DE10261834A1

DE10261834A1 - Hochdurchsatz-geeignetes Screening-Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen

Info

Publication number: DE10261834A1
Application number: DE2002161834
Authority: DE
Inventors: Dietmar Dr. Eschrich; Karl-Dieter Prof. Dr. Entian; Jürgen Dr. Recktenwald
Original assignee: Phenion GmbH and Co KG
Current assignee: Phenion GmbH and Co KG
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2004-07-08
Also published as: WO2004059000A2; AU2003298160A1; AU2003298160A8; WO2004059000A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hochdurchsatz-geeignetes Screening-Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Hochdurchsatz-geeignetes Screening-Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen.
Nahezu alle klassischen Antibiotika wurden durch Optimierung von Substanzen erhalten, die eine antimikrobielle Wirkung im Ganzzellen-Screening zeigten. Die Verfahren haben jedoch den Nachteil, dass sie unempfindlich sind und gefundene Wachstumsinhibitoren häufig auch für den Menschen zytotoxisch wirken.
Des weiteren ist der Wirkort gefundener Substanzen meist unbekannt, was eine rationale Optimierung der antimikrobiellen Substanzen erschwert. Somit ist nicht verwunderlich, dass diese Strategie der Wirkstofffindung in den vergangenen Jahren nur zu wenigen neuen Wirkstoffen geführt hat.
Deshalb hat sich die pharmazeutische Forschung im Laufe der vergangenen Jahre auf eine Zielort-gerichtete Technologie konzentriert, bei der gezielt durch die Störung essentieller Stoffwechselwege bzw. Strukturen („Ziele", „Targets") ein Abtöten bzw. eine Wachstumshemmung des Mikroorganismus erzielt wird.
In Zielort-gerichteten Ansätzen werden Substanzen gesucht, die spezifisch eine biochemische Reaktion oder intermolekulare Wechselwirkung inhibieren. Der Vorteil solcher Zielort-gerichteter Ansätze ist, dass völlig neue Zielorte für Antibiotika bestimmt werden können, die bisher noch nicht durch antimikrobielle Substanzen angegriffen werden.
Neue Zielorte bzw. Wirkmechanismen für Wirkstoffe sind insbesondere deshalb notwendig, da hierfür noch keine Resistenzen entwickelt werden konnten. Dies ist für nahezu alle gängigen antimikrobiellen Substanzen bereits geschehen und sie haben so an Wirksamkeit eingebüßt. Zum Beispiel sind Candida albicans Stämme, die durch Veränderung oder Überexpression des Wirkortes bzw. Überexpression von Efflux-Pumpen resistent gegen die Stoffklasse der Azole sind, keine Seltenheit mehr.
Das Rohmaterial für in silico Wirkstoffzielort- (Drug-Target) Identifizierung stellt die Sequenzinformation der Genome in Verbindung mit der Funktionsanalyse der entdeckten Gene dar. Zum Anmeldetag der vorliegenden Erfindung sind mehr als 60 mikrobielle Genome komplett sequenziert und allgemein zugänglich.
Auswahlverfahren von Drug-Targets stellen mindestens zwei Anforderungen an einen geeigneten Zielort. Zum einen sollte die Genfunktion essentiell für den Organismus sein, woraus geschlossen werden kann, dass auch die Inhibition des dazugehörigen Genproduktes (Protein) durch Wirkstoffe einen toxischen Effekt auf den Mikroorganismus zeigt.
Damit Substanzen mit breitem Wirkspektrum gegen Schadorganismen gefunden werden können ist es zum anderen wichtig, dass der Zielort (Zielprotein) möglichst unter den Schadorganismen konserviert ist (z.B. unter Bakterien und/oder Pilzen), d.h. dass die Proteinsequenzen der Zielorganismen hohe Übereinstimmung aufweist.
Bisherige Auswahlverfahren berücksichtigen nur solche Targets, zu denen es beim Menschen kein homologes Gen bzw. Protein gibt. Dies erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass ein gefundener Wirkstoff keine negativen Auswirkungen auf menschliche Zellen hat und somit nebenwirkungsarm ist. Gleichzeitig schränkt diese Bedingung aber die Auswahl der zur Verfügung stehenden Targets drastisch ein, insbesondere bei der Suche nach neuen antimykotisch wirksamen Substanzen.
Dies beruht darauf, dass Pilze, genauso wie der Mensch, Eukaryonten sind bei denen sehr viele zelluläre Prozesse konserviert sind. Insbesondere die essentiellen Gene der Pilze kodieren zu einem Großteil für grundlegende, für zelluläre Prozesse wichtige Proteine, zu denen es homologe Proteine bei allen Eukaryonten und somit auch beim Menschen gibt. Es konnte durch Arbeiten der Anmelderin gezeigt werden, das zu etwa 80% aller essentiellen S. cerevisiae Proteine ein menschliches Homologes existiert und diese somit nach obigen Kriterien nicht als Targets in Frage kommen.
Die Effizienz von Screening-Systemen hängt im Wesentlichen von deren Spezifität ab, d.h. es müssen geeignete Parameter gefunden werden, die die Zahl der falsch positiven Ergebnisse minimieren.
