biology (1993) 4:41-46; Valdes and Tagle, Methods inMolecular Biology (1997) 68:1, Boultwood, ed., Human Press, Totowa, NJ参照）。
ヒト中期染色体の調製物は、ヒト初代組織または細胞系から標準細胞遺伝学的技法を用いて調製される。配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、さらにいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４のヌクレオチド配列またはそれらに相補的な配列から選択される少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを含むヌクレオチドプローブが、相当する染色体を同定するために用いられる。ヌクレオチドプローブは、例えば放射性、蛍光、ビオチン化または化学発光標識を用いて標識され、選定された特定の標識に適した既知の方法により検出される。ヌクレオチドプローブを中期染色体の調製物とハイブリダイズするためのプロトコルも、当該技術分野で既知である。ヌクレオチドプローブは、プローブのヌクレオチド配列と相補的である染色体調製物中のヌクレオチド配列と特異的にハイブリダイズする。標的遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブは、非関連コード配列を用いて提供されるバックグラウンドハイブリダイゼーションより少なくとも５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供する。
核酸は、例えば放射線ハイブリッドまたは染色体特異的ハイブリッドパネルを用いて特定の染色体にマッピングされる（Leach et al., Advancesin Genetics, (1995) 33:63-99; Walter et al., Nature Genetics (1994) 7:22-28;Walterand Goodfellow, Trends in Genetics (1992) 9:352参照）。放射線ハイブリッドマッピングに関するパネルは、ResearchGenetics, Inc., Huntsville, Alabama, USAから入手可能である。種々のパネルを用いたマーカーに関するデータベースは、http:/F/shgc-www.stanford.eduおよびその他のロケーションでワールドワイドウェブを経由して利用可能である。統計プログラムＲＨＭＡＰは、あるオーダー対別のオーダーの相対的見込みの測定により放射線ハイブリダイゼーションからのデータに基づいたマップを構築するために用いられ、ＲＨＭＡＰは、http://www.sph.umich.edu/group/statgen/softwareでワールドワイドウェブを経由して利用可能である。
このようなマッピングは、既知の機能を有する他の遺伝子に対するその近接性により標的遺伝子の機能を同定するのに有用であり得る。機能は、特定の症候群または疾患が同一染色体に位置する場合、標的遺伝子に割り当てられ得る。
組織プロファイリング 本発明の核酸は、所定試料が得られる組織型を決定するために用いられ得る。例えば転移性病変は、その器官または組織の特定のマーカーの発現を同定することにより、その発達した器官または組織源により同定される。核酸が特定組織型においてのみ発現され、転移性病変がその核酸を発現することが見出された場合には、病変の発生源は同定された。特定核酸の発現は、相当するｍＲＮＡまたはタンパク質産物の検出によりアッセイされる。免疫学的方法、例えば抗体染色を用いて、特定タンパク質産物を検出し得る。ハイブリダイゼーション法は、特定ｍＲＮＡ種を検出するために用いられ、その例としては、例えばｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびノーザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
多型の使用 遺伝子の相当する領域がヒト集団において多型である場合、核酸は、討論学、遺伝子分析、マッピングおよび診断的用途に有用である。特定の多型形態の核酸を用いて、疑わしいものに由来すると試料を同定するか、あるいは試料が疑わしいものに由来する可能性を除外し得る。遺伝子における多型を検出するための任意の手段が用いられ、その例としてはタンパク質多型変異体の電気泳動、制限酵素切断に対するディファレンシャルな感受性および対立遺伝子特異的プローブとのハイブリダイゼーションが挙げられるが、これらに限定されない。
Ｂ．抗体を産生するための核酸およびコードポリペプチドの使用 核酸の発現産物、相当するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいは相当する完全遺伝子は、実験、診断および治療目的のために抗体を産生するために調製され、用いられる。相当する遺伝子が割り当てられていない核酸に関しては、これは、相当する遺伝子を同定するための付加的方法を提供する。核酸または関連ｃＤＮＡは、上記と同様に発現され、抗体が調製される。これらの抗体はコードポリペプチド上のエピトープに対して特異的であり、細胞または組織調製物中で、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系の無細胞抽出物中で、相当する天然タンパク質を沈殿させるかまたはそれと結合し得る。
抗体を産生するための免疫原は、本発明の核酸にコードされるポリペプチドをアジュバントと混合することにより調製される。あるいはポリペプチドは、大型免疫原性タンパク質との融合タンパク質として作製される。ポリペプチドは、他の大型免疫原性タンパク質、例えばスカシガイヘモシアニンとも共有結合される。免疫原は、典型的には皮内に、皮下にまたは筋肉内に投与される。免疫原は、実験動物、例えばウサギ、ヒツジおよびマウスに投与されて、抗体を生成する。任意に、動物脾臓細胞が単離され、骨髄腫細胞と融合されて、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを形成する。このような方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知の別の方法によれば、核酸は直接的に、例えば筋肉内注射により投与されて、invivoで発現される。発現タンパク質は、タンパク質の投与に匹敵する種々のタンパク質特異的免疫応答、例えば抗体産生を生じる。
