JPH10501135A - 免疫抑制剤標的蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体のための直ぐ下流の標的である、哺乳類起源の新規の蛋白質の発見に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫抑制剤標的蛋白質 発明の背景 シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、およびラパマイシンは、主にＴリンパ球活性 化の選択的阻害から生じる有望な免疫抑制性特性を有する微生物産物である。ラ パマイシンは最初にはストレプトミセス属の菌株（ストレプトミセス ヒグロス コピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ））から抽 出された抗真菌性抗生物質として記載された（Ｖｅｚｉｎａ ｅｔ ａｌ．（１ ９７５） Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｌ．、２８：７２１；Ｓｅｈｇａｌ ｅｔ ａｌ ．（１９７５） Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ． ２８：７２７；およびＳｅｈｇａｌ ｅｔ ａｌ．、米国特許第３，９２９，９９２号）。その後、マクロライド剤 であるラパマイシンが、免疫抑制性、ならびに抗新生物性および抗増殖性特性を 呈示することが示された（Ｍｏｒｒｉｓ（１９９２） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｒｅｓ ６：３９−８７）。 これらの化合物、すなわちシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、およびラパマイシ ンの各々は明らかに異なる生化学的反応（これらの反応は通常は免疫細胞の活性 化を開始させるであろう）を遮断することにより免疫系を抑制する。簡潔に記載 すると、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６はＣａ²⁺−依存的Ｔ細胞活性化後に まもなく作用して、免疫応答の永続化および増幅化に重要なサイトカインの合成 を阻害する。ラパマイシンはより後期に作用して免疫細胞におけるサイトカイン の複数の影響を遮 断する（これには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）により開始されるＴ細胞 増殖の阻害が含まれる）が、その抗増殖性効果は単にＴおよびＢ細胞に制約され るには留まらない。ラパマイシンは更に、成長因子−依存性および成長因子−非 依存性の非免疫細胞の増殖をも選択的に阻害する。ラパマイシンは一般的には、 リンパ球（Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０） ＰＮＡＳ ８７：９２３ １−９２３５；およびＤｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ １４４：１４１８−１４２４）、ならびに肝臓細胞（Ｆｒａｎｃａｖｉ ｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １５：８７１−８ ７７；およびＰｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７ ：９７３−９７７）を一例とする非免疫細胞を含む多数のタイプの細胞における Ｓ期の開始に必要な特異的シグナル伝達現象を遮断することにより細胞増殖を阻 害するものと考えられている。幾つかの一連の証拠により、細胞内ＦＫ５０６／ ラパマイシン結合性蛋白質（ＦＫＢＰ）（複数）のファミリーの内の様々なメン バーとラパマイシンとの結合が、ラパマイシンにより媒介されるＧ₁期進行の阻 害に必要であることが示唆されている。例えば、ラパマイシンの作用は過剰量の 構造的ＦＫＢＰ−リガンド ＦＫ５０６もしくは５０６ＢＤにより逆行する（Ｂ ｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．上述；Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．上述；およびＢｉ ｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：５５６−５５ ９）。 シクロスポリンＡはシクロフィリン（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１３１１５−１３１１８）と称されるあ る種の蛋白質に結合する一方で、先に記載されるＦＫ ５０６およびラパマイシンの両方のための初期標的はＦＫＢＰである（Ｈａｒｄ ｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：７５８−７６０ １；Ｓｉｅｋｉｅｎｋａ ｅｔ ａｌ（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３４１：７ ５５−７５７；およびＳｏｌｔｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１７４７２−１７４７７）。シクロフィリン／シクロ スポリンとＦＫＢＰＩ２／ＦＫ５０６との両複合体が特異的蛋白質ホスファター ゼ（カルシニュリン（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ））に結合し、この蛋白質ホスフ ァターゼはＩＬ−２遺伝子特異的転写活性化因子の活性を制御するものと仮定さ れている（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（１９９１） Ｃｅｌｌ ７０：３６５−３６８ ）に総説が記載されている）。それとは対照的に、ラパマイシン感受性シグナル 伝達経路のための下流細胞性標的、具体的にはＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の 直接的標的の同定に関してはは未だに詳細には特徴決定がなされてはいない。 Ｓ． ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＯＲ１およびＴＯＲ ２遺伝子はもともとはラパマイシンに対する耐性を細胞に付与する突然変異によ り同定され（Ｈｅｉｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５３：９０５−９０９）、そしてＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体は、ＴＯＲ１も しくはＴＯＲ２のいずれかのホスホセリン残基に直接結合することによりＴＯＲ 遺伝子産物の細胞性機能を阻害することがあるという初期の仮説が存在していた 。しかしながらその後には、ＴＯＲ蛋白質に対するＦＫＢＰ／ラパマイシン複合 体の直接的結合は関与していないというラパマイシン剤相互作用についての新規 のモデルが提案された。例えば、ラパマイシンで処理した細胞における サイクリン−ｃｄｋ活性に関する実験データを基にして、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ研 究所はＡｌｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２ ６８：２２８２５−２２８２９中に以下の記述を行った： 「ＴＯＲ２遺伝子産物がＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の直接標的である可能 性は考えられるものの、一層もっともらしい説明は、ＴＯＲ２遺伝子産物はラパ マイシンの直接標的の下流に存在すること、およびＴＯＲ２突然変異によりその 蛋白質が構造的に活性となるということである。後者のモデルが正しいとすると 、ＴＯＲ２遺伝子産物はｐ７０^s6k、サイクリン−依存的キナーゼ、およびサイ クリンＤ１に、ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の直接標的の下流に存在する蛋白 質として結合することとなり、かつ細胞周期の進行にとって重要な役割を担うこ とが既に示されている。ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の直接標的を同定するこ とで、Ｇ１期への進行をもたらすシグナル変換経路の上流構成成分が明らかにな りそうである、そしてそのことが成長因子−媒介性シグナル伝達現象と細胞周期 の進行に必要とされるサイクリン−ｃｄｋ活性とを結び付けるシグナル変換経路 の詳細を浮き彫りにする手助けとなるであろう。」 同様に、ラパマイシン−耐性イースト細胞におけるＴＯＲ１およびＴＯＲ２突 然変異の役割を研究した後に、ＬｉｖｉのグループはＣａｆｆｅｒｋｅｙら（１ ９９３） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３：６０１２−６０２３において 以下のように記述している： 「従って、ラパマイシンにより放出されたＤＲＲ１［ＴＯＲ１］蛋白質におい て我々が同定したアミノ酸変化により、その蛋白質がＦＫＢＰ１２−ラパマイシ ン複合体との結合を妨害することによるよりはむしろ 別のシグナルを構造的に活性化させることによりラパマイシンによって阻害され る増殖性シグナルの損失を補うことが可能となることがある。そのキナーゼドメ イン内に含まれるがただしＰＩ ３−キナーゼと共有されてはいない領域内に存 在する突然変異の位置によってこの構想が支持される。従って、ＤＲＲ１は野生 型イースト細胞内のラパマイシン感受性経路の構成成分ではないという見込みは 確実なものである。その代わりＳｅｒ−１９７２でのＤＲＲ１のミスセンス突然 変異はその正常活性を変化させ、そしてその活性をラパマイシンの真の標的であ る主要蛋白質の機能の代用とさせることがある。」 ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体にとっての直接的下流標的蛋白質である細胞性 蛋白質を同定し、そしてそれらの蛋白質をコードする遺伝子を同定することが、 本発明の目的である。 発明の要約 本発明は、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体にとって直ぐ下流の標的である哺乳 類起源の新規の蛋白質の発見に関する。本明細書に記載されるように、薬剤依存 的相互作用捕捉アッセイを用いて、ＦＫ５０６−結合性蛋白質／ラパマイシン複 合体と相互作用を行い、そして本明細書内では集合的に「ＲＡＰ−結合性蛋白質 」もしくは「ＲＡＰ−ＢＰ」として引用される多数の蛋白質が単離された。具体 的には数々の哺乳類遺伝子（オーソロガス遺伝子）を、本明細書では「ＲＡＰＴ １」として引用される蛋白質（この蛋白質はイーストのＴＯＲ１およびＴＯＲ２ 遺伝子産物との明らかな関連性を有している）についてクローン化した。それに 加え新規のユビキチン−結合性酵素（本明細書では「ｒａｐ−ＵＢＣ」として引 用される）を、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するその 酵素の能力に基づきクローン化した。それに加え、ＲＡＰＴ１−様蛋白質をヒト 病原体カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からクローン化した。従って本発明は、新規 の蛋白質（組換えおよび精製化の両形態）、組換え遺伝子、ＲＡＰ−結合性蛋白 質に対する抗体、診断および治療用使用のための他の新規の試薬およびアッセイ を利用可能とさせる。 本発明は真核生物細胞、特にヒト細胞内での、ＦＫ５０６−結合性蛋白質／ラ パマイシン複合体と、本明細書内では「ＲＡＰ−結合性蛋白質」もしくは「ＲＡ Ｐ−ＢＰ」として引用される所定の細胞性蛋白質との間の新規の蛋白質−蛋白質 相互作用の発見に関する。 一般的には本発明は哺乳類ＲＡＰＴ１ポリペプチド、好ましくはＲＡＰＴ１ポ リペプチドの実質的に純粋な調製物もしくは組換えＲＡＰＴ１ポリペプチドを特 徴とする。好ましい態様では、それらのポリペプチドはラパマイシンへの結合に 関連する生物学的活性を有する（一例ではそのポリペプチドはＦＫＢＰ／ラパマ イシン複合体に結合する能力を保持している）ものの、そのポリペプチドはラパ マイシン−依存的複合体の構築に対する作動性作用もしくは拮抗性作用のいずれ かを行うことが可能であるかもしれない。そのポリペプチドは配列番号２もしく は１２の内の一つに示されるポリペプチドと同一であることができるか、あるい は単にその配列に相同であることができる。例えばそのポリペプチドは好ましく は、配列番号２もしくは１２のいずれかの内の少なくとも一つのアミノ酸配列に 少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有する一方で、例えば８０％、９０％、 もしくは９５％のような一層高目の配列相同性も予期され、そして一般的にはそ れらが好ましいであろう。このポリペプチドは全長蛋白質を含むか、もしくは全 長蛋白質の一部分(例えば、配 列番号２もしくは１２のいずれかに表されるＲＡＰＴ１ポリペプチド)、あるい はその蛋白質の更に小さめの断片さえ（その断片は例えば少なくとも５、１０、 ２０、５０、１００、もしくは１５０アミノ酸の長さである）をも含むことがで きる。以下に記載されるようにＲＡＰＴ１ポリペプチドは、その蛋白質の天然に 存在する形態の生物学的活性のアゴニスト（例えば、疑似物）、もしくは別法で はアンタゴニストの内のいずれかであることができ、例えばそのポリペプチドは ラパマイシン複合体（例えば、ＦＫ５０６−結合性蛋白質もしくは細胞周期調節 性蛋白質に関与する複合体）の構築を調節することが可能である。 好ましい態様では表題ＲＡＰＴ１ポリペプチドの内の少なくとも一つの生物学 的活性を有するポリペプチドは配列番号２もしくは１２の配列とはアミノ酸配列 が異なるかもしれないが、このような差異により天然のＲＡＰＴ１蛋白質と同一 もしくは類似の様式で機能するか、あるいは天然のＲＡＰＴ１蛋白質と同一もし くは類似の特徴を有する改変化蛋白質がもたらされる。しかしながら、天然に存 在する蛋白質の細胞上での正常な役割の拮抗剤となる天然に存在する蛋白質の相 同体が企画されている。 更に他の好ましい態様ではＲＡＰＴ１蛋白質は、第二ポリペプチド部分（例え ば、ＲＡＰＴ１ポリペプチド部分に無関係なアミノ酸配列を有する第二ポリペプ チド）を含む組換え融合蛋白質であり、一例ではその第二ポリペプチド部分はグ ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、一例ではその第二ポリペプチド部 分は転写調節蛋白質のＤＮＡ結合性ドメインであり、一例ではその第二ポリペプ チド部分はＲＮＡポリメラーゼ活性性ドメインであり、一例ではその融合蛋白質 は二重ハイブリッド アッセイにおいて機能を示す。 本発明の更に他の態様は、免疫原性調製物中にＲＡＰＴ１ペプチドを含む免疫 原に関し、その免疫原はＲＡＰＴ１ポリペプチドに特異的な免疫応答を誘導する ことが可能であり、そのような免疫応答は；例えば液性応答、例えば抗体応答； 例えば細胞性応答である。好ましい態様では、免疫原は、配列番号２および／ま たは１２により表される蛋白質からの抗原決定基（例えば、独特な決定基）を含 む。 本発明の更に別の態様は、ＲＡＰＴ１免疫原のエピトープと特異的な反応性を 示す抗体調製物を特徴とする。 更に他の態様では本発明は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種（ｃａＲＡＰＴ１ ）からのＲＡＰＴ１−様ポリペプチド、好ましくはｃａＲＡＰＴ１ポリペプチド の実質的に純粋な調製物、もしくは組換えｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドを特徴と する。先に記載されるように、好ましい態様ではｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドは ラパマイシンへのその結合性に関連する生物学的活性を有し、例えばそのポリペ プチドはラパマイシン複合体（例えば、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体）に結合 する能力を保持する。そのポリペプチドは配列番号１４に示されるポリペプチド と同一であることができるか、あるいはそのポリペプチドは単にその配列に相同 であることができる。例えば、ｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドは配列番号１４のア ミノ酸配列に少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を有することが好ましい一方 で、一例では８０％、９０％、もしくは９５％のような一層高目の配列相同性も 予期される。ｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドは配列番号１４に表される全ポリペプ チドを含むことができるか、あるいはその蛋白質の断片を含むことができ、その 断片は例えば少なくとも５、 １０、２０、５０、もしくは１００アミノ酸の長さのものであるかもしれない。 ｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドは、その蛋白質の天然に存在する形態の生物学的活 性のアゴニスト（例えば疑似物）もしくは別法ではアンタゴニストのいずれかで あることができる。 好ましい態様では、表題ｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドの少なくとも一つの生物 学的活性を有するペプチドは配列番号１４の配列とはアミノ酸配列が異なるかも しれないが、そのような差異により天然のｃａＲＡＰＴ１と同一もしくは類似の 様式で機能するか、あるいは天然の蛋白質と同一もしくは類似の特徴を有する改 変化蛋白質がもたらされる。しかしながら、天然に存在する蛋白質の細胞上での 正常な役割の拮抗剤となる天然に存在するｃａＲＡＰＴ１蛋白質の相同体が期待 される。 更に他の好ましい態様では、ｃａＲＡＰＴ１蛋白質は第二ポリペプチド部分を 含む組換え融合蛋白質であり、例えば第二ポリペプチドはｃａＲＡＰＴ１配列と は無関係なアミノ酸配列を有し、例えばその第二ポリペプチド部分はグルタチオ ン−Ｓ−トランスフェラーゼであり、例えば第二ポリペプチド部分はＲＮＡポリ メラーゼ活性性ドメインであり、例えばその融合蛋白質は二重ハイブリッドアッ セイにおいて機能を示す。 本発明の更に他の態様は、免疫原性調製物内にｃａＲＡＰＴ１ペプチドを含む 免疫原に関し、その免疫原はｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドに特異的な免疫応答を 誘導することが可能であり、その免疫応答は：例えば液性応答、例えば抗体応答 ；例えば細胞性応答である。好ましい態様では、免疫原は、例えば配列番号１４ により表される蛋白質からの抗原決定基（例えば、独特な決定基）を含む。 本発明の更に別の態様は、ｃａＲＡＰＴ１免疫原のエピトープと特異 的に反応する抗体調製物を特徴とする。 本発明の更に別の態様は、ＲＰＡＴ１の断片（例えば、ｈＲＡＰＴ１もしくは ｍＲＡＰＴ１）、あるいは他のＲＡＰＴ１−様ポリペプチド(例えば、ｃａＲＡ ＰＴ１、ＴＯＲ１、もしくはＴＯＲ２)を特徴とし、これらの断片はラパマイシ ン依存的様式でＦＫ−結合性蛋白質に結合する能力を保持する。従って本発明は 、免疫抑制剤、抗−真菌剤、およびＲＡＰＴ１−様蛋白質のラパマイシン結合性 ドメインの結合を通して作用する類似物のための薬剤スクリーニングアッセイ、 特に以下に記載される高処理量アッセイの作製を容易にする。例えば本発明は、 全長蛋白質と比較して操作が一層容易なＲＡＰＴ１−様蛋白質の複数部分を提供 する。全長蛋白質はそのサイズがために、ラパマイシン−結合性活性を保持する であろう組換え蛋白質もしくは融合蛋白質として発現することが一層困難であり 、かつ非常に高い確立で不溶性となることがある。従って本発明は、例えば配列 番号２（ｍＲＡＰＴ１）のＶａｌ２６−Ｔｙｒ１６０、配列番号１２（ｈＲＡＰ Ｔ１）のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番号１４（ｃａＲＡＰＴ１）の Ｖａｌ４１−Ｔｙｒ１７３、配列番号１６（ＴＯＲ１）のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３ ３、および配列番号１８（ＴＯＲ２）のＶａｌ１−Ａｒｇ１３３からなる群より 選択されるアミノ酸配列により表されるラパマイシン−結合性ドメインのような 、前記ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するＲＡＰＴ１−様ポリペプチドの 可溶性部分を含む可溶性ポリペプチドを提供する。 本発明の他の態様は、ＲＡＰＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列 を有する実質的に単離された核酸を提供する。好ましい態様では：コードされる ポリペプチドは実質的にラパマイシン複合に結合し、 そして／またはラパマイシン−含有性蛋白質複合体の構築の作動性作用もしくは 拮抗性作用のいずれかを行うことが可能である。その核酸のコーディング配列は ＲＡＰＴ１をコードする配列（この配列は配列番号１もしくは１１に示されるｃ ＤＮＡと同一であるか、あるいは単にその配列に相同であることができる）を含 むことができる。例えば、ＲＡＰＴ１をコードする配列は配列番号１もしくは１ １のヌクレオチド配列の一つもしくは両方に対する少なくとも７０％の相同性を 有することが好ましい一方で、例えば８０％、９０％、もしくは９５％のような 一層高い配列相同性も期待される。この核酸は配列番号１に表されるヌクレオチ ド配列を含むことができるか、あるいはその核酸の断片を含むことができ、その 断片は例えば一例では少なくとも５、１０、２０、５０、１００、もしくは１３ ３アミノ酸の長さである断片をコードすることがある。この核酸によりコードさ れるポリペプチドはＲＡＰＴ１蛋白質の天然に存在する形態の生物学的活性のア ゴニスト（例えば疑似物）か、あるいは別法ではアンタゴニストのいずれかであ ることができ、例えばそのポリペプチドはラパマイシン媒介性蛋白質複合体を調 節することが可能である。 それに加え所定の好ましい態様では、表題ＲＡＰＴ１核酸は、転写調節配列（ 例えば、転写プロモーターもしくは転写エンハンサー配列の内の少なくとも一つ ）を含み、そしてその調節配列はＲＡＰＴ１遺伝子配列に操作的に連結されるで あろう。そのような調節配列を用いてＲＡＰＴ１遺伝子配列を発現ベクターとし ての使用に適切なものにすることができる。 別の好ましい態様では、この核酸は緊縮条件下で、配列番号１および ／または１１の内の少なくとも１２の連続ヌクレオチド；好ましくは少なくとも ２０の連続ヌクレオチド、そして一層好ましくは少なくとも４０の連続ヌクレオ チオドに相当する核酸プローブにハイブリダイズする。更に別の態様では、この 核酸は、ラパマイシンのための結合性ドメインに相当するヒトもしくはマウスＲ ＡＰＴ１遺伝子の領域にハイブリダイズする。 本発明の他の態様は、ｃａＲＡＰＴ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド 配列を有する実質的に単離された核酸配列を提供する。好ましい態様では：コー ドされるポリペプチドはラパマイシン複合体と特異的に結合し、そして／または ラパマイシン含有性蛋白質複合体の構築の作動性作用もしくは拮抗性作用のいず れかを行うことが可能である。この核酸のコーディング配列は配列番号１３に示 されるｃＤＮＡと同一であることができるか、あるいは単にその配列に相同であ ることができる。例えばｃａＲＡＰＴ１をコードする配列は配列番号１３のヌク レオチド配列に少なくとも６０％相同な配列を有する一方で、例えば８０％、９ ０％、もしくは９５％のような一層高目の配列相同性も予期される。この核酸は 配列番号１３に表されるヌクレオチド配列を含むことができるか、あるいはその 核酸配列の断片を含むことができ、その断片は例えば一例では少なくとも５、１ ０、２０、５０、１００、もしくは１４０のアミノ酸の長さの断片をコードする ことがある。その核酸によりコードされるポリペプチドは、ｃａＲＡＰＴ１蛋白 質の天然に存在する形態の生物学的活性のアゴニスト（例えば疑似物）もしくは 別法ではアンタゴニストのいずれかであることができ、例えばそのポリペプチド はラパマイシン媒介性蛋白質複合体を調節することが可能である。 その上、所定の好ましい態様では表題ｃａＲＡＰＴ１核酸は転写調節配列（例 えば、転写プロモーターもしくは転写エンハンサー配列の内の少なくとも一つ） を含み、そしてその調節配列はｃａＲＡＰＴ１遺伝子配列に操作的に連結される であろう。そのような調節配列を用いてｃａＲＡＰＴ１遺伝子配列を発現ベクタ ーとしての使用に適するものにすることができる。 更に別の好ましい態様では、この核酸は緊縮条件下では、配列番号１３の内の 少なくとも１２の連続ヌクレオチド；好ましくは少なくとも２０の連続ヌクレオ チド、および一層好ましくは少なくとも４０の連続ヌクレオチドに相当する核酸 プローブにハイブリダイズする。 本発明は更に、トランスジーンを有する形質転換非ヒト動物（例えば、マウス 、ラット、ウサギ、もしくはブタ）、例えば本明細書に記載されるＲＡＰ−ＢＰ 遺伝子の内の一つの異種形態（例えばヒトに由来する遺伝子）を含む（および好 ましくは発現する）動物、例えば表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つもしくは 複数の発現が破壊される動物をも特徴とする。このような形質転換動物は、突然 変異を生じたかもしくは過誤発現されるＲＡＰ−ＢＰ対立遺伝子を含む細胞性障 害を研究するため、あるいは薬剤スクリーニングにおける使用のための動物モデ ルとして役立つことができる。 本発明は更に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プラ イマーを提供し、この場合、このオリゴヌクレオチドは緊縮条件下で配列番号１ 、１１、もしくは１３、またはその天然に存在する突然変異体の内の一つのセン スもしくはアンチセンス配列の内の少なくとも１０の連続ヌクレオチドにハイブ リダイズするヌクレオチド配列の領 域を含む。好ましい態様ではそのプローブ／プライマーは更にそれらに連結され かつ検出が可能なラベル基を含む。そのラベル基は例えば、放射性同位元素、蛍 光化合物、酵素、および酵素補助因子からなる群より選択することができる。本 発明のプローブは、形質転換化細胞をも同定するため、例えば患者から単離され た細胞の試料内において表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つをコードする核酸 のレベルを検出するため；例えば細胞内のＲＡＰ−ＢＰ ｍＲＮＡレベルを測定 するか、あるいはそのゲノムＲＡＰ−ＢＰ遺伝子が突然変異もしくは欠失を生じ ているかどうかを決定するための診断検査キットの一部分として用いることがで きる。そのオリゴヌクレオチドが少なくとも１０のヌクレオチドの長さを有する ことが好ましい一方で、２０、３０、５０、１００、もしくは１５０のヌクレオ チドの長さのプライマーも予期される。 更に別の態様では本発明は、ＲＡＰ−結合性蛋白質とラパマイシン／蛋白質複 合体との間の相互作用を誘導する分子について検査化合物をスクリーニングする ためのアッセイ系を提供する。例示的な方法は、（ｉ）本発明のＲＡＰ−結合性 蛋白質、ＦＫ５０６−結合性蛋白質、および検査化合物を、例えばその検査化合 物が存在しなければＦＫ５０６−結合性蛋白質とＲＡＰ−結合性蛋白質とが相互 作用を行うことが不可能である条件下で合わせる段階：および（ｉｉ）ＦＫ５０ ６−結合性蛋白質およびＲＡＰ−結合性蛋白質を含む薬剤依存的複合体の形成を 検出する段階を含む。検査化合物の存在下での複合体形成における統計的に有意 な変化（例えば増加）（その検査化合物の非存在下において観察されるものと比 較される）が、ＦＫ５０６−結合性蛋白質とＲＡＰ−結合性蛋白質との間の相互 作用の調節（例えば誘導）を意味する。その上、ＦＫ５ ０６−結合性蛋白質およびＲＡＰ−結合性蛋白質が無細胞系において合わせられ 、そしてその検査化合物に接触される初期スクリーニングが提供されるが；これ はすなわち、その無細胞系は、細胞溶解物および再構成させた蛋白質混合物から なる群より選択されるということである。別法ではＦＫ５０６−結合性蛋白質お よびＲＡＰ−結合性蛋白質が、ある細胞中で同時に発現され（例えば、組換え的 に）、そしてその細胞は例えば相互作用捕獲アッセイとしてその検査化合物と接 触される（二重ハイブリッドアッセイ）。 本発明は更に、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つもしくは複数の野生型機 能の喪失を特徴とする所望されない細胞成長を示す動物を治療するための方法を 提供し、その方法は、他の細胞性もしくはウイルス性蛋白質とＲＡＰ−結合性蛋 白質との相互作用を阻害することができる作用物質の治療学的有効量を投与する ことを含む。ある態様では、その方法は配列番号２もしくは１２の内の一つに表 されるポリペプチドをコードする核酸構築物を、その構築物がそのＲＡＰ−結合 性蛋白質中で欠損を生じている細胞により取込まれる条件下、およびその組換え 遺伝子が例えば遺伝子療法技術により発現される条件下で投与することを含む。 他の態様では天然に存在するＲＡＰ−結合性蛋白質の作用が、例えばラパマイシ ンにより媒介される複合体の構築のアンタゴニストであるＲＡＰ−ＢＰ相同物の 治療的発現によるか、あるいは標的化ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の転写および／または 翻訳を阻害するアンチセンス核酸分子の輸送により拮抗される。 本発明の他の態様は、被検体（例えばヒト患者）が所望されない細胞増殖を特 徴とする障害の危険にさらされているかどうかを決定する方法 を提供する。この方法はその被検体の組織内で、（ｉ）配列番号１もしくは１１ 、またはその相同物の内の一つにより表される蛋白質をコードする遺伝子の突然 変異；（ｉｉ）配列番号１もしくは１１の内の一つにより表される蛋白質をコー ドする遺伝子の過誤発現；あるいは（ｉｉｉ）調節蛋白質複合体（例えばラパマ イシン含有性複合体）におけるＲＡＰ−結合性蛋白質の過誤取込み、の内の少な くとも一つを特徴とする遺伝子病変の存在および非存在を検出することを含む。 好ましい態様では：遺伝子病変の検出は：ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子からの一つもしく は複数のヌクレオチドの欠失；その遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチド の添加；その遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、その遺伝子の総 体的染色体再構成；その遺伝子のメッセンジャ−ＲＮＡ転写物のレベルの変化； その遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型タイプのスプライシングパ ターンの存在；もしくはその蛋白質の非野生型レベル、の内の少なくとも一つの 存在を確認することを含む。 例えば、遺伝子病変の検出は、（ｉ）配列番号１もしくは１１、または天然に 存在するそれらの突然変異体、あるいはＲＡＰ−ＢＰ遺伝子に天然の状態で連結 する５’もしくは３’フランク配列の内の一つのセンスもしくはアンチセンス配 列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含 むプローブ／プライマーを提供すること；（ｉｉ）その組織の核酸に対してその プローブ／プライマーを露出すること；および（ｉｉｉ）その核酸へのそのプロ ーブ／プライマーのハイブリダイゼーションにより遺伝子病変の存在もしくは非 存在を検出すること、を含むことができ：この場合、例えばその病変の検出は、 ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子および場合によってはフランク核酸配列のヌクレオ チド配列を決定する目的でそのプローブ／プライマーを利用することを含む。例 えば、そのプローブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは連 結連鎖反応（ＬＣＲ）において利用することができる。別の態様ではＲＡＰ−結 合性蛋白質のレベルが、配列番号１もしくは１１の内の一つにより表される蛋白 質と特異的免疫反応性を示す抗体を用いる免疫アッセイにおいて検出される。 類似様式ではカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）感染を、ＲＡＰＴ１−様蛋白質をコ ードするカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）遺伝子にハイブリダイズするプローブ／プ ライマーの使用により検出することができる。例えばこの方法は、（ｉ）配列番 号１３、または天然に存在するその突然変異体、あるいはｃａＲＡＰＴ１遺伝子 に天然の状態で連結する５’もしくは３’フランク配列の内の一つのセンスもし くはアンチセンス配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含むオリ ゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマーを提供すること；（ｉｉ）そのプロ ーブ／プライマーを生物学的試料（例えば、組織生検、液体試料、便等）の核酸 に露出すること；ならびに（ｉｉｉ）その核酸へのそのプローブ／プライマーの ハイブリダイゼーションによりカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）生物体の存在および 非存在を検出すること、を含むことができる。 本発明の他の態様は、「おとり」用蛋白質／薬剤複合体と物理的に相互作用す る蛋白質をコードする遺伝子の単離のための新規のインビボでの方法に関する。 この方法は薬剤の存在下、特にその薬剤が非ペプチジル性小有機分子（例えば＜ ２５００Ｋ）（例えばマクロライド、例えばラパマイシン、ＦＫ５０６、もしく はシクロスポリン）である場合における転写活性化因子の再構成の検出を頼みと している。具体的には、こ の方法はハイブリッド蛋白質を発現するキメラ遺伝子を利用する。第一ハイブリ ッド蛋白質は、おとり用蛋白質に融合された転写活性因子のＤＮＡ−結合性ドメ インを含む。第二ハイブリッド蛋白質は「魚」役蛋白質（例えばｃＤＮＡライブ ラリーに由来する検査蛋白質）に融合された転写活性化ドメインを含む。その魚 役およびおとり用の蛋白質が薬剤依存性様式で相互作用を行う場合には、それら の蛋白質はその転写活性化因子の二つのドメインに極めて接近するようになる。 この接近状況は、転写活性化因子に対して応答性である転写調節部位に操作的に 連結されるレポーター遺伝子の転写を生じるに十分なものであり、そしてそのマ ーカー遺伝子の発現を検出し、そしてそれを利用して他の蛋白質と、そのおとり 用蛋白質／薬剤複合体との相互作用についての評定を行うことができる。 本発明の実施は他に特別な記載がない限りは、細胞生物学、細胞培養法、分子 生物学、形質転換生物学、微生物額、組換えＤＮＡ法、および免疫学の通常の技 術を利用するであろうし、そしてそれらの技術は当業者の技術範囲内に含まれる 。