Bei Screening-Systemen im in vitro Verfahren (zellfreie Zielort-gerichtete Ansätze) wird meist die Bindung von Effektoren an aufgereinigte Proteine gemessen. Hierbei wird in großen Substanzbibliotheken im Hochdurchsatzverfahren (HTS) nach interessanten Leitstrukturen gesucht. Als Messsignal dient dabei der Funktionsausfall des Targets, was in der Regel eine katalytische Aktivität voraussetzt. Dies schränkt zum einen die Zahl der geeigneten Targetproteine stark ein und zum anderen muss die physiologische Funktion des Targetproteins bereits bekannt sein.
Der Vorteil Zielort-basierender in vitro Ansätze ist, dass völlig neue Zielorte für Antibiotika bestimmt werden können, die bisher noch nicht durch antimikrobielle Substanzen angegriffen werden. Sie sind empfindlicher als Ganzzell-Screenings und auch schwach inhibierende Substanzen werden damit gefunden, die dann rational optimiert werden können, da der Wirkort bekannt ist.
Ein Nachteil zellfreier/biochemischer Testsysteme zur Identifizierung neuer inhibierender Substanzen ist, dass oftmals eine sehr große Menge möglicher Treffer („Hits") detektiert wird, die in anschließenden Tests aufwändig verifiziert werden müssen, wobei sich viele falsch-positiv erweisen. Für die gefundenen Substanzen steht zu diesem Zeitpunkt noch keine Information zur Verfügung, ob der gefundene Inhibitor des Enzyms auch eine Beeinflussung von Mikroorganismen in vivo bewirkt.
So müssen die Substanzen zunächst an ihre Wirkorte gelangen, d.h. in aller Regel in das Zellinnere. Die Zellwand sowie die Zytoplasmamembran stellen selektive Barrieren dar, die nicht alle Substanzen in ausreichender Menge penetrieren können.
Bei in vivo Testsystemen werden ganze Zellen eingesetzt. Hier ist die Erfassung des Messsignals oft ein Problem, es sei denn, dass das Wachstum der Zellen als besonders kostengünstiger und einfacher Parameter herangezogen werden kann. Bei Screening-Systemen, die Wachstum als Messparameter ausnutzen, besteht das Hauptproblem darin, die proteinspezifisch toxische Wirkung von einer allgemein zytotoxischen Wirkung zu unterscheiden. Dies ist bei essentiellen Proteinen als Targets sehr schwierig, da sowohl die proteinspezifische Wirkung als auch die zytotoxische Wirkung zum gleichen Ergebnis, dem Zelltod führen.
Die US 6228588 B1 beschreibt ein Verfahren zur Identifizierung essentieller Gene von S. aureus mittels konditional letaler Mutanten, Sequenzen essentieller S. aureus Gene (und derenen Homologe in anderen Baktereien) und den Aufbau von Screening-Verfahren mittels konditional letaler Mutanten.
Beschrieben wird u.a. die Nutzung einer Kollektion konditional letaler Mutanten (bekannte Mutationen in essentiellen Genen) zur Identifizierung der Targets bekannter Wachstumsinhibitoren. Dies ist möglich, da bei konditional letalen Mutanten das Genprodukt oftmals nur partiell funktionell ist und eine weitere Beeinflussung genau dieses Genproduktes schneller zur Wachstumshemmung führt als bei dem Wildtyp.
Aus der WO 9526400 A1 ist eine Hefezell-basierte Methode (Reverse Twohybrid) bekannt, mit der nach Substanzen gesucht werden kann, die spezifisch die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen stören. Es kann nach kleinen Molekülen gesucht werden, die ganz spezifisch die Wechselwirkung zwischen zwei Proteinen (jedweder Herkunft, z.B. Mensch, Pflanze, Bakterium, Pilz) stören. Ausgelesen wird die Störung der Wechselwirkung durch eine dadurch bedingte Induktion der Expression eines Reportergenes. Allerdings kann mit diesem Verfahren nicht nach Wachstumsinhibitoren gesucht werden.
Die WO 9957536 C2 beschreibt das CAK1 (cdk-activating kinase) Gen/Protein von C. albicans (u.a.). Es werden Methoden eines Zielort-gerichteten Protein-Differenz-Screenings („Differential Screening Formats" S.53) für CAK1 erläutert, bei der die Wirkung von Substanzen gegen ein pilzliches CAK1 mit der Wirkung gegen humanes CAK1 verglichen wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Screening-Verfahren bereitzustellen, das möglichst viele der Vorteile eines Zielort-gerichteten Testverfahrens mit denen eines in vivo Verfahrens kombiniert.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Hochdurchsatzgeeignetes Screening-Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen Zielorganismus (Targetorganismus) auswählt, den die zu identifizierenden Wirkstoffe inhibieren oder abtöten sollen,
b) ein Zielgen (Target) auswählt, das oder dessen Genprodukt durch die zu identifizierenden Wirkstoffe deaktiviert werden soll,
c) einen zu schützenden Organismus auswählt, der vor Schädigung durch den Zielorganismus bewahrt werden soll,
d) einen Testorganismus auswählt, der ein dem Zielgen funktionshomologes Testgen trägt,
e) zwei Teststämme eines Testorganismus konstruiert, die sich genotypisch in genau zwei Merkmalen unterscheiden, nämlich i. in dem Zielgen, dadurch, daß einer der Teststämme eine höhere Dosis eines das Zielgen oder dessen Genprodukt deaktivierenden Wirkstoffes toleriert als der andere Teststamm und ii. in einem Gen, das für eine gut detektierbare Eigenschaft kodiert (phänotypische Marke), für die Vitalität und Proliferationsfähigkeit des Testorganismus aber nicht essentiell ist,
f) beide Teststämme mischt und gemeinsam inkubiert,
g) einen potentiellen Wirkstoff zugibt und
h) anhand des gegebenenfalls unterschiedlich starken Wachstums der beiden Teststämme einen Wirkstoff identifiziert

Gegenüber dem bekannten Stand der Technik weist das erfindungsgmäße Verfahren beträchtliche Vorteile auf:

– Eine Vielzahl neuer Targets (Zielgene) kann erschlossen werden, ohne dass die genaue Funktion des Targets bekannt ist (beispielsweise essentielle Gene/Proteine von humanpathogenen Organismen).