核酸コードタンパク質およびポリペプチドに特異的なポリクローナルおよびモノクローナル抗体の調製は、当該技術分野で既知の標準方法を用いてなされる。抗体は、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、よりいっそう好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の核酸またはそれらに相補的な配列にコードされるポリペプチド中に存在するエピトープと特異的に結合する。好ましい実施形態では、抗体は、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のポリペプチド上のエピトープと結合する。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも約６個、８個、１０個または１２個の連続したアミノ酸が必要とされる。しかしながら、非連続アミノ酸を包含するエピトープは、より多くの、例えば少なくとも約１５個、２５個または５０個のアミノ酸を要する。その場合、既知のタンパク質との交差反応性に関する可能性のために、短い配列のアミノ酸は、相当する新規タンパク質を同定するために抗体を産生するためのエピトープとして用いるのに適していないことがある。しかしながら抗体は、特にそれらが既知のタンパク質および本発明の核酸にコードされる新規のポリペプチドの共通の構造的特徴を同定する場合、他の目的のために有用であり得る。
ヒト核酸コードポリペプチドと特異的に結合する抗体は、ウエスタンブロットまたはその他の免疫化学的アッセイに用いられる場合、他のタンパク質を用いて提供される検出シグナルより少なくとも約５倍、１０倍または２０倍高い検出シグナルを提供するはずである。好ましくは、核酸Ｔコードポリペプチドと特異的に結合する抗体は免疫化学的アッセイにおいて他のタンパク質を検出せず、溶液から核酸コードタンパク質を免疫沈降し得る。
ヒト集団における核酸コードポリペプチドに対する血清抗体の存在に関して試験するために、ヒト抗体が当該技術分野で既知の方法により精製される。好ましくは抗体は、核酸コードタンパク質、ポリペプチドまたは融合タンパク質が結合されるカラム上に抗血清を通すことにより、アフィニティー精製される。結合抗体は次に、例えば高塩濃度を有する緩衝液を用いてカラムから溶離され得る。
上記の抗体のほかに、遺伝子操作した抗体誘導体、例えば一本鎖抗体が作製される。
抗体は、当該技術分野で既知の標準プロトコルを用いて作製され得る（例えばAntibodies: A Laboratory Manual ed. ByHarlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)参照）。哺乳類、例えばマウス、ハムスターまたはウサギは、免疫原形態のペプチド（例えば抗体応答を引き出すことが可能な哺乳類ポリペプチドまたは抗原性断片、あるいは上記のような融合タンパク質）を用いて免疫感作され得る。
一態様において、本発明は、対象ポリペプチドが結腸直腸組織または腫瘍組織、特に結腸癌組織または結腸癌由来細胞系中で高度に発現されることを示すモノクローナル抗体を包含する。したがって一実施形態において、本発明は、概して、特に結腸癌に対する診断としての対象ポリペプチドの発現の分析のための診断ツールを提供する。
タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与するための技法としては、担体への結合または当該技術分野で既知の他の技法が挙げられる。タンパク質の免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与され得る。免疫感作の進行は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニタリングされ得る。標準ＥＬＩＳＡまたはその他のイムノアッセイが抗原としての免疫原とともに用いられて、抗体のレベルを査定し得る。好ましい実施形態では、対象抗体は、哺乳類のタンパク質の抗原決定基、例えば配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４または密接に関連する相同体（例えば少なくとも９０％同一、さらに好ましくは少なくとも９５％同一）のうちの１つにコードされるタンパク質の抗原決定基に対して免疫特異的である。
ポリペプチドの抗原性調製物による動物の免疫感作後、抗血清が得られ、所望により、血清からポリクローナル抗体が単離される。モノクローナル抗体を産生するためには、抗体産生細胞（リンパ球）が免疫感作動物から収穫され、骨髄腫細胞のような不死化細胞を用いた標準体細胞融合手法により融合されて、ハイブリドーマ細胞を生じる。このような技法は当該技術分野で既知であり、その例としては、例えばハイブリドーマ技法（初めは、Kohlerand Milstein, (1975) Nature, 256:495-497により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Kozbar et al.,(1983) Immunology Today, 4:72）、ならびにヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole et al.,(1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞は、本発明のポリペプチドと特異的に反応する抗体の産生のために免疫化学的にスクリーニングされ、モノクローナル抗体が、このようなハイブリドーマ細胞を含む培養から単離される。
抗体という用語は、本明細書中で用いる場合、対象ポリペプチドの１つと特異的に反応性であるその断片を包含するよう意図される。抗体は慣用的技法を用いて断片化され、断片は、全抗体に関して上記されたのと同様の方法で、有用性に関してスクリーニングされる。例えばＦ（ａｂ）２断片は、ペプシンで抗体を処理することにより生成され得る。その結果生じるＦ（ａｂ）２断片は、ジスルフィド架橋を還元するよう処理されて、Ｆａｂ断片を生成し得る。本発明の抗体はさらに、二重特異的一本鎖、ならびに抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域により付与されるポリペプチドに対する親和性を有するキメラおよびヒト化分子を包含するよう意図される。好ましい実施形態では、抗体はさらに、それに付着された標識を含み、検出され得る（例えば標識は、放射性同位元素、蛍光化合物、化学発光化合物、酵素または酵素補因子であり得る）。