そのような技術は刊行物において詳細に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、ｅｄ． ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎ ｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎ ｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ ｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．、１９８４）；Ｍ ｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． 米国特許第４，６８３，１ ９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈ ａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）；Ｔｒａｎｓｃ ｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． １９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎ ｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚ ｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８ ４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａ ｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ． Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．、１９８７、Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃ ｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ、ｅｄｓ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９ ８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌ．ｅｄｓ．、１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６）、を参照された い。 本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な記述および請求の範囲から明白に なるであろう。 図面の説明 図１はヒトＲＡＰＴ１クローンをクローン化するのに用いたｐＡＣＴベクター のマップを説明する。「ｐＩＣ５２４」と称されるｐＡＣＴのＲＡＰＴ１含有性 異形は既にＡＴＣＣに寄託してある。 図２はラパマイシン濃度の関数としてのＦＫＢＰ１２およびｈＲＡＰＴ１（ラ パマイシン−結合性ドメイン）の相互作用を説明する。相互作用はβ−ガラクト シダーゼ活性として検出される。ＦＫ５０６をラパマイシンの代わりに用いた場 合、もしくはｌｅｘ．ｄａ（対照プラスミド）をＦＫＢＰ１２に置換した際には 相互作用は全く検出されない。 図３はＦＫ５０６−含有性蛋白質とラパマイシン−結合性ドメイン（ＢＤ）融 合物のペアの間の、様々な濃度のラパマイシンの存在下における、β−ガラクト シダーゼ発現により測定される相互作用の相対的強度を説明する（図８を参照さ れたい）。イーストのレポーター株ＶＢＹ５６７を指示されるプラスミドペアで 形質転換させた。ヒトＦＫＢＰ１２、イーストＦＫＢＰ１２、および陰性対照と して作用する無関係の配列に対するＬｅｘＡ ＤＮＡ−結合性ドメイン融合物を 「おとり」として用いた。ヒトＲＡＰＴ１ ＢＤ、アルギニンへのセリン置換を 含むヒトＲＡＰＴ１ ＢＤ、イーストＴｏｒＩ ＢＤ、イーストＴｏｒ２ ＢＤ （非公開）、およびカンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ ｓ ）ＲＡＰＴ１ ＢＤに対するＶＰ１６酸性活性化ドメイン融合物 をおとり用融合物に対する相互作用について検査した。各ペアのプラスミドを含 む形質転換体を、色素産生性基質Ｘ−ｇａｌを含む培地上でのβ−ガラクトシダ ーゼ発現について検査した。コロニーを、３０℃下、２日間の成長の後に白色（ 白抜き棒）もしくは青色（黒塗り棒）のいずれかとして評定した。β−ガラクト シダーゼ発現のレベルを、１（明るい青色）〜４（暗い青色）の範囲にわたる青 色の強度により定量的に評定した。 発明の詳細な記述 最近の研究により真核生物細胞周期調節の分子的基盤に対する幾つかの驚くべ き知見が提供された。細胞周期を通過する哺乳類細胞の進行は、多数の主要制御 地点で調節される。中でも、それらは静止期（Ｇ₀）、制限地点、Ｇ₁／Ｓ過渡期 、およびＧ₂／Ｍ過渡期内への移入およびそこからの脱出の地点である（総説に ついては例えば、Ｄｒａｅｔｔｅ（１９９０） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃ ｉ １５：３７８−３８３；およびＳｈｅｒｒ（１９９３） Ｃｅｌｌ ７３： １９５９−１０６５、を参照されたい）。究極的にはこれらのチェックポイント 制御からの情報が関連するキナーゼの一群、すなわちサイクリン−依存性キナー ゼ（ＣＤＫ）の調節された活性を通して統合される。例えばＧ₁期からＳ期への 過渡期は現在では、多数のサイクリンおよびサイクリン−依存性キナーゼの周期 的相互作用に関わる多重蛋白質複合体の一過性構築により厳密に時間的調節が行 われていると考えられている。 詳細に説明すると、細胞結合化抗原による静止期のＴリンパ球の刺激化が複合 体活性化プログラムの口火を切り、そのことにより細胞周期移入（Ｇ₀期からＧ₁ 期への過渡期）および高親和性インターロイキン−２ （ＩＬ−２）レセプターの発現がもたらされる。その後に生じるその高親和性レ セプターへのＩＬ−２の結合により、活性化Ｔ細胞の後期Ｇ₁期「制限地点」を 通過する進行が誘導され（Ｐａｒｄｅｅ（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６ ：６０３−６０８）、そしてその後にはその細胞はＤＮＡ複製、および究極的に は有糸分裂という比較的自律的なプログラムを完了するように仕向けられる。 真核生物細胞周期調節に関連する情報の内の一つの重要な結果が、有望な成長 調節剤についての新規の種類の分子標的の詳細な説明となる。マクロライドエス テルであるラパマイシンは有望な免疫抑制剤であり、その作用メカニズムはサイ トカイン−依存性Ｔ細胞増殖の阻害に関連する（Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９９０） ＰＮＡＳ ８７：９２３１−９２３５；Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ ．（１９９０） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：１４１８−１４２４；Ｓｉｇａ ｌ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ ２３：１− ５：およびＳｉｇａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍ ｕｎｏｌ １０：５１９−５６０）。ラパマイシンは、ＩＬ−２刺激化細胞がＳ 期に移入する進行に必要とされる後期Ｇ₁期現象を特異的に妨害する（Ｍｏｒｉ ｃｅ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：３７３４ −３７３８）。ラパマイシンにより誘導される細胞周期拘束地点の位置により、 この薬剤が特にリンパ球におけるＧ１期からＳ期への過渡期を支配する調節地点 を妨害することのヒントが与えられる。 本明細書に記載されるように、本発明はＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体のため の直ぐ下流の標的である哺乳類起源の新規の蛋白質の発見に関 する。以下に記載されるように、薬剤−依存性相互作用捕獲アッセイを用いてＦ ＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体に結合し、かつ本明細書では「ＲＡＰ−結合性 蛋白質（複数）」もしくは「ＲＡＰ−ＢＰ（複数）」として集合的に引用される 多数の蛋白質を単離した。具体的には、マウスおよびヒトの遺伝子を、イースト ＴＯＲ１およびＴＯＲ２遺伝子産物に関連すると思われる蛋白質（本明細書では 「ＲＡＰＴ１」として引用される）についてクローン化した。それに加え、新規 のユビキチン−複合体形成性酵素（本明細書では「ｒａｐ−ＵＢＣ」として引用 される）を、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するその能力に基づいてクロ ーン化した。従って本発明は、新規の蛋白質（組換えおよび精製化の両形態）、 組換え遺伝子、ＲＡＰ−結合性蛋白質に対する抗体、ならびに診断的および治療 的使用のための他の新規の試薬およびアッセイを利用可能とする。それに加え、 ＦＫ５０６−結合性蛋白質との一つもしくは複数の表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の 結合を調節することができる作用物質を同定するための薬剤発見用アッセイが提 供される。そのような作用物質は細胞の成長および／または分化を変化させる目 的では治療的に有用であり得るが、更に細胞培養物および組織の増殖および／ま たは分化を制御するための細胞培養用添加物としてインビトロで用いることもで きる。本発明の他の態様は以下に記載されてか、もしくは本開示を考慮する際に 当業者には明らかになるであろう。 便宜を図るため、本明細書、実施例、および添付される請求の範囲に利用され る所定の用語をここに終結させた。 本明細書で用いられる際には用語「核酸」は、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮ Ａ）および適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌ クレオチドを意味する。この用語は更に、等価物としてヌクレオチドアナログか ら作製されたＲＮＡもしくはＤＮＡのいずれかのアナログ、ならびに記載される 態様に適応可能な際には一本鎖（例えばセンスもしくはアンチセンス）および二 本鎖のポリヌクレオチドを含むことが理解されるはずである。 用語「遺伝子」もしくは「組換え遺伝子」は、本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質 をコードする読み取り枠を含み、エキソンおよび（場合によっては）イントロン 配列を含む核酸を意味する。「組換え遺伝子」はＲＡＰ−結合性蛋白質をコード し、かつＲＡ−ＢＰをコードするエキソン配列を含むことを意味する一方で、そ の組換え遺伝子は場合によっては染色体ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子もしくは無関係の染 色体遺伝子のいずれかに由来するイントロン配列を含むことがある。説明的なＲ ＡＰ−結合性蛋白質をコードする例示的組換え遺伝子は、配列番号１、１１、１ ３、もしくは２３の内の一つにより表される核酸配列を含む。用語「イントロン 」は所定のＲＡＰ−ＢＰ遺伝子中に存在するＤＮＡ配列（これは、蛋白質に翻訳 されず、かつ一般的にはエキソン間に見いだされる）を意味する。 本明細書で用いられる場合には、用語「トランスフェクション」は核酸（例え ば、発現ベクター）の、核酸により媒介される遺伝子移送によるレシピエント細 胞内への組込みを意味する。「形質転換」は本明細書で用いられる際には、細胞 の遺伝型が外因性ＤＮＡもしくはＲＮＡの細胞性取込みの結果として変化する過 程を意味し、そして例えば形質転換化細胞は本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質の組 換え形態を発現するか、あるいは移送された遺伝子からアンチセンス発現が生じ る場合にはＲＡＰ−結合性蛋白質の天然に存在する形態についての発現が破壊さ れる。 本明細書で用いられる際には用語「ベクター」は、予め連結されている他の核 酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。好ましいベクターの内の一つの タイプはエピソームであり、これはすなわち過剰な染色体複製が可能な核酸であ る。好ましいベクターは、連結されている核酸の自律的複製および／または発現 が可能なものである。操作的に連結される遺伝子の発現を指令することが可能な ベクターは、本発明では「発現ベクター」として引用される。一般的には、組換え ＤＮＡ技術に使用される発現ベクターは「プラスミド」の形態をとることがよく あり、このプラスミドは環状の二本鎖ＤＮＡループを意味し、そのようなベクタ ー形態ではこのＤＮＡループは染色体には結合することはない。本明細書では「 プラスミド」および「ベクター」は互換的に用いられるが、それはプラスミドが 最も一般的に用いられるベクターの形態であるためである。しかしながら本発明 は、等価機能を果たし、かつ本明細書の精読後に当該技術分野に知られるように なる他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。 「転写調節配列」は、例えば開始シグナル、エンハンサー、およびプロモータ ーのような、操作的に連結されている蛋白質コーディング配列の転写を誘導もし くは制御するＤＮＡ配列を意味するために、本明細書を通して用いられる遺伝子 用語である。好ましい態様では、組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の転写は、発現が意 図される細胞タイプ内での組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（も しくは他の転写調節配列）の制御下に置かれている。組換え遺伝子がＲＡＰ−結 合性蛋白質の天然に存在する形態の転写を制御する配列と同一であるかもしくは 異なる転写調節蛋白質の制御下に置かれることがあり得ることも理解されるであ ろう。 本明細書で用いられる際には用語「組織特異的プロモーター」は、プロモータ ーとして作用する、すなわちそのプロモーターに操作的に連結される選択された ＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列を意味し、そしてそのようなプロモータ ーは例えばリンパ系系列（例えば、ＢもしくはＴリンパ球）の細胞、あるいは別 法では例えば肝細胞のような、ある組織内の特異的細胞内での選択されたＤＮＡ 配列の発現を実施する。説明的態様ではリンパ系−特異的プロモーターを利用す る遺伝子構築物を、リンパ系組織においてのみのＲＡＰ−ＢＰの突然変異形態の 発現を指令することによりリンパ系細胞をラパマイシンに対して耐性にさせるた めのＲＡＰ−結合性蛋白質の優性ネガティブ突然変異形態を提供するための遺伝 子療法の一部分として用いることができる。この用語は更に、ある組織内では主 に選択されたＤＮＡの発現を調節するが、他の組織でも同様に発現を引き起こす いわゆる「リーキー」プロモーターをも含む。 本明細書で用いられる際には「形質転換動物」はいずれかの動物、好ましくは 非ヒト動物、鳥類もしくは両生類であり、それらの動物においてはその動物の内 の一つもしくは複数の細胞がヒトの介入（例えば当該技術分野において熟知され る形質転換技術）により導入された異種核酸を含む。核酸は、直接的もしくは間 接的に、その細胞の前駆体内への組込みによるか、慎重な遺伝子操作（例えばマ イクロインジェクション）によるか、あるいは組換えウイルスでの感染によりそ の細胞内に組込まれる。用語「遺伝子操作」は古典的雑種形成もしくはインビト ロ受精を含まず、むしろ組換えＤＮＡ分子の組込みを意味する。この分子は染色 体内に組み込まれることがあるか、あるいは染色体外で複製するＤＮＡ であることがある。本明細書に記載される典型的形質転換動物では、そのトラン スジーンにより細胞が表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の組換え形態（例えば、アゴニ ストもしくはアンタゴニストのいずれかの形態）を発現するようになる。しかし ながら組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子がサイレントである形質転換動物も企画されて おり、その例は以下に記載されるＦＬＰもしくはＣＲＥレコンビナーゼ依存的構 築物である。本発明の「非ヒト動物」は脊椎動物（例えば、齧歯類、非ヒト霊長 類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類など）を含む。好ましい非 ヒト動物はラットおよびマウスを初めとする齧歯類科から選択され、最も好まし くはマウスである一方で、形質転換両生類（例えば、キセノプス（ゼノパス）（Ｘｅｎｏｐｕｓ ）属）および形質転換ニワトリも、例えば胚発生および組織パタ ーン形成を理解するための重要な道具を提供することができる。用語「キメラ動 物」は本明細書では組換え遺伝子が見いだされるか、もしくは組換え遺伝子がそ の動物の全体ではなく幾つかの細胞において発現される動物を意味する。用語「 組織特異的キメラ動物」は、その組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子が存在し、そして／ または幾つかの組織では発現されるが他の組織では発現されないことを意味する 。 本明細書で用いられる際には用語「トランスジーン」は核酸配列（例えば、Ｒ ＡＰ−結合性蛋白質をコードする）を意味し、このトランスジーンはそれが組込 まれる形質転換動物もしくは細胞に対して部分的もしくは完全に異種（すなわち 外来性）であるか、あるいはそれが組込まれる形質転換動物もしくは細胞の内在 性遺伝子に対して同種であるが、ただしそのトランスジーンはそれが挿入される 細胞のゲノムを変化させる様式でその動物のゲノム内に挿入されるように設計さ れるか、あるいは 挿入される（例えば、天然の遺伝子ものとは異なる位置に挿入されるか、あるい はその挿入によりノックアウトがもたらされる）。トランスジーンは一つもしく は複数の転写調節配列、および選択される核酸の至適発現に必要とされることが あるいずれかの他の核酸（例えばイントロン）を含むことができる。 熟知されるように、特別なポリペプチドのための遺伝子が、ある個体のゲノム 内に単独もしくは多重コピーとして存在することがある。このような重複遺伝子 は同一であることがあるか、あるいはヌクレオチド置換、添加、もしくは欠失を 初めとする所定の改変を有することがあるが、このような遺伝子は全て依然とし て実質的に同一の活性を有するポリペプチドをコードしている。用語「ＲＡＰ− 結合性蛋白質をコードするＤＮＡ配列」は従って、特別な個体内の一つもしくは 複数の遺伝子を意味することがある。それに加え、ヌクレオチド配列内の所定の 差異が個々の生物体間に存在することがあり、これは対立遺伝子と称される。こ のような対立遺伝子の違いは、同一の生物学的活性を有する蛋白質を依然として コードするコード化ポリペプチドのアミノ酸配列の違いをもたらすこともあるし 、あるいはそうでないこともある。 「相同性」は、２本のペプチド間もしくは２つの核酸分子間の配列類似性を意 味する。相同性は、比較の目的で整列されることがある各配列内のある位置を比 較することにより決定することができる。比較される配列のある位置が同一塩基 もしくはアミノ酸で占められている場合には、その分子はその位置においては相 同となる。配列間の相同性の程度はそれらの配列により共有される対合するかも しくは相同な位置の数の関数となる。 「細胞」、「宿主細胞」、もしくは「組換え宿主細胞」は本明細書では互換的 に用いられる用語である。そのような用語は特別な被検体細胞のみばかりでなく そのような細胞の子孫もしくは潜在的子孫をも意味することが理解される。所定 の改変が突然変異もしくは環境的影響のいずれかのために次の世代に生じること があるため、そのような子孫は実際にはその親細胞とは同一でなくなることがあ るかもしれないが、それでも依然として本明細書で用いられるこの用語の範囲内 に含まれる。 「キメラ蛋白質」もしくは「融合蛋白質」は、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内 の一つをコードする第一アミノ酸配列と、その表題ＲＡＰ−ＢＰのいずれかのド メインについて外来性であるかあるいは実質的には相同ではないドメインを特定 する第二アミノ酸配列との融合物である。キメラ蛋白質はその第一蛋白質をも発 現する生物体内に見いだされる（異なる蛋白質内であるにもかかわらず）外来性 ドメインを表すことがあるか、あるいは異なる種類の生物体により発現される蛋 白質構造の「種間」、「遺伝子間」などの融合物であることがある。例えば本発明 の融合蛋白質は一般式Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₃［式中、Ｚ₂はＲＡＰ−結合性蛋白質のポリ ペプチド配列の全部もしくは一部分を表し、そしてＺ₁およびＺ₃は各々ＲＡＰ− ＢＰ配列に対して異種であるポリペプチド配列を表し、Ｚ₁およびＺ₃の内の少な くとも一つは融合蛋白質内に存在する］により表すことができる。 用語「進化的に関連する」はＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする核酸配列に関 しては、ある生物体において天然に生じた核酸配列を意味し、これには天然に存 在する突然変異体が含まれる。それに加えこの用語は、ＲＡＰ−結合性蛋白質の 天然に生じるイソ型に当初は由来しながらも、 例えば以下に記載される組み合わせ突然変異誘発のような突然変異誘発により既 に改変されているものの、それでも依然としてＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に 結合するか、もしくはＲＡＰ−結合性親蛋白質の少なくとも一つの活性を保持す るポリペプチドを依然としてコードするか、あるいはその蛋白質活性のアンタゴ ニストである核酸配列をも意味する。 用語「単離された」は核酸（例えばＤＮＡもしくはＲＮＡ）に関して本明細書 において用いられる際には更に、その巨大分子の天然の源中に存在する他のＤＮ ＡもしくはＲＮＡから各々単離された分子をも意味する。例えば、表題ＲＡＰ− 結合性蛋白質の内の一つをコードする単離された核酸は、ゲノムＤＮＡ遺伝子の 特別なＲＡＰ−ＢＰ遺伝子を天然の状態で直にフランクする１０キロベース（ｋ ｂ）程度の核酸配列を含むことが好ましく、５ｋｂ程度のそのような天然に存在 するフランク配列であることがより好ましく、そして１．５ｋｂを下回るそのよ うな天然に存在するフランク配列が最も好ましい。用語「単離された」は本明細 書で用いられる際には更に、組換えＤＮＡ技術により産生される場合には、細胞 性物質、ウイルス性物質、もしくは培養培地を、あるいは化学的に合成される場 合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペ プチドをも意味する。それに加え、「単離された核酸」は、断片としては天然に は存在することがなく、かつ天然の状況では見いだされることがないであろう核 酸断片を含むことが意味される。 本明細書で用いられる際には「ラパマイシン−結合性ドメイン」は、ＦＫＢＰ ／ラパマイシン複合体と特異的に相互作用するための結合性活性を付与するポリ ペプチド配列を意味する。例示的ラパマイシン−結合 性ドメインは、配列番号２（ｍＲＡＰＴ１）のＶａｌ２６−Ｔｙｒ１６０、配列 番号１２（ｈＲＡＴＰ１）のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番号１４（ ｃａＲＡＰＴ１）のＶａｌ４１−Ｔｙｒ１７３、配列番号１６（ＴＯＲ１）のＶ ａｌ１−Ｔｙｒ１３３、および配列番号１８（ＴＯＲ２）のＶａｌ１−Ａｒｇ１ ３３により特定されるポリペプチド内に表される。 「ＲＡＰＴ１−様ポリペプチド」は、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体のための 直接的結合性標的蛋白質であり、かつ本発明の哺乳類ＲＡＰＴ１蛋白質と幾分か の配列相同性を共有する真核生物細胞性蛋白質を意味する。例示的ＲＡＰＴ１− 様ポリペプチドにはイーストＴＯＲ１およびＴＯＲ２蛋白質が含まれる。 「可溶性蛋白質」は生理学的等張条件下（例えば、０．１４Ｍ ＮａＣｌ、あ るいはせいぜい１０μＭ、より好ましくはせいぜい１０ｍＭの蛋白質濃度のスク ロース）で、水性緩衝液から沈殿することのない（例えば、少なくとも９５−パ ーセント、より好ましくは少なくとも９９−パーセントがその上清中に残留する ）ポリペプチドを意味する。これらの条件は具体的には効果的な濃度での洗剤も しくは他の変性剤が非存在である場合に関連するものである。 以下に記載されるように本発明の内の一つの態様は、ＲＡＰ−結合性蛋白質を コードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、その断片、および／または そのような核酸の等価物に関する。用語「核酸」は本明細書で用いられる場合に はそのような断片および等価物を含むことが意図され、例えば用語「等価物」は 、機能的に等価なＲＡＰ−結合性蛋白質をコードするヌクレオチド配列、もしく は例えばＦＫＢＰ／ラパマイ シン複合体に結合する能力を保持し、かつ追加的に本明細書に記載されるような ＲＡＰ−結合性蛋白質の他の活性を保持することがある機能的等価ペプチドを含 むことが理解される。等価ヌクレオチド配列は、一つもしくは複数のヌクレオチ ド置換、添加、もしくは欠失により異なる配列（例えば、対立遺伝子変異体）を 含むであろうし；かつ配列番号１もしくは配列番号１１に表される哺乳類ＲＡＰ Ｔ１遺伝子のヌクレオチド配列か、あるいは配列番号１３に表される真菌類ＲＡ ＰＴ１蛋白質のヌクレオチド配列か、あるいは配列番号２３に表されるＵＢＣ酵 素をコードするヌクレオチド配列とは、遺伝子コードの縮重により異なる配列を も含むであろう。等価核酸配列は更に、緊縮条件下（すなわち、約１Ｍの塩中で 形成されるＤＮＡ二重らせんの溶解温度（Ｔ_m）以下の約２０〜２７℃に等しい ）で、配列番号２もしくは１２に表されるいずれかの配列を含むＲＡＰＴ１蛋白 質のヌクレオチド配列か、あるいはｐＩＣ５２４（ＡＴＣＣ受託番号７５７８７ ）のＲＡＰＴ１遺伝子挿入断片のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレ オチド配列をも含むであろう。同様に、表題ｒａｐ−ＵＢＣ酵素の相同物をコー ドする等価核酸は、緊縮条件下で、配列番号２３に表されるヌクレオチド配列か 、あるいはＳＭＲ４−１５（ＡＴＣＣ受託番号７５７８６）のｒａｐ−ＵＢＣ遺 伝子挿入断片のヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む 。ある態様では等価物は、配列番号１もしくは配列番号１１もしくは配列番号１ ３もしくは配列番号２３のいずれかに表される配列を含むヌクレオチド配列に由 来し、かつその配列に進化的に関連する核酸配列を更に含むであろう。 配列番号２に示されるアミノ酸配列およびＡＴＣＣクローン７５７８ ７として表される断片は、哺乳類ＲＡＰＴ１蛋白質のより大きな全長形態の生物 学的活性部分を表す。好ましい態様ではＲＡＰＴ１ポリペプチドはＦＫＢＰ／ラ パマイシン複合体への結合のための結合性ドメイン(例えば、配列番号２の残基 ２８〜１６０もしくは配列番号１２の残基２０１２〜２１４４により表されるｒ ａｐ−結合性ドメイン)を含む。好ましい態様では全長形態から単離されたＲＡ ＰＴ１蛋白質の複数部分が、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体（例えば、ＦＫＢＰ １２／ラパマイシン複合体）についての特異的結合親和性（例えば、そのような ラパマイシン複合体についてのＲＡＰＴ１の天然に存在する形態の結合親和性の ものの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、そして更に一層好 ましくは少なくとも９０％の親和性）を保持するであろう。ポリペプチドは、そ のポリペプチドが一つもしくは複数の以下の特徴を有する場合にはＲＡＰＴ１蛋 白質の生物学的活性を保持するとして見なされ、それらの特徴とは：ＦＫＢＰ／ 薬剤複合体（例えば、ＦＫＢＰ／マクロライド複合体、例えばＦＫＢＰ／ラパマ イシン複合体）と結合する能力：ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体に結合する 能力：ＦＫＢＰ／ラパマイシン−複合体の構築を調節する能力：細胞増殖を調節 する（例えば、細胞周期を調節する、例えば、Ｇ₁期を通過する細胞の進行を調 節する）能力、である。その上、配列分析に基づくと、表題ＲＡＰＴ１蛋白質の 生物学的機能はホスファチジルイノシトール−キナーゼ活性（例えばＰＩ−３− キナーゼ活性）を含むことができる。ある蛋白質は更に、その蛋白質が先に引用 される特徴の内の一つの特異的アゴニスト（疑似物）もしくはアンタゴニストで ある場合には、ＲＡＰＴ１生物活性に関しては生物活性を示すものと見なされる 。 ｒａｐ−ＵＢＣ酵素に関しては、表題蛋白質の好ましい態様は、ＦＫＢＰ／ラ パマイシン複合体と結合する能力か細胞性蛋白質にユビキチンを複合体形成させ る能力のいずれかか、あるいはその両方を保持する配列番号２４（もしくは実施 例５に記載されるＳＭＲ４−１５のｒａｐ−ＵＢＣ遺伝子挿入断片）のアミノ酸 配列の少なくとも一部分を含む。ラパマイシンがＧ₁期中に細胞周期の遮断を生 じるとすると、表題ｒａｐ−ＵＢＣ酵素の生物学的活性スペクトラムが所定の細 胞周期調節蛋白質、特に比較的寿命の短い蛋白質（例えば、３０分〜２時間の単 位での半減期を有する蛋白質）の制御を含むもことがありそうである。例えば表 題ＵＢＣは、一例ではｐ５３、ｍｙｃ、および／またはサイクリンのユビキチン 化を媒介する能力を有することがあり、そしてそのため増殖性細胞内での細胞周 期調節性蛋白質の細胞性半減期に影響を及ぼす。ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体 へのｒａｐ−ＵＢＣの結合は、その基質蛋白質からの酵素の解離をもたらすこと がある。従ってラパマイシンは、細胞性ｐ５３レベルを上昇させ、そしてそのこ とにより次にはＧ₁期の進行を阻害するという様式でｐ５３のユビキチン−媒介 化変性を妨害することがある。 それに加え、所定の条件下では、その蛋白質の天然に存在する形態の生物学的 活性の内のたった一つのサブセットのみの促進もしくは阻害のいずれかを行わせ る目的で、ＲＡＰ−ＢＰアゴニストもしくはＲＡＰ−ＢＰアンタゴニストのいず れかの内の一つとしての限定された能力内で機能するクローン化ＲＡＰ−結合性 蛋白質の相同物を提供することが有利であるかもしれないことが一般的に認識さ れるであろう。従って、特異的生物学的効果を、限定された機能の相同物を用い 、かつ全ＲＡＰ− ＢＰ関連性生物学的活性に対するアゴニストもしくはアンタゴニストでの処理と 比較すると一層少ない副作用を示す処理により誘導することができる。例えば、 ＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体にはいずれかの実質的な様式では結合しないが、 それでもその蛋白質の天然に存在する形態に起因する他の生物学的機能の大半を 保持するＲＡＰＴ１アナログおよびｒａｐ−ＵＢＣアナログを作製することがで きる。例えば、ＲＡＰＴ１相同体は、例えばホスファチジルイノシトールキナー ゼ活性（一例ではＰＩ−３−キナーゼ活性）のようなキナーゼ活性を保持するこ とがあるかもしれない。それとは対照的に、ＲＡＰＴ１相同体は、キナーゼ活性 を喪失させながらも、依然としてＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体と結合する能力 を保持するように工学的に操作されることがあるかもしれない。例えば、ＲＡＰ Ｔ１相同体のＦＫＢＰ／ラパマイシン結合性部分（例えば、配列番号２もしくは １２に表されるラパマイシン−結合性ドメイン）を、ＲＡＰＴ１の天然に存在す る形態によるラパマイシン複合体への結合性の競合的阻害を行うように用いるこ とができる。 表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の相同体を、突然変異誘発（例えば、不連続の点突 然変異誘発（複数））もしくは切断化により作製することができる。例えば、突 然変異は、取得されてくるＲＡＰ−ＢＰ形態の生物学的活性と実質的に同一な活 性もしくは単にそのサブセットを保持する相同体をもたらすことができる。別法 では、例えばＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に競合的に結合することにより、そ の蛋白質の天然に存在する形態の機能を阻害することが可能なその蛋白質のアン タゴニスト形態を作製することができる。 配列番号１に示されるヌクレオチド配列はマウスＲＡＰＴ１蛋白質の 生物学的活性部分をコードし、かつ具体的にはラパマイシン−結合性ドメインを 含む。従って本発明のある態様は、配列番号２により表されるＲＡＰＴ１蛋白質 のその部分に実質的に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸 を提供する。その核酸が配列番号１に示されるヌクレオチド配列の少なくとも一 部分を含むｃＤＮＡ配列であることが好ましい。本発明の更に別の態様は、配列 番号１２により表されるＲＡＰＴ１蛋白質の一部分（これはラパマイシン−結合 性ドメインに相当する）（例えば、配列番号１２のＶａｌ２０１２〜Ｔｙｒ２１ ４４）に実質的に相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を提 供する。類似様式で、本発明は配列番号１４のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ＲＡ ＰＴ１ポリペプチドの少なくとも一部分（例えば、ラパマイシン−結合性部分） をコードする核酸を提供する。 好ましい核酸は、配列番号２、１２、もしくは１４の内の一つもしくは複数に 示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％相同であり、より好ましくは７０％ 相同であり、そして最も好ましくは８０％相同であるアミノ酸配列を含むポリペ プチドをコードすることが好ましい。ペプチド、特にＲＡＰＴ１蛋白質の活性を 有するペプチドをコードし、かつ配列番号２、１２、もしくは１４のいずれかに 示される配列と少なくとも約９０％相同な、より好ましくは少なくとも約９５％ 、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９９％相同なアミノ酸配列を含む核 酸もやはり本発明の範囲内に含まれ、当然のことながら同様に既述の配列リスト において確認される蛋白質も本発明の範囲内に含まれる。ある態様では核酸は、 表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の少なくとも一つの活性を有するペプチドをコードす るｃＤＮＡである。