– Das Screeningverfahren ist HTS-tauglich (96 well als auch 384 well Platten) und ermöglicht ein sehr einfaches Auslesen der Ergebnisse.
– Ziel- und Kontrollstämme werden gemischt und gemeinsam inkubiert. Dies führt beim Einsatz im HTS zu einer 50%igen Reduktion der Gesamt-Well-Zahl und damit zu einer deutlichen Kostenersparnis.
– Die Empfindlichkeit des Screeningverfahrens kann durch unterschiedliche Animpfungsmengen und Animpfungsverhältnisse der Teststämme moduliert werden und zeigt somit je nach Bedarf eine sehr hohe bis sehr schwache Empfindlichkeit.
– Selbst minimal inhibierende Wirkstoffkonzentrationen sind messbar bzw. detektierbar, da die daraus resultierenden längeren Verdopplungszeiten bis in die stationäre Phase zu einer Akkumulation des nicht-gehemmten Stammes und damit des phänotypischen Markers führt. So führt eine selektiv wirkortspezifische Hemmung, die lediglich in einem 10% langsamer wachsenden Stamm resultiert nach ca. 10 Verdopplungen des nicht gehemmten Stammes zu doppelt so vielen Zellen dieses Stammes wie des gehemmten Stammes in der Kultur.
– Durch den Einsatz von Mikroorganismen (z.B. Hefe) können komplexe Extrakte untersucht werden ohne dass dies den Assay beeinträchtigt.
– Nach Erstellung der Tests ist das Verfahren schnell und kostengünstig, da sich das Testmaterial selbst vervielfältigt.
– Nur relevante Substanzen generieren ein auslesbares Signal („Hits"). Dadurch werden tatsächlich nur wirkortspezifische Substanzen identifiziert und übermäßig viele falsch-positiver Treffer vermieden. Dies erspart eine weitere zeit- und kostenaufwendige Verifikation/Analyse der Hits.
– „Hits" besitzen mit hoher Wahrscheinlichkeit „Leadpotential", da die Substanz den Wirkort erreicht (die Zelle penetrieren kann) und ein starker Einfluss auf das Target in vivo gezeigt ist.

Vorzugsweise ist der Zielorganismus ausgewählt unter Menschen und Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Organismen, vorzugsweise unter pflanzen-, tier- und/oder humanpathogenen Organismen, bevorzugt unter humanpathogenen Pilzen oder Bakterien.
Targetorganismen sind insbesondere Pflanzenpathogene und Human- bzw. Tierpathogene (Viren, Pro- und Eukaryonten), Mikroorganismen und Pflanzen (Algen), die die industrielle Produktion stören (Biofilme, Ablagerungen in Kühlkreisläufen usw.) oder der Mensch z.B. zur Auffindung von Cytostatika zur Behandlung gegen Krebs oder der Suche nach Enzyminhibitoren (HMG-CoA Reduktase Inhibitoren zur Behandlung von Arteriosklerose).
Besonders geeignete human- bzw. tierpathogene Targetorganismen sind Organismen der Gattungen Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, Mycobacterium, Neisseria, Haemophilus, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Francisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobacter, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Listeria, Brucella, Bacillus, Clostridium, Treponema, Escherichia, Salmonella, Klebsiella, Vibrio, Proteus, Borrelia, Lep tospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, Aeromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia, Mycoplasma, Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Exophalia, Histoplasma, Pneumocystis, Cryptococcus, Trichosporon, Absidia, Mucor, Rhizomucor, Rhizopus, Mitglieder der Spezies oder Gruppe Gruppe A Streptococcus, Gruppe B Streptococcus, Gruppe C Streptococcus, Gruppe D Streptococcus, Gruppe G Strepfococcus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningifidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphteriae, Gardnerella vaginalis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium leprae, Actinomyces israelii, Listeria monocytogenes, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Vibrio cholerae, Shigella dysenterii, Pseudomonas aeruginosa, Francisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rikkettsii, Chlamydia trachomifis, Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatidis, Candida dublinensis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida albicans, Candida fropicalis, Candida parapsilopsis, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii, Cryptococcus neoformans.