抗体は、例えば被験体が異常タンパク質レベルに関連した疾患または状態、例えば結腸癌を有するか否かを決定するために、あるいはこのような障害に冒された個体に対する所定の治療レジメンの効力の決定を可能にするために、個体におけるタンパク質レベルをモニタリングするために用いられ得る。ポリペプチドのレベルは、体液中、例えば血液試料中の細胞から測定され得る。
本発明の抗体の別の用途は、ｇｔｌ１、ｇｔｌ８−２３、ＺＡＰおよびＯＲＦ８のような発現ベクター中に構築されたｃＤＮＡライブラリーの免疫学的スクリーニングにおいてである。正しいリーディングフレームおよび配向で挿入されたコード配列を有するこの種類のメッセンジャーライブラリーは、融合タンパク質を生成し得る。例えばｇｔｌ１は、そのアミノ末端がβ−ガラクトシダーゼアミノ酸配列からなり、そのカルボキシル末端が外来ポリペプチドからなる融合タンパク質を生成する。次に、例えば感染プレートから取り外されたニトロセルロースフィルターを抗体と反応させると、タンパク質の抗原エピトープ、例えば特定のタンパク質の他のオルトログまたは同一種からの他のパラログが抗体を用いて検出され得る。次に、このアッセイにより検出された陽性ファージが感染プレートから単離され得る。このようにして相同体の存在は、ヒトからのアイソフォーム（例えばスプライシング変異体）を変え得るので、他の動物から検出され、クローンニングされ得る。
別の実施形態では、モノクローナル抗体のパネルが用いられ得るが、この場合、エピトープ包含機能の各々は、モノクローナル抗体により表される。パネル中のモノクローナル抗体の結合の損失または摂動は、タンパク質の、したがって相当する遺伝子の突然変異性配慮を示す。
Ｃ．ディファレンシャルな発現 本発明は、ヒトにおける異常または疾患組織を同定するための方法も提供する。上記のようなタンパク質ファミリーのプロフィールに相当する核酸に関しては、推定生物学的機能により組織の選択が決定される。特定の核酸に相当する遺伝子の発現は、罹患が疑われる第１の組織とヒトの第２の正常組織との間で比較される。正常組織は、ヒトの任意の組織、特に標的遺伝子を発現するものであり、その例としては脳、胸腺、精巣、心臓、前立腺、胎盤、脾臓、小腸、骨格筋、膵臓および結腸の粘膜内層が挙げられるが、これらに限定されない。
異常または罹患が疑われる組織は、ヒトの異なる組織型から得られるが、好ましくはそれは同一組織型から得られる。例えば腸ポリープまたはその他の異常増殖は、正常腸組織と比較されるべきである。例えば分子量、アミノ酸またはヌクレオチド配列、あるいは相対存在量において比較される２つの組織中の標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質間の差は、罹患が疑われたヒトの組織中の遺伝子の、またはそれを調節する遺伝子の変化を示す。
２つの組織中の標的遺伝子は、当該技術分野で既知の任意の手段により比較される。例えば２つの遺伝子はシーケンシングされ、罹患が疑われる組織中の遺伝子の配列が正常組織中の遺伝子配列と比較される。２つの組織中の標的遺伝子またはその一部分は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて、配列表に示されたヌクレオチド配列を基礎にしたヌクレオチドプライマーを用いて増幅される。増幅遺伝子または遺伝子の一部分は、配列番号１〜４４９４で示された相当するヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドプローブとハイブリダイズされる。正常ヌクレオチド配列と比較した場合の罹患が疑われる組織中の標的遺伝子のヌクレオチド配列における差は、疾患における核酸コードタンパク質の役割を示唆し、治療薬を調製するためのきっかけを提供する。ヌクレオチドプローブは、種々の方法により、例えば放射能標識、ビオチン化、あるいは蛍光または化学発光タグを用いた標識により標識され、当該技術分野で既知の標準方法により検出される。
あるいは２つの組織中の標的ｍＲＮＡが比較される。ポリＡ＋ＲＮＡが、当該技術分野で既知のように２つの組織から単離される。例えば、ノーザンブロット、および配列表に示されたヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチドプローブを用いて、２つの組織間の標的ｍＲＮＡ転写体のサイズまたは量の差を当業者は容易に決定し得る。正常組織中の同一標的ｍＲＮＡの発現と比較した場合の、罹患が疑われる組織試料中の標的ＲＮＡの発現の増大または低減は、発現タンパク質が疾患においてある役割を有することを示唆し、治療薬を調製するためのきっかけも提供する。
タンパク質を分析するための任意の方法を用いて、適合試料からの２つの核酸コードタンパク質を比較する。２つの組織中のタンパク質のサイズは、例えば本発明の抗体を用いて比較されて、２つの組織からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットにおいて核酸コードタンパク質を検出する。他の変化、例えば発現レベルまたは亜細胞性局在化も、相当するタンパク質に対する抗体を用いて免疫学的に検出され得る。正常組織中の同一核酸コードタンパク質発現レベルと比較した場合の、罹患が疑われる組織中の核酸コードタンパク質発現のより高いまたはより低いレベルは、発現タンパク質が疾患においてある役割を有することを示し、治療薬を調製するための別のきっかけを提供する。
同様に、罹患が疑われるヒト組織とヒトの正常組織との間の遺伝子配列の、または遺伝子発現産物の、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質の比較を用いて、ヒトにおける疾患進行または寛解を追跡する。遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質のこのような比較は、上記のようになされる。
例えば腫瘍性であることが疑われる組織中の標的遺伝子の発現の増大または低減は、組織中の腫瘍性細胞の存在を示し得る。正常組織中の遺伝子の発現と比較した場合の腫瘍性組織中の標的遺伝子の発現増大の程度、あるいは長時間に及ぶ腫瘍性組織中の標的遺伝子の発現増大の量の差を用いて、その組織における腫瘍形成の進行を査定し、あるいは長時間に及ぶ治療プロトコルに対する腫瘍性組織の応答をモニタリングする。