この核酸が、配列番号２、１２、 もしくは１４の内の一つに表されるヌクレオチド配列の少なくとも一部分を含む ｃＤＮＡ分子であることが好ましい。これらのｃＤＮＡ分子の好ましい部分には 、その遺伝子のコーディング領域が含まれる。例えば組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子 は、ＡＴＣＣ受託番号７５７８７のＲＡＰ−ＢＰクローンの内の一つのためのコ ーディング配列を増幅させることにより作製されるＰＣＲ断片のヌクレオチド配 列を含むことができる。 配列番号２３に示されるヌクレオチド配列は生物学的に活性なヒトユビキチン 複合体形成性酵素をコードする。従って、本発明のある態様では、核酸は配列番 号２４により表されるｒａｐ−ＵＢＣ蛋白質のラパマイシン−結合性ドメインを 含むポリペプチドをコードする。その核酸が配列番号２３に示されるヌクレオチ ド配列の少なくとも一部分を含むｃＤＮＡ分子であることが好ましい。好ましい 核酸は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列と、少なくとも６０％相同である 、より好ましくは７０％相同である、そして最も好ましくは８０％相同であるア ミノ酸配列を含むペプチドをコードする。ポリペプチド、特にユビキチン複合体 形成性活性を有し、かつ配列番号２４に示される配列と少なくとも約９０％、よ り好ましくは少なくとも約９５％、そして最も好ましくは少なくとも約９８〜９ ９％相同なアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸もやはり本発明の 範囲内に含まれる。 本発明の更に別の態様では、組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子は更に、添付される配 列表に示されるアミノ酸配列に加え、それらの配列表には示されてはいないもの の、その蛋白質のＣ−末端およびＮ−末端のアミノ酸をコードする追加的ヌクレ オチド配列を含むことができる。例えば、組換えＲＡＰＴ１遺伝子は、実施例４ に記載されるプライマーセットを用 いてｐＩＣ５２４のＲＡＰＴ１コーディング配列を増幅することにより作製され るＰＣＲ断片のヌクレオチド配列を含むことができる。それに加え、本開示を考 慮すると、日常的な実験方法程度の技術を用いることで、例えばｃＤＮＡライブ ラリーからＲＡＰＴ１の残存性５’配列を、例えばｐＩＣ５２４クローンの配列 から設計されたプライマー（複数）を用いるＲＡＣＥ ＰＣＲにより単離するこ と（一例では、配列番号１２の全長配列を作製すること）が可能であるだろう。 具体的には本発明は、全長ＲＡＰＴ１蛋白質をコードする組換えＲＡＰＴ１遺伝 子を企画している。本発明の更に他の態様は、マウスもしくはヒトのＲＡＰＴ１ のイソ型、特にＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体に結合することが可能なイソ 型（例えば、スプライシング変異体、対立遺伝子変異体など）をコードする核酸 を含む。このようなイソ型はＲＡＰ−結合性蛋白質の巨大ファミリーの他のメン バーと同様に、これ以降に更に詳細が記載される薬剤依存性相互作用捕獲アッセ イを用いて単離することができる。 本発明の他の態様は、高緊縮性もしくは低緊縮性条件下で、配列番号２、１２ 、もしくは１４の内の一つにより表されるアミノ酸配列の内の少なくとも一部分 を有するペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸を提供する。ＤＮ Ａハイブリダイゼーションを促進させる適切な緊縮条件（例えば、約４５℃下で の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、およびその後の５ ０℃下での２．０×ＳＳＣの洗浄）は当業者に知られているか、もしくはＣｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ． （１９８９）、６．３．１− ６．３．６、において見いだすことができる。例えば洗浄段階の塩濃度 は、５０℃下での約２．０×ＳＳＣの低緊縮性から５０℃下での約０．２×ＳＳ Ｃの高緊縮性までから選択することができる。それに加え、洗浄段階の温度を室 温（約２２℃）での低緊縮性条件から約６５℃での高緊縮条件にまで上昇させる ことができる。 遺伝子コードの縮重により、配列番号１、１１、もしくは１３の内のいずれか に示されるヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸もやはり本発明の範囲 内に含まれる。このような核酸は、機能的には等価であるペプチド（すなわち、 ＲＡＰ−結合性蛋白質の生物学的活性を有するペプチド）であるが、遺伝子コー ドの縮重により添付される配列表からものとは配列が異なるペプチドをコードす る。例えば、多数のアミノ酸が一つを上回るトリプレットにより表示される。同 一アミノ酸を特定するコドンすなわち同義コドン（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣ は各々ヒスチジンをコードする）は、ＲＡＰ−結合性蛋白質のアミノ酸配列には 影響を及ぼさない「サイレント」突然変異をもたらすことがある。しかしながら 、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質のアミノ酸配列の変化をもたらすことのないＤＮＡ 配列多形性が脊椎動物内に存在するであろうことが予期される。当業者は、ＲＡ Ｐ−結合性蛋白質の活性を有するポリペプチドをコードする核酸の一つもしくは 複数のヌクレオチドのこれらの変異体（そのヌクレオチドの内の最高約３〜５％ ）が、天然の対立遺伝子変異により所定の種の個体中に存在するかもしれないこ とを認識するであろう。いずれかもしくは全てのこのようなヌクレオチド変異体 および得られるアミノ酸多形性は本発明の範囲内に含まれる。 本発明は更に、ＲＡＰＴ１蛋白質の一部分（例えば、ラパマイシン−結合性ド メイン）のみをコードする核酸を提供する。本明細書で用いら れる際には、ＲＡＰ−結合性蛋白質のそのような一部分をコードする核酸の断片 は、全長ＲＡＰ−結合性蛋白質の全アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列 よりも少なめのヌクレオチドを有しながらも、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に 結合することが可能なポリペプチドをコードするのに十分なコーディング配列を 依然として含むヌクレオチド配列を意味する。それに加え、本発明の範囲内に含 まれる核酸断片は他の脊椎動物種、特に他の哺乳類からの核酸と、高緊縮性もし くは低緊縮性条件下でハイブリダイズすることが可能な断片を含み、かつこれを 、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の相同体を検出するためのスクリーニングプロトコ ールに使用することができる。本発明の範囲内に含まれる核酸は更に、リンカー 配列、改変化制限エンドヌクレアーゼ部位、ならびにＲＡＰ−結合性蛋白質に由 来する組換えペプチドの分子クローニング、発現、もしくは精製に役立つ他の配 列をも含むことがある。 以下に記載される実施例により示されるように、ＲＡＰ−結合性蛋白質をコー ドする核酸は脊椎動物生物体、特に哺乳類（例えば、マウスもしくはヒト）から の多数の細胞の内のいずれかの中に存在するｍＲＮＡから取得されることがある 。ＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする核酸を、成体および胎仔の両方から取得さ れるゲノムＤＮＡから取得することも可能であるはずである。例えば、ＲＡＰ− 結合性蛋白質をコードする遺伝子を、本明細書内に記載されるプロトコール、な らびに当該技術分野において一般的に知られるプロトコールに従ってｃＤＮＡも しくはゲノムライブラリーのいずれかからクローン化することができる。例えば 、ＲＡＰＴ１蛋白質、特に配列番号２もしくは１２により表されるＲＡＰＴ１蛋 白質の他のイソ型（例えば、パラログもしくはオートログ）をコ ードするｃＤＮＡを、哺乳類細胞（例えばヒト細胞）から総ｍＲＮＡを単離し、 その総ｍＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを作製し、そのｃＤＮＡを適切なプラスミド もしくはバクテリオファージ内にクローン化し、そして多数の既知の技術（例え ば、オリゴヌクレオチドプローブもしくはウエスタンブロット分析）の内のいず れか一つを用いてＲＡＰＴ１クローンを単離することにより取得することができ る。表題ＲＡＰ−結合性蛋白質に関連する蛋白質をコードする遺伝子は、本発明 により提供されるヌクレオチド配列情報に従って、既に確立されているポリメラ ーゼ連鎖反応技術を用いてクローン化することもできる。本発明の核酸はＤＮＡ もしくはＲＮＡであることができる。 本発明の他の態様は、「アンチセンス」療法における単離化核酸の使用に関す る。本明細書で用いられる際には「アンチセンス」療法は、細胞性条件下で、Ｒ ＡＰ−結合性蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと 特異的にハイブリダイズし（例えば、結合し）、その結果その蛋白質の発現を阻 害する（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）オリゴヌクレ オチドもしくはそれらの誘導体の投与もしくはインサイチュー作製を意味する。 結合は、通常の塩基対相補性によるか、例えばＤＮＡ二重らせんへの結合の場合 にはその二重らせんの主溝内での特異的相互作用を介するものであることがある 。一般的には「アンチセンス」療法は当該技術分野において一般的に利用される 技術の範囲を意味し、かつオリゴヌクレオチド配列への特異的結合を頼みとする いずれかの療法を含む。 本発明のアンチセンス構築物を例えば、細胞内で転写される際には、ＲＡＰ− 結合性蛋白質をコードする細胞性ｍＲＮＡの内の少なくとも独 特な部分に相補的なＲＮＡを産生する発現プラスミドとして輸送することができ る。別法ではアンチセンス構築物は、エックスビボで作製され、かつ細胞内に組 み込まれた際には、ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子のｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列と ハイブリダイズすることにより発現の阻害を引き起こすオリゴヌクレオチドプロ ーブであることができる。このようなオリゴヌクレオチドプローブは内因性ヌク レアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ）に 対して耐性を示し、かつそのためインビボで安定である改変化オリゴヌクレオチ ドであることが好ましい。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての使用のため の例示的核酸分子は、ＤＮＡのホスホルアミダイト、ホスホチオエート、および メチルホスホネートアナログである（米国特許第５，１７６，９９６号；第５， ２６４，５６４号；および第５，２５６，７７５号も参照されたい）。それに加 え、アンチセンス療法に有用なオリゴマーの構築のための一般的研究方法が、例 えばｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６ ：９５８−９７６；およびＳｔｅｉｎら（１９８８） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６５９−２６６８、により既に総説としてまとめられている。 従って、本発明のオリゴマーは、治療的、診断的、および研究用の状況におい て有用である。治療的適用法ではオリゴマーは一般的にアンチセンス療法に適切 な様式で利用される。そのような療法のためには本発明のオリゴマーを多様な投 与経路（これには、全身投与および局所もしくは局在化投与が含まれる）のため に製剤することができる。技術および製剤法は一般的にはＲｅｍｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ 、Ｍｅａｄ Ｐｕｂｌｉ ｓｈｉｎｇ Ｃｏ． 、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、において見いだすことができる。全身投与のためには注 入が好ましく、それには注入用の筋肉内、静脈内、腹膜内、および皮下経路が含 まれ、本発明のオリゴマーを液体溶液、好ましくは例えばハンクス（Ｈａｎｋ’ ｓ）溶液もしくはリンゲル（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）溶液のような生理学的適合性緩 衝液中で製剤することができる。それに加え、これらのオリゴマーは固形形態と して製剤され、そして使用直前に再溶解もしくは懸濁されることがある。凍結乾 燥化形態もそれに含まれる。 全身投与は経粘膜的もしくは経皮的手法によるものであることもあり得るか、 あるいはその化合物を経口的に投与することができる。経粘膜的もしくは経皮的 投与のためには浸透予定の関門に適切な浸透剤がその製剤内に用いられる。この ような浸透剤は当該技術分野において一般的に知られており、そして例えば経粘 膜投与のためには胆汁塩およびフシジン酸誘導体がこれに含まれる。それに加え 、洗剤が浸透を促進させるために用いられることがあるかもしれない。経粘膜投 与は鼻内噴霧を通してか、もしくは座薬を用いてものであることがある。経口投 与のためには、オリゴマーは通常の経口投与剤形態（例えば、カプセル剤、錠剤 、および強壮剤）に製剤される。局所投与のためには本発明のオリゴマーは、当 該技術分野において一般的に知られるように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏 （ｓａｌｖｅｓ）、ゲル、もしくはクリームに製剤される。 療法における使用に加え、本発明のオリゴマーを、特異的に結合する標的ＤＮ ＡもしくはＲＮＡ配列の存在もしくは非存在を検出するための診断用試薬として 用いることがある。このような診断用検査は以下に更 に詳細に記載される。 同様に本発明のアンチセン構築物は、ＲＡＰ−結合性蛋白質の正常な生物学的 活性を拮抗することにより、インビボおよびエックスビボでの両方における組織 培養系のための組織の操作（例えば、組織増殖および／または分化）に用いるこ とができる。 本発明は更に、少なくとも一つの転写調節配列に操作的に連結される、本発明 のＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする核酸を含む発現ベクターをも提供する。「 操作的に連結される」は、そのヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列の発 現を可能にさせる様式で調節配列に連結されることを意味することが意図される 。調節配列は当業者には熟知されており、そして組換えＲＡＰ−結合性蛋白質の 発現を指令するように選択される。従って、用語「転写調節配列」は、プロモー ター、エンハンサー、および他の発現制御因子を含む。このような調節配列は、 Ｇｏｅｄｄｅｌ：Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒ ｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）、に記載されている。例えば、 操作的に連結された際にＤＮＡ配列の発現を制御する多種多様の発現制御配列− 配列の内のいずれかをこれらのベクターに用いて本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質 をコードするＤＮＡ配列を発現させることがあるかもしれない。このような有用 な発現制御配列には例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、アデノウ イルスもしくはサイトメガロウイルスの前初期プロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ 系、ＴＡＣもしくはＴＣＲ系、それ自体の発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによ り指令されるＴ７プロモーター、ファージラムダーの主要オペレーターおよ びプロモーター領域、ｆｄコート蛋白質のための制御領域、３−ホスホグリセレ ートキナーゼもしくは他の糖分解酵素のためのプロモーター、酸性ホスファター ゼのためのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、イーストのα−交配因子のプロ モーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、および原核生物も しくは真核生物細胞、またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが 知られている他の配列、あるいはそれらの組み合わせ物が含まれる。発現ベクタ ーの設計は形質転換予定の宿主細胞の選択および／または発現されることが所望 される蛋白質の種類のような因子に依存することがあることが理解されるはずで ある。それに加え、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および そのベクターによりコードされる他のいずれかの蛋白質（例えば、抗生物質マー カー）の発現も考慮されるはずである。ある態様では発現ベクターは、ＲＡＰ− 結合性蛋白質の作用を模倣するもしくはそうでなければその作用の作動活性を行 うポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含むか、あるいは別法ではその組換 え遺伝子は真のＲＡＰ−結合性蛋白質の作用の拮抗作用を行うポリペプチドをコ ードする。そのような発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクトさせ、そし てそのことにより、本明細書に記載される核酸によりコードされるポリペプチド （これには融合蛋白質が含まれる）を産生することができる。 それに加え、本発明の遺伝子構築物は更に、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の 一つもしくは複数のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれかの形態をコー ドする核酸を輸送するための遺伝子療法プロトコールの一部分として用いること もできる。従って、本発明の他の態様は、ある細胞（その細胞内ではその蛋白質 もしくはそれに結合する他の転写調 節蛋白質が過誤発現される）内での表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つもしく は複数の機能を再構築させるかもしくは別法では排除するような、特別な細胞タ イプ内でのＲＡＰ−結合性蛋白質のインビボトランスフェクションおよび発現の ための発現ベクターを特徴とする。例えば、遺伝子療法を使用して、特別な組織 もしくは細胞タイプにラパマイシン誘導化細胞周期拘束に対する耐性を付与する 目的で、ラパマイシン−非感受性ＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする遺伝子を輸 送することができる。 表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の発現構築物およびその突然変異体をいずれかの生 物学的に有効な担体（例えば、ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子をインビボで細胞に効率よく 輸送することが可能ないずれかの製剤もしくは組成物）として投与することがあ る。そのような研究方法には、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ −関連性ウイルス、および単純疱疹ウイルス−１、あるいは細菌性もしくは真核 生物性の組換えプラスミドを初めとするウイルスベクター内への表題遺伝子の挿 入が含まれる。ウイルス性ベクターは細胞を直接トランスフェクトし；プラスミ ドＤＮＡは例えばカチオン性ポリソーム（リポフェクション）もしくは誘導化さ せた（例えば、抗体複合体形成させた）ポリリシン複合体、グラミシジンＳ、人 工ウイルス包膜、もしくは他のそのような細胞内担体、ならびにインビボで実施 される遺伝子構築物もしくはＣａＰＯ₄沈殿物の直接注入の助けを借りて輸送さ れ得る。適切な標的細胞の形質導入は遺伝子療法の重要な第一段階であるがため に、特別な遺伝子輸送系の選択は、意図される標的の表現型および投与経路（例 えば、局所投与もしくは全身投与）のような因子に依存するであろうことが理解 されるであろう。そ れに加え、ＲＡＰ−ＢＰ発現のインビボ形質導入のために提供される特別な遺伝 子構築物も細胞のインビトロ形質導入（例えば診断用アッセイとしてのもの）に とって有用である。 細胞内への核酸のインビボ導入のための好ましい研究方法は、所望されるＲＡ Ｐ−結合性蛋白質の特別な形態をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を含むウ イルス性ベクターの使用による。ウイルス性ベクターでの細胞の感染は、大多数 の割合の標的細胞がその核酸を受け取ることができるという利点を有する。それ に加え、そのウイルス性ベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルス性ベ クター内に含まれるｃＤＮＡにより）は、ウイルス性ベクターの核酸を既に取り 込んでいる細胞内では効率よく発現される。 レトロウイルスベクターおよびアデノ−関連性ウイルスベクターは一般的には 、インビボでの外因性遺伝子の、特にヒトへの移送のためのよりすぐりの組換え 遺伝子輸送系であるとして理解されている。これらのベクターは遺伝子の細胞内 への効率的輸送を提供し、そして移送された核酸は宿主の染色体ＤＮＡ内に安定 に取込まれる。レトロウイルスの使用のための主要な必須事項はそれらの使用、 特に細胞集団内での野生型ウイルスの拡散の可能性に関する安全性を確認するこ とである。複製欠陥性レトロウイルスのみを産生する特殊化細胞株（「パッケー ジング細胞」と称される）の開発により、遺伝子療法のためのレトロウイルスの 利用性が増大し、かつ欠陥性レトロウイルスは遺伝子療法の目的のための遺伝子 移送における使用についての特徴決定が詳細に行われている(総説に関してはＭ ｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１、を参照されたい )。従って、レトロウイルスのコーディング配 列の部分（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）がレトロウイルスに複製欠陥性を付与する 表題レセプターの内の一つをコードする核酸で予め置換してある組換えレトロウ イルスを構築することができる。 その後にこの複製欠陥レトロウイルスをビリオン内にパッケージングし、そし てそれを用いて標準的技術によるヘルパーウイルスの使用を通して標的細胞を感 染することができる。組換えレトロウイルスを産生するため、およびそのような ウイルスを用いて細胞をインビトロもしくはインビボで感染するためのプロトコ ールは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ 、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） Ｇｒｅ ｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、Ｓｅｃｔ ｉｏｎｓ９．１０−９．１４、および他の標準的研究室用手引書に見いだすこと ができる。適切なレトロウイルスの例にはｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥ、およびｐ ＥＭが含まれ、これらは当業者には熟知されている。環境栄養性および両栄養性 の両方のレトロウイルス系を調製するための適切なパッケージング用ウイルス株 の例には、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２、およびΨＡｍが含まれる。レトロウイ ルスは多くの異なる細胞タイプ（これにはリンパ球が含まれる）内にインビトロ および／またはインビボで、様々な遺伝子を組み込ませるのに用いられている（ 例えば、Ｅｇｌｉｔｉｓ，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０： １３９５−１３９８；Ｄａｎｏｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８） Ｐ ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎ ｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ． ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１ ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０ ４３；Ｆｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．（１ ９９２） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａ ｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ ＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１ １６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際公開第８９／０７１３６号；国 際公開第８９／０２４６８号；国際公開第８９／０５３４５号；および国際公開 第９２／０７５７３号、を参照されたい）。 それに加え、レトロウイルスおよびその結果レトロウイルスを基にするベクタ ーの感染スペクトラムを、そのウイルス粒子表面上のウイルス性パッケージング 用蛋白質を改変化することにより制限することが可能であることが既に示されて いる（例えば、国際公開第９３／２５２３４号および国際公開第９４／０６９２ ０号を参照されたい）。例えば、レトロウイルスベクターの感染スペクトラムの 改変化のための手法には：ウイルスのｅｎｖ蛋白質に、細胞表面抗原に特異的な 抗体を結合させる ことか（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．（１９８９） ＰＮＡＳ ８６：９０７９−９ ０８３；Ｊｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ ７ ３：３２５１−３２５５；およびＧｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ １６３：２５１−２５４）；もしくはウイルスのｅｎｖ蛋白質に、 細胞表面レセプターリガンドを結合させること（Ｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９ ９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１４１４３−１４１４６）が含まれ る。結合は、蛋白質もしくは他の多様なもの（例えば、ｅｎｖ蛋白質をアシアロ 糖蛋白質に転化させるためのラクトース）との化学的架橋結合形成の形態をとる ことも、そして融合蛋白質（例えば、一本鎖抗体／ｅｎｖ融合蛋白質）を作製す ることによることもあり得る。この技術は所定のタイプの組織への感染を制限す るか、もしくはそうでなければ指令するのに有用であると同時に、この技術を用 いて環境栄養性ベクターを両栄養性ベクターへと転化させることもできる。 それに加え、レトロウイルス遺伝子輸送の使用は更に、そのレトロウイルスベ クターのＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の発現を制御する組織もしくは細胞特異的転写調節 配列により亢進され得る。 本発明に役立つ他のウイルス遺伝子輸送系はアデノウイルス由来のベクターを 利用する。アデノウイルスのゲノムを、そのゲノムが目的の遺伝子産物をコード および発現するが、ただし正常な溶菌性ウイルス生命環中で複製する能力に関し ては不活化されるように操作することができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎ ｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３ ４；およびＲｏｓｅ ｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５、を 参照されたい。アデノウイルス株Ａｄタイプ５ ｄｌ３２４、もしくはアデノウ イルスの他の株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ４、Ａｄ７など）に由来する適切なアデ ノウイルスベクターが当業者には熟知されている。組換えアデノウイルスは、そ れらが非分裂性細胞を感染することが不可能であり、かつ多種多様タイプの細胞 を感染するのに用いることができるという点で有利であり得る。それに加え、こ のウイルス粒子は比較的安定であり、かつ精製および濃縮が容易であり、そして 先に記載するように感染のスペクトラムに影響を及ぼすように改変することがで きる。その上、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来性 ＤＮＡ）は、宿主のゲノム内には組込まれはしないがしかしエピソームに留まり 、そのことにより導入されたＤＮＡが宿主ゲノム（例えばレトロウイルスＤＮＡ ）内に組み込まれるようになるインサイチューでの挿入性突然変異誘発という結 果をもたらし得るという潜在的問題が回避される。それに加え、外来性ＤＮＡに ついてのアデノウイルスゲノムの保持能力（最高８キロベースまで）は他の遺伝 子輸送ベクターと比較すると大きい（Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ、先に引用； Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ ａｎｄ Ｇｒａｈａｍ （１９８６） Ｊ．Ｖｉｏｌ． ５７：２６７）。現在用いられており、そしてそのため本発明にも好ましい大 半の複製欠陥性アデノウイルスベクターは、ウイルス性Ｅ１およびＥ３遺伝子の 全部もしくは複数部分について欠損を生じているが、８０％ものアデノウイルス 性遺伝子物質を保持している（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９） Ｃｅｌｌ １６：６８３；Ｂｅｒｋｎｅｒ ｅｔ ａｌ、上述；およびＧｒａ ｈａｍ ｅｔ ａｌ． ｉ ｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅ．Ｊ．Ｍ ｕｒｒｙ、Ｅｄ（Ｈｕｍａｎａ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ、１９９１） ｖｏｌ． ７、ｐｐ１０９−１２７、を参照されたい）。挿入されたＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の 発現は、例えばＥ１Ａプロモーター、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）、および 連結されるリーダー配列、Ｅ３プロモーター、もしくは外から添加されたプロモ ーター配列の制御下に置くことができる。 表題ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の輸送に有用な更に他のウイルス性ベクター系はアデ ノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ関連性ウイルスは、効率的な複製お よび産生的生命環のためのヘルパーウイルスとして他のウイルス（例えば、アデ ノウイルスもしくはヘルペスウイルス）を必要とする天然に存在する欠陥ウイル スである（総説に関しては、Ｍｕｚｙｃｚｋａ ｅｔ ａｌ． Ｃｕｒｒ．Ｔｏ ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２） １５８ ：９７−１２９、を参照されたい）。このウイルスは、それ自体のＤＮＡを非分 裂性細胞内に組込ませることがあり、かつ高頻度での安定な組込みを示す数少な いウイルスの内の一つでもある（例えば、Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９ ２） Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ７：３４９− ３５６：Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６ ３：３８２２−３８２８；およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８ ９） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３、を参照されたい）。ＡＡ Ｖの内の３００程の少数の塩基対を含むベクターをパッケージングすることがで き、かつ組込みを行うことができる。外因性ＤＮＡのための余地は約４．５ｋｂ に限定されて いる。例えばＴｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０に記載されるようなＡＡＶベクターを 用いてＤＮＡを細胞内に導入することができる。様々な核酸が、ＡＡＶベクター を用いることで様々なタイプの細胞内に既に導入されている（例えば、Ｈｅｒｍ ｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０：Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（ １９８５） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ４：２０２７−２０８１；Ｗｏｎ ｄｉｓｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｖｉ ｒｏｌ． ５１：６１１−６１９；およびＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９ ３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０、を参照された い）。 例えば先に説明されるようなウイルス移送方法に加え、非ウイルス的方法を利 用しても、動物の組織内へのＲＡＰ−結合性蛋白質の発現を生じることができる 。遺伝子移送の大半の非ウイルス的方法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸 送のために哺乳類細胞により用いられる正常なメカニズムを頼みとしている。好 ましい態様では本発明の非ウイルス性遺伝子輸送系は、標的化細胞による表題Ｒ ＡＰ−ＢＰ遺伝子の取り込みのためのエンドサイトーシス経路を頼みとしている 。