Geeignete pflanzenpathogene Targetorganismen sind Organismen der Gattungen Alternaria, Gaeumannomyces, Cercospora, Botrytis, Claviceps, Corticium, Colletotrichum, Didymella, Endothia, Exobasidium, Sclerotinia, Erysiphe, Fusarium, Magnaporuthe, Plasmopara, Penicillium, Peronospora, Pseudoperonospora, Phytophthora, Pythium, Monilia, Mucor, Trametes, Ophiostoma, Rhizoctonia, Sphacelotheca, Septoria, Sclerospora, Venturia, Verticillium, Puccinia, Phoma, Tilletia, Ustilago, und Urocystis.
Mit Targetgenen (Zielgenen) bzw. Taurgetproteinen sind erfindungsgemäß Gene/Proteine bezeichnet, die essentiell für das vegetative Wachstum des Targetorganismus sind. Die Störung, Hemmung oder Inauktivierung der Gene bzw. der zugehörigen Genprodukte (Proteine) führt zu einer Abtötung bzw. Wachstumshemmung des Targetorganismus. Hierunter fallen insbesondere alle Proteine/Gene eines Targetorganismus die Funktionshomologe zu essentiellen Genen/Proteinen von S. cerevisiae darstellen. Um essentielle Gene der Hefe S. cerevisiae handelt es sich bei folgendenden Genen:
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Interessant sind Gene bzw. Proteine von Targetorganismen insbesondere dann, wenn die Ähnlichkeit der abgeleiteten Aminosäuresequenzen mindestens 30% zu den abgeleiteten Aminosäuresequenzen der S. cerevisae essentiellen Gene beträgt oder durch Komplementation gezeigt werden konnte, dass das Gen/Protein des Targetorganismus das entsprechende Gen/Protein aus S. cerevisiae ersetzen kann.
Besonders geeignete Targets sind solche, zu denen keine homologen Vertreter bei höheren Eukaryonten (z.B. Mensch) existieren. Dies sind insbesondere homologe Gene/Proteine zu den folgenden essentiellen S. cerevisiae Genen bzw. deren Genprodukten:
YER022w, YBR211c, YDR118w, YOR249c, YKL004w, YHR101c, YDL220c, YLR459w, YMR168c, YER026c, YMR094w, YDR016c, YGR113w, YOL149w, YJL090c, YMR220w, YBR102c, YKL060c, YNL256w, YPR136c, YNL038w, YJR016c, YER038C, YLR317w, YDR499w, YBR193c, YEL019c, YKL186c, YGR158c, YGR147c, YML031w, YPL124w, YJL039c, YPR168w, YLL004w, YCL052c, YNL282w, YGR030c, YBR167c, YBL018c, YGR075c, YFR029w, YJL173c, YBR256c, YMR200w, YML091c, YML043c, YLR141w, YBL014c, YJL025w, YMR270c, YCR035c, YDR303c, YLR033w, YDR041W, YER147c, YNR026c, YDR498c, YMR059w, YPL083c, YLL003w, YGL113w, YIL147c, YDR478w, YDL098c, YDR240c, YDR201w, YBR253w, YHR178w, YDR082w, YIR011c, YJL035c, YPL128c, YGR099w, YLR010C, YAL001c, YDR362c, YPL007c, YJL054w, YNL131w, YBR126c, YJL087c, YDR407c, YDR472w, YEL035c, YAL035C-A, YBL073W, YBL077W, YBR168w, YBR190w, YCL041C, YCR013C, YDL016C, YDL163W, YDL196W, YDL221W, YDR053w, YDR187C, YDR327W, YDR355c, YDR367w, YDR396w, YDR413C, YDR526C, YFR042W, YGL069C, YGL074C, YGL 102C, YGL239C, YGL247W, YGR046W, YGR073C, YGR114C, YGR128c, YGR190C, YGR251W, YGR265W, YGR277C, YHR083w, YHR196w, YJL009W, YJL010C, YJL015C, YJL032W, YJL086C, YJL091C, YJL195C, YJL202C, YJR012C, YJR023c, YJR041c, YJR046w, YJR136c, YKL014c, YKL036c, YKL083W, YKL111C, YKL153W, YKR081C, YKR083C, YLL037w, YLR007w, YLR076c, YLR101c, YLR112w, YLR132c, YLR140w, YLR145w, YLR198c, YLR230W, YLR339C, YLR379W, YLR440C, YLR458W, YML023C, YML127W, YMR134W, YMR290w-a, YMR298w, YNL114C, YNL149C, YNL150W, YNL158W, YNL260c, YOL026C, YOL134C, YOR060C, YOR102W, YOR146W, YOR169C, YOR203W, YOR218C, YOR282W, YDL235c, YPL044C, YPL142C, YPL233W, YPL238C, YPL251W, YPR085C, YPR142C, YPR177C, YLR336c, YML015c, YNL232w, YER029c, YLR438c-a, YBR091c, YCR054C, YDR412w, YDR052c, YBR123c, YJR022w, YDR527W, YNL221c, YIL004c, YDL207w, YPL242c, YCL031c, YNL258c, YIR015w, YKL012w, YGR005c, YER008c, YOR148c, YNL039w, YKR063c, YKR008w, YLR166c, YDR398w, YOR174w, YPL190c, YMR112C, YMR239c, YOR353c, YER104w, YPR190c, YAL034w-a, YNL151c, YJR112w, YIL019W, YOR194c, YLR457c, YLR105c, YJR067c, YEL055c, YJL109C, YDR353w, YGL098W, YGR047c, YLR409C, YDR228c, YDR168w, YMR005w, YJL061w, YDL139c, YDR468c, YHR197w, YOR340c, YGR156w, YDR308c, YOR122c, YHR052w, YMR049c, YKL195W, YAL043c, YMR211w, YIR010w, YER168c, YKR025w, YLL035w, YAL033w, YER018c, YBL034c, YKL 108W, YDR081c, YMR117c, YGR140w, YFR003C, YGL075c, YLR316c, YKL059c, YGR009c, YPL231w, YGR179C, YKL182w, YKR062w, YDR235w, YPL255w, YOR110w, YNL251c, YER127w, YHR040w, YNL216w, YKL144c, YPL076w, YLR045c, YDR288W, YHR036w, YML025C, YMR149w, YOL146W, YGL061c, YLR071c, YJR141w, YLR078c, YPL011c, YKL042w, YGR013w, YGR090W, YNL188w, YGR115C, YDL003w, YMR218c, YOR075w, YNL272c, YPR105C, YKL052c, YFL024c, YML046w, YGL093w, YGL225w, YKR022C, YPL085w, YOR372c, YML114c, YPR169W, YHR118c, YGL145w, YGR186w, YDL209C, YNL152W, YGR198W, YPL126w, YMR033w, YOL130w, YKL089w, YDR166c, YDR182w, YDR464w, YOL144W, YJR089W, YDR113c, YGL122c