任意の２つの細胞型の、例えば低および高転移性腫瘍細胞系、あるいは治療薬に曝露された、または曝露されたことのない組織からの細胞の発現パターンが比較され得る。胎児組織中の標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質を、正常標的遺伝子、ｍＲＮＡまたはタンパク質と比較することにより、ヒトにおける疾患に対する遺伝的素因が検出される。この目的のために用いられる胎児組織としては、羊水、絨毛膜絨毛、血液およびｉｎ ｖｉｔｒｏ受精胚の卵割球が挙げられるが、これらに限定されない。匹敵する正常標的遺伝子は、任意の組織から得られる。ｍＲＮＡまたはタンパク質は、標的遺伝子が発現されるヒトの正常組織から得られる。ヌクレオチド配列あるいは胎児標的遺伝子またはｍＲＮＡのサイズにおける変化、あるいは分子量、アミノ酸配列または胎児標的タンパク質の相対存在量における変化といった差異は、胎児の標的遺伝子における生殖細胞系列突然変異を示し、これは疾患に対する遺伝的素因を示す。
好ましい実施形態では、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の１つまたは複数の配列を含む核酸マクロアレイを用いて、上記のように正常細胞または組織中の同一配列の発現と比較した場合の癌性細胞または組織中の核酸配列のディファレンシャルな発現を評価し得る。好ましくはこのような配列は、正常細胞または組織と比較して、癌性細胞または組織中では少なくとも３倍、ディファレンシャルに発現される。より具体的には、本発明は、正常患者試料と比較して少なくとも３倍、癌性結腸細胞／組織中でディファレンシャルに発現される配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の完全長配列を提供する。したがって配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の配列、ならびにコードされるポリペプチド(それぞれ配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３)は、患者における結腸癌に関して同定し、スクリーニングするための有益な診断マーカーとして役立つ。
Ｄ．ペプチド類縁体およびアンタゴニストに関してスクリーニングするための核酸およびコードポリペプチドの使用 当該核酸、例えば配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、好ましくは配列番号１〜１１０３、よりいっそう好ましくは配列番号１〜５０３、最も好ましくは配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４、またはそれらに相補的な配列、ならびに相当する完全長遺伝子にコードされるポリペプチドを用いて、ペプチドライブラリーをスクリーニングして、コードポリペプチドの間から結合相手、例えば受容体を同定し得る。好ましくは配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１および４４９３のポリペプチドを用いて、結合相手に関してスクリーニングし得る。
ペプチドのライブラリーは、米国特許第５，０１０，１７５号およびＰＣＴ 国際公開第９１／１７８２３に開示された方法にしたがって合成され得る。以下で簡単に説明されるように、ペプチドの混合物を調製し、次にこれをスクリーニングして、所望のシグナル伝達および受容体結合活性を示すペプチドを同定する。特許‘１７５の方法では、適切なペプチド合成支持体(例えば樹脂)は、適切に保護した活性化アミノ酸の混合物に結合される。反応混合物中の各アミノ酸の濃度は、生成物が
、出発樹脂に結合されたアミノ酸の等モル混合物であるよう、そのカップリング反応速度に逆比例して平衡または調整される。次に、結合アミノ酸を脱保護化し、別の平衡アミノ酸混合物と反応させて、すべての考え得るジペプチドの等モル混合物を形成する。所望長(例えば六量体)のペプチドの混合物が生成されるまで、この過程が反復される。各工程にすべてのアミノ酸を包含する必要はない、すなわち、いくつかの段階では１つまたは２つのアミノ酸だけを包含し(例えば特定のアミノ酸が所定位置に不可欠であることが既知である場合)、したがって混合物の複雑さを低減し得る、ということに留意されたい。ペプチドライブラリーの合成が完了した後、選定ポリペプチドとの結合に関して、ペプチドの混合物がスクリーニングされる。ペプチドは次に、活性を阻害または強化するそれらの能力に関して試験される。所望の活性を示すペプチドは次に、単離され、シーケンシングされる。
国際公開第９１／１７８２３に記載された方法は同様である。しかしながら、合成樹脂と活性化アミノ酸の混合物とを反応させる代わりに、樹脂は２０の等部分に(またはその段階で添加される異なるアミノ酸の数に相当する多数の部分に)分けられ、各アミノ酸は樹脂のその部分に別々に結合される。樹脂部分は次に、併合され、混合され、第２のアミノ酸との反応のために再び多数の等部分に分けられる。このようにして、各反応は容易に完了するよう強いられる。さらに、各段階ですべての樹脂を併合するというよりむしろ、並行して部分を処理することにより、別個の「サブプール」を保持し得る。これは、ペプチドが任意の観察された受容体結合またはシグナル伝達活性に寄与するか否かを決定する過程を簡素化する。
このような場合、例えば各々１〜２，０００個の候補を含有するサブプールは、１つまたは複数の本発明のポリペプチドに曝露される。陽性結果を生じる各サブプールは、その後、例えば２０〜１００個の候補を含有するより小さいサブプール(サブ−サブプール)の一群として再合成され、再アッセイされる。陽性サブ−サブプールは、個々の化合物として再合成され、最後に高結合定数を示すペプチドを決定するためにアッセイされる。これらのペプチドは、天然活性を阻害または強化するそれらの能力に関して試験され得る。国際公開第９１／１７８２３および米国特許第５，１９４，３９２号(これらの記載内容は、参照により本明細書中に援用される)に記載された方法は、すべての合成および再合成が日常的に実施され得るよう、並行して自動技法によりこのようなプールおよびサブプールの調製を可能にする。
ペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、任意の利用可能な方法、例えばシグナル伝達、抗体結合、受容体結合、分裂促進アッセイ、走化性アッセイ等を用いてスクリーニングされる。本明細書中に記載された方法が、目下好ましい。アッセイ条件は、理想的には、天然活性がｉｎ ｖｉｖｏで示される条件、すなわち生理学的ｐＨ、温度およびイオン強度下での条件に類似すべきである。適切なアゴニストまたはアンタゴニストは、被験体において有毒副作用を引き起こさない濃度で強度の天然活性の阻害または強化を示すであろう。天然ポリペプチドとの結合に関して競合するアゴニストまたはアンタゴニストは天然濃度と等しいかまたはそれより高い濃度を要し得るが、一方、ポリペプチドと不可逆的に結合可能な阻害剤は、天然濃度のオーダーの濃度で付加され得る。
このようなスクリーニングおよび実験の最終結果は、本発明の核酸にコードされる少なくとも１つの新規のポリペプチド結合相手、例えば受容体、ならびに新規の結合相手の少なくとも１つのペプチドアゴニストまたはアンタゴニストである。このようなアゴニストおよびアンタゴニストは、受容体が自然である細胞における、あるいは遺伝子操作した結果として受容体を保有する細胞における受容体機能を調整、強化、または阻害するために用いられ得る。さらに、新規の受容体が既知の受容体と生物学的に重要な特徴を共有する場合、アゴニスト／アンタゴニスト結合についての情報は、既知の受容体の改良型アゴニスト／アンタゴニストを開発するのに役立ち得る。
本発明の実施は、別記しない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよび免疫学の慣用的技術(これらは当該技術分野の技能内である)を用いる。このような技術は、文献中で十分に説明されている(例えばMolecularCloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch andManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I andII(D.N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthsis(M.J. Gait ed., 1984); 米国特許第４，６８３，１９５号（Mullis等）；NucleicAcid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.1984); Transcription And Translation (B.D.Hames & S.J.Higginseds.1984);Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical GuideTo Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods in Enzymology(AcademicPress, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller andM.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology,Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987);Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor N.Y., 1986)参照)。
上記のように、本明細書中に記載された配列は、結腸癌に関して特別な有用性を有すると考えられる。しかしながらそれらは、他の種類の癌および他の疾患状態に関しても有用であり得る。
特に有益な実施形態を記述する以下の実施例を参照することにより、ここで本発明を例証する。しかしながら、これらの実施形態は例証的であって、いかなる点においても本発明を制限するよう意図されないことに留意されたい。
ＸＩ．実施例 Ａ．ディファレンシャルな発現配列の同定 ライブラリーの説明 配列番号１〜４４７０は、以下で簡単に説明されるような、添付の表(表１)中の１０１、１０２、１０３、１０４、１０９、１１０、１１１および１１２と称されるライブラリーから得た。例えば１０１ライブラリーは、標準化した結腸癌特異的な差し引き（subtracted）ｃＤＮＡライブラリーである。それは結腸癌中［近位および遠位Dukes’Ｂ、マイクロサテライト不安定陰性(ＭＳＩ−)］で発現されるが、しかし正常結腸組織を含めた正常組織中では発現されない配列に特異的である。１０２ライブラリーは、標準化した結腸特異的な差し引きｃＤＮＡライブラリーである。それは正常結腸組織中で発現されるが、しかし他の正常組織中では発現されない配列に特異的である。残りのライブラリーの特徴は、表１に記載されている。

ライブラリー名称および説明
標準化および差し引きｃＤＮＡライブラリーの構築 公開された手法（Daitchenko et al., 1996 PNAS 93:6025-6030, Gurskaya etal., 1996 Analytical Biochemistry 240:90-97）にしたがって、標準化および差し引きｃＤＮＡライブラリーを構築した。ClontechLaboratories,Inc., PaloAlto, Californiaからの市販キットを利用した（ＣｌｏｎｔｅｃｈＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成キット、カタログ番号Ｋ１０５２−１およびＣｌｏｎｔｅｃｈＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡ差し引きキット、カタログ番号Ｋ１８０４−１）。各差し引きライブラリーに関しては、特定のまたは「テスター」ｃＤＮＡは、一緒にプールされた４つの同様の試料型からの増幅ｃＤＮＡで構成された。同様に、参照または「ドライバー」ｃＤＮＡは、表１に示したような試料型のプールで構成された。差し引き過程中、テスターに独特の遺伝子または転写体を保持し、テスターおよびドライバーの両方に共通の遺伝子または転写体を除去する。したがって原則として、差し引きライブラリー中に存在するクローンは、テスター中で発現(または過剰発現)されるが、しかしドライバー中では発現されない（過小発現される）遺伝子または転写体を示す。テスターおよびドライバー物質を逆にした逆差し引きライブラリーも構築した。これらのライブラリーのみを利用して、標識した標的を調製した(以下参照)。