このタイプの例示的遺伝子輸送系には、リポソームに由来する系、ポリ−リシ ン複合体、および人工ウイルス包膜が含まれる。 代表的態様では、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つをコードする遺伝子を その表面に陽性電荷を保持するリポソーム内に捕獲し（例えば、 リポフェクション）、そして（場合によっては）それを、その標的組織の細胞表 面抗原に対する抗体で標識化することができる（Ｍｉｚｕｎｏ ｅｔ ａｌ．（ １９９２） Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５５１；国際公 開第９１／０６３０９号；日本特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許出 願公開第４３０７５号）。例えば、細胞のリポフェクションを、例えばＴ細胞上 に存在するいずれかの細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体で標識化させた リポソームを用いて実施することができる。 臨床的状況下では治療用ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子のための遺伝子輸送系を多数の方 法（これら各々は当該技術分野においてはよく知られている）の内のいずれかに より患者内に導入することができる。例えば遺伝子輸送系の薬剤学的調製物を例 えば静脈内注入により全身的に導入することができ、そして標的細胞内での蛋白 質の特異的形質導入が、遺伝子輸送用担体により提供されるトランスフェクショ ンの特異性、レセプター遺伝子の発現を制御する転写調節配列に起因する細胞タ イプもしくは組織タイプ発現、あるいはそれらの組み合わせ物から広範囲にわた りに生じる。他の態様では組換え遺伝子の初期輸送は動物内への導入に関しては 一層限定されており、非常に局在化される。例えば、遺伝子輸送用担体をカテー テルによるか（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、あるいは定 位的注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４） ＰＮＡＳ ９１：３ ０５４−３０５７）により導入することができる。 遺伝子療法用構築物の薬剤学的調製物は本質的には許容される賦形剤中の遺伝 子輸送系でできていることがあるか、あるいは遺伝子輸送用担 体が包埋されている徐放性マトリックスを含むことができる。別法では完全な遺 伝子輸送系を組換え細胞（例えばレトロウイルス性ベクター）から完全な形のま まで産生させることができる場合には、その薬剤学的調製物はその遺伝子輸送系 を産生する一つもしくは複数の細胞を含むことができる。 本発明の他の態様は、真核生物細胞、例えば哺乳類細胞、例えばヒト、マウス 、ラット、ウサギ、もしくはブタからの細胞に由来する遺伝子によりコードされ る組換えＲＡＰ−結合性蛋白質に関する。用語「組換え蛋白質」は、一般的には 例えばＲＡＰＴ１蛋白質をコードするＤＮＡが適切な発現ベクター内に挿入され 、そして次にはそれを用いて宿主細胞を形質転換させて異種蛋白質を産生させる 組換えＤＮＡ技術により産生される本発明の蛋白質を意味する。それに加え、成 句「〜に由来する」は組換えＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする組換え遺伝子に 関しては、「組換え蛋白質」の意味の範囲内に、天然のＲＡＰ−結合性蛋白質の アミノ酸配列もしくはそれに類似するアミノ酸配列を有する蛋白質であって、あ る生物体のＲＡＰ−結合性蛋白質の天然に存在する形態と比較すると置換および ／または欠失を含むような突然変異により作製される蛋白質を含むことを意味す る。本発明により好ましいとされる組換えＲＡＰＴ１蛋白質は、天然のＲＡＰＴ １蛋白質のアミノ酸配列を有するものに加え、配列番号２、１２、もしくは１４ の内の一つに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同であり、より好まし くは８０％相同であり、そして最も好ましくは９０％相同であるアミノ酸配列を 含む。ＲＡＰＴ１蛋白質の生物学的活性を有し、そして配列番号２、１２、もし くは１４の内の一つに表される配列に少なくとも約９５％、より好ましく は少なくとも約９８％、そして最も好ましくはそれと同一であるアミノ酸配列を 含むポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。 同様に、組換えｒａｐ−ＵＢＣ蛋白質の好ましい態様は、配列番号２４により 表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％相同、より好ましくは８０％相同、そ して最も好ましくは９０％相同であるアミノ酸配列を含む。配列番号２４のアミ ノ酸配列と同一であるかもしくは実質的に同一である（例えば、９５〜９８％相 同である）組換えｒａｐ−ＵＢＣ蛋白質も本発明により具体的に企画されている 。 それに加え、本発明は実施例４に記載されるＡＴＣＣに寄託してあるクローン から（例えばＡＴＣＣ受託番号７５７８７から）産生される組換えＲＡＰＴ１蛋 白質、ならびに実施例５に記載されるＡＴＣＣ受託番号７５７８６から産生され る組換えユビキチン−複合体形成性酵素を特に含む。 本発明は更に、配列番号２もしくは１２の内の一つに表されるＲＡＰ−結合性 蛋白質に進化的に関連するが、その配列とは同一ではなく、それでも依然として ＲＡＰ−結合性蛋白質の生物学的活性の内の少なくとも一つのアゴニストもしく はアンタゴニストとして機能することが可能な表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の組換 え形態に関する。用語「進化的に関連する」は組換えＲＡＰ−結合性蛋白質のア ミノ酸配列に関しては、天然に生じるアミノ酸配列を有する蛋白質、ならびに例 えば組換え突然変異誘発により取得される突然変異性変異体を意味する。 本発明の他の態様は、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質を産生する方法に関する。例 えば、表題ＲＡＰＴ１蛋白質もしくはｒａｐ−ＵＢＣをコードするヌクレオチド 配列の発現を指令する核酸ベクターでトランスフェク トさせた宿主細胞を、そのペプチドの発現を生じさせるための適切な条件下で培 養することができる。そのペプチドは、その細胞から分泌され、そしてその細胞 および組換え蛋白質を含む培地の混合物から単離されることがある。別法ではそ のペプチドは、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の天然に存在する形態がそうであると 考えられているのと同様に細胞質に滞留することがあり、このような場合にはそ の細胞を回収、溶解し、そして蛋白質を単離する。細胞培培養物は宿主細胞、培 地、および他の副産物を含む。細胞培養に適する培地は当該技術分野において熟 知されている。組換えＲＡＰ−結合性蛋白質を、細胞培養培地、宿主細胞、もし くはその両者から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ ー、限外濾過、電気泳動法、およびＲＡＰ−結合性蛋白質に特異的な抗体での免 疫親和性精製を初めとする蛋白質精製のために当該技術分野において知られる技 術を用いて単離することができる。ある態様ではＲＡＰ−結合性蛋白質は、精製 を容易にさせるドメインを含む融合蛋白質（例えば、ＲＡＰＴ１−ＧＳＴ融合蛋 白質もしくはｒａｐＵＢＣ−ＧＳＴ融合蛋白質）である。 本発明は更に、ＲＡＰ−結合性蛋白質の組換え形態を発現するためのＲＡＰ− ＢＰ遺伝子でトランスフェクトさせた宿主細胞をも提供する。この宿主細胞はい ずれかの原核生物もしくは真核生物細胞であるかもしれない。従って、本発明の ＲＡＰ−結合性蛋白質のクローニングにより取得され、ある蛋白質の全部もしく は選択された部分をコードするヌクレオチド配列を用いて、微生物学的もしくは 真核生物細胞的過程を介してＲＡＰ−ＢＰの組換え形態を産生することができる 。遺伝子構築物(例えば、発現ベクター)内へのポリヌクレオチド配列の連結、お よびその ベクターでの宿主細胞の形質転換もしくはトランスフェクションは、他の熟知さ れる蛋白質（例えば、インシュリン、インターフェロン、ｐ５３、ｍｙｃ、およ びサイクリンなど）を産生させる際に用いられる標準的方法である。類似の方法 もしくはその変法を利用して組換えＲＡＰ−結合性蛋白質もしくはその複数部分 を、本発明に従う微生物学的手法もしくは組織培養技術により調製することがで きる。組換えＲＡＰ−結合性蛋白質の発現に適する宿主細胞を例えば、真核生物 （イースト、鳥類、昆虫、もしくは哺乳類）細胞あるいは原核生物（細菌）細胞 から選択することができる。 組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子は、ＲＡＰ−結合性蛋白質をコードする核酸もしく はその一部分を、原核生物細胞、真核生物細胞、もしくはその両者のいずれかに おける発現に適するベクター内に連結させることにより産生することができる。 ＲＡＰ−結合性蛋白質の組換え形態の産生のための発現ベクターにはプラスミド および他のベクターが含まれる。例えば、ＲＡＰ−ＢＰの発現に適するベクター には以下のタイプのプラスミドが含まれ、それらは：原核生物細胞（例えば大腸 菌（Ｅ． ｃｏｌｉ））内での発現のためのｐＢＲ３２２−由来のプラスミド、 ｐＥＭＢＬ−由来のプラスミド、ｐＥＸ−由来のプラスミド、ｐＢＴａｃ−由来 のプラスミド、およびｐＵＣ−由来のプラスミド、である。 多数のベクターがイースト内での組換え蛋白質の発現用に存在する。例えば、 ＹＥＰ２４、ＹＩＰ５１、ＹＥＰ５２、ｐＹＥＳ２、およびＹＲＰ１７は、Ｓ． ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内への遺伝子構築物の導入に有用 なクローニング用および発現用担体である（例えば、Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ ．（１９８３） ｉｎ Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ、ｅｄ．Ｍ．Ｉｎｏｕｙｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ｐ８３（ これは引用により本明細書に取り込まれる）、を参照されたい）。これらのベク ターは、ｐＢＲ３２２ｏｒｉの存在のために大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内で、そ してイースト ２ミクロンプラスミドの複製決定基のためにＳ．ケレビシアエ（Ｓ ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内で複製することができる。それに加え、例えば アンピリシンのような薬剤耐性マーカーを使用することができる。 好ましい哺乳類発現ベクターは、細菌内でのベクターの増殖を容易にさせるた めの原核生物性の配列、および真核生物細胞内での組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の 発現を生じる一つもしくは複数の真核生物性転写調節配列を含む。ｐｃＤＮＡＩ ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核生物細胞のトラン スフェクションに適する哺乳類発現ベクターの例である。これらのベクターの内 の幾つかは、原核生物および真核生物の両細胞内での複製および薬剤耐性選択を 容易にさせる目的で、細菌性プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２）からの配列で 改変される。別法では、例えばウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）もしくは エプスタイン−バール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐ ＲＥＰ−由来のもの、およびｐ２０５）のようなウイルスの誘導体を、真核生物 細胞内での蛋白質の一過性発現のために用いることができる。他のウイルス性（ レトロウイルスを含む）発現系の例は、遺伝子療法輸送系の記載において先に見 いだすことができ る。 幾つかの事例では、組換えＲＡＰ−結合性蛋白質をバキュロウイルス発現系の 使用により発現させることが所望されることがある（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａ ｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２、 を参照されたい）。このようなバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ−由来 のベクター（例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１） 、ｐＡｃＵＷ−由来のベクター（例えば、ｐＡｃＵＷ１）、ならびにｐＢｌｕｅ Ｂａｃ−由来のベクター（例えば、β−ｇａｌ含有性ｐＢｌｕｅＢａｃ ＩＩＩ ）が含まれる。 プラスミドの調製および宿主生物体の形質転換に利用される様々な方法は当該 技術分野において熟知されている。原核生物および真核生物の両細胞に適切な他 の発現系、ならびに一般的組換え方法については、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ Ｅｄ．、ｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌ ｄ Ｓｐｌｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８ ９）第１６章および第１７章を参照されたい。 表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つの内の一部分の発現が所望される場合に は（すなわち、切断突然変異体（例えば、配列２、１２、もしくは１４のＲＡＰ Ｔ１ポリペプチド））、開始コドン（ＡＴＧ）を発現が予定される所望の配列を 含むオリゴヌクレオチド断片に添加する必要があることがある。Ｎ−末端の位置 のメチオニンは酵素メチオニンアミ ノペプチダーゼ（ＭＡＰ）の使用により酵素的に開裂されることは当該技術分野 において熟知されている。ＭＡＰは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）（Ｂｅｎ−Ｂａｓ ｓａｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６９：７５ １−７５７）およびサルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙ ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）から既にクローン化されており、かつそのインビトロ活性 が組換え蛋白質について既に記載されている（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１ ９８７） ＰＮＡＳ ８４：２７１８−１７２２）。従って所望される場合には 、Ｎ−末端メチオニンの除去を、ＭＡＰを産生する宿主（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）もしくはＣＭ８９もしくはＳ．ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ ））内でＲＡＰ−ＢＰ−由来のポリペプチドをインビボで発現させるこ とによるか、あるいはインビトロでの精製化ＭＡＰの使用によるか（例えば、Ｍ ｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ、上述の方法）のいずれかで達成することができる。 別法では、そのポリペプチドのためのコーディング配列を、異なるポリペプチ ドをコードする第二ヌクレオチド配列とインフレームで共有結合により連結させ るように融合遺伝子の一部分を取込ませることができる。このタイプの発現系は 、例えばＲＡＰ−結合性蛋白質の免疫原性断片を産生することが所望される場合 には有用であり得る。例えば、ロタウイルスのＶＰ６カプシド蛋白質をＲＡＰＴ １ポリペプチドの複数部分のための免疫原性担体蛋白質として、単量体形態もし くはウイルス粒子の形態のいずれかで用いることができる。抗体を作製する予定 のＲＡＰＴ１蛋白質の部分に相当する核酸配列を、ある融合遺伝子構築物内に取 込ませることができるが、その融合遺伝子構築物はそのビリオンの部分 として蛋白質ＲＡＰＴ１の一部分を含む融合蛋白質を発現する一連の組換えウイ ルスを産生するための後期ワクシニアウイルス構造蛋白質のためのコーディング 配列を含む。組換えＢ型肝炎ビリオンを同様にこの役割に利用することができる ことが、Ｂ型肝炎表面抗原融合蛋白質を利用する免疫原性融合蛋白質の使用に関 して既に証明されている。これに類似して、ＲＡＰＴ１蛋白質の一部分およびポ リオウイルスカプシド蛋白質を含む融合蛋白質をコードするキメラ構築物を作製 して、一連のポリペプチド抗原の免疫原性を亢進させることができる（例えば、 欧州特許出願公開第０２５９１４９号；およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９ ８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：３８５；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８８ ） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２：３８５５；およびＳｃｈｌｉｅｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６６；２、を参照されたい）。表題ユ ビキチン−複合体形成性酵素を類似の様式で免疫原として操作することができる 。 ペプチドを基にする免疫化のための多重抗原ペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａ ｎｔｉｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）系を利用することもでき、この系ではＲＡＰ− 結合性蛋白質の所望される部分が、オリゴマー性の分岐性リシンコア上へのペプ チドの有機化学合成から直接的に取得される（例えば、Ｐｏｓｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８） ＪＢＣ ２６３：１７１９およびＮａｒｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：９１４、を参照された い）。ＲＡＰ−結合性蛋白質の抗原決定基を細菌性細胞により発現および呈示さ せることもできる。 免疫原性を亢進させるための融合蛋白質の利用に加え、融合蛋白質が 蛋白質（例えば、本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質の内のいずれか一つ）の発現お よび精製を促進させることもできることは広く認識されている。例えばＲＡＰ− 結合性蛋白質をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合蛋白質と して作製することができる。このようなＧＳＴ融合蛋白質はＲＡＰ−結合性蛋白 質の精製を簡素化させることができるが、それは例えばグルタチオン−誘導化マ トリックスを用いる親和性精製により実施される（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐ ｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕ ｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｎ．Ｙ．：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、 １９９１、を参照されたい）。他の態様では、精製用リーダー配列（例えば、ポ リ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ開裂配列を含むペプチドリーダー配列）をコ ードする融合遺伝子を、Ｎｉ²⁺金属樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーによ るポリ−（Ｈｉｓ）−融合蛋白質の精製を可能にさせる目的で、ＲＡＰ−結合性 蛋白質の所望の部分のＮ−末端に添加することができる。その後にこの精製用リ ーダー配列をエンテロキナーゼでの処理により除去することができる（例えば、 Ｈｏｃｈｕｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ ｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ８ ８：８９７２、を参照されたい）。 融合遺伝子を作製する技術は当業者には知られている。本質的には、異なるポ リペプチド配列をコードする様々なＤＮＡ断片の連結を、通常の技術に従い、連 結のための平滑末端もしくは食い違い末端、適切な末端を提供するための制限酵 素消化、適切な場合には付着性末端の充填、所望されない連結を回避するための アルカリ性ホスファターゼ処理、お よび酵素的連結を利用することで実施される。他の態様では、融合遺伝子を、自 動化ＤＮＡ合成機を初めとする通常の技術により合成することができる。別法で は、遺伝子断片のＰＣＲ増幅をアンカープライマーを用いて実施し、このことに より２つの連続的遺伝子断片の間に相補的張り出し構造を生じ、そしてその後に その構造をアニールしてキメラ遺伝子配列を作製することができる（例えば、Ｃ ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏ ｎｓ、１９９２、を参照されたい）。 本発明は更に、通常ではＲＡＰ−結合性蛋白質と結合していることがある、他 の細胞性蛋白質、特にＦＫＢＰもしくは他のラパマイシン結合性蛋白質、ならび にユビキチンおよびユビキチン−依存性酵素、シグナル変換および細胞周期の調 節蛋白質から単離されているか、あるいはそうでなければ実質的にそれらを含ま ない表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の精製された、もしくはそうでなければ単離され た形態を取得可能とさせる。用語「他の細胞性もしくはウイルス性蛋白質（本明 細書では「混入性蛋白質」としても引用される）を実質的に含まない」または「 実質的に純粋もしくは精製された調製物」は２０％を下回る（乾燥重量により） 混入性蛋白質を有する、そして好ましくは５％を下回る混入性蛋白質を有するＲ ＡＰ−結合性蛋白質の調製物を含むとして特定される。表題ＲＡＰ−結合性蛋白 質の機能性形態を、本明細書に記載される組換え蛋白質を使用することにより精 製化調製物として初めて調製することができる。別法では、表題ＲＡＰ−結合性 蛋白質を、例えばマトリックス結合化ＦＫＢＰ／ラパマイシン蛋白質を用いる親 和性精製により単離することが できる。「精製された」によっては、ペプチド、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ配列に ついて言及する際には、指示される分子が他の生物学的巨大分子（例えば他の蛋 白質（特にＦＫ５０６結合性蛋白質ならびに他の混入性蛋白質））が実質的に非 存在である状態で存在することが意味される。用語「精製された」は本明細書で 用いられる際には、少なくとも８０乾燥重量％、より好ましくは９５〜９９重量 ％の範囲内の、そして最も好ましくは９９重量％の同一タイプの生物学的巨大分 子が存在することを意味することが好ましい（しかし、水、緩衝液、および他の 小分子、特に５０００を下回る分子量を有する分子は存在し得る）。用語「純粋 」は本明細書で用いられる際には、直ぐ上の「精製された」と同一の数値的制限 を有することが好ましい。「単離された」および「精製された」は、天然の状態 をとる天然物質あるいは予め構成成分に分離されてはいる（例えばアクリルアミ ドゲル内で）が、純粋な（例えば、混入性蛋白質、あるいは一例では変性剤およ びポリマー（例えば、アクリルアミドもしくはアガロース）のようなクロマトグ ラフィー用試薬を含まない）物質もしくは溶液のいずれとしても取得されてはい ない天然物質のいずれをも含みはしない。 それに加え、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の単離されたペプチジル部分を、その ようなペプチドをコードする核酸の対応断片から組換え的に産生されるペプチド をスクリーニングすることにより取得することもできる。それに加え、断片を、 例えば通常のメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相ｆ−Ｍｏｃもしくは ｔ−Ｂｏｃ化学法のような当該技術分野において知られる技術を使用する化学的 に合成することができる。例えば、本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質は、断片の重 複がないような所 望の長さの断片に随意に分断されるか、あるいは好ましくは所望の長さの重複性 断片に分割されることがある。これらの断片を産生させ（組換え的にか、もしく は化学合成により）、そして検査を行って、ＲＡＰ−結合性蛋白質活性のアゴニ ストもしくはアンタゴニストのいずれかとして機能することができるペプチジル 断片を同定することができるが、それは例えばマイクロインジェクションアッセ イもしくはインビトロ蛋白質結合性アッセイによって実施される。説明的態様で は、ＲＡＰ−結合性蛋白質のペプチジル部分（複数）（例えば、ＲＡＰＴ１もし くはｒａｐＵＢＣ）をＦＫＢＰ／ラパマイシン−結合性活性について検査するこ とができる。 治療的もしくは予防的効果、あるいは安定性（例えば、エックスビボでの貯蔵 期間、およびインビボでの蛋白質分解に対する耐性）を亢進させるような目的で ＲＡＰ−結合性蛋白質の構造を改変することも可能であろう。このような改変化 ペプチドは、その蛋白質の天然に存在する形態の少なくとも一つの活性を保持す るように設計された場合には、本明細書に一層詳細に記載されるＲＡＰ−結合性 蛋白質の機能的等価物と見なされる。このような改変化ペプチドは例えば、アミ ノ酸置換、欠失、もしくは添加により産生することができる。 例えば、ロイシンのイソロイシンもしくはバリンとの隔離的置換、アスパラギ ン酸のグルタミン酸との置換、スレオニンのセリンとの置換、もしくはあるアミ ノ酸の構造的関連性のあるアミノ酸との類似置換（すなわち、保存的突然変異） はその蛋白質の折り畳み構造には主要な影響を及ぼすことはいなであろうし、そ して得られる分子の生物学的活性には大きな影響を与えることがあることも、あ るいはないこともある。保 存的置換は、それらの側鎖が関連するアミノ酸ファミリー内で生じる置換である 。一般的には、コードされるアミノ酸は以下の４つのファミリーに分割すること ができ、それらは：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性 ＝リシン、アルギニン、ヒスチジン：（３）無極性＝アラニン、バリン、ロイシ ン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン ；ならびに（４）非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイ ン、セリン、スレオニン、チロシン、である。フェニルアラニン、トリプトファ ン、およびチロシンは時としてはひとまとめにされて芳香族性アミノ酸として分 類される。類似様式で、アミノ酸レパートリーを、（１）酸性＝アスパラギン酸 、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）脂肪 族性＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオ ニン、（ただし、セリンとスレオニンとは場合によっては別個に脂肪族性ヒドロ キシルとして分類される）；（４）芳香族性＝フェニルアラニン、チロシン、ト リプトファン；（５）アミド＝アスパラギン、グルタミン；ならびに（６）硫黄 含有性＝システインおよびメチオニン（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２ ｎｄ ｅｄ．、Ｅｄ ｂｙ Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．：１９８１、を参照されたい）。別法ではアミノ酸置換は立体障害的基 準に基づくことがあり（例えば、等配電子置換）、この場合にはアミノ酸側鎖の 極性もしくは荷電は考慮されない。あるペプチドのアミノ酸配列内の荷電が機能 的ＲＡＰ−ＢＰ相同体をもたらすかどうか(例えば、野生型形態を模倣もしくは 拮抗するように作用するという意味における機能性)は、野生型ＲＡＰ−ＢＰに 類似の様式での細胞内の応答 を産生するか、もしくはそのような応答を競合的に阻害する変異体ペプチドの能 力を評定することにより容易に決定することができる。一つを上回る置換が行わ れているペプチドを同一様式で容易に検査することができる。 本発明は更に、ＲＡＰ−結合性蛋白質（例えば、ＲＡＰＴ１蛋白質および／ま たはｒａｐ−ＵＢＣ酵素）の組み合わせ突然変異体、ならびにその切断化突然変 異体のセットを作製する方法を企画しており、かつ特にラパマイシン−媒介性効 果ならびに細胞成長もしくは分化の他の特徴を調節する機能を示す変異体配列（ 例えばＲＡＰ−ＢＰ相同体）を同定するのに有用である。類似の様式で、その蛋 白質の真の形態の細胞上での正常な機能を妨害することが可能であるという点で アンタゴニストとされるＲＡＰ−ＢＰ相同体を、本組み合わせ研究方法により作 製することができる。 そのような組み合わせライブラリーをスクリーニングするための一つの目的は 例えば、野生型（「真の」）蛋白質の生物学的活性のアゴニストもしくはアンタ ゴニストのいずれかの内の一つとしての能力という点で機能するか、あるいは別 法では新規の生物学的活性をひとまとめにして保持する新規のＲＡＰ−ＢＰ相同 物をそのライブラリーから単離することである。説明すると、ＲＡＰＴ１相同体 は、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体には結合することができないが、それでも依 然として真のＲＡＰＴ１に関連する細胞上での正常な活性の少なくとも一部分を 保持する相同体を提供するための本方法により工学的に作製することができる。 従って組み合わせライブラリーに由来する相同体を作製してラパマイシン−耐性 を提供することができる。このような蛋白質は組換えＤＭＡ構 築物から発現される場合には、遺伝子療法プロトコールで用いることができる。 同様に、突然変異誘発により、対応する野生型蛋白質とは劇的に異なる細胞内 半減期を有するＲＡＰ−ＢＰ相同体をもたらすことができる。例えば、改変化蛋 白質を、真のＲＡＰ−結合性蛋白質の破壊もしくはそうでない場合にはその不活 化をもたらす蛋白質分解もしくは他の細胞性過程に対してより強いもしくはより 弱い安定性を示すようにすることができる。このような相同体、およびそれらを コードする遺伝子を利用して、その蛋白質の半減期を改変することにより特別な ＲＡＰ−ＢＰの発現物の包膜を改変することができる。例えば短い半減期により 一層一過性的特質の強いＲＡＰＴ１生物学的効果をもたらすことができ、そして それが誘導性発現系の部分である際には細胞内での組換えＲＡＰＴ１レベルのよ り強固な制御が可能となり得る。先と同様に、そのような蛋白質および特にそれ らの組換え核酸構築物を遺伝子療法プロトコールで用いることができる。 本方法の説明的態様では、ＲＡＰ−ＢＰ相同体の集団もしくは他の関連性蛋白 質のためのアミノ酸配列を、好ましくは可能な限りの最高の相同性を促進させる ように整列させる。このような変異体集団は例えば一つもしくは複数の種からの ＲＡＰＴ１相同体（例えば、配列２および１２により表されるマウスおよびヒト のＲＡＰＴ１蛋白質の配列アラインメント）か、もしくは同一種からの様々なＲ ＡＰ−ＢＰイソ型（例えば、様々なヒトＲＡＰＴ１イソ型）を含むことができる 。配列アラインメントの各地点に出現するアミノ酸を、組み合わせ配列の縮重セ ットを作製するために選択することができる。 好ましい態様では、組み合わせＲＡＰ−ＢＰライブラリーは、ポリペプチドの ライブラリー（そのポリペプチドの各々は有望なＲＡＰ−ＢＰ配列の少なくとも 一部分（例えば、配列番号２もしくは１２により表されるＲＡＰＴ１の部分か、 あるいは配列２４により表されるｒａｐ−ＵＢＣの部分）を含む）をコードする 遺伝子の縮重ライブラリーにより産生される。合成オリゴヌクレオチドの混合物 を酵素的に遺伝子配列に連結させ、その結果有望なＲＡＰ−ＢＰ配列の縮重セッ トが個々のポリペプチドとしてか、もしくは別法ではＲＡＰ−ＢＰ配列ライブラ リーを含む一層大きな融合蛋白質のセット（例えば、ファージ呈示用のもの）と して発現可能となる。ＲＡＰ−ＢＰ相同体のライブラリーを縮重オリゴヌクレオ チド配列から作製することができる多くの方法が存在する。例えば、縮重遺伝子 配列の化学的合成を自動化ＤＮＡ合成機内で実施することができ、そしてその後 にその合成遺伝子の発現にとって適切な遺伝子に連結させる。ＲＡＰ−ＢＰ遺伝 子の縮重セットの目的は、一つの混合物内に、有望なＲＡＰ−ＢＰ配列の所望さ れるセットをコードする全配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチド の合成法は当該技術分野では熟知されている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，ＳＡ（１ ９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖ ｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ｅｄ． ＡＧ Ｗ ａｌｔｏｎ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ：Ｅ、ｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉ ｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ． ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃ ｅ １９８：１０５６；Ｉ ｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１ ：４７７、を参照されたい）。このような技術は他の蛋白質の有向進化において も既に利用されている（例えば、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｓｃ ｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９ ２） ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（１ ９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａ ｅｔ ａ ｌ．