Weiterhin besonders geeignete essentielle Gene eines Targetorganismus sind solche Gene bzw. Proteine, die zwar Funktionshomologe in höheren Eukaryonten besitzen, bei denen aber Unterschiede (idealerweise maximal) in der Proteinstruktur zwischen dem Protein aus höheren Eukaryonten (Kontrollprotein) und dem Targetprotein bestehen (in Primär-, und/oder Sekundär-, und/oder Tertiär-, und/oder Quartärstruktur). Das Kontrollgen bzw. Protein kann hierbei insbesondere von einem Säuger (z.B. Mensch) oder einer Pflanze stammen. Besonders geeignete Targetgene/Proteine des humanpathogenen Targetorganismus Candida albicans sind homologe Gene/Proteine zu den essentiellen S. cerevisiae Genen/Proteinen YDR236c (FMuN1), YBR265w (TSC10), YPR113w (PIS1), YOR122c (PFY1) und YMR197c (VTI1).
Vorzugsweise ist der zu schützende Organismus ausgewählt unter Pflanzen, Tieren und Menschen, insbesondere Menschen.
Testorganismen, Teststämme bzw. Kulturen, die hierbei zum Einsatz kommen können sind grundsätzlich alle Organismen bzw. Zellkulturen, die einfach (z.B. Bakterien im Reagenzglas/Mikrotiterplatte oder Zellkulturen in Zellkulturflaschen/Mikrotiterplatte) zu kultivieren sind.
Diese können sowohl prokaryontischen als auch eukaryontischen Ursprungs sein. Bevorzugt finden hierbei Organismen Verwendung, die genetisch zugänglich sind und in denen Gene heterolog exprimiert werden können.
Unter den prokaryontischen Testorganismen eignen sich sowohl Gram-positive als auch Gram-negative Bakterien. Exemplarische, jedoch nicht ausschließliche, Testorganismen aus dem Reich der Prokaryonten sind beispielsweise Spezies der Gattungen Bacillus (B. subtilis), Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. planticola), Lactobacillus (L. delbruckii, L. lactis), Pseudomonas (P. aeroginosa, P. fluorescens) Salmonella (S. typhimurium) Serratia (S. marcescens) Streptococcus (S. lactis, S. mutans, S. pyogenes), Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis) Vibrio (V. cholerae) Yersinia (Y. ruckeri).
Besonders geeignet sind hierbei Testorganismen für die eine Reihe molekularbiologischer Werkzeuge (z.B. Vektoren) zur Verfügung steht wie etwa Escherichia coli und Bacillus subtilis.
Bei den eukaryotischen Testorganismen eignen sich sowohl eukaryotische Einzeller (Protozoen, Schleimpilze, Pilze usw.) als auch eukaryotische Zellkulturen. Unter den eukaryotischen Einzellern eignen sich insbesondere Hefen. Unter den Hefen wiederum sind besonders Spezies aus den Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Ashbya, Hansenula, Pichia, geeignet. Hierunter sind insbesondere Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe und Candida albicans besonders geeignet.
Ganz besonders geeignet sind Saccharomyces cerevisiae Stämme, bevorzugt die Stämme CEN.PK2, BY4743, BMA46 (W303), FY1679 sowie deren haploide Derivate.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zum Hochdurchsatzscreening, vorzugsweise durch Parallelisierung, besonders bevorzugt, indem es in einer Mehrzahl paralleler Ansätze, ganz besonders bevorzugt in Mikrotiter-Platten oder anderen dem Fachmann bekannten Vorrichtungen durchgeführt wird, die die Paralellisierung von Ansätzen erlauben.
Unterschiedliche genotypische Merkmale stellen erfindungsgemäß die differentielle Expression des Targetgens in den Teststämmen dar (unterschiedliche „Gendosis"), z.B. hervorgerufen durch die Deletion eines Targetgen-Allels (für Testorganismen mit Ploidie > 1), Einbringen zusätzlicher Targetgenkopien in einen der Teststämme oder unterschiedlich regulierte Expression der Targetgene in den Teststämmen.