ライブラリーを構築するために、ＣｌｏｎｔｅｃｈＳＭＡＲＴ ｃＤＮＡ合成キットを用いて、各試料からの１μｇの全ＲＮＡを代表的に増幅した。増幅ｃＤＮＡを精製し、プールして、その後のライブラリー構築のために用いられる個々のテスターおよびドライバー試料を作製した。標準化および差し引きライブラリーを構築するために、ＣｌｏｎｔｅｃｈＰＣＲ−セレクトｃＤＮＡ差し引きキットを利用した。各差し引き実験のために、４５倍の過剰質量のドライバーｃＤＮＡ（４５０ナノグラム）を用いた。テスターとドライバーｃＤＮＡとの差し引きハイブリダイゼーションを、２回、毎回８〜１２時間実施した。差し引き癌特異的ｃＤＮＡをｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクター（InvitrogenCorporation,Carlsbad、 CA）に連結し、超適格性Epicurian大腸菌ＸＬ１Ｏ−Ｇｏｌｄ細胞(Stratagene, La Jolla, CA)中で化学的に形質転換した。ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有するＬＢ−アンピシリンプレート上で形質転換細胞を平板培養した。クローン化挿入物を有するものを示す個々の白色コロニーを摘み取って、ＬＢ−アンピシリンブロス中で一夜増殖させた。ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏキット(Qiagen,Valencia, CA)を用いて、プラスミドＤＮＡを精製した。
クローンのシーケンシング サンガーシーケンシング法による蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを用いてＴ７またはＭ１３プロモーター部位からの１回シーケンシングにより、クローンからの挿入物のヌクレオチド配列を決定した。個々のクローンのヌクレオチド配列を、テキストに記載された方法にしたがってＢｌａｓｔ２ホモロジー検索により、公的データベース(GenBank、dbEST、Geneseq)中の配列と比較した。
差し引きライブラリーの作製に用いたｃＤＮＡを、約６００塩基対の平均サイズを有する断片を生じる４塩基切断体制限エンドヌクレアーゼであるＲｓａＩで制限したため、上記のライブラリーからの個々のクローン由来の配列は、部分ｍＲＮＡ転写体からの配列を示す。
本発明の核酸に、配列同定番号(図１参照)を割り当てた。添付の配列表に核酸配列を提示する。
結腸癌におけるディファレンシャルな発現の検証 このライブラリーに見出されるディファレンシャルな発現配列が結腸癌に特異的であることを検証するために、プラスミドＤＮＡからの挿入物を、ベクター特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。増幅産物をナイロン膜上に整列させ、差し引きライブラリーｃＤＮＡならびに相当する逆差し引きｃＤＮＡライブラリーから調製した３３Ｐ−標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。各膜アレイは、約３，４５６クローンを含む。以下の表３に示すように、生成された４つのこのような膜は、表１に示したクローンライブラリーを含む。

当業者に既知のさらに上記した技法を用いて、４つの膜の組を、ヒト結腸癌組織から得た３２Ｐ標識標的核酸分子とハイブリダイズさせる。次に、同一組の膜を、正常ヒト結腸組織から得た３２Ｐ標識標的核酸分子とハイブリダイズさせる。その後、癌膜上のハイブリダイゼーション産物のシグナルを正常膜上のシグナルと比較する。結腸癌対正常における配列の発現の差を示す少なくとも３倍というハイブリダイゼーションの差異は、ディファレンシャルな発現を示すと考えられる。
この検証技法を用いて、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２および４４９４の完全長ｃＤＮＡ配列は、正常結腸組織と比較して、結腸癌において有意にディファレンシャルに発現されると同定された。
慣例より少ない実験を用いて、多くが、本明細書中に記載した本発明の特定の実施形態と等価であると当業者は認識し、あるいは確証し得る。このような特定の実施形態および等価物は特許請求の範囲に包含されるよう意図される。
本明細書中で引用された特許、公開特許出願および刊行物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に援用される。

Claims (41)

  1. 配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の１つまたは複数をプローブとして使用する癌の検出方法であって、 （ａ）患者から細胞の試料を収集することと； （ｂ）該試料の該細胞から核酸を単離することと； （ｃ）該核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、該核酸試料を、配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーと接触させることと； （ｄ）増幅産物の存在、非存在、またはサイズを、正常な細胞の増幅産物と比較することと；を含む方法。
  2. 前記癌は、結腸癌である、請求項１に記載の方法。
  3. 患者試料における癌の検出方法であって、配列番号１〜４４７０にコードされるタンパク質に対する抗体が、前記試料中のタンパク質と反応するのに使用される方法。
  4. 患者試料における癌の検出方法であって、配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、または４４９４の１つまたは複数にコードされるタンパク質に対する抗体が、前記試料中のタンパク質と反応するのに使用される方法。
  5. 患者試料における癌の検出方法であって、配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３の配列を有するタンパク質に対する抗体が、前記試料中のタンパク質と反応するのに使用される方法。