（１９９０） ＰＮＡＳ ８７：６３７８−６３８２：ならびに米国特許第 ５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号、および第５，０９６，８１５ 号、を参照されたい）。 別法では他の形態の突然変異誘発を利用して組み合わせライブラリーを作製す ることができる。例えば、ＲＡＰ−ＢＰ相同体（アゴニストおよびアンタゴニス トの両形態）を、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発など（Ｒｕｆ ｅ ｔ ａｌ．（１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１５６５−１５７ ２：Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９ ：３０９５−３０９９；Ｂａｌｉｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｇｅｎｅ １３７：１０９−１１８；Ｇｒｏｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｅｕ ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２１８：５９７−６０１；Ｎａｇａｓｈｉｍａ ｅ ｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２８８８−２８ ９２：Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８；およびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．（ １９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５）を使用することに よるか；リンカースキャニング突然 変異誘発（Ｇｕｓｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９ ３：６５３−６６０；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｍｏｌ．Ｃｅｌ ｌ．Ｂｉｏｌ． １２：２６４４−２６５２；ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． （１９８２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：３１６）；飽和突然変異誘発（Ｍｅｙ ｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：６１３）による か；ＰＣＲ突然変異誘発（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｍｅｔｈｏ ｄ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １：１１−１９）によるか；あるいはランダ ム突然変異誘発（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣＳＨＬ Ｐｒ ｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；およびＧｒｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３２−３４）を用いることにより作製されるライブラリーから作製および 単離することができる。 所定の特性を有する個々の遺伝子産物を同定するために特に組み合わせ突然変 異誘発により作製される多彩な遺伝子ライブラリーの遺伝子産物のスクリーニン グのための多種多様な技術が当該技術分野に知られている。このような技術は一 般的には例えばＲＡＰＴ１相同体の組み合わせ突然変異により作製された遺伝子 ライブラリーの迅速スクリーニングに適用されるであろう。大きな遺伝子ライブ ラリーをスクリーニングするために最も広く用いられる技術は典型的には、その 遺伝子ライブラリーの複製性発現ベクター内へのクローニング、得られるライブ ラリーベクターでの適切な細胞の形質転換、および所望される活性の検出が検出 される産物の遺伝子をコードするベクターの単離を比較的容易にさせる 条件下でその組み合わせ遺伝子を発現させることを含む。以下に記載される各説 明的アッセイは、必要に応じて、組み合わせ突然変異誘発技術により作製される 多数の縮重ＲＡＰ−ＢＰ配列をスクリーニングするための高処理量分析に適応可 能である。 あるスクリーニングアッセイでは、候補ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子産物が細胞もしく はウイルス粒子の表面上に呈示され、そして特別な細胞もしくはウイルス粒子が この遺伝子産物を介してＦＫＢＰ／１２ラパマイシン複合体に結合する能力が「 パニングアッセイ」において検出される。例えば、縮重ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子ライ ブラリーを細菌性細胞の表面膜蛋白質のための遺伝子内にクローン化し、そして 得られる融合蛋白質をパニングプロトコールにより検出することができる（例え ば、Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第８８／０６６３０号；Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０− １３７１；およびＧｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＴＩＢＳ １８： １３６−１４０、を参照されたい）。類似様式で、ＲＡＰ−結合性蛋白質と結合 する蛍光ラベル化分子（例えば、蛍光ラベル化させたラパマイシンもしくはＦＫ ＢＰ１２／ラパマイシン複合体）を用いて機能する可能性のあるＲＡＰ−ＢＰ相 同体についての評定を行うことができる。細胞は蛍光顕微鏡下で可視的に調査お よび分離することができるか、あるいは細胞の形態が許す場合には蛍光活性化細 胞分別装置により分離することができる。 別の態様では、遺伝子ライブラリーはウイルス粒子の表面上の融合蛋白質とし て発現される。例えば、線維状ファージ系では外来性ペプチド配列は感染性ファ ージの表面上に発現され、そのことにより２つの有意 な利点を付与することができる。第一には、それらのファージを非常な高濃度で 親和性マトリックスに適用することができるため、多数のファージを一度にスク リーニングすることができる。第二に、各感染性ファージはその表面に組み合わ せ遺伝子産物を呈示するため、特別なファージが低収率で親和性マトリックスか ら回収された際には、もう一度感染周期を繰り返すことによりそのファージを増 幅させることができる。ほぼ同一な大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）線維状ファージ Ｍ１３、ｆｄ、およびｆｌのグループがファージ呈示ライブラリーとしては最も 頻繁に使用されるが、それはファージｇＩＩＩもしくはｇＶＩＩＩのいずれかの コート蛋白質を用いると、そのウイルス粒子の最終パッケージングを破壊するこ となく融合蛋白質を作製することができるためである（Ｌａｄｎｅｒ ｅｔ ａ ｌ．、国際公開第９０／０２０９０号；Ｇａｒｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．、国際公 開第９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏ ｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏ ｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；およ びＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：４４５７−４４ ６１）。説明的態様では組換えファージ抗体系（ＲＰＡＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ 社カタログ番号２７−９４００−０１）をＲＡＰ−ＢＰ組み合わせライブラリー を発現およびスクリーニングする際の使用のために容易に改変することができ、 そしてＲＡＰ−ＢＰファージライブラリーをグルタチオン固定化ＦＫＢＰ−ＧＳ Ｔ／ラパマイシン複合体上でパニングさせることができる。再感染の連続周期、 ファージ増幅、およびパニ ングにより、ＦＫＢＰ／ラパマイシン結合性を保持する相同体をかなり濃縮する ことができるであろうし、そしてその後にアゴニストとアンタゴニストとの間を 識別する目的での更に詳細な生物学的活性についてその相同体をスクリーニング することができる。 ヒトおよびマウスのＲＡＰ−結合性蛋白質の相同体は、ＲＡＰ−ＢＰ突然変異 体の組み合わせライブラリーをスクリーニングするための相互作用捕獲アッセイ の使用を通して作製することもできる。以下の実施例１０に記載されるように、 薬剤−依存的様式でＦＫ５０６−結合性蛋白質と相互作用する蛋白質についてｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いられるものと同一の二重ハ イブリッドアッセイを用いて、例えばＲＡＰＴ１突然変異体の組み合わせライブ ラリーを通す選別を行ってアゴニストとアンタゴニストの両形態を見いだすこと もできる。例えばレポーター構築物の発現を稼働するのに用いられるプロモータ ー配列の強度の操作を通して相互作用についてのアッセイの感度を制御すること により、その蛋白質の真の形態と比較するとラパマイシンに対して一層強い結合 親和性を有するＲＡＰＴ１のアゴニスト形態に有利となるように作用するアッセ イを作製することができる。別法では実施例１０に記載されるように、このアッ セイを用いて、現在ではラパマイシン複合体に結合することができず、そしてそ のためその細胞をそのマクロライドでの処理に対して非感受性にさせることがで きるＲＡＰＴ１蛋白質の異形であるＲＡＰＴ１相同体を選択することができる。 本発明は更に、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体との本発明のポリペプチドの結 合を破壊することが可能な疑似物（例えば、ペプチドもしくは非ペプチド性作用 物質）を作製するための、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質 のラパマイシン−結合性ドメインの変形法を提供する。従って、先に記載される ような突然変異誘発技術も、例えばＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に対する結合 に関わる相互作用に関与するＲＡＰ−結合性蛋白質の決定基のマッピングを行う のにも有用である。説明すると、ＦＫＢＰ／ラパマイシンの分子認識に関わるＲ ＡＰ−結合性蛋白質の重要な残基を決定し、そしてそれを用いてラパマイシン複 合体へのＲＡＰ−ＢＰの結合を競合的に阻害するＲＡＰ−ＢＰ−由来のペプチド 疑似物を作製することができる。例えばＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体の結合に 関わる特別なＲＡＰ−結合性蛋白質のアミノ酸残基のマッピングを行うためのス キャニング突然変異誘発を利用することにより、ラパマイシン複合体に結合する 際にそれらの残基を模倣し、かつＦＫＢＰ／ラパマイシンへのＲＡＰ−ＢＰの結 合を阻害することにより細胞周期拘束におけるラパマイシンの機能を妨害するこ とができるペプチド疑似体化合物を作製することができる。例えば、非加水分解 性ペプチドアナログのそのような残基を、レトロ−インバースペプチド（例えば 、米国特許第５，１１６，９４７号および第５，２１８，０８９号；ならびにＰ ａｌｌａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３） Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ｒｅｓ ２１：８４−９２、を参照されたい）、ベンゾジアゼピン（例えば 、Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．、ＥＳ ＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８ ８）、を参照されたい）、アゼピン（例えば、Ｈｕｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．、 ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇ． Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ.、 ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１ ９８８）、を参照されたい）、置換化ガンマーラクタム環（Ｇａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｄ．、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｅｉｄｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８）、ケト−メチレンプソイド ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉ ｕｍ）Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、 １９８５）、β−ターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．（１９８５ ） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；およびＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １ ：１２３１）、ならびにβ−アミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．（ １９８５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １２６ ：４１９；およびＤａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉ ｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）、を用いて作製することが できる。側鎖毎のアッセイを利用して、哺乳類細胞内でのＦＫＢＰ１２／ラパマ イシン複合体のヒトＲＡＰＴ１（もしくは他の哺乳類相同体）の相互作用を特異 的に阻害はするが、ＦＫＢ１／ラパマイシン複合体とのイースト蛋白質ＴＯＲ１ もしくはＴＯＲ２の相互作用には実質的には影響を及ぼさないペプチド疑似物を 設計することができる。こ のようなペプチドアナログは、ラパマイシンの副作用（例えば、免疫抑制）から 宿主哺乳類を保護するための真菌感染のラパマイシン治療法と組み合わせ、抗真 菌剤としてのラパマイシンの効果を実質的に減少させることなく用いることがで きるであろう。 本発明の他の態様は、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つもしくは複数と特 異的に反応する抗体に関する。例えば、ＲＡＰ−結合性蛋白質に由来する免疫原 を用いることにより、抗−蛋白質／抗−ペプチド抗血清もしくはモノクローナル 抗体を標準的プロトコールにより作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｌｏ ｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ： １９８８）、を参照されたい）。例えばマウス、ハムスター、もしくはウサギの ような哺乳類をそのペプチドの免疫原性形態（例えば、全長ＲＡＰ−結合性蛋白 質、もしくは抗体応答を誘導することが可能な抗原性断片）で免疫化することが できる。蛋白質もしくはペプチドに免疫原性を付与するための技術には、担体へ の複合体形成もしくは当該技術分野において熟知される他の技術が含まれる。表 題ＲＡＰ−結合性蛋白質の免疫原性部分をアジュバントの存在下で投与すること ができる。免疫化の進行を、血漿もしくは血清中の抗体力価の検出によりモニタ ーすることができる。標準的ＥＬＩＳＡもしくは他の免疫アッセイを、抗体のレ ベルを評定するための抗原としての免疫原と共に用いることができる。好ましい 態様では、表題抗体は本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質の抗原決定基（例えば、配 列番号２、１２の内の一つに表される蛋白質、もしくはそれらの密接に関連する ヒトもしくは非ヒト哺乳類相同体の抗原決定基）に対して免疫特 異性を示す。例えば、本発明の好ましい抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗体は、配列番号２も しくは１２の内の一つに対して９０％を下回る相同性を示す蛋白質とは実質的に は交差反応性（すなわち、特異的反応）を行わないものの；配列番号２、１２、 もしくは２４の内の一つと９５パーセントを下回る相同性を示すか、あるいは更 には配列番号２もしくは１２の内の一つと９８〜９９パーセントを下回る相同性 を示す蛋白質とは実質的には交差反応（すなわち、特異的反応）を行わない抗体 が具体的に企画されている。「実質的に交差反応を行わない」によっては、その 抗体が、哺乳類ＲＡＰＴ１蛋白質（例えば、配列番号２もしくは１２の内の一つ に表される蛋白質）に対して１０パーセントを下回る、より好ましくは５パーセ ントを下回る、そして更により好ましくは１パーセントを下回る結合親和性を示 す非相同性蛋白質（例えば、イーストのＴＯＲ１もしくはＴＯＲ２蛋白質）に対 する結合親和性を有することが意味される。 免疫化後には抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗血清を取得し、そして所望される場合にはポ リクローナル抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗体をその血清から単離することができる。モノ クローナル抗体を産生するためには抗体産生性細胞(リンパ球)を免疫化動物から 回収し、そして標準的な体細胞融合方法により例えば黒色腫細胞のような不滅化 細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を産生することができる。当該技術分野に 熟知されているこのような技術には例えば、ハイブリドーマ技術（もともとはＫ ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４ ９５−４９７、により開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂ ａｒ ｅｔ ａｌ．、（１９８３） Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４： ７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢ Ｖ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８５） Ｍｏｎｏｃ ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、 Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリ ドーマ細胞を、本発明のＲＡＰ−結合性蛋白質と特異的反応性を示す抗体の産生 について免疫化学的にスクリーニングし、そしてモノクローナル抗体をそのよう なハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。 先に記載されるポリペプチドから調製される本発明の抗体調製物は、凍結乾燥 により取得される乾燥形態をとることができる。しかしながら抗体は通常は、血 清中もしくは例えばＰＢＳのような適切な緩衝液中の水性液体組成物として使用 および供給される。 用語「抗体」は本明細書で用いられる際には、やはり表題ＲＡＰ−結合性蛋白 質の内の一つと特異的に反応するその断片を含むことが意図される。抗体は、組 換え工学的操作を初めとする通常の技術を用いて断片化し、そしてその断片を、 完全な抗体について先に記載されるものと同一の様式での利用のためにスクリー ニングすることができる。例えばＦ（ａｂ’）₂断片をペプシンでの抗体の処理 により作製することができる。得られるＦ（ａｂ’）₂断片を、ジスルフィド架 橋を還元するための処理に付してＦａｂ’断片を産生することができる。本発明 の抗体は更に、抗−ＲＡＰ−ＢＰ部分を有する二重特異的かつキメラ的分子を含 むことが意図される。 ＲＡＰ−結合性蛋白質に対するモノクローナルおよびポリクローナルの両抗体 （Ａｂ）を用いてその蛋白質の作用を遮断し、そして例えば一般的には細胞周期 調節の、あるいは具体的には増殖性および／または分 化的障害の病因の、あるいはラパマイシンの作用メカニズムにおける、ある特別 なＲＡＰ−結合性蛋白質の役割の研究を、例えば細胞内への抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗 体のマイクロインジェクションにより可能にすることができる。 ＲＡＰ−ＢＰエピトープに特異的に結合する抗体を、各々の表題ＲＡＰ−結合 性蛋白質の発現の量およびパターンを評定する目的で、組織試料の免疫細胞化学 的染色にも用いることができる。抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗体を診断的に免疫沈降法お よび免疫ブロッティングに用いて、臨床検査方法の部分として組織および体液中 のＲＡＰ−ＢＰレベルを検出および評定することができる。例えば、遊離のＲＡ Ｐ−ＢＰのＲＡＰ−ＢＰ／ＦＫＢＰ／薬剤複合体に対するレベルのような測定値 は特別なラパマイシンアナログの効果の予測的評価の際に有効であり得、かつあ る個体にとっての所定の治療方法の効果を決定することを可能にし得る。ＲＡＰ −結合性蛋白質のレベルを体液中に見いだされる細胞（例えば、血液の試料から の細胞）中で測定することができるか、あるいは組織（例えば生検により産生さ れるもの）中で測定することができる。 表題抗体の他の適用法は、例えばλｇｔ１１、λｇｔ１８−２３、λＺＡＰ、 およびλＯＲＦ８のような発現ベクター中に構築されるｃＤＮＡの免疫学的スク リーニングにおけるものである。コーディング配列が正しい読み取り枠内および 配向で挿入されているこのタイプのメッセンジャーライブラリーは融合蛋白質を 産生することができる。例えばλｇｔ１１は、アミノ末端がβ−ガラクトシダー ゼのアミノ酸配列からできており、かつカルボキシ末端が外来性ポリペプチドで できている融合蛋白質を産生するであろう。その後にＲＡＰ−結合性蛋白質の抗 原性エピ トープを抗体で検出することができるが、それは例えば感染化プレートから拾い あげてきたニトロセルロースフィルターと抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗体とを反応させる 際に検出される。その後には、このアッセイにより評定されるファージを、その 感染化プレートから単離することができる。従ってＲＡＰ−ＢＰ相同体の存在を 他の動物から検出およびクローン化することができ、そして別のイソ型（これに はスプライシング変異体が含まれる）をヒトの源から検出およびクローン化する ことができる。 それに加え、ヒト細胞株からの表題ＲＡＰ−結合性蛋白質のクローニングから 決定されるヌクレオチド配列は更に、他のヒト細胞タイプにおける相同体、なら びに他の哺乳類からのＲＡＰ−ＢＰ相同体（例えば、オートログ）を同定する際 の使用のために設計されるプローブの作製を考慮するものとなるであろう。例え ば、イーストＴＯＲ遺伝子との哺乳類ＲＡＰＴ１遺伝子の比較を通して高度に保 存されるヌクレオチド配列を同定することにより、実際にいずれかの真核生物細 胞からＲＡＰＴ１相同体を単離するための縮重プライマーを設計することが可能 となるであろう。例えば、マウスＲＡＰＴ１遺伝子配列ならびにイーストＤＲＲ −１およびＴＯＲ２配列のアラインメントから、我々は他の哺乳類相同体から、 ならびに病原性真菌類からＲＡＰＴ１相同体を単離するための至適プライマーに は、プライマーＧＲＧＡＹＴＴＲＡＷＢＧＡＢＧＣＨＹＡＭＧＡＷＴＧＧ、ＣＡ ＡＧＣＢＴＧＧＧＡＹＭＴＹＭＴＹＴＡＹＴＡＴＭＡＹＧＴＢＴＴＣＡＧおよび ＧＡＹＹＢＧＡＲＴＴＧＧＣＴＧＴＢＣＣＨＧＧが含まれることを決定した。 従って本発明は更に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含むプローブ ／プライマーをも提供し、そのオリゴヌクレオチドは配列番号 １もしくは１１、あるいはそれらの天然に存在する突然変異体の内の一つのセン スもしくはアンチセンス配列の内の少なくとも１０の連続ヌクレオチドに対して 緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。好ましい態様 では、そのプローブ／プライマーは更に、それに連結されかつ検出することが可 能なラベル基を含み、例えばそのラベル基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵 素、および酵素補助因子からなる群より選択される。そのようなプローブを、形 質転換化細胞を同定するため（たとえば、患者からの細胞試料中のＲＡＰ−ＢＰ 核酸のレベルを測定するため；例えば、ＲＡＰ−ＢＰ ｍＲＮＡをコードするｍ ＲＮＡレベルを検出する；例えば、ゲノムＲＡＰ−ＢＰ遺伝子が突然変異もしく は欠失を受けているかどうかを決定するため）の診断検査用キットの一部分とし て用いることができる。 それに加え、ＲＡＰ−ＢＰ ｍＲＮＡの存在についての未処理組織および組織 試料の組織学的スクリーニングを考慮するヌクレオチドプローブを作製すること ができる。抗−ＲＡＰ−ＢＰ抗体の診断的使用に類似して、ＲＡＰ−ＢＰ ｍＲ ＮＡもしくはゲノムＲＡＰ−ＢＰ配列に対するプローブの使用を、例えば新生物 性もしくは過形成性障害（例えば、所望されない細胞成長）、あるいは組織の異 常分化として出現することがある対立遺伝子突然変異の予防的および治療的の両 方の評定のために用いることができる。抗体免疫アッセイと組み合わせて用いる ことで、これらのヌクレオチドプローブは、ＲＡＰ−結合性蛋白質の発現（もし くはその欠失）に関連する幾つかの異常性に関与することがある発生障害につい ての分子的基盤の決定を容易にする手助けとなることができる。例えば、ＲＡＰ −結合性蛋白質の合成についての変種を、遺伝子コーディ ング配列についての突然変異体から識別することができる。 従って本発明は、被検体が所望されない細胞増殖もしくは分化の異常制御を特 徴とする障害についての危険性をはらむかどうかを決定するための方法を提供す る。好ましい態様では、表題方法は一般的には、その被検体（例えば、ヒト患者 ）の組織試料中で、（ｉ）表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つをコードする遺 伝子の突然変異、もしくは（ｉｉ）ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の過誤発現、の内の一つ を特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在を検出することを含むとして特徴 付けることができる。説明すると、そのような遺伝子病変を、（ｉ）ＲＡＰ−Ｂ Ｐ遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）そのようなＲ ＡＰ−ＢＰ遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、（ｉｉｉ）ＲＡ ＢＰ−ＢＰ遺伝子の一つもしくは複数の置換、（ｉｖ）ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の内 の一つの総体的染色体再配列、（ｖ）ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子のメッセンジャ−ＲＮ Ａ転写物のレベルの総体的変化、（ｖｉ）ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子のメッセンジャー ＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、および（ｖｉｉ）ＲＡ Ｐ−結合性蛋白質の非野生型レベル、の内の少なくとも一つの存在を証明するこ とにより検出することができる。本発明のある態様では、配列番号１もしくは１ １、または天然に存在するその突然変異体、あるいは５’もしくは３’フランク 配列、または表題ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子と天然の状態で結合するイントロン配列の 内の一つのセンスもしくはアンチセンス配列にハイブリダイズすることが可能な ヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プライマー が提供される。このプローブは組織試料の核酸に露出され：そしてそのプローブ の試料核酸へのハイブリダイゼーショ ンが検出される。所定の態様では、病変の検出はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を 参照されたい）か、あるいは別法では連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎ ｄｅｇｒａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７ −１０８０：およびＮａｋａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（１９４４） ＰＮＡＳ ９１：３６０−３６４、を参照されたい）においてそのプローブ／プライマーを 利用することを含み、これらの反応の内の後者はＲＡＰ−ＢＰ遺伝子における点 突然変異を検出するのに特に有用であり得る。別法では、免疫アッセイを利用し てＲＡＰ−結合性蛋白質、および／または蛋白質複合体、特に転写調節性複合体 （例えば、ＦＫＢＰ／ラパマイシンに関与するもの）へのその関与のレベルを決 定することができる。 更に、特別なＲＡＰ−結合性蛋白質の内因性産生を阻害することにより、アン チセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、もしく は転写物がＲＡＰ−ＢＰのｍＲＮＡもしくは遺伝子配列に関してアンチセンスと なるプラスミドでのトランスフェクション）を用いて、成長および分化現象（例 えば、ウイルム（Ｗｉｌｍ’ｓ）腫瘍を生じる現象）における各表題ＲＡＰ−Ｂ Ｐの役割、ならびに各表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の正常な細胞性機能（例えば、 転写の調節における機能）を調査することができる。このような技術を細胞培養 物に利用することができるが、これを形質転換動物の作製にも用いることができ る。 それに加え、精製化された組換えＲＡＰ−結合性蛋白質を利用可能にすること により、本発明は各表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の細胞性機能、 もしくは増殖性および分化性障害の病原性におけるそれらの役割のアゴニストも しくはアンタゴニストのいずれかである薬剤についてのスクリーニングを行うた めに用いることができるアッセイの作製を提供する。例えば、ＲＡＰ−結合性蛋 白質とＦＫ５０６−結合性蛋白質との間の結合性を調節する化合物の能力を評定 するアッセイを、本発明に従って作製することができる。特にこのようなアッセ イを用いて、新規のラパマイシンアナログの設計およびスクリーニング、ならび に比較的無関係の化合物を、ＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体の形成を媒介するそ れらの能力について検査することができる。このようなアッセイを用いて、ラパ マイシンに類似する作用メカニズムを有する、より有望な抗−真菌剤（例えば、 ラパマイシンアナログ）を作製することができる。様々なアッセイフォーマット は有能なものであろうし、そして本発明を考慮することで、当業者はそのような アッセイフォーマットを思い浮かべることができるであろう。 薬剤スクリーニングアッセイ、特に以下に記載される高処理能アッセイの作製 を容易にさせる本発明の態様は、ＲＡＰＴ１−様蛋白質のラパマイシン結合性ド メインの同定である。例えば本発明は、その全長蛋白質と比較すると操作が一層 容易であるＲＡＰＴ１−様蛋白質の複数部分を提供する。その全長蛋白質はその サイズゆえに、ラパマイシン−結合性活性を保持するであろう組換え蛋白質もし くは融合蛋白質として発現するのが一層困難であり、かつ往々にして不溶性であ ることがある。従って本発明は、前記ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合する ＲＡＰＴ１−様ポリペプチドの可溶性部分（例えば、配列番号２のＶａｌ２６− Ｔｙｒ１６０、配列番号１２のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番 号１４のＶａｌ４１−Ｔｙｒ１７３、配列番号１６のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３３、 および配列番号１８のＶａｌ１−Ａｇｒ１３３からなる群より選択されるアミノ 酸配列により表されるラパマイシン−結合性ドメイン）を含む可溶性ポリペプチ ドを提供する。 例えば、表題スクリーニングアッセイに有用なＲＡＰＴ１ポリペプチドは、一 般式Ｘ−Ｙ−Ｚにより表されることがあり、Ｙは配列番号１２の残基２０１２〜 ２１４４内に含まれるラパマイシン−結合性ドメインのアミノ酸配列を表し、Ｘ は非存在であるか、あるいはＹによっては表されない配列番号１２のおおよその 残基１７００および２１４４の間のアミノ酸配列の全てもしくはＣ−末端部分を 表し、そしてＺは非存在であるか、あるいはＹによっては表されない配列番号１ ２の内の残基２０１２と２５４９との間のアミノ酸配列の全てもしくはＮ−末端 部分を表す。そのポリペプチドがＲＡＰＴ１蛋白質配列の内の約５０〜２００残 基のみを含むに過ぎず、かつその部分がラパマイシン−結合性ドメインを含むこ とが好ましい。類似のポリペプチドを他のＲＡＰＴ１−様蛋白質について作製す ることができる。 別の態様では、同一の式を用いて表題ＲＡＰＴ１蛋白質の生物活性性断片を表 示することができ、その場合式中、Ｙは配列番号１２の残基２０１２〜２１４４ 内に含まれるラパマイシン−結合性ドメインを表し、Ｘは非存在であるか、ある いはラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＮ−末端側にある配列番号１２の内の １〜約５００アミノ酸残基のポリペプチドを表し、そしてＺは非存在であるか、 あるいは選択されたラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＣ−末端側にある配列 番号２の内の１〜約３６５アミノ酸残基を表す。 