Zellen, die ein Targetgen stärker exprimieren und somit mehr Targetprotein bilden, tolerieren eine viel höhere Wirkstoffkonzentration, die gegen genau dieses Tagetprotein gerichtet sind. Ein weiteres Unterscheidungsmerkmal stellt eine genetische Veränderung des Targetgenes in einem der Teststämme dar. Dies kann hervorgerufen werden durch konditionale Mutationen (Punktmutationen, Deletionen oder Trunkierung).
Solche genetische Veränderungen führen häufig zu partiell funktionellen Proteinen die leichter durch Wirkstoffe inhibiert werden können als Wildtyp-Proteine. Auch können sich die Teststämme durch die Substitution essentieller Gene durch funktionshomologe Proteine aus anderen Organismen (Eubakterien, Archaea, Eukaryonten Viren) unterscheiden. Hierbei können je nach Ziel Tests mit unterschiedlichsten Teststamm-Kombinationen gebildet werden.
Neben diesem genotypischen Merkmal unterscheiden sich die Stämme in einem weiteren Merkmal, da einer der beiden Teststämme eine phänotypische Marke erhält. Phänotypische Marken bezeichnen hierbei phänotypische Merkmale, die keinen oder nur geringen Einfluss auf das Wachstum des Teststammes haben. Dies kann z.B. eine Deletion in einem weiteren Genlokus sein, was zur Folge hat, dass die Zellen ein farbiges Pigment akkumulieren oder dadurch besondere biochemische Eigenschaften verliehen werden, die gut auszulesen sind. So führt beispielsweise die Deletion des ADE2 Genlokus bei Hefen (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe oder Candida albicans) zur Akkumulation von Phosphoribosylaminoimidazol in der Vakuole, das durch Sauerstoff in ein rotes Pigment überführt wird. Das Zell-Sediment einer solchen Kultur ist rot und kann mit dem Auge einfach erfasst werden. Damit böte sich die ADE2 Deletion grundsätzlich als eine phänotypische Marke an, unglücklicherweise führt die Akkumulation des roten Pigmentes jedoch zu einer Wachstumsverschlechterung des Deletionsstammes im Vergleich zum Wildtyp-Stamm (Ugolini und Bruschi, 1996), was sehr nachteilig für einen Einsatz im weiter unten beschriebenen Verfahren ist. Durch eine geschickte Anordnung des Versuchs- bzw. Verfahrensablaufs, wird die Akkumulation des wachstumshemmenden Pigmentes jedoch erst nach Anzucht der Zellen induziert, so dass die ADE2 Deletion doch genutzt werden kann und sogar eine besonders geeignete phänotypische Marke darstellt. Weitere phänotypische Marken sind die Expression des Grün-Fluoreszierenden-Proteins (GFP) in einem der Stämme oder die Expression von anderen Reportergenen wie etwa der β-Galactosidase, der Luziferase oder ähnliches.
Die beiden Teststämme (Target- und Kontrollstamm), die sich nur durch das Zielgen/protein und die phänotypische Marke unterscheiden werden angezogen und gemischt. Mit einer geringen Zellzahl dieses Stammgemisches wird frisches Medium beimpft. Nach Applikation von Testsubstanzen werden die Kulturen bis in die stationäre Wachstumsphase angezogen. Die End-Zusammensetzung der resultierenden Mischkulturen, kann nun durch eine Quantifizierung der charakteristischen phänotypischen Marke sehr leicht ermit telt werden. Wird beispielsweise einer der beiden Stämme spezifisch bzw. stärker durch eine Substanz im Wachstum inhibiert, so führt dies zu einer Verstärkung bzw. Abschwächung der entsprechenden phänotypischen Marke, was wiederum durch stärkere/schwächere Fluoreszenz oder intensivere/schwächere Färbung oder stärkerer/schwächerer biochemischer Reaktion ausgelesen werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Test-Kit zur Identifikation von Wirkstoffen, das Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt.
Ein weiterer Gegegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) das erfindungsgemäße Verfahren durchführt und so einen Wirkstoff ermittelt und
b) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und/oder pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Auffinden von Wirkstoffen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
Beispiel 1:
Target-Auswahl zur Identifizierung antibiotischer Substanzen im Substitutionsverfahren des Protein-Differenz-Screenings
Targets für das PDS-Substitutionsverfahren zur Identifizierung antibiotischer Substanzen sind essentiell für das vegetative Wachstum des Krankheitserregers unter Vollmedium-Bedingungen und sind konserviert unter Pathogenen. Für die Targets muss im Testorganismus ein funktionshomologes Gen/Protein existieren, das auch für den Testorganismus ein essentielles Gen/Protein darstellt. Das Rohmaterial für die Targetauswahl stellt die Sequenzinformation der Genome in Verbindung mit der Funktionsanalyse der entdeckten Gene dar.