  6. 配列番号１〜４４７０、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中の発現レベルを変更させる作用物質の同定方法であって、 （ａ）細胞を供給することと； （ｂ）該細胞を試験作用物質で処理することと； （ｃ）配列番号１〜４４７０、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の該細胞中の発現レベルを決定することと； （ｄ）処理細胞中の該核酸の発現レベルを、未処理細胞中の核酸の発現レベルと比較することであって、該比較において、未処理細胞中の該核酸の該発現レベルに対する処理細胞中の該核酸の該発現レベルの変化が、細胞中の該核酸の該発現レベルを変更させる作用物質であることを示していることによって、比較することと；を含む方法。
  7. 配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、または４４９４、あるいはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中の発現レベルを変更させる作用物質の同定方法であって、
    （ａ）細胞を供給することと；
    （ｂ）該細胞を試験作用物質で処理することと；
    （ｃ）配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、または４４９４、あるいはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の該細胞中の発現レベルを決定することと；
    （ｄ）処理細胞中の該核酸の発現レベルを、未処理細胞中の核酸の発現レベルと比較することであって、該比較において、未処理細胞中の該核酸の該発現レベルに対する処理細胞中の該核酸の該発現レベルの変化が、細胞中の該核酸の該発現レベルを変更させる作用物質を示すことによって、比較することとを含む方法。
  8. 配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３の１つまたは複数のポリペプチドの細胞中の発現レベルを変更させる作用物質の同定方法であって、
    （ａ）細胞を供給することと；
    （ｂ）該細胞を試験作用物質で処理することと；
    （ｃ）配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３のポリペプチドの１つまたは複数に特異的な抗体と前記細胞を反応させることにより、前記細胞中の配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３の１つまたは複数のポリペプチドの発現レベルを決定することと；
    （ｄ）処理細胞中の前記１つまたは複数のポリペプチドの該発現レベルを、未処理細胞中の前記１つまたは複数のポリペプチドの発現レベルと比較することであって、該比較において、未処理細胞中の該核酸の該発現レベルに対する処理細胞中の該核酸の該発現レベルの変化が、細胞中の該ポリペプチドの該発現レベルを変更させる作用物質であることを示していることによって、比較することと；を含む方法。
  9. 請求項２９、３０または３１に記載の方法により同定される作用物質を含む薬学的組成物。
  10. 配列番号１〜４４７０、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を含む薬学的組成物。
  11. 配列番号１〜４４７０、またはそれらに相補的な配列のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸にコードされるポリペプチドを含む薬学的組成物。
  12. 配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３のうちの１つの配列を有するポリペプチドを含む薬学的組成物。
  13. 配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、または４４９３の配列を有する１つまたは複数のポリペプチドに結合する抗体を含む薬学的組成物。
  14. 配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、または４４９４のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１つの核酸の、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法であって、前記核酸は、少なくとも２つからなるファクターがディファレンシャルに発現される方法。
  15. 患者からの細胞試料中の細胞の表現型の決定方法であって、
    （ａ）配列番号１〜４４７０、４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４のいずれかの少なくとも１２個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む核酸プローブを供給することと；
    （ｂ）患者からの細胞試料を獲得することと；
    （ｃ）実質的に全てが非癌性である第２の細胞試料を供給することと；
    （ｄ）該核酸プローブを、ストリンジェントな条件下で、前記第１および第２の細胞試料それぞれのｍＲＮＡと接触させて、（ａ）該第１の細胞試料のｍＲＮＡとの該プローブのハイブリダイゼーションの量を、（ｂ）該第２の細胞試料のｍＲＮＡとの該プローブのハイブリダイゼーションの量と比較することであって、該比較において、該第２の細胞試料の該ｍＲＮＡとの該ハイブリダイゼーションの量と比較した場合の該第１の細胞試料の該ｍＲＮＡとの該ハイブリダイゼーションの量における少なくとも２つからなるファクターの差異が、該第１の細胞試料中の細胞の該表現型であることを示していることによって、比較することと；を含む方法。
  16. 配列番号１〜４４７０のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされる少なくとも１つのポリペプチドの、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法であって、該ポリペプチドは、少なくとも２つからなるファクターがディファレンシャルに発現される方法。