化合物および天然抽出物のライブラリーを検査する多くの薬剤スクリーニング プログラムでは、所定の期間内に調査される化合物数を最大限にする目的では高 処理能アッセイが所望される。無細胞系で実施されるアッセイ（例えば、精製さ れたかもしくは半精製された蛋白質を用いて取得されることがあるアッセイ）が 、検査用化合物と接触させた際には分子標的の変化の迅速な発生および比較的容 易な検出を可能にさせるようにそれらのアッセイを作製することができるという 点で、「初期」スクリーニングとして好まれることがよくある。それに加え、そ の検査化合物の細胞毒性の効果および／または生物利用性は一般的にインビトロ 系では無視することができ、その代わりそのアッセイは、他の蛋白質との結合親 和性の変化として表されることがある分子標的におけるその薬剤の効果か、ある いはその分子標的の酵素的特性の変化に主に焦点を当てている。従って本発明の 例示的スクリーニングアッセイにおいては、目的の化合物（「薬剤」）を、単離 および精製されたＲＡＰ−結合性蛋白質（例えば、ＲＡＰＴ１もしくはｒａｐＵ ＢＣ）およびＦＫ５０６−結合性蛋白質から作製される混合物と接触させる。薬 剤−依存性ＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体の検出および定量化により、それら２ つの蛋白質間の複合体形成を媒介するためのその化合物の効率を決定するための 手段が提供される。その化合物の効率は、様々な濃度の検査化合物を用いて取得 されるデータから用量反応性曲線を作製することにより評定することができる。 それに加え、対照アッセイを行って比較のための基準線を提供することもできる 。その対照アッセイでは、単離および精製されたＲＡＰ−ＢＰをＦＫ５０６−結 合性蛋白質を含む組成物に添加し、そしてＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体の形成 をその検査化合物の非存在 下で定量する。 ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫＢＰ／薬剤複合体との間の複合体形成はは様々な 技術により検出されることがある。例えば、複合体の形成における調節を、一例 では検出可能なようにラベル化された蛋白質（例えば、放射性ラベル化、蛍光ラ ベル化、もしくは酵素ラベル化された蛋白質）を用い、免疫アッセイによるか、 もしくはクロマトグラフィー的検出により定量化することができる。 典型的にはＦＫ５０６−結合性蛋白質かもしくはＲＡＰ−結合性蛋白質かのい ずれかを固定化させて、それらの蛋白質の内の一つの非複合体形成化形態からの 薬剤−依存的蛋白質複合体の分離を容易にさせ、同時にそのアッセイの自動化の 便宜を図ることが所望されるであろう。説明的態様では、その蛋白質が不溶性マ トリックスに結合することを可能にさせるドメインを添加する融合蛋白質を提供 することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＦＫＢＰ （ＦＫＢＰ−ＧＳＴ）融合蛋白質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）もしくはグルタチオンで誘 導化させてあるマイクロタイタープレート上に吸着させ、そしてその後にそれら をＲＡＰ−結合性蛋白質（例えば、³⁵Ｓ−ラベル化ＲＡＰ−結合性蛋白質）およ び検査化合物と連結させ、そして複合体形成を推進させる条件下でインキュベー トすることができる（例えば実施例９を参照されたい）。インキュベーション後 にはそれらのビーズを洗浄して、いすれかの非結合化ＲＡＰ−ＢＰを除去し、そ してそのマトリックス−ビーズ結合化放射ラベルを直接決定するか（例えば、ビ ーズをシンチラント中に入れる）、あるいはＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体が解 離した後に(例 えば、マイクロタイタープレートを使用した際に)上清中で決定する。別法では 、非結合化蛋白質の洗い落とし後に、その複合体をマトッリクスから解離させ、 ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、そしてそのマトリックス結合化分画中に見 いだされるＲＡＰ−ＢＰのレベルを標準的電気泳動技術を用いてそのゲルから定 量化することができる。 マトリックス上に蛋白質を固定化するための他の技術も表題アッセイにおける 使用に利用可能である。例えば、ＦＫ５０６−結合性蛋白質を、ビオチンおよび ストレプトアビジンの複合体形成化を利用して固定化することができる。ビオチ ニル化ＦＫＢＰを、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシル−スクシンイミド）か ら、当該技術分野に熟知される技術(例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃ ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ)を用いて調製し、そして ストレプトアビジンでコートした９６ウエルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌｓ社）のウエルに固定化することができる。別法では、ＦＫＢＰとの反 応性を示す抗体をプレートのウエルに誘導化させ、そしてＦＫＢＰを抗体複合体 形成によりそれらのウエル内に捕獲することができる。先と同様にＲＡＰ−結合 性蛋白質の調製物と検査化合物とを、そのプレートのＦＫＢＰが呈示されている ウエル内でインキュベートし、そしてそのウエル内に捕獲されるＦＫＢＰ／ＲＡ Ｐ−ＢＰ複合体の量を定量化することができる。そのような複合体を検出するた めの例示的方法には、ＧＳＴ−固定化複合体について先に記載されるものに加え て、ＲＡＰ−結合性蛋白質との反応性を示す抗体、もしくはＦＫ５０６−結合性 蛋白質との反応性を示しかつＲＡＰ−ＢＰとの結合に関して競合する抗体を用い る複合体の免疫検出；ならびにＲＡＰ−結合性蛋白質と結合する酵素活性を検 出することを頼みとする酵素抗体アッセイが含まれる。後者の例では、その酵素 活性は内因性のもの（例えば、キナーゼ（ＲＡＰＴ１）もしくはユビキチンリガ ーゼ（ｒａｐＵＢＣ）活性）であることができるか、あるいは化学的複合体形成 されるかもしくはＲＡＰ−結合性蛋白質との融合蛋白質として提供される外因性 活性であることができる。説明すると、ＲＡＰ−結合性蛋白質はアルカリ性ホス ファターゼと化学的に架橋結合させることができ、そしてその複合体中に捕獲さ れるＲＡＰ−ＢＰの量を酵素の色素産生性基質（例えば、リン酸パラニトロフェ ニル）を用いて評定することができる。同様に、ＲＡＰ−ＢＰおよびグルタチオ ン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合蛋白質を提供することができ、そして複 合体形成を、１−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（Ｈａｂｉｇ ｅｔ ａｌ ．（１９７４） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４９：７１３０）を用いてＧＳＴ 活性を検出することにより定量化することができる。 複合体内に捕獲される蛋白質の内の一つを定量化するための免疫検出を頼みと する方法のためには、蛋白質に対する抗体（例えば、本明細書内に記載される抗 −ＲＡＰ−ＢＰ抗体）を用いることができる。別法では複合体内に含まれる検出 予定の蛋白質を、ＲＡＰ−ＢＰもしくはＦＫＢＰ配列に加え、抗体を容易に利用 することができる（例えば、商業的源から）第二ポリペプチドを含む融合蛋白質 の形態での「エピトープ標識化」を施すことができる。例えば、先に記載される ＧＳＴ融合蛋白質を、ＧＳＴ部分に対する抗体を用いる結合の定量化のために用 いることもできる。他の有用なエピトープ標識には、ｍｙｃ−エピトープ（例え ば、Ｅｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈ ｅｍ ２６６：２１１５０−２１１５７）（これは、ｃ−ｍｙｃからの１０残基 分の配列を含む）、ならびにｐＦＬＡＧ系（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）、もしくはｐＥＥＺ−プロテインＡ 系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＮＪ）が含まれる。 それに加え、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質を用いて、ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦ Ｋ５０６−結合性蛋白質との間の複合体形成を誘導する作用性物質を検出するた めの薬剤−依存性相互作用捕獲アッセイ（以下の実施例に記載される）を作製す ることができる。以下に示されるように、相互作用捕獲アッセイは、２つの個別 の融合蛋白質からインビボで機能的転写活性因子蛋白質を再構築することを頼み としており、それら２つの融合蛋白質の内の一つはＦＫ５０６−結合性蛋白質に 融合される転写活性化因子のＤＮＡ−結合性ドメインを含む（例えば、米国特許 第５，２８３，３１７号；国際公開第９４／１０３００号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０ ５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６、を参照されたい）。この第二融 合蛋白質は、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の内の一つに融合される転写活性化ドメ インを含む（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ転写を活性化することが可能である） 。ＦＫＢＰおよびＲＡＰ−結合性蛋白質が例えばラパマイシンのような作用物質 の存在下で相互作用する場合には、その転写活性化因子蛋白質の内の２ つのドメインはレポーター遺伝子の転写を生じるのに十分に近接するようになる 。以下の実施例に記載されるＬｅｘＡ相互作用捕獲に加え、更に他の説明的態様 は、ＧＡＬ４ｄｂ−ＦＫＢＰ融合物（ｄｂ：ＤＮＡ結合性ドメイン）をコードす るプラスミド、および表題ＲＡＰ−ＢＰに融合されるＧＡＬ４活性化ドメイン（ ＧＡＬ４ａｄ）をコードするプラスミドとで同時に形質転換させたサッカロミセ ス ケレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＰ Ｂ２細胞を含む。それに加えその株は、ＧＡＬ４−応答性プロモーターが表現型 マーカーの発現を稼働するように形質転換させられる。例えば、ヒスチジンの非 存在下で増殖する能力は、ＨＩＳ３遺伝子の発現に依存することがあり得る。Ｈ ＩＳ３遺伝子がＧＡＬ４−応答性プロモーターの制御下に置かれる場合には、こ の栄養要求表現型の緩和により、機能性ＧＡＬ４活性化因子がＦＫＢＰとＲＡＰ −ＢＰとの薬剤−依存的相互作用を通して予め再構築されていることが示される 。従って、ＦＫＢＰとのＲＡＰ−ＢＰの相互作用を促進させることが可能な作用 物質は、ヒスチジンの非存在下で成長することが可能なイースト細胞をもたらす であろう。表題ＲＡＰ−結合性蛋白質に関する二重−ハイブリッドアッセイを開 発するために改変することができる市販キットが現在では入手可能である（例え ば、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲキット、ＣｌｏｎＴｅｃｈ社、カタログ番号 Ｋ１６ ０５−１、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。 好ましい態様では、表題哺乳類ＲＡＰ−結合性蛋白質を利用するアッセイを使 用して、ラパマイシンと比較すると一層好ましい治療指数を有するラパマイシン 疑似体を同定することができる。例えば、ラパマイシンと比較して亢進した組織 タイプもしくは細胞タイプ特異性を有するラ パマイシン−様薬剤を本発明により同定することができる。説明すると、表題ア ッセイを用いて、他の組織（例えば、肝細胞）を実質的に妨害することなくＩＬ −２により媒介されるリンパ球の増殖／活性化を特異的に阻害する化合物を作製 することができる。同様に類似のアッセイを用いて、イースト細胞もしくは他の より下等な真核生物の増殖を阻害するが、ただし哺乳類細胞については実質的に 低下した効果を有し、そのためラパマイシンと比較すると抗−真菌剤としての薬 剤の治療学的指数が改善されているラパマイシン−様薬剤を同定することができ る。 ある態様では、そのような化合物の同定は、２つもしくはそれを上回る様々な タイプのＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体の薬剤に媒介される形成を検出および比 較する特異的スクリーニングアッセイの使用により可能となる。説明すると、こ のアッセイを、組織タイプ特異的ＦＫＢＰ／ＲＡＰＴ１複合体の形成に関する検 査化合物の効果の並列比較用に設計することができる。ＦＫＢＰの多様性および ＲＰＴ１が関連性蛋白質の巨大ファミリーの単一メンバーを表すことの実質的な 可能性が存在するとすると、様々な機能性ＦＫＢＰ／ＲＡＰＴ１複合体が存在し 、そして所定の事例ではそれらは特別な組織もしくは細胞タイプに局在化する見 込みがありそうである。「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｔｉｓｓ ｕｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＦＫ５０６ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅ ｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」という表題の 国際公開第９３／２３５４８号に記載されるように、ＦＫＢＰの組織分布はある 種の蛋白質と次の種の蛋白質とでは異なっている。従って、検査用化合物をＦＫ ＢＰ／ＲＡＰＴ１複合体の有望なレパートリーの内のたった一つのサブセットの みの組織特異的形 成を媒介することが可能な作用物質についてスクリーニングすることができる。 例示的態様では、相互作用捕獲アッセイを、２つもしくはそれを上回る様々なお とり用蛋白質（例えば、ＦＫＢＰ１２（配列番号５および６）、ＦＫＢＰ２５（ ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号Ｍ９０３０９）、もしくはＦＫＢＰ５２（ＧｅｎＢａ ｎｋ 受託番号Ｍ８８２７９）を用いて取得することができる一方で、魚役の蛋 白質は各アッセイにおいて不変である（例えば、ヒトＲＡＰＴ１構築物）。ＩＴ Ｓを並列に実施することにより、他のＦＫＢＰ複合体の形成についてと比較する と、ＦＫＢＰ／ＲＡＰＲＴ１複合体の内の一つの形成について一層大きな効果( 例えば、統計的に有意な効果)を有する作用物質の検出が可能となる。 類似の様式で、特異的スクリーニングアッセイを用いて、哺乳類複合体と比較 するイースト複合体についての特異性において統計的に有意な増加を示す作用物 質を同定する目的では、哺乳類ＦＫＢＰ／ＲＡＰ−ＢＰ複合体およびイーストＦ ＫＢＰ／ＴＯＲ複合体の薬剤により媒介される形成における差異を活用すること ができる。従って、病原体（例えば、真菌感染に関与する真菌類）に特異的に作 用する先駆的化合物を開発することができる。説明すると、本アッセイを用いて 、カンジダ症、アスペルギルス症、ムコール症、ブラストミセス症、ゲオトリク ム症、クリプトコッカス症、色素酵母菌症、コクイジオミセス症、コニオスポリ ウム症、ヒストプラスマ症、マズラミコーシス、リノスポリジウム症、ノカルジ ア症、パラ−アクチノミセス症、ペニシリウム症、モニリア症、もしくはスポロ トリクム症のような真菌症に関わる少なくとも一つの真菌類を阻害するのに結局 は役立つことがある作用物質についてスクリーニングを行うことができる。例え ば、治療が所望される真菌感染がカン ジダ症である場合には、本アッセイは、哺乳類ＦＫＢＰ／ＲＡＰＴ１複合体の形 成を媒介することについての検査化合物の相対的効果を、カンジダ アルビカン ス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ ステラトイディア（Ｃａ ｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ トロピカリス（Ｃａｎｄ ｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ パラプシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕ ｓｅｉ ）、カンジダ プセウドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔ ｒｏｐｉｃａｌｉｓ ）、カンジダ クゥイレルモンディイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｑ ｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ ）、もしくはカンジダ ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒ ｕｇｏｓａ ）からなる群より選択されるイーストからクローン化される遺伝子か ら形成されるそのような複合体を媒介することに対する効果と比較することを含 む。同様に、本アッセイを用いて、例えばアスペルギルス フミガトゥス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス フラブス（Ａｓ ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス ニゲル（Ａｓｐｅｒｇ ｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス ニドゥランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、もしくはアスペルギルス テレウス（Ａｓｐｅｒ ｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）のようなイーストからクローン化されるＦＫＢ ＰおよびＴＯＲ遺伝子に由来する表題薬剤依存的相互作用捕獲アッセイの使用を 行うことによりアスペルギルス症を治療する際に治療的価値を有することがある 抗−真菌剤を同定することができる。真菌感染がムコール症である場合には、そ の化合物は、例えばリゾプス アルヒズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕ ｓ ）、リゾプス オリザエ （Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アブジディア コリムビフェラ（Ａｂｓ ｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、アブシジア ラモサ(Ａｂｓｉｄｉａ ｒａｍｏｓａ )、もしくはムコル プシルス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ） のようなイーストに由来することができる。哺乳類ＦＫＢＰ／ＲＡＰＴ１複合体 との比較のための他のラパマイシン−依存的複合体の源には、病原体プネウモシ スチス カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）が含まれる。 ヒト病原体および他の下等真核生物からの例示的ＦＫ５０６−結合性蛋白質は、 例えばＧｅｎＢａｎｋ 受託番号：Ｍ８４７５９（カンディダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ））；Ｕ０１１９５、Ｕ０１１９８、Ｕ０１ １９７、Ｕ０１１９３、Ｕ０１１８８、Ｕ０１１９４、Ｕ０１１９９（ネイッセ リア エスピーピー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐｐ．））；およびＭ９８４２８ （ストレプトミセス クリソマルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｈｒｙｓｏ ｍａｌｌｕｓ ））により提供される。 例示的態様では、特異的スクリーニングアッセイを、カンディダ アルビカン （Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎ）のＲＡＰＴ１蛋白質（実施例１１を参照さ れたい）、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ＦＫ５０６−結合性蛋白質（例え ば、ＲＢＰ１、ＧｅｎＢａｎｋ 受託番号Ｍ８４７５９、Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｇｅｎｅ １１３：１２５−１２７、も参照されたい） 、もしくはイーストＦＫ５０６−結合性蛋白質（実施例８および図３を参照され たい）の内の少なくともラパマイシン−結合性ドメインを用いて作製することが できる。ヒトＲＡＰＴ１複合体およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）ＲＰＴ１複合 体との形成の比較により、ｃａＲＡＰＴ１複合体の形成について一層高 い選択性を示し、そしてそのためラパマイシンと比較して抗−真菌剤としての特 異性が一層高いと思われる作用物質を同定するための手段が提供される。 本発明の他の態様は、本発明のトランスジーンを含み、そして動物の一つもし くは複数の細胞内で外因性ＲＡＰ−結合性蛋白質を恐らく（場合によってではあ るが）発現する細胞（その動物の）を含んでなる形質転換動物に関する。ＲＡＰ −ＢＰトランスジーンはその蛋白質の野生型形態をコードすることができるか、 あるいはその相同体をコードすることができ、それらの相同体には、アゴニスト とアンタゴニストの両方、ならびに内因性遺伝子の発現を阻害するために設計さ れるアンチセンス構築物が含まれる。好ましい態様では、そのトランスジーンの 発現は、例えば所望されるパターンでの発現を制御するシス−作用性配列の使用 を通して、細胞、組織、もしくは発達段階の特異的サブセットに限定される。本 発明では、表題ＲＡＰ−結合性蛋白質のそのようなモザイク発現が多くの形態の 系列分析にとって必須であることがあり得、そして追加的には機能喪失突然変異 （この欠陥は他の点では正常な胎仔内の組織の小パッチ内の成長を総体的に変化 させることがあるであろう）の効果を評定する手段を提供することができる。こ の目的のためには、組織特異的調節配列および条件的調節配列を用いて、所定の 空間的パターンでのトランスジーンの発現を制御することができる。その上、一 過性パターンの発現を、例えば条件的組換え系もしく原核生物転写調節配列によ り提供することができる。 トランスジーンの発現を考慮する遺伝子技術を、当業者に知られるインビボで の部位特異的遺伝子操作を介して調節することができる。例え ば、標的配列の遺伝子組換えの触媒反応を行うリコンビナーゼの調節化発現を考 慮する遺伝子系が利用可能である。本明細書で用いられる際には成句「標的配列 」は、リコンビナーゼにより遺伝子的に組換えられるヌクレオチド配列を意味す る。標的配列はリコンビナーゼ認識配列によりフランクされ、そして一般的には リコンビンナーゼ活性を発現する細胞からの切り出しかもしくは逆位のいずれか が施される。リコンビナーゼによる触媒反応を受ける組換え現象を、その標的配 列の組換えが表題ＲＡＰ−結合性蛋白質の発現の活性化もしくは抑制のいずれか をもたらすように設計することができる。例えば、組換えＲＡＰ−ＢＰ遺伝子の 発現を妨害する標的配列の切り出しがその遺伝子の発現を活性化させるように設 計することができる。この蛋白質の発現の妨害は様々なメカニズム（例えば、そ の遺伝子のプロモーター因子もしくは内部停止コドンからの空間的隔離）により 生じることがある。それに加え、遺伝子のコーディング配列がリコンビナーゼ認 識配列によりフランクされ、かつ最初にはプロモーター因子に関して３’−５’ 方向に細胞内にトランスフェクトされるトランスジーンを作製することができる 。このような事例では、標的配列の逆位は表題遺伝子の再配向を行うことになる であろうが、、それはプロモーター因子に関する配向（これはプロモーターによ り稼働される転写活性を考慮するものである）にそのコーディング配列の５’末 端を配置することによるものである。 説明的態様では、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ 系（Ｌａｋｓｏ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６２３２−６２ ３６；Ｏｒｂａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） ＰＮＡＳ ８９：６８６１−６ ８６５）かもしくはサッカロミセス ケレビ シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰリコン ビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１−１３５５：国際公開第９２／１５６９４号）のいずれかを用 いてインビボでの部位特異的遺伝子組換え系を作製することができる。Ｃｒｅリ コンビナーゼはｌｏｘＰ配列間に存在する介在性標的配列の部位特異的組換えの 触媒反応を行う。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合し、そしてＣｒｅ リコンビナーゼ媒介性遺伝子組換えに必要とされる３４塩基対のヌクレオチド反 復配列である。ｌｏｘＰ配列の配向が、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在する際に、 その介在性標的配列が切り出されるかもしくは逆位を生じるかを決定し（Ａｂｒ ｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２５９： １５０９−１５１４）；ｌｏｘＰ配列が正の反復構造としての配向をとる際には 標的配列の切り出しの触媒反応が行われ、そしてｌｏｘＰ配列が逆位の反復配列 としての配向をとる場合にはその標的配列の逆位の触媒反応が行われる。 従って、標的配列の遺伝子組換えはＣｒｅリコンビナーゼの発現に依存する。 リコンビナーゼの発現は、調節性制御（例えば、組織特異的、分化段階特異的、 外部から添加された作用物質により誘導もしくは抑制される制御）に供されるプ ロモーター因子により調節することができる。このような調節性制御により、リ コンビナーゼ発現がプロモーター因子により媒介される細胞内でのみ標的配列の 遺伝子組換えがもたらされるであろう。従って、ＲＡＰ−結合性蛋白質の活性化 発現を、リコンビナーゼ発現の調節を介して調節することができる。 組換えＲＡＰ−結合性蛋白質（例えば、ＲＡＰＴ１もしくはｒａｐＵ ＢＣ）の発現を調節するためのｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の使用には、 Ｃｒｅリコンビナーゼと表題蛋白質との両方をコードするトランスジーンを含む 形質転換動物の構築が必要とされる。Ｃｒｅリコンビナーゼと組換えＲＡＰ−Ｂ Ｐ遺伝子との両方を含む動物を、「二重」形質転換動物の構築を通して提供する ことができる。そのような動物を提供するのに都合のよい方法は、それぞれ、あ る動物がトランスジーン(例えば、ＲＡＰ−ＢＰ遺伝子)を含み、そしてもう一方 の動物がリコンビナーゼ遺伝子を含むという２匹の形質転換動物を交配させるこ とである。 リコンビナーゼ−媒介性発現性フォーマット内にトランスジーンを含む形質転 換動物を最初に構築することにより取得される一つの利点は、その表題蛋白質が その形質転換動物中での発現の際に有毒となるだろうという可能性に由来する。 このような事例では、表題トランスジーンが全組織中でサイレントである創始体 集団の作製により、特別な組織もしくは分化段階での細胞周期調節の破壊が例え ば致死的表現型をもたらすであろう、そのような創始細胞からの子孫の研究が可 能となるであろう。 類似の条件性トランスジーンを、トランスジーンの発現を容易にさせる目的で 、原核生物蛋白質が同時に発現されることを指令する原核生物プロモーター配列 を用いて提供することができる。例示的プロモーターおよび対応するトランス− 活性性原核生物蛋白質は米国特許第４，８３３，０８０号に記載されている。そ の上、条件的トランスジーンの発現を、そのトランス−活性性蛋白質（例えば、 リコンビナーゼもしくは原核生物性蛋白質）をコードする遺伝子が組織に輸送さ れ、そして例えば先に記載される遺伝子療法用構築物の内の一つを使用して発現 を生じさせる、遺伝子療法−様方法により誘導することができる。この方法によ りＲＡＰ−ＢＰトランスジーンを成体期になってもサイレントのままにさせてお くことができ、そしてその発現はトランス−活性化因子の導入によって「スイッ チオン」となるであろう。 例示的態様では本発明の「形質転換非ヒト動物」は非ヒト生殖系列内にトラン スジーンを組込むことにより作製される。様々な分化段階の胎仔標的細胞を用い てトランスジーンを組み込ませることができる。胎仔標的細胞の発生段階に依存 して様々な方法が用いられる。受精体がマイクロインジェクションにとっての最 善の標的である。マウスではオスの前核は直径約２０マイクロメーターのサイズ に到達し、そのことにより１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液の再現的注入が可能となる。 遺伝子移送の標的としての受精体の使用は、大半の事例では注入したＤＮＡが第 一分裂以前に宿主遺伝子内に組込まれるであろうという点での主な利点を有する （Ｂｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５） ＰＮＡＳ ８２：４４３８− ４４４２）。結果として形質転換非ヒト動物の全細胞は組み込まれたトランスジ ーンを保持するであろう。このことは一般的には創始体の子孫へのそのトランス ジーンの効率的伝達にも反映されるであろうが、それは生殖細胞の５０％がその トランスジーンを保持であろうからである。受精体のマイクロインジェクション は、本発明を実施する際にトランスジーンを組込ませるための好ましい方法であ る。 レトロウイルス感染も非ヒト動物内にＲＡＰ−ＢＰトランスジーンを組込ませ るのに用いられる。発育中の非ヒト胎仔をインビトロで培養して胞胚段階にもっ てゆくことができる。この期間中、分割細胞はレトロウイルスにとっての標的と なることができる（Ｊａｅｎｉｃｈ，Ｒ．（１９７６） ＰＮＡＳ ７３：１２ ６０−１２６４）。分割細胞の効 率的感染は、透明体を除去するための酵素的処理により達成することができる（ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｈｏｇａｎ ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８６）。トランスジー ンを組込ませるのに用いられるウイルス性ベクター系は典型的には、トランスジ ーンを保持する複製欠陥レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８５） ＰＮＡＳ ８２：６９２７−６９３１；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔ ｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５） ＰＮＡＳ ８２：６１４８−６１５２）。ト ランスフェクションは、単層のウイルス産生性細胞上で分割細胞を培養すること により簡便かつ効率的に取得される（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ、上述；Ｓ ｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７） ＥＭＢＯ Ｊ．６：３８３−３８８ ）。別法では、感染をもっと後期の段階で実施することができる。ウイルスもし くはウイルス産生性細胞を分割腔内に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ ｅ ｔ ａｌ．（１９８２） Ｎａｔｕｒｅ ２９８：６２３−６２８）。大半の創 始体トランスジーンについてモザイクとなるであろうが、それは組込みが形質転 換非ヒト動物を形成した細胞のサブセットにのみ生じるためである。更にその創 始体はゲノムの様々な位置にそのトランスジーンの様々なレトロウイルス挿入断 片を含むことがあり、この場合一般的にはこれらの挿入断片は子孫細胞では隔離 されるであろう。それに加え、トランスジーンを、妊娠中期の胎仔の子宮内レト ロウイルス感染により生殖系列内に組込ませることも可能である(Ｊａｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）、上述)。 トランスジーン組込みのための第三のタイプの標的細胞は胚幹細胞 （ＥＳ）である。ＥＳ細胞はインビトロで培養される移植前胎仔から取得され、 そしてこれが胚と融合される（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９８１） Ｎａｔ ｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８４） Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｒｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（ １９８６） ＰＮＡＳ ８３：９０６５−９０６９；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６） Ｎａｔｕｒｅ ３２２：４４５−４４８）。トラ ンスジーンを、ＤＮＡトランスフェクションによるか、もしくはレトロウイルス により媒介される形質導入によりＥＳ細胞内に効率的に導入することができる。 このような形質転換化ＥＳ細胞をその後に非ヒト動物からの胚胞と合わせること ができる。その後にこのＥＳ細胞は胚内に混ざり合い、そして得られるキメラ動 物の生殖系列の一員となる。総説については例えば、Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（ １９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４、を参照されたい。 ノックアウトすなわち破壊形質転換動物を作製する方法も一般的に知られてい る。例えば、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６、を参照されたい ）。リコンビナーゼ依存的ノックアウト体も、リコンビナーゼ標的配列を挿入す るための例えば相同組換えにより作製することができ、その結果、ＲＡＰ−ＢＰ 遺伝子の不活化の組織特異的および／または一過性制御が先の要領で制御され得 る。 