In vielen Fällen unterscheiden sich Proteine, die die gleiche Funktion (in der Regel ist hier die enzymkatalytische Funktion gemeint) im Mensch (bzw. Tier) und im Infektionskeim ausüben (funktionshomologe Proteine), in molekularen Strukturbereichen (Proteindomänen). Es ist davon auszugehen, dass die Störung dieser spezifischen Proteindomänen durch die Bindung von Wirkstoffen, auch zum Funktionsausfall des Gesamtproteins führen kann. Derartige Wirkstoffe wären somit in ihrer hemmenden Funktion spezifisch für das Protein des Infektionskeims, ohne dass die Funktion des isofunktionellen Kontrollproteins (der menschlichen bzw. pflanzlichen Zelle) betroffen ist. Ideale Targets für das hier beschriebene Verfahren zeigen dementsprechend lediglich geringe Sequenzübereinstimmungen mit deren Kontrollproteinen bei gleichzeitiger Funktionsidentität.
Das im Beispiel ausgewählte Target ist die bakterielle Dihydrofolatreduktase. Die Dihydrofolatreduktase katalysiert in einer zweistufigen Reaktion die Reduktion von Folsäure durch NADPH zu Tetrahydrofolsäure, einem wichtigen Coenzym für die Übertragung von C1-Einheiten. Dieses Enzym ist essentiell für das vegetative Wachstum des Infektionskeimes. Des weiteren existieren sowohl im Testorganismus S. cerevisiae als auch im Menschen funktionshomologe Enzyme. Das menschliche Protein, das in dem Verfahren als Kontrollprotein eingesetzt wird, weist eine 47%ige Sequenzähnlichkeit und eine 27% Sequenzidentität zur Dihydrofolatreduktase (FoIA) von E. coli auf.
Beispiele für weitere Targets dieser Target-Katergorie, d.h. bakterielle Targets mit homologen Proteinen in Pilzen (S. cerevisiae) und im Menschen sind funktionshomologe Proteine zu folgenden essentiellen Proteinen der Hefe S. cerevisiae:
Acs2p (Acetyl-Coenzyme A Synthetase), Ala1p (Alanyl-tRNA Synthetase), Hsp60p (heat shock protein; 60kD), Gua1p (GMP synthetase), Kar2p (nuclear fusion protein), IIv2p (Acetolactate Synthase), Gnd1 (6-Phosphogluconate Dehydrogenase), Ths1p (Threonyl tRNA Synthetase), Nfs1p (NifS-like protein), GIn4p (Glutaminyl-tRNA Synthetase), Prp22p (Helicase-like protein), Prp43p (involved in spliceosome disassembly), Eno2p (Enolase), Ssc1p (mitochondria) heat shock protein 70-related protein), Vas1p (Valyl-tRNA Synthetase), Sgv1p (ser/thr protein kinase), Rrp46p (involved in rRNA processing), Krs1p (lysyltRNA synthetase), Prp16p (RNA-dependent ATPase), Cdc19p (pyruvate kinase), Kre30p (strong similarity to members of the ABC transporter family), Dhr2p (RNA helicase, involved in ribosomal RNA maturation), IIs1p (cytoplasmic isoleucyl-tRNA synthetase), Prp2p (RNA splicing factor RNA-dependent NTPase with DEAD-box motif), Yg1245wp (Glutamyl-tRNA synthetase), Pro2p (gammaglutamyl phosphate reductase), Trr1p (Thioredoxin reductase), Erg10 (Acetyl-CoA C-acetyltransferase), Gfa1p (Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase), Hem13p (Coproporphyrinogen III oxidase), Rrp3p (required for maturation of the 35S primary transcript), Ydr341 cp (arginyl-tRNA synthetase), Hem12p (uroporphyrinogen decarboxylase), Gpm1p (phosphoglycerate mutase), Pgk1p (3-phosphoglycerate kinase), Hip1p (histidine permease), Mes1p (methionyl tRNA synthetase), Pma1p (N+-transporting P-type ATPase), Ded1p (ATP-dependent RNA helicase), Fall p (involved in maturation of 18S rRNA), Rnr1p (ribonucleoside-diphosphate reductase), Dbp2p (ATP-dependent RNA helicase of the DEAD-box family), Drs1p (RNA helicase of the DEAD box family), Atm1p (ATP-binding cassette transporter protein), Acc1p (acetyl-CoA carboxylase), Sub2p (RNA helicase), Prp28 (pre-mRNA splicing factor RNA helicase of DEAD box family), Hem 1p (5-aminolevulinate synthase), Pro1p (glutamate 5-kinase), Tpi1p (Triosephosphate isomerase), Hem2p (Porphobilinogen synthase), Ynl247wp (cysteinyl-tRNA synthetase), Hem3p (phorphobilinogen deaminase), Ded81p (asparaginyl-tRNA-synthetase), Ses1p (seryl-tRNA synthetase), Pmi40p (mannose-6-phosphate isomerase), Lcb2p (serine Cpalmitoyltransferase), Guk1p (guanylate kinase), Prs1p (Phosphoribosylpyrophosphate synthetase), Fol3p (Dihydrofolate synthetase), Rer2p (cisprenyltransferase), Fol2p (GTP cyclohydrolase I), Dps1p (aspartyl-tRNA synthetase), Frs2p (Phenylalanyl-tRNA synthetase), Lcb1p (serine Cpalmitoyltransferase), Pro3p (delta 1-pyrroline-5-carboxylate reductase), Ura6p (uridine-monophosphate kinase), Hem15p (Ferrochelatase), Rib2p (DRAP deaminase), Hts1p (histidine-tRNA ligase), Rki1p (Ribose-5-phosphate ketolisomerase), GIn1p (glutamine synthetase).