  17. 配列番号４４７２、４４７４、４４７６、４４７８、４４８０、４４８２、４４８４、４４８６、４４８８、４４９０、４４９２、および４４９４からなる群から選択される配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされる少なくとも１つのポリペプチドの、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法であって、該ポリペプチドは、少なくとも２つからなるファクターがディファレンシャルに発現される方法。
  18. 配列番号４４７１、４４７３、４４７５、４４７７、４４７９、４４８１、４４８３、４４８５、４４８７、４４８９、４４９１、および４４９３のポリペプチドの群から選択される少なくとも１つのポリペプチドの、正常細胞に対するディファレンシャルな発現を検出することを含む、細胞の表現型の決定方法であって、該ポリペプチドは、少なくとも２つからなるファクターがディファレンシャルに発現される方法。
  19. 前記ポリペプチドのレベルは、イムノアッセイで検出される、請求項１６、１７または１８に記載の方法。
  20. 配列番号１〜４４７０、またはそれらに相補的な配列の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする試験核酸中の突然変異の検出方法であって、 （ａ）患者から細胞の試料を収集することと； （ｂ）該試料の該細胞から核酸を単離することと； （ｃ）該核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅が起きるような条件下で、該核酸試料を、配列番号１〜４４７０の核酸配列に特異的にハイブリダイズする１つまたは複数のプライマーと接触させることと； （ｄ）増幅産物の存在、非存在、またはサイズを、正常な細胞の増幅産物と比較することと；を含む方法。
  21. 配列番号５０４〜１１０３のヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列の一部を含む単離核酸。
  22. 配列番号１〜５０３のうちの１つにハイブリダイズする遺伝子。
  23. 配列番号１〜５０３の配列、またはそれらに相補的な配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  24. 配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドに相当する配列に対して少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む単離核酸。
  25. 配列番号１〜５０３のヌクレオチド配列、またはそれらに相補的な配列を含む単離核酸。
  26. 前記ヌクレオチド配列を発現ベクターとして使用するのに適切とするように、前記ヌクレオチド配列に操作可能に連結される転写調節配列をさらに含む、請求項２５に記載の単離核酸。
  27. 請求項２６に記載の核酸を含む、原核細胞および真核細胞の少なくとも１つで複製することが可能な発現ベクター。
  28. 請求項２７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
  29. 請求項２５に記載の核酸の導入遺伝子を細胞に組み込まれたトランスジェニック動物であって、該導入遺伝子は、該核酸の発現レベル、該核酸のｍＲＮＡ転写体の安定性、または該核酸のコード産物の活性を改変させるトランスジェニック動物。
  30. 配列番号１〜１１０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに相当する核酸プローブに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする実質的に純粋な核酸。
  31. 請求項２５に記載の核酸にコードされるアミノ酸配列、またはその少なくとも２５個のアミノ酸を含む断片を含むポリペプチド。
  32. 実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーであって、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１１０３から選択されるセンスまたはアンチセンス配列の少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含有するプローブ／プライマー。
  33. 固体支持体に結合された請求項３２に記載の少なくとも１０個の異なるプローブを含むアレイ。
  34. プローブ／プライマーに結合され、かつ検出可能な標識基をさらに含む、請求項３２に記載のプローブ／プライマー。
  35. 前記標識基は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、および酵素補因子から選択される、請求項３４に記載のプローブ／プライマー。
  36. 請求項３１に記載のポリペプチドと免疫反応性のある抗体。
  37. 配列番号１〜１１０３のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸の細胞中の存在または非存在の決定方法であって、該細胞を請求項３２に記載のプローブと接触させることを含む方法。
  38. 配列番号１〜５０３のうちの１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるポリペプチドの細胞中の存在または非存在の決定方法であって、該細胞を請求項３６に記載の抗体と接触させることを含む方法。
  39. 配列番号１〜５０３、またはそれらに相補的な配列のうちの１つの少なくとも１２個の連続したヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレアーゼによる切断に耐性であるアンチセンスオリゴヌクレオチド類縁体。
  40. 患者から単離される細胞試料中の、配列番号１〜４４７０の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸のレベルを測定するための、請求項３４に記載のプローブ／プライマーを含む、形質転換細胞の表現型を決定するための試験キット。
  41. 配列番号１〜４４７０のいずれか１つに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸にコードされるタンパク質に特異的な抗体を含む、形質転換細胞の表現型を決定するための試験キット。
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