本発明の他の態様は、「おとり」用の蛋白質／薬剤複合体と物理的に相互作用 を行う蛋白質をコードする遺伝子の単離のための新規のインビ ボ方法に関する。この方法は薬剤の存在下での転写活性化因子の再構築を検出す ることを頼みとしており、特にこの場合、そのような薬剤は非−ペプチド性の小 有機分子（例えば＜２５００Ｋ）、例えばマクロライド、例えばラパマイシン、 ＦＫ５０６、もしくはシクロスポリンである。具体的にはこの方法はハイブリッ ド蛋白質を発現するキメラ遺伝子を利用する。第一のハイブリッド蛋白質はおと り用蛋白質に融合された転写活性化因子のＤＮＡ−結合性ドメインを含む。第二 ハイブリッド蛋白質は、「魚」役の蛋白質（例えば、ｃＤＮＡライブラリーに由 来する検査用蛋白質）に融合される転写活性化ドメインを含む。これらの魚役と おとり用の蛋白質が薬剤−依存的様式で相互作用を行うことが可能である場合に は、それらはその転写活性化因子のその２つのドメインに非常に近接するように なる。この近接の度合いは転写活性化因子に応答する転写調節部位に操作的に連 結されるレポーター遺伝子の転写を生じるに十分なものであり、そしてマーカー 遺伝子の発現を検出し、そして他の蛋白質と、このおとり用蛋白質／薬剤複合体 との相互作用の評定を行うのに用いることができる。 この方法の一つの利点は、複数の蛋白質を同時に検査して、薬剤／蛋白質複合 体とのいずれかの相互作用が存在するかどうかを決定することができることがあ る。例えば、ＤＮＡ−結合性ドメインをコードするＤＮＡ断片を、一つのハイブ リッドを提供する目的でおとり用蛋白質をコードするＤＮＡ断片に融合させるこ とができる。このハイブリッドはマーカー遺伝子を保持する細胞内に組込まれ、 そしてそしてその細胞を、おとり用蛋白質と結合することが知られている薬剤に 接触させる。第二ハイブリッドのためには、例えば活性化ドメインをコードする ＤＮＡ配 列に融合される哺乳類の全相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むことがあるプラスミ ドのライブラリーを構築することができる。このライブラリーを第一ハイブリッ ドを保持する細胞内に組込ませる。検査用ライブラリーからのいずれかの個々の プラスミドが薬剤／蛋白質複合体と相互作用することが可能な蛋白質をコードす る場合には、レポーター遺伝子の発現を検出することにより陽性シグナルが取得 されることがある。それに加え、薬剤複合体と新規の蛋白質との間に相互作用が 生じる場合には、この新規に同定された蛋白質のための遺伝子を簡便に取得する ことができる。 本明細書に説明されるように、本相互作用捕獲アッセイは、特別な蛋白質／薬 剤複合体の直ぐ上流もしくは下流に存在する所定のシグナル変換経路の地点で作 用する蛋白質をコードする新規の遺伝子の同定の際の貴重な道具となる。例えば 、表題アッセイを用いてＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体か、もしくはＦＫＢＰ／ ＦＫ５０６複合体か、もしくはシクロフィリン／シクロスポリン複合体の直ぐ下 流の標的を同定することができる。薬剤−依存的様式でそのような複合体の内の 一つと相互作用する蛋白質を同定することができるかもしれず、そしてそれらの 蛋白質は診断的および治療的の上での両方の価値を有するものであり得る。 宿主細胞、好ましくはイースト細胞、最も好ましくはサッカロミセス ケレビ シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）もしくはシゾサ ッカロミセス ポムベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ）内で発現されることが可能な第一キメラ遺伝子が提供される。宿主細胞は転写 活性因子のＤＮＡ−結合性ドメインのための結合性部位を有する検出可能な遺伝 子を含み、その結果、その遺 伝子はマーカー遺伝子が転写的に活性化された際にはマーカー蛋白質を発現する 。このような活性化は、転写活性化因子の転写活性化ドメインが転写活性化因子 のＤＮＡ−結合性ドメインに十分に近接してきた際に生じる。この第一キメラ遺 伝子は宿主細胞の染色体内に存在することがある。この遺伝子は、宿主細胞内の マーカー遺伝子上の結合性部位を認識するＤＮＡ結合性ドメインを含むキメラ蛋 白質、およびおとり用蛋白質（このおとり用蛋白質は第二検査用蛋白質もしくは 蛋白質断片との薬剤媒介性相互作用について検査される予定のものである）をコ ードする。 宿主細胞内で発現されることが可能な第二キメラ遺伝子が提供される。ある態 様では、第一および第二の両キメラ遺伝子がプラスミドの形態で宿主細胞内に取 り込まれる。しかしながら、この第一キメラ遺伝子が宿主細胞の染色体内に存在 し、かつ第二キメラ遺伝子がプラスミドの部分として宿主細胞内に取り込まれる ことが好ましい。第二キメラ遺伝子は、第二ハイブリッド蛋白質をコードするＤ ＮＡ配列を含む。この第二ハイブリッド蛋白質は転写活性化ドメインを含む。こ の第二ハイブリッド蛋白質は更に、第一検査用蛋白質もしくは蛋白質断片との相 互作用について検査される予定の第二検査用蛋白質もしくは蛋白質断片をも含む 。第一ハイブリッド蛋白質のＤＮＡ−結合性ドメインおよび第二ハイブリッド蛋 白質の転写活性化ドメインが、離れて存在するＤＮＡ−結合性ドメインおよび転 写活性化ドメインを有する転写活性化因子に由来することが好ましい。これらの 離れて存在するＤＮＡ−結合性ドメインおよび転写活性性ドメインはイーストＧ ＡＬ４蛋白質内に見いだされることが知られており、かつイーストＧＣＮ４およ びＡＤＲ１蛋白質内にも見いだされることが知られている。転写に関与する多く の他の蛋白質も、離れ て存在する結合性活性化ドメインおよび転写活性化ドメインを有し、そのことに よりそれらの蛋白質は本発明にとって有用なものとなっている。他の態様ではＤ ＮＡ−結合性ドメインおよび転写活性化ドメインは異なる転写活性化因子からの ものであることがあるかもしれない。第二ハイブリッド蛋白質が、転写活性化ド メインをコードするＤＮＡ配列に融合されるゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、もしくは 合成的に作製されたＤＮＡの配列を含むプラスミドのライブラリー上にコードさ れることが好ましい。 従って、宿主細胞内の第一検査用蛋白質と第二検査用蛋白質との間の薬剤媒介 性相互作用により、その転写活性化ドメインが検出可能な遺伝子の転写を活性化 させるようになる。この方法は、第一キメラ遺伝子および第二キメラ遺伝子を宿 主細胞内に組込ませ、そしてその細胞を目的の薬剤と接触させることにより実施 される。宿主細胞は、その第一ハイブリッド蛋白質および第二ハイブリッド蛋白 質が活性化予定の検出可能な遺伝子について十分な量で発現される条件に供され る条件下に供される。その後にこの細胞を、検出可能な遺伝子の薬剤−依存的発 現について検査する。 従って、第一蛋白質と蛋白質のライブラリーとの間の相互作用を、そのライブ ラリーの内のどのメンバーがその第一蛋白質と第二蛋白質との間の薬剤−依存的 複合体の形成に関与するかを決定する目的で、目的の薬剤の存在下での検査を行 うことができる。例えば、おとり役の蛋白質は、ＦＫ５０６、ラパマイシン、も しくはシクロスポリンに結合する蛋白質であることがある（例えば、ＦＫＢＰも しくはシクロフィリンであることができる）。第二検査用蛋白質はｃＤＮＡライ ブラリーに由来することがある。 実施例 本発明は目下のところ一般的に記載されているが、本発明の所定の特徴および 態様の単なる説明の目的のみで包括され、かつ本発明を制約することを意図する のではない以下の実施例を参照することにより本発明が更に容易に理解されるで あろう。 実施例１ 二重ハイブリッドスクリーニングのためのおとり用プラスミドの構築 Ａ． ＬｅｘＡ−ＦＫＢＰ１２おとり： 本薬剤−依存的相互作用捕獲アッセイに用いられるこのおとり用蛋白質および 魚役蛋白質構築物は、本質的には、他の二重ハイブリッドアッセイ（例えば、米 国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃ ｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ ｅｔ ａｌ（１９９３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；お よびＩｗａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１ ６９３−１６９６、を参照されたい）。以下のオリゴヌクレオチド： コーディング鎖 非コーディング鎖 を用いてＰＣＲ増幅をリンパ球ｃＤＮＡライブラリーから実施して、Ｆ ＫＢＰ１２蛋白質のためのコーディング配列を単離した。クローン化されたヒト ＦＫＢＰ１２の配列は： として確認された。 ヒトＦＫＢＰ１２コーディング配列を含む、得られるＰＣＲ産物をその後にＥ ｃｏ ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＢＴＭ１１６のＥｃｏＲＩ＋Ｂａ ｍ ＨＩ部位内にクローン化させてＬｅｘＡおよびＦＫＢＰ１２との間のインフレ ーム融合物を作製した。得られるプラスミドを今後ｐｌＣ５０４として引用する 。 Ｂ． ＬｅｘＡ−（ｇｌｙ）₆−ＦＫＢＰ１２おとり ６つのグリシン残基から離れて存在するＬｅｘＡとＦＫＢＰ１２との間のイン フレーム融合物を作製する目的で、ヒトＦＫＢＰ１２からのコーディング配列を 先の要領でＰＣＲによりクローン化したが、例外はセンスオリゴヌクレオチドに より追加的な１８のオリゴヌクレオチドが提供されることであり、そのれらのオ リゴヌクレオチドには６つのグリシンが融合蛋白質の読み取り枠内に挿入されて いる。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドは： コーディング鎖 非コーディング鎖 であった。 ヒトＦＫＢＰ１２コーディング配列を含むＰＣＲ産物をその後にＥｃｏＲＩお よびＢａｍＨＩで消化し、そして先の要領でｐＢＴＭ１１６のＥｃｏＲＩ＋Ｂａ ｍ ＨＩ部位内にクローン化させた。得られるプラスミドをこれ以降、ｐＩＣ５０ ６として引用する。 実施例２ ＦＫＢＰ１２欠損株の構築 ＦＫＢ１（ＦＫＢＰ１２のＳ．ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 相同体）を含む１．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩイーストゲノム断片を ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のＨｉｎｄＩＩＩ＋ＥｃｏＲＩ内にクローン化 した。 一段回ＰＣＲ手法を用いて、ＡＴＧ開始コドンからＴＧＡ停止コドンにまで伸 展するＦＫＢ１コーディング配列の厳密な欠損を作製した。同時に非反復のＢａ ｍ ＨＩ部位をＦＫＢ１コーディング配列の代わりに導入した。ＦＫＢ１欠損の作 製および非反復のＨｉｎｄＨＩ部位の導入に用いたオリゴヌクレオチドは： であった。 その後に３．６ｋｂのＢａｍＨＩ断片上のイーストＡＤＥ２遺伝子を先に記載 されるプラスミドの非反復ＢａｍＨＩ部位内にクローン化させてプラスミドｐＶ Ｂ１７２を作製した。ＸｈｏＩ部位が、ＦＫＢ１の５’および３’非コーディン グ配列内のｐＶＢ１７２のＡＤＥ２破壊マーカーをフランクしている。ｐＶＢ１ ７２をＸｈｏＩで消化させて、ＦＫＢ１非コーディング配列によりフランクされ るＡＤＥ２を含む直線配列を放出させた。この直線配列を用いてイースト株Ｌ４ ０（Ｍａｔ ａ ｈｉｓ３ Δ２００ ｔｒｐｌ−９０１ ｌｅｕ２−３．１１ ２ ａｄｅ２ ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｐｏ）４−ＨＩＳ３ ＵＲＡ３：：（ｌ ｅｘＡｏｐ）₈−ＬａｃＺ ＧＡＬ４ ｇａｌ８０）を形質転換させて、アデニ ン原栄養性についての選択にかけた。 ＡＤＥ＋イースト形質転換体をラパマイシン耐性について検査して、野生型Ｆ ＫＢ１対立遺伝子がＡＤＥ２に置き換わっていることを確認した。ＦＫＢ１のこ の破壊対立遺伝子はＬ４０−ＦＫＢＬ−２と表示される。 実施例３ 哺乳類ラパマイシン標的遺伝子のクローニング 我々は先の実施例１に記載される薬剤−依存的相互作用捕獲アッセイを、おと りとしてのＬｅｘＡ結合性−ドメイン融合構築物と共に用いて、ＶＰ１６活性化 −ドメイン融合物を含むｃＤＮＡライブラリーからのクローンとの相互作用を検 出した。この系内での「読みだし」シグナル伝達相互作用として用いられるレポ ーターは、Ｓ． ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＩＳ３および 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＬａｃＺ遺伝子である。ベクターｐＶＰ１６中のイー スト株Ｌ４０、おと り用ベクタープラスミドｐＢＴＭ１１６、およびマウス胎仔ＰＣＲライブラリー を用いてｃＤＮＡ融合蛋白質ライブラリーを構築した。 先の実施例２に記載される株Ｌ４０−ｆｋｂ１−２を、２つのおとり用プラス ミドの各々、すなわちｐｌＣ５０４(ＬｅｘＡ−ＦＫＢＰ１２融合蛋白質をコー ドする)もしくはｐｌＣ５０６(ＬｅｘＡ−(ｇｌｙ)₆−ＦＫＢＰ１２融合蛋白質 をコードする)で形質転換させた。形質転換体Ｌ４０−ｆｋｂ１−２／ｐＩＣ５ ０４（ＩＣＹ９９と称される）およびＬ４０−ｆｋｂ１−２／ｐＩＣ５０６（Ｉ ＣＹ１０１と称される）をトリプトファンを欠損するイースト培地上で維持した （その培地により、そのおとり用プラスミドを保持する細胞についての選択が行 われる）。 性交後１０．５日目のＣＤ１マウス胎仔のポリＡ＋ＲＮＡのランダム−プライ ム合成を用いる標準的プロトコールにより作製され、かつ３５０ｂｐと７００ｂ ｐとの間の長さの挿入断片についてサイズ選択してある、ｐＶＰ１６（ｐＳＨ１ ０．５と表示される）中のマウス胎仔ＰＣＲライブラリーを用いてイーストＩＣ Ｙ９９およびＩＣＹ１０１を形質転換させた。この形質転換化イースト細胞を、 トリプトファンおよびロイシンを含まない培地でプレート培養した。各株からの 約１０⁷の形質転換体を合わせ、完全に混合させ、そして−８０℃下で５０％グ リセロール中の水溶液として凍結保存した。 スクリーニングの前に細胞を解凍し、液体培地中で５時間成長させ、そして選 択的培地上でプレート培養した。約１．５×１０⁷のＩＣＹ９９／ｐＳＨ１０． ５を、（ｉ）トリプトファン、ロイシン、およびヒスチジンを除く全アミノ酸、 （ｉｉ）１２５ｎｇ／ｍｌのラパマイシン、（ｉｉｉ）１００ｎｇ／ｍｌの色素 産生性基質Ｘ−ｇａｌ、ならびに （ｉｖ）炭素源としての２％グルコースを含むリン酸緩衝化（ｐＨ７）合成アガ ー培地上に、１５ｃｍのプレート当たり約１０⁶のプレート培養密度でプレート 培養した。低めのラパマイシン濃度（１５．６ｎｇ／ｍｌ）を用いたことを例外 としては同一のプロトコールを、ＩＣＹ１０１／ｐＳＨ１０．５形質転換体のス クリーニングのために用いた。 選択培地上で成長し、かつ青色を示すことの両者を行うコロニーを更に詳細な 検査用に拾いあげた。これらは成長のためにヒスチジンを必要とはせず、かつβ −ガラクトシダーゼレポーターを発現している細胞を意味する。候補となるコロ ニーはプレート培養後４〜１１日の間に出現し、そして青色の範囲は、非常に薄 い青色から暗い青色の範囲にまでわたっていた。その後にこれらのコロニーを後 続の検査に供した。 ｉ）ラパマイシン−依存性 各候補物を、ヒスチジンを含まず、かつ１２５ｎｇ／ｍｌ（ＩＣＹ９９／ｐＳ Ｈ１０．５候補物について）、１５．６ｎｇ／ｍｌ（ＩＣＹ１０１／ｐＳＨ１０ ．５候補物について）のいずれかのラパマイシンを含むか、もしくはラパマイシ ンを含まない（両候補物について）培地上に線状塗布した。ラパマイシンの存在 下で成長し、かつラパマイシンを含まない培地上では成長しない候補クローンを 次の検査用に選択した。 ＩＣＹ９９／ｐＳＨ１０．５のスクリーニングについては、ヒスチジンを含ま ない培地上での増殖についてのスクリーニングにかけた１０７のＨｉｓ＋および ＬａｃＺ＋候補物の内の２４がラパマイシン−依存性であった。ＩＣＹ１０１／ ｐＳＨ１０．５については、スクリーニングにかけた１０１のＨｉｓ＋およびＬ ａｃＺ＋候補物の内の２０がラパマイシン−依存性であった。 ｉｉ）プラスミド−関連作用 染色体突然変異により生じる偽陽性物を除去するために、各候補物を非選択的 培地（ＹＰＤ）中で成長させて、おとり（Ｔｒｐ＋＋）およびｃＤＮＡ（Ｌｅｕ ＋）プラスミドの喪失を可能にさせた。おとり用プラスミド（Ｔｒｐ−）、ｃＤ ＮＡ（Ｌｅｕ−）プラスミド、もしくはその両プラスミド（Ｔｒｐ−およびＬｅ ｕ−）を喪失している細胞、ならびに両プラスミドを保持している細胞（Ｔｒｐ ＋およびＬｅｕ＋）を、ラパマイシンは含むがヒスチジンは含まない培地上に線 条塗布した。両プラスミドを含む誘導体のみについての候補物（Ｔｒｐ＋および Ｌｅｕ＋）は成長する一方で、他の３つの誘導体は成長を示さず、先の候補物を 更に詳細な分析のために選択した。 ＩＣＹ９９／ｐＳＨ１０．５のスクリーニングについては２４の内の２３が検 査で陽性と認められた。ＩＣＹ１０１／ｐＳＨ１０．５のスクリーニングについ ては２０全てが検査で陽性と認められた。 ｉｉｉ）対照のおとりとの陽性および陰性相互作用 従来の検査が、相互作用（おとり用構築物と魚役構築物）のいずれかもしくは 両方のメンバーが喪失された際に、その相互作用が消失するかどうかを問題にし ていたのに対し、本検査は候補ｃＤＮＡプラスミド（＋Ｌｅｕ）が、様々なおと りを保持するイースト株内に形質転換された際に相互作用を生じさせることがで きるかどうかを問題にしている。ＤＮＡ試料を各候補物から調製し、そしてそれ を用いて大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株Ｂ２９０（トリプトファンおよびロイシン についての両栄養性）を形質転換させた。イーストＴＲＰ１およびＬＥＵ２遺伝 子が各々その細菌の両栄養性を補うことができるため、おとり用プラスミドを含 むＢ ２９０細胞はＴｒｐ＋となり、かつトリプトファンを含まない培地上で成長する ことができる一方で、ｃＤＮＡプラスミドを含むＢ２９０細胞はＬｅｕ＋となり 、かつロイシンを含まない培地中で成長することができる。プラスミドＤＮＡ試 料は各々以下の様々なおとりを含み、それらは：ｉ）ＩＣＹ９９（スクリーニン グに用いられるもともとの株であって、ＬｅｘＡ：：ＦＫＢＰ１２おとり用融合 物を含む）；ｉｉ）ＩＣＹ１０１（ＬｅｘＡ：：（ｇｌｙ）₆：：ＦＫＢＰ１２ おとり用融合物を含む）；およびｉｉｉ）ＩＣＹ１０２（本調査には無関係であ り、かつ陰性対照として作用するＬｅｘＡ融合物おとりを含む）、であった。理 想的な候補物は、ラパマイシン−依存的様式でＩＣＹ９９およびＩＣＹ１０１に Ｈｉｓ＋およびＬａｃＺ＋を付与するが、ＩＣＹ１０２にはそのような付与は行 わないはずである。 ＩＣＹ９９／ｐＳＨ１０．５のスクリーニングについては２３候補物の内の１ １が既述の基準を満たした。ＩＣＹ１０１／ｐＳＨ１０．５のスクリーニングに ついては２０の候補物の内の１０が既述の基準を満たした。 これらの候補物クローンのｃＤＮＡ挿入断片については、ＡＢＩ蛍光配列決定 系を用いて両方の鎖での配列決定を行った。ＩＣＹ９９／ｐＳＨ１０．５のスク リーニングからの全１１の候補物および、ＩＣＹ１０１／ｐＳＨ１０．５のスク リーニングからの１０の候補物の内の少なくとも４つが同一配列の重複性断片を 含む。これらの１４のクローンは、各クローンの挿入断片／ベクター境界により 判定したところ、ライブラリーからの少なくとも５回の独立したクローニング現 象を表している。最長挿入断片と最短挿入断片とはアミノ末端で約７０ｂｐの差 があり、 そしてアミノ末端では約１０ｂｐの差がある。マウスのラパマイシン／ＦＫＢＰ １２結合性蛋白質（ＲＡＰＴ１）から単離された部分的ヌクレオチド配列および 対応するアミノ酸配列が配列番号１および配列番号２にそれぞれ示されている。 驚くべきことに、プログラムＢＬＡＳＴを用いるＧｅｎＢａｎｋデータベース の検索により、先の配列によりコードされるペプチドはイーストから既に単離さ れているＳ．ケレビシアエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＯＲ１（および ＤＲＲ１）、ならびにＴＯＲ２遺伝子産物に対して、６０を下回るパーセントの 絶対的相同性ではあるものの、幾分かの相同性を共有することが判明した。 実施例４ ラパマイシン標的遺伝子のヒト相同物のクローニング マウスライブラリーからラパマイシン−標的−蛋白質をコードする遺伝子のた めの部分的配列を単離したことで、我々はプローブとしてそのマウス配列を用い てヒト遺伝子を単離する作業に取りかかった。ＲＡＰＴ１クローンの最長挿入断 片を含むプラスミドクローンｐＩＣ９９．１．５をハイブリダイゼーション用の プローブとして選択した。この挿入断片（５００ｂｐ）はＮｏｔＩ制限エンドヌ クレアーゼでの消化、ならびにその後のアガロースゲル電気泳動および断片精製 によりプラスミドＤＮＡから分離された。この断片を、ＤＮＡポリメラーゼのク レノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片を用いるランダム取り込みによりα−Ｐ³²−放射ラ ベル化ｄＤＮＡで放射ラベル化した。放射ラベル化ＤＮＡプローブをＧ５０カラ ムにより遊離ヌクレオチドから単離し、アルカリ性変性させ、そして２×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌでハイブリダイゼーションミックスに添加 した。 λ−ｐＡＣＴ中のヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーの約３×１０⁶ファージ（ 図１）を、既述のプローブを用いる、３０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デ ンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔｓ）、２０μｇ／ｍｌの変性化サケ精子ＤＮＡ 、および１％ＳＤＳ中、３７℃下でのフィルターハイブリダイゼーションにより スクリーニングした。ハイブリダイゼーション後にそのフィルターを、０．５× ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、５０℃下で洗浄した。これらはマウス対ヒトの交 差種ハイブリダイゼーションに適切な培地緊縮性の条件を表す。多数の陽性クロ ーンが取得され、そして幾つかを分析した。多数の単離されたクローンは同一遺 伝子あるいは非常に密接に関与する遺伝子の様々な３’断片であることが判明し 、そしてこの遺伝子は配列分析後に、ヒトＲＡＰＴ１遺伝子であることが決定さ れた。最長のコーディング配列断片を含むクローンは、全長蛋白質の大まかな半 分（Ｃ−末端）と考えられるものを含み、かつＦＫＢＰ／ラパマイシン結合性部 位および仮想的ＰＩ−キナーゼ活性を含み、このクローンはプラスミドｐＩＣ５ ２４として表示される。ｐＩＣ５２４からのｐＡＣＴプラスミドの寄託は、ｔｈ ｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒ ｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）において１９９４年５月２７日に、ブダペスト条約（ Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ）の基に実施された。その寄託物はＡＴＣＣ受 託番号７５７８となった。 図１はｐＩＣ５２４のヒトＲＡＰＴ１クローン（ＸｈｏＩ部位での挿入）のマ ップである。この挿入断片は長さが約３．７４ｋｂあり、そしてその挿入断片か らのヌクレオチドＲＡＰＴ１コーディング配列が既に 取得され、かつ配列番号１１のヌクレオチド残基４７１７−７７４６により表さ れる。対応するアミノ酸配列は配列番号１２のＨｉｓ１５４１−Ｔｒｐ２５４９ により表される。マウスＲＡＰＴ１断片に相当するヒトＲＡＰＴ１クローンの領 域は、アミノ酸レベルでは９５％を上回る相同性を示し、そしてヌクレオチドレ ベルでは９０％の相同性を示す。ｐＩＣ５２４クローンに加え、ヒトＲＡＰＴ１ 遺伝子の更に別の５’配列が他の重複性クローンから取得され、約５．４ｋｂの 部分的遺伝子の３’末端の配列が配列番号１１に示されている。それに加え、配 列番号１９により、ＲＡＰＴ１コーディング配列をフランクする追加的３’非コ ーディング配列（他のクローンから取得された）が提供される。 本配列情報が与えられるとすると、ｐＩＣ５２４中に提供されるＲＡＰＴ１遺 伝子配列の全部もしくは所定の断片を増幅するためのＰＣＲプライマーを設計す ることができることは当業者に明白であろう。例えば、プライマーＴＧＡＡＧＡ ＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＣ（配列番号２１）およびＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧ ＡＡＧＴＧＡＡＣ（配列番号２２）はＸｈｏＩ部位をフランクするｐＡＣＴ配列 に相当し、そしてこれらのプライマーを用いてｐＩＣ５２４から全ＲＡＰＴ１配 列をＰＣＲ増幅することができる。別法では、配列番号１１の核酸配列に基づく プライマーを用いてｐＩＣ５２４内のＲＡＰＴ１遺伝子の断片を増幅することが できる。その後にＰＣＲプライマーを発現ベクター内にサブクローン化し、そし てそれを用いて表題ＲＡＰＴ１蛋白質の組換え形態を産生することができる。従 って本方法により、ＡＴＣＣ受託番号７５７８７からのＲＡＰＴ１ヌクレオチド 配列を含む組換え遺伝子によりコードされる組換えＲＡＰＴ１蛋白質が提供され る。それに加え、既知の配列に基づくＰ ＣＲプライマーを単純に提供することにより、配列決定が未だに行われていない ｐＩＣ５２４の部分さえも含むプライマー／プローブを作製することができるこ とは明白である。 その上、我々の初期データにより、ＲＡＰＴ１に関連する他の蛋白質（例えば 、ＲＡＰＴ１相同体）も本アッセイから取得することができることが示され、こ のことによりＲＡＰＴ１が関連する蛋白質の巨大ファミリーの内の一メンバーで あることが示唆される。 実施例５ 新規のヒトユビキチン複合体形成性酵素のクローニング 薬剤−依存性相互作用捕獲アッセイについて既述されるものに類似の構築物を 用いてｐＧＡＤＧＨ（ＸｈｏＩ挿入断片、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）内のＷＩ３８ （Ｇ₀期および分裂性繊維芽細胞の混合物）のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎ ｅｔｅｃｈ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）をスクリーニングした。簡潔に述べ ると、二重ハイブリッドアッセイを既述の要領で、ＬｅｘＡの代わりにＧＡＬ４ 構築物を用い、そしてＦＫＢ１遺伝子が破壊されたＨＦ７Ｃイースト細胞（Ｃｌ ｏｎｅｔｅｃｈ社）内で実施した。単離されたクローンの内、新規のヒトユビキ チン−複合体形成性酵素（ｒａｐ−ＵＢＣ）が同定された。ｐＧＡＤＧＨプラス ミド（クローン「ＳＭＲ４−１５」）の寄託は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ） において１９９４年５月２７日に、ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ Ｔｒｅ ａｔｙ）の基に実施された。その寄託物はＡＴＣＣ受託番号７５７８６となった 。この挿入断片は約１ｋＢである。 ＳＭＲ４−１５挿入断片の配列ＵＢＣ−コーディング部分が配列番号 ２３（ヌクレオチド）および配列番号２４（アミノ酸）により示される。このク ローンの３’部分のための配列が配列番号２５により提供される。先に示される ように、配列番号２３（および２５）の核酸配列に基づくプライマーを用いてＳ ＭＲ４−１５からｒａｐ−ＵＢＣ遺伝子の断片を増幅することができる。その後 にＰＣＲプライマーを発現ベクター内にサブクローン化し、そしてそれを用いて 表題蛋白質の組換え形態を産生することができる。従って、本方法により、ＡＴ ＣＣ受託番号７５７８６からのｒａｐ−ＵＢＣヌクレオチド配列を含む組換え遺 伝子によりコードされる組換えｒａｐ−ＵＢＣ蛋白質が提供される。 実施例６ セリンからアルギニンへのＲＡＰＴ１突然変異体の構築 ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体と相互作用を行う最小のｍＲＡＰＴ１クロ ーンは３９９ｂｐであり、このクローンがラパマイシン結合性ドメインを特定す る。ＲＡＰＴ１結合性ドメインは脂質キナーゼ共通配列の直ぐ上流ではあるがそ の配列の外側に位置するイーストＴＯＲ１／ＴＯＲ２内の領域に相当する。この 領域は、イーストＴＯＲ内で突然変異を生じる際にはラパマイシンに対する耐性 を付与するセリン残基を含む（Ｃａｆｆｅｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：６０１２−６０２３）。マウスおよびヒ トの両方のＲＡＰＴ１のセリンからアルギニンへの突然変異体をオリゴヌクレオ チド突然変異誘発により作製した。ｍＲＡＰＴ１突然変異体の事例では、突然変 異を含むコーディングおよび非コーディング鎖オリゴヌクレオチドは：ＧＡＡＧ ＡＧＧＣＡＡＧＡＣＧＣＴＴＧＴＡＣ（配列番号２６）およびＧＴＡＣＡＡＧＣ ＧＴＣＴＴＧＣＣＴＣＴＴＣ（配列番号２７） であった。ＰＣＲ反応を、これらのオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドＧ ＡＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＧＴＴＴＡ（配列番号２８）およびＭ１３万能プラ イマー（これらは各々、ｐＶＰ１６ベクター、ｍＲＡＰＴ１挿入断片の５’およ び３’内の配列である）と組み合わせて用いて実施した。ｍＲＡＰ１を含むｐＶ Ｐ１６をＰＣＲ用の鋳型として用いた。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化させ たこのＰＣＲ断片をｐＶＰ１６内のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位内にクロー ン化した。得られるクローンの配列決定を行って、そのクローンがセリンからア ルギニンへの突然変異を含み、かつ他の突然変異は含まないことを確認した。 ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体と相互作用を行う最小のｍＲＡＰＴ１クロ ーンは３９９ｂｐであり、このクローンがＲＡＰＴ１結合性ドメインを特定する 。このＲＡＰＴ１結合性ドメインは脂質キナーゼ共通配列の直ぐ上流であるがそ の配列の外側に位置するイーストＴＯＲ内の領域に相当する。この領域は、イー ストＴＯＲ１（ＤＲＲ１とも称される）内で突然変異を生じる際にはラパマイシ ンに対する耐性を付与するセリン残基を含む（Ｃａｆｆｅｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ ．（１９９３） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３：６０１２−６０２３； Ｈｅｌｌｉｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９４） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ． ５：１０５−１１８）。対応する突然変異体をｍＲＡＰＴ１内に構築した。 セリンからアルギニンへの突然変異により、ＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体 とのｍＲＡＰＴ１の相互作用が解除され（図３を参照されたい）、二重ハイブリ ッドアッセイにおけるＨＩＳ３もしくはＬａｃＺのいずれの発現も活性化されず 、このことによりセリンがｍＲＡＰＴ１とのＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体 の結合に関与することが示さ れる。 実施例７ ノザン分析 複数組織用のノザンブロット（レーン当たりに２μｇのヒトＲＮＡを含む）を Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ．、Ｉｎｃ．社から取得した。ハイブリダイゼー ションは、４２℃下、５×ＳＳＰＥ、５×デンンハート溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ ’ｓ）、３０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、および２００μｇ／ｍｌの変性化サ ケ精子ＤＮＡ中で実施した。洗浄は、５５℃下、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中で実施した。このブロットをオートラジオグラフィーにかける前に５ 日間露出させた。各レーンにかけられたＲＮＡのレベルをヒトＧ３ＰＤＨプロー ブで同一ブロットをハイブリダイズすることにより独立にモニターし、そしてそ のレベルを骨格筋を例外として（これは約２〜３０％倍のシグナルを示した）全 レーンで類似することが見いだされた。 ＲＡＰＴ１は調査した全組織中に存在する約９ｋｂの単一転写物を特定し、睾 丸で最高レベルを示した。この転写物はイーストＴＯＲのサイズ（これは２８４ ｋＤａである）に等しい蛋白質をコードするのに十分である。ＲＡＰＴ１がより 小さいサイズのものであると仮定して、１３３アミノ酸の小断片が大きな蛋白質 内から既にクローン化されているが、この断片はＦＫＢＰ１２／ラパマイシン複 合体を結合するのに十分なものである。 実施例８ 新規のラパマイシンアナログを同定するための二重ハイブリッド系に基づく高処 理量アッセイ 二重ハイブリッド系に基づく高処理量スクリーニング法を開発するために、我 々は小分子により媒介される蛋白質−蛋白質相互作用を定量化するための方法を 考案した。二重ハイブリッド系内での蛋白質−蛋白質相互作用がｌａｃＺレポー ター遺伝子の転写を刺激化するため、このアッセイは、開裂を受けた際には定量 化することができる化学ルミネセントシグナルを産生するβ−ガラクトシダーゼ （ｌａｃＺ遺伝子産物）の基質を利用する。このアッセイはマイクロタイタープ レート内で実施することができ、このことにより一週間当たり数千の化合物をス クリーニングすることが可能となる。このアッセイは以下の段階を含む： １． 単一コロニーから５０ｍｌの増殖用培地、すなわちロイシンおよびトリプ トファンを含まない合成完全培地（Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．（１９９１） Ｍｅｔ ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：３−２０）内へイースト細胞を接種されよ 。そのフラスコを一晩、３０℃下で、震盪しながらインキュベートされよ（〜２ ００ｒｐｍ）。 ２． 増殖培地中で最終Ａ₆₀₀が０．０２になるまでそのオーバーナイト培養物 を希釈し、そして段階１に記載される要領で一晩インキュベートされよ。 ３． 増殖培地中で最終Ａ₆₀₀が０．０５になるまでその第二オーバーナイト培 養物を希釈されよ。Ｑｕａｄｒａ９６ピペッター（ＴｏｍＴｅｃ．Ｉｎｃ社）を 用いて、その細胞懸濁物の１３５μｌアリコートを、様々な濃度での検査予定の 化合物（１５μｌ／ウエル）を予め充填してある丸底マイクロタイタープレート のウエル内に分配されよ。（これらの化合物は５％のジメチルスルホキシド内に 溶解され、そのため細胞に添加される最終ＤＭＳＯ濃度は０．５％となり、この 濃度はイースト細 胞の成長を不安定にさせることはない）。マイクロタイタープレートに蓋をかぶ せ、そして３０℃下で４時間、３００ｒｐｍで震盪させながらインキュベートさ れよ。 ４． マイクロタイタープレートを１０分間、２０００ｒｐｍで遠心されよ。上 清をＱｕａｄｒａ９６ピペッターで除去し、そして２２５μｌのリン酸緩衝化食 塩水で洗浄されよ。 ５． １００μｌの溶解用緩衝液（１００ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ｐＨ７．８；０ ．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００；１．０ｍＭ ジチオスレイトール）を各ウ エル内に分配し、蓋をかぶせ、そして室温で３０分間、３００ｒｐｍで震盪させ ながらインキュベートされよ。 ６． Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ社、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）の各ウエル内に希釈液（１００ｍＭ Ｎ ａ₂ＨＰＯ₄、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ８．０）中の５０μｌの化学ルミネセン ス基質Ｇａｌａｃｔｏｎ Ｐｌｕｓ（商標）（Ｔｒｉｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．社、Ｂ ｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を分配されよ。これらのウエルに２０μｌの細胞溶解物を 移し入れ、そして暗所で６０分間、室温でインキュベートされよ。 ７． 各ウエルに７５μｌのＥｍｅｒａｌ（商標）促進剤を添加されよ。プレー トに蓋をかぶせ、そしてＴｏｐｃｏｕｎｔシンチレーション計測器（Ｐａｃｋａ ｒｄ，Ｉｎｃ．社）内で０．０１分／ウエル間計数されよ。 既述の要領で単離されるラパマイシン標的蛋白質をその定量用アッセイに取り 込ませ、そして様々なＦＫＢＰも同様にそのアッセイに取り込ませた。スクリー ニング作業に含まれるＦＫＢＰはヒトＦＫＢＰ１２、 ならびに病原性真菌類ＦＫＢＰ１３（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８：６６７７）およびＦＫＢＰ２５（ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６７：２９ ４２；Ｇａｌａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２） Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：２４２ ７−２４３４）からのＦＫＢＰであった。様々なＦＫＢＰ−標的対を含むイース ト株をラパマイシンおよびＦＫ５０６アナログのライブラリーに対して検査する ことができる。このようなスクリーニングにより、（ｉ）特異的標的と一つを上 回るＦＫＢＰとの間の相互作用を媒介する標的特異的化合物、（ｉｉ）特別なＦ ＫＢＰと一つを上回る標的との間の相互作用を媒介するＦＫＢＰ−特異的化合物 、および最も理想的には（ｉｉｉ）特別なＦＫＢＰと標的との間の相互作用を媒 介するＦＫＢＰ／標的−特異的化合物、を初めとする様々なクラスの化合物を生 じることができる。検査用化合物により媒介され、そしてこのアッセイにおいて 測定される蛋白質相互作用は免疫抑制性特性、抗−真菌性特性、抗−増殖性特性 、および毒性特性、ならびにＦＫＢＰ ＰＰＩａｓｅ活性の阻害についてのＫｉ 値と相関し得る。 既述の定量的化学ルミネセンスアッセイを用いてヒトＬｅｘＡ−ＦＫＢＰ１２ およびＶＰ１６−ＲＡＰＴ１の相互作用をラパマイシンの存在および非存在下で 分析した。ＦＫＢＰ１２とＲＡＰＴ１との間の相互作用を薬剤濃度の関数として 測定した。０〜５００ｎｇ／ｍｌのラパマイシンの添加によりβ−ガラクトシダ ーゼ活性が約千倍増加した。この効果はラパマイシンに特異的であり；同一の濃 度範囲にわたるＦＫ５０６はバックグラウンドレベルと比較して顕著にはβ−ガ ラクトシダーゼ活性を増加させはしなかった。ｌｅｘＡ−ｄａ（対照構築物）を ｌｅｘＡ −ＦＫＢＰ１２に置き換える場合には、β−ガラクトシダーゼ活性はラパマイシ ン添加の関数としては上昇しない。陰性対照でのβ−ガラクトシダーゼの基本レ ベルは、ＦＫＢＰ１２およびＲＡＰＴ１構築物を含むイースト株（これは、５０ ０ｎｇ／ｍｌのラパマイシンを含む培地中で成長させた）中で検出される最大レ ベルの０．１パーセントとなる。図２に説明されるこれらの結果により、二重ハ イブリッド系内で小分子により媒介される蛋白質相互作用を、高処理量スクリー ニングに利用することができるマイクロタイターフォーマット内で定量化および アッセイすることができることが示される。この二重ハイブリッドフォーマット 内で様々なＦＫＢＰおよびＲＡＰＴ１蛋白質を利用することで（図３）ラパマイ シンにより媒介される相互作用をこの定量アッセイにおいて測定した。 実施例９ ラパマイシンにより媒介されるインビトロ蛋白質相互作用 ＦＫ５０６−結合性蛋白質およびＲＡＰＴ１蛋白質の薬剤媒介性相互作用はグ ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合された精製化ＦＫＢＰ１ ２、ならびにインビトロでの転写および翻訳により調製された³⁵Ｓ−ラベル化Ｒ ＡＰＴ１蛋白質を用いてインビトロで分析される。この目的のためにはＦＫＢＰ １２をｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）中のＧ ＳＴの枠内に融合させる。ＧＳＴ−ＦＫＢＰ１２融合蛋白質は大腸菌（Ｅ． ｃ ｏｌｉ ）から発現および精製される（Ｖｏｊｔｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｃｅｌｌ ７４：２０５−２１４）。ＲＡＰＴ１コーディング配列は哺乳類発 現ベクターｐＸ（Ｓｕｐｅｒｔｉ−Ｆｕｒｇａ ｅｔ ａｌ．（１９９ １） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｓ． １５１：２３７−２４４）中のＣＭ ＶおよびＴ７プロモーターの後ろにクローン化される。ＲＡＰＴ１配列はＴ７プ ロモーターから転写され、そして³⁵Ｓ−メチオニンを含む反応物で商品として入 手可能な試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いてインビトロ で転写される。インビトロ結合のためには（Ｔｏｙｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｃｅｌｌ ７８：６７−７４）、５〜２０μｌのインビトロ転写 ／翻訳反応物が２００μｌの結合用緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．４ ］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、０．０５％ ＮＰ−４０） に添加される。グルタチオン−アガロースビーズに連結された１０μｌのＧＳＴ −ＦＫＢＰ１２の添加後に、この反応物を４℃で２時間、回転させながらインキ ュベートする。様々な濃度の薬剤を、例えば、モルを基準にするとＦＫＢＰ１２ のモル濃度の０．１〜１０倍で反応物に添加する。対照用反応物には薬剤は全く 添加しない。その後にこれらのアガロースビーズを沈殿させ、そして結合用緩衝 液で４回洗浄する。結合した蛋白質をレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料用緩衝液中 で沸騰させることにより単離し、４〜２０％の密度勾配ＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル上で分離させ、そしてオートラジオグラフィーにより可視化させる。薬剤 を含む結合性反応物からの³⁵Ｓ−ラベル化ＲＡＰＴ１蛋白質の検出により、薬剤 の関数としてＦＫＢＰ１２に対する直接結合が証明される。 実施例１０ 複合体形成およびラパマイシン感受性についてのＲＡＰＴ１突然変異の影響 ＲＡＰＴ１のラパマイシン−結合性ドメインを一層具体的にマッピン グするためには、ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合しない突然変異体の単離 が必要である。先の実施例に記載されるように、ＦＫＢＰ／ラパマイシンとの結 合を、ＦＫＢＰ１２がＬｅｘＡへの融合物として発現され、かつＲＡＰＴ１蛋白 質がＶＰ１６活性化ドメインへの融合物として発現されるＬｅｘＡ二重ハイブリ ッド系内で検査することができる。従って突然変異体ＲＡＰＴ１蛋白質のライブ ラリーが、ＰＣＲにより作製されるランダム突然変異誘発を通すコーディング配 列の突然変異により作製される（Ｃａｄｗｅｌｌ ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ（１９９ ２） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２：２８−３３）。ＰＣＲのための ５’および３’オリゴヌクレオチドは各々ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位 を含み、これらの制限部位によりその後のＰＣＲ産物のｐＶＰ１６のクローニン グが可能となり、そのことによりインフレーム融合物が作製される。それに加え 、３’オリゴヌクレオチドは２７ｂｐのＨＡエピトープ配列およびその後に続く インフレーム停止コドンを含む。この融合蛋白質のＣ−末端へのＨＡエピトープ 標識の添加により、突然変異体ＲＡＰＴ１蛋白質の特徴決定が可能となる（下記 を参照されたい）。 突然変異誘発を完結させる際に、ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化させたＰＣＲ産 物をｐＶＰ１６内に挿入する。突然変異体ＲＡＰＴ１蛋白質のライブラリーを大 腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）内への形質転換により増幅させる。ＦＫＢＰ／ラパマイ シン複合体と相互作用するＲＡＰＴ１の能力を損なっているこれらの突然変異体 を同定するために、突然変異誘発させたＲＡＰＴ１ライブラリーを、ＬｅｘＡ− ＦＫＢＰおとり用蛋白質を含むイースト株内に組込ませる。各形質転換化細胞は 、転写活性化因子ＶＰ１６に融合された個々の一つの突然変異体ＲＡＰＴ１を保 持する。 ＦＫＢＰと野生型ＲＡＰＴ１との間の相互作用は、その細胞がラパマイシンを含 む培地中で成長する際に生じ、その相互作用によりｌａｃＺ発現が誘導され、そ してＸ−ＧＡＬインディケータープレート上でコロニーが青色に変化する。ＦＫ ＢＰ／ラパマイシン複合体とＲＡＰＴ１突然変異体との間の相互作用が損なわれ ているコロニーは、明青色もしくは白色となる。２種類の突然変異体がこの表現 型を生じることができ：それらはすなわち、ＲＡＰＴ１の切断異形をもたらすナ ンセンス突然変異体、もしくはＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体へのＲＡＰＴ１の 結合性に影響を及ぼすセンス突然変異体である。これら２種類の突然変異体の間 を識別するためには、これらのコロニーから作製された全蛋白質抽出物を抗−Ｈ Ａ抗体を用いるウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）ブロット分析に供する。より短め で切断された蛋白質を生じるナンセンス突然変異体はそれらのＣ−末端にＨＡエ ピトープは含まず、つまり抗−ＨＡ抗体によっては検出されない。それとは逆に 、センス突然変異を取り込んでいる全長蛋白質はこの抗体で検出される。 ＨＡエピトープを保持する全長ＲＡＰＴ１蛋白質を発現する明青色もしくは白 色のコロニーからのライブラリープラスミドは、大腸菌（（Ｅ． ｃｏｌｉ）内 への形質転換により救済される。この突然変異の位置を配列分析により決定し、 そして表現型を、ＬｅｘＡ−ＦＫＢＰ１２を含むイースト株内へこれらのプラス ミドを戻す再形質転換により確認する。 再検査を通過した突然変異体を哺乳類発現ベクターｐＸ内にクローン化するこ とができる。その後にｐＸ−ＲＡＰＴ１もしくはｐＸ欠損性ＲＡＰＴ１配列を、 ラパマイシンに対する感受性を示すリンパ球系（ＣＴＬＬおよびＫｉｔ２２５） および非リンパ球系（ＭＧ６３およびＲＨ３ ０）の細胞内に導入する。ラパマイシン感受性に対するこの突然変異の効果を、 ＢｒｄＵ取り込みによりモニターされるＤＮＡ合成の阻害に関して測定する。Ｆ ＫＢＰ１２／ラパマイシン複合体に結合することが不可能であることによるラパ マイシンの耐性を付与する突然変異体により、そのような突然変異がリンパ球系 および非リンパ球系の細胞内での薬剤感受性を媒介することが示される。異なる ＲＡＰＴ１が異なるタイプの細胞内での薬剤耐性を媒介するかどうかが特に興味 の対照となるところである。 実施例１１ カンジダ アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）からのＲＡＰＴ １−様ポリペプチドのクローニング ヒト病原体カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）からＲＡＰＴ１遺伝子の相同体をクロ ーン化する目的で、ＲＡＰＴ１およびＴＯＲ蛋白質の保存化領域に基づく縮重オ リゴヌクレオチドを設計し、そしてこれを使用してλＺＡＰ（株３１３５Ａ）内 でＣ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ） ｃＤＮＡを増幅した。この増 幅作業は、９４℃下１分間、５５℃下１分間、および７２℃下１分間の３０周期 分からできており、ＰＣＲアンプリマーＧＧＮＡＡＲＧＣＮＣＡＹＣＣＮＣＡＲ ＧＣおよびＡＴＮＧＣＮＧＧＲＴＡＹＴＧＹＴＧＤＡＴＮＴＣを用いた。このＰ ＣＲ反応物を２．５％の低融解性アガロースゲル上で分離させ、そのことにより かなり大きめの断片が同定された。この断片を溶出し、そしてｐＣＲＩＩ（ＴＡ クローニングシステム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）内 にクローン化させた。 このｃ．アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ） ＤＮＡプローブ をニック翻訳により³²Ｐ−ラベル化し、そしてこれをサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ）ブロットに用いてその断片の種同一性を確認し、そして更にＣ．アルビカンス （Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ） ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。大 きめのｃＤＮＡの配列決定によりそれらのクローンの同一性が確認された。Ｃ． アルビカンス（Ｃ． ａｌｂｉｃａｎｓ） ＲＡＰＴ１−様ポリペプチドの部分 配列が配列番号１３および１４により提供され、その配列内では読み取り枠の表 示が行われている。 先に引用される全引用文献および刊行物は、引用により本明細書に取り込まれ る。 等価物 当業者は、日常的な実験程度のものを用いて本明細書に記載される本発明の具 体的態様に対する多くの等価物を認識するであろうし、あるいはそれを確認する ことが可能であろう。そのような等価物は以下の請求の範囲によって包含される ことが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 0276−2Ｊ Ｐ 33/566 0276−2Ｊ 33/566 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＫＲ (72)発明者 コタレル， ギヨーム アメリカ合衆国マサチユセツツ州02132ウ エストロクスバリー・リカーヒルロード15 (72)発明者 ダマグネス， ベロニク アメリカ合衆国マサチユセツツ州02141ケ ンブリツジ・ナンバー３・サイアラツパス トリート119

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 配列番号２もしくは１２に少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有す るＲＡＰＴ１ポリペプチドもしくはその断片の実質的に純粋な調製物。 ２． 前記ポリペプチドがＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合する、請求の 範囲１のポリペプチド。 ３． 配列番号２もしくは１８のアミノ酸配列に少なくとも９５％相同なアミ ノ酸配列を有する、請求の範囲１のポリペプチド。 ４． 前記ポリペプチドが細胞増殖のラパマイシン調節のアゴニスト、もしく は細胞増殖のラパマイシン調節のアンタゴニストのいずれかの役割の内の一つと して機能する、請求の範囲１のポリペプチド。 ５． 前記ポリペプチドがＡＴＣＣ受託番号７５７８７のｐＩＣ５２４クロー ンから産生される組換え蛋白質である、請求の範囲１のポリペプチド。 ６． ポリペプチドが哺乳類起源のものである、請求の範囲１のポリペプチド 。 ７． 請求の範囲１のポリペプチドのエピトープと特異的に反応する抗体調製 物。 ８． 配列番号のＶａｌ２６−Ｔｙｒ１６０および配列番号１２のＶａｌ２０ １２−Ｔｙｒ２１４４の内の一つもしくは両方に少なくとも７０％相同なアミノ 酸配列を有するラパマイシン−結合性ドメインを含む、単離されたポリペプチド もしくは組換えポリペプチド。 ９． ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体と特異的に結合し、その結合性 がラパマイシン−依存的である可溶性ポリペプチド。 １０． そのポリペプチドが前記ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するＲＡ ＰＴ１−様ポリペプチドの可溶性部分を含む、請求の範囲９のポリペプチド。 １１． 前記ＲＡＰＴ１−様ポリペプチド部分が、配列番号２のＶａｌ２６−Ｔ ｙｒ１６０、配列番号１２のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番号１４の Ｖａｌ４１−Ｔｙｒ１７３、配列番号１６のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３３、および配 列番号１８のＶａｌ１−Ａｇｒ１３３からなる群より選択されるアミノ酸配列に より表されるラパマイシン−結合性ドメインと同一もしくは相同なアミノ酸を有 する、請求の範囲９のポリペプチド。 １２． そのポリペプチドが、前記ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するた めの第一ポリペプチド部分、および前記第一ポリペプチド部分に無関係なアミノ 酸配列を有する第二ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドである、請求の範 囲１のポリペプチド。 １３． 前記第二ポリペプチド部分により前記融合蛋白質の存在を検出するため の検出用ラベルが提供される、請求の範囲１２のポリペプチド。 １４． 前記第二ポリペプチド部分により不溶性マトリックス上に前記融合蛋白 質を固定化するためのマトリックス−結合性ドメインが提供される、請求の範囲 １２のポリペプチド。 １５． 前記融合ポリペプチドがラパマイシン−依存的二重ハイブリッドアッセ イにおいて機能を示す、請求の範囲１２のポリペプチド。 １６． ＲＡＰＴ１−様ポリペプチドのラパマイシン−結合性ドメインを含み、 ラパマイシン−依存的様式でＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体と 特異的に結合する可溶性蛋白質。 １７． 前記ラパマイシン−結合性ドメインが、配列番号２のＶａｌ２６−Ｔｙ ｒ１６０、配列番号１２のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番号１４のＶ ａｌ４１−Ｔｒｙ１７３、配列番号１６のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３３、および配列 番号１８のＶａｌ１−Ａｒｇ１３３からなる群より選択されるアミノ酸配列によ り表されるラパマイシン−結合性ドメインと同一もしくは相同なアミノ酸配列を 有する、請求の範囲１６の蛋白質。 １８． このペプチドが一般式Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₃［式中、 Ｚ₁は、配列番号１２の残基１２７２〜１４４４内に含まれるラパマイシン−結 合性ドメインを表し、 Ｚ₂は、非存在であるか、あるいは前記ラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＮ −末端側にある配列番号１２の１から約５００アミノ酸残基までのポリペプチド を表し、そして Ｚ₃は、非存在であるか、あるいは前記ラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＣ −末端側にある配列番号２の１から約３６５アミノ酸残基までのポリペプチドを 表し、 前記ポリペプチドがラパマイシン−依存的様式でＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体 と特異的に結合する］ により表される、ＲＡＰＴ１蛋白質の可溶性ポリペプチド部分。 １９． 一般式Ａ−Ｂ−Ｃ［式中、 Ｂは、主に配列番号１２のアミノ酸残基２０１４〜２１４４からなるラパマイシ ン−結合性ドメイン、もしくはそれに相同なＲＡＰＴ１−様蛋白質の対応性ラパ マイシン−結合性ドメインを表し、そして ＸおよびＺは個別に非存在であるか、あるいはＲＡＰＴ１−様蛋白質と無関係な アミノ酸配列を有するポリペプチドを表す］ により表されるキメラポリペプチド。 ２０． ＲＡＰＴ１蛋白質もしくは配列番号２もしくは１２の内の一つもしくは 両方に少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有するその断片をコードするヌク レオチド配列を有する実質的に純粋な核酸。 ２１． 前記ＲＡＰＴ１蛋白質がＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合する、請 求の範囲２０の核酸。 ２２． 前記ＲＡＰＴ１蛋白質が、細胞増殖のラパマイシン調節のアゴニストも しくは細胞増殖のラパマイシン調節のアンタゴニストの役割のいずれかの内の一 つとして機能する、請求の範囲２０の核酸。 ２３． 前記ＲＡＰＴ１蛋白質がホスファチジルイノシトールキナーゼ活性を有 する、請求の範囲２０の核酸。 ２４． ＡＴＣＣ受託番号７５７８７のｐＩＣ５２４クローンからのＲＡＰＴ１ コーディング配列を含む、請求の範囲２０の核酸。 ２５． 緊縮条件下で、配列番号１もしくは１１の内の少なくとも１２の連続的 ヌクレオチドに相当する核酸プローブにハイブリダイズする、請求の範囲２０の 核酸。 ２６． 前記ヌクレオチド配列を発現ベクターとしての使用に適切なものにする ように前記ヌクレオチド配列に操作的に連結される転写調節配列を更に含む、請 求の範囲２０の核酸。 ２７． 原核生物細胞および真核生物細胞の内の少なくとも一つの中で複製する ことが可能であり、請求の範囲２６の核酸を含む、発現ベクター。 ２８． 請求の範囲２７の発現ベクターでトランスフェクトさせ、かつ前記ポリ ペプチドを発現する宿主細胞。 ２９． 前記ＲＡＰＴ１蛋白質を発現させるために細胞培養培地中で請求項２８ の細胞を培養し、そして前記細胞培養物から前記ＲＡＰＴ１蛋白質を単離するこ とを含む、組換えＲＡＰＴ１蛋白質の産生方法。 ３０． ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体と特異的に結合し、その結合がラパマイ シン−依存的である、可溶性ポリペプチドをコードする核酸。 ３１． 前記可溶性ポリペプチドが、配列番号２のＶａｌ２６−Ｔｙｒ１６０、 配列番号１２のＶａｌ２０１２−Ｔｙｒ２１４４、配列番号１４のＶａｌ４１− Ｔｙｒ１７３、配列番号１６のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３３、および配列番号１８の Ｖａｌ１−Ａｒｇ１３３からなる群より選択されるアミノ酸配列により表される ラパマイシン−結合性ドメインと同一もしくは相同なアミノ酸配列を含む、請求 の範囲３０の核酸。 ３２． その核酸が、前記ＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合するための第一 ポリペプチド部分、および前記第一ポリペプチド部分に無関係なアミノ酸配列を 有する第二ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドをコードする、請求の範囲 ３０の核酸。 ３３． 前記第二ポリペプチドにより前記融合蛋白質の存在を検出するための検 出性ラベルが提供される、請求の範囲３２の核酸。 ３４． 前記第二ポリペプチド部分により不溶性マトリックス上に前記融合蛋白 質を固定化するためのマトリックス−結合性ドメインが提供される、請求の範囲 ３２の核酸。 ３５． 前記融合ポリペプチドがラパマイシン−依存的二重ハイブリッドアッセ イにおいて機能を示す、請求の範囲３２の核酸。 ３６． ＲＡＰＴ１ポリペプチドのポリペプチド部分をコードし、そのポリペプ チドがラパマイシン−依存的様式でＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体と特異的に結 合し、そして一般式Ｚ₁−Ｚ₂−Ｚ₃［式中、 Ｚ₁は、配列番号１２の残基１２７２〜１４４４内に含まれるラパマイシン−結 合性ドメインを表し、 Ｚ₂は、非存在であるか、あるいは前記ラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＮ −末端側にある配列番号１２の１から約５００アミノ酸残基までのポリペプチド を表し、そして Ｚ₃は、非存在であるか、あるいは前記ラパマイシン−結合性ドメインの直ぐＣ −末端側にある配列番号２の１から約３６５アミノ酸残基までのポリペプチドを 表す］ により表される、核酸。 ３７． 一般式Ａ−Ｂ−Ｃ［式中、 Ｙは、主に配列番号１４のアミノ酸残基Ｖａｌ４１−Ｔｙｒ１７３、配列番号１ ６のＶａｌ１−Ｔｙｒ１３３、もしくは配列番号１８のＶａｌ１−Ａｒｇ１３３ からなるラパマイシン−結合性ドメイン、あるいはそれらに相同なイーストもし くは真菌類のＲＡＰＴ１−様蛋白質の対応性ラパマイシン−結合性ドメインを表 し、そして ＸおよびＺは、個別に非存在であるか、あるいはＲＡＰＴ１−様蛋白質に無関係 なアミノ酸配列を有するポリペプチドを表す］ により表されるキメラポリペプチド。 ３８． 配列番号２もしくは１２に少なくとも７０％相同なアミノ酸配列を有す る、組換えＲＡＰＴ１ポリペプチドもしくはその断片。 ３９． 前記ポリペプチドがＦＫＢＰ／ラパマイシン複合体に結合する、 請求の範囲２８のポリペプチド。 ４０． ｉ． 配列番号２もしくは１２のアミノ酸配列により表されるラ パマイシン−結合性ドメインを含むＲＡＰ−ＢＰポリペプチド、および ＦＫ５０６−結合性蛋白質のラパマイシン−結合性ドメイ ンを含むＦＫＢＰポリペプチドを、 前記ＲＡＰ−ＢＰおよびＦＫＢＰポリペプチドが相互作用を行うことが可能な 条件下で合わせること； ｉｉ． 前記組み合わせ物を検査用化合物と接触させ；そして ｉｉｉ． 前記ＲＡＰ−ＢＰおよびＦＫＢＰポリペプチドを含む複合 体の形成を検出すること、 を含み、 前記検査用化合物の存在下での前記複合体の形成の統計的に有意な増加は、非存 在の場合の前記複合体の形成と比較すると、ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫ５０６ −結合性蛋白質との間の相互作用のインデューサーを示す、 ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫ５０６−結合性蛋白質との結合を誘導する作用物質 について検査用化合物をスクリーニングするためのアッセイ。 ４１． ｉ． ＲＡＰＴ１もしくはＲＡＰＴ１−様蛋白質のラパマイシン −結合性ドメインを主に含むＲＡＰ−ＢＰポリペプチド、および ＦＫ５０６−結合性蛋白質のラパマイシン−結合性ドメイ ンを含むＦＫＢＰポリペプチドを、 前記ＲＡＰ−ＢＰおよびＦＫＢＰポリペプチドが相互作用を行うことが可能な 条件下で合わせること； ｉｉ． 前記組み合わせ物を検査用化合物と接触させること；そし て ｉｉｉ． 前記ＲＡＰ−ＢＰおよびＦＫＢＰポリペプチドを含む複合 体の形成を検出すること、 を含み、 前記検査用化合物の存在下での前記複合体の形成の統計的に有意な増加は、非存 在の場合の前記複合体の形成と比較すると、ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫ５０６ −結合性蛋白質との間の相互作用のインデューサーを示す、 ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫ５０６−結合性蛋白質との結合を誘導する作用物質 について検査用化合物をスクリーニングするためのアッセイ。 ４２． （ｉ） 検出可能な遺伝子を含み、その検出可能な遺伝子は、そ の検出可能な遺伝子が転写活性化ドメインを含み、その転写活性化ドメインがそ の検出可能な遺伝子に十分近接している場合に、あるアミノ酸配列により活性化 される活性化される宿主細胞を提供すること； （ｉｉ） その宿主細胞をその宿主細胞内で発現されることが可能 であって、第一ハイブリッド蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、その第一ハ イブリッド蛋白質が： （ａ） その宿主細胞内の検出可能な遺伝子上の結合部位を認識 するＤＮＡ−結合性ドメイン；および （ｂ） ＦＫ５０６−結合性蛋白質のラパマイシン−結合性ドメ イン； を含む第一キメラ遺伝子で形質転換させること； （ｉｉｉ） その宿主細胞をその宿主細胞内で発現されることが可能 であって、第二ハイブリッド蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含み、その第二ハ イブリッド蛋白質が： （ａ） 転写活性化ドメイン；および （ｂ） ＲＡＰＴ１−様蛋白質のラパマイシン−結合性ドメイン ； を含むこと； （ｉｖ） その宿主細胞を、その第一ハイブリッド蛋白質および第 二ハイブリッド蛋白質がその検出可能な遺伝子が活性化されるのに十分な量で発 現される条件下に供すること； （ｖ） その宿主細胞を検査用作用物質と接触させること；なら びに （ｖｉ） その検出可能な遺伝子が、その第一検査用蛋白質と第二 検査用蛋白質との間の総合作用の非存在下での発現と比較すると、統計学的に見 て有意に大きい度合いにまで発現されているかどうかを決定すること、 を含む、 ＲＡＰ−結合性蛋白質とＦＫ５０６−結合性蛋白質の結合性を誘導する作用物質 について検査用化合物をスクリーニングするための方法。 ４３． ＤＮＡ−結合性ドメインおよび転写活性化ドメインが、分離可能なＤＮ Ａ−結合性ドメインおよび転写活性性ドメインを有する転写活性化因子に由来す る、請求の範囲４２の方法。 ４４． ＤＮＡ結合性ドメインと転写活性化ドメインとが、転写活性化 因子 ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、ＬｅｘＡ、ＶＰ１６、およびＡＤＲ１からなる群よ り選択される、請求の範囲４３の方法。 ４５． ＦＫ５０６−結合性蛋白質のラパマイシン−結合性ドメインが第一ハイ ブリッド蛋白質よりはむしろ第二ハイブリッド蛋白質の部分であり、かつＲＡＰ Ｔ１−様蛋白質のラパマイシン−結合性ドメインが第二ハイブリッド蛋白質より はむしろ第一ハイブリッド蛋白質の部分である、請求の範囲４２の方法。 ４６． 実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチ ドが、緊縮条件下で、配列番号１もしくは１１、またはその天然に存在する突然 変異体からなる群より選択される核酸のセンスもしくはアンチセンス配列の内の 少なくとも２０の連続ヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領 域を含むプローブ／プライマー。 ４７． 連結されかつ検出されることが可能なラベル基を更に含む、請求の範囲 ４６のプローブ／プライマー。 ４８． 前記ラベルが、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、および酵素補助因 子からなる群より選択される、請求の範囲４７のプローブ／プライマー。 ４９． ある被検体が所望されない細胞増殖を特徴とする障害の危険にさらされ ているかどうかを決定し、かつ前記被検体の組織内で、 配列番号２もしくは１２により表される蛋白質、またはそれらの哺乳類相同体 をコードする遺伝子の突然変異；および前記遺伝子の過誤発現、の内の少なくと も一つを特徴とする遺伝子病変の存在もしくは非存在を決定することを含む方法 。 ５０． 前記病変の検出が、 ｉ． 前記遺伝子からの一つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、 ｉｉ． 前記遺伝子への一つもしくは複数のヌクレオチドの添加、 ｉｉｉ． 前記遺伝子の一つもしくは複数のヌクレオチドの置換、 ｉｖ． 前記遺伝子の総体的染色体再配列、 ｖ． 前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの総体的変化、 ｖｉ． 前記遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシン グパターンの存在、 ｖｉｉ． 前記蛋白質の非野生型タイプレベル、 の内の少なくとも一つの存在を確認することを含む、請求の範囲４９の方法。 ５１． 前記遺伝子病変の検出が、 ｉ． 配列番号１もしくは１１、またはそれらの天然に存在する突然変異 体、あるいは前記遺伝子に天然の状態で結合する５’もしくは３’フランク配列 からなる群より選択される核酸のセンスもしくはアンチセンス配列にハイブリダ イズするヌクレオチド配列の領域を含むオリゴヌクレオチドを含むプローブ／プ ライマーを提供すること； ｉｉ． 前記プローブ／プライマーを前記組織の核酸に露出すること；なら びに ｉｉｉ 前記プローブ／プライマーの前記核酸へのハイブリダイゼーション により前記遺伝子病変の存在もしくは非存在を検出すること、 を含む、請求の範囲４９の方法。 ５２． 前記病変の検出が、前記遺伝子および場合によっては前記フランク核酸 配列のヌクレオチド配列を決定するために前記プローブ／プラ イマーを利用することを含む、請求の範囲５１の方法。 ５３． 前記病変の検出が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で前記プローブ／ プライマーを利用することを含む、請求の範囲５１の方法。 ５４． 前記病変の検出が、連結連鎖反応（ＬＣＲ）で前記プローブ／プライマ ーを利用することを含む、請求の範囲５１の方法。 ５５． 前記蛋白質のレベルが免疫アッセイにおいて検出される、請求の範囲５ １の方法。