Weiterhin sind bakterielle Targets interessant, für die keine sequenzhomologen Proteine im Menschen existieren, wohl aber in Pilzen (z.B. der Hefe S. cerevisiae). Als Targetprotein kann hierbei das bakterielle Homologe dienen, als Kontrollprotein das Protein des Pilzes. Treffer die in einem solchen Ansatz erzielt werden sind entweder interessante Fungizide und/oder Antibiotika.
Besonders interessante Beispiele dieser Target-Kategorie sind Homologe der S. cerevisae Proteine Fba1p (Fructose-bisphosphate Aldolase), IIv3p (Dihydroxyacid Dehydratase), Tps1p (alpha,alpha-Trehalose- phosphate Synthase), Ssy1p (regulator of transporters), Rib3p (3,4-Dihydroxy-2-butanone 4-phosphate Synthase), Hom6p (Homoserine dehydrogenase) Erg8p (Phophomevalonat Kinase), IIv5p (Ketol-acid Reduktoisomerase), Fol1p (Dihydroneopterin Aldolase) und RibSp (Riboflavin Synthase).
Ideale Targets für das Protein-Differenz-Screening im Substitutionsverfahren weisen bei Funktionshomologie eine maximale Differenz in der Struktur der beiden homologen Proteine (Target- und Kontrollprotein) auf.
Für die Identifizierung fungizider Substanzen sind daher insbesondere Homologe zu folgenden essentiellen Proteinen der Hefe S. cerevisiae interessant: Thi80p (thiamin pyrophosphokinase), Pfy1p (profilin), Pro1p (glutamate 5-kinase), Vti1p (v-SNARE: involved in Golgi retrograde protein traffic), Ero1p (required for protein disulfide bond formation in the ER), Pro3p (delta 1-pyrroline-5-carboxylate reductase), Cds1p (CDP-diacylglycerol synthase), Ole1p (delta-9-fatty acid desaturase), Erg8p (phosphomevalonate kinase), Fba1p (fructose-bisphosphate aldolase), Tsc10p (3-ketosphinganine reductase), Gna1p (glucosamine-phosphate N-acetyltransferase), Fmn1p (Riboflavin kinase), Fad1p (flavin adenine dinucleotide synthetase), Pgs1p (phosphatidylglycerolphosphate synthase), Fol3p (Dihydrofolate synthetase), Pis1p (CDP diacylglycerol-inositol 3-phosphatidyltransferase), Lcb1p (serine Cpalmitoyltransferase).
Beispiel 2:
Target-Validierung
Ist noch nicht bekannt, ob das ausgewählte Target ein essentielles Gen/Protein des Infektionskeimes darstellt, muss dies noch bestätigt werden. Dies ist auch dann der Fall, wenn putative Targets aufgrund der bekannten essentiellen Funktion eines homologen Proteins in einem verwandtschaftlich nahestehenden Organismus ausgewählt werden. So kennt man beispielsweise alle essentiellen Gene der Bäckerhefe S. cerevisiae ( ca. 1100) und kann dementsprechend mutmaßen, dass die funktionshomologen Proteine in verwandten pathogenen Pilzen auch essentielle Proteine sind und somit interessante Wirkstoffzielorte darstellen. Dies muss jedoch noch nachgewiesen werden beispielsweise durch eine Gendeletion des putativen Targetgens in dem Infektionskeim mit anschließender Phänotypanalyse.
Im Fall der Dihydrofolatreduktase ist bekannt, dass es sich um ein essentielles Enzym von E. coli handelt.
Beispiel 3:
Klonierung der Target- und Kontrollgene in Testorganismus-Expressionsvektoren.
Zur Konstruktion der Teststämme mussten zunächst das Targetgen, die bakterielle Dihydrofolatreduktase (E. coli folA) als auch das Kontrollgen (humane DHFR) in für den Testorganismus geeignete Expressionsvektoren kloniert werden. Als Testorganismus wurde die Bäckerhefe S. cerevisea ausgewählt, von der bekannt ist, dass die Dihydrofolatreduktase (codiert durch DFR1) ein essentielles Protein in dem Organismus darstellt. Dieser Testorganismus ist des weiteren gut geeignet für solche Analysen, da eine große Auswahl molekularbiologischer Werkzeuge wie etwa Expressionsvektoren und regulierbare Promotoren zur Verfügung steht. Als Expressionsvektor dient pDE95, ein Centromerbasierender Vektor, der als Selektionsmarke das HIS3 Gen trägt und einklonierte Gene mittels des Hefe MET25 Promotors exprimiert werden. Zur Klonierung von E. coli folA wurde mittels der Primerkombination ecfolA 5' GGA AAT CGA TAT GAT CAG TCT GAT TGC GG und ecfolA 3' TTC TCT CGA GAA TTA CCG CCG CTC CAG AAT C das Gen aus genomischer E. coli DNS amplifiziert und in pDE95 kloniert (mit molekularbiologischer Methoden, die dem Stand der Technik widerspiegeln). Der resultierende Vektor hat den Namen pDE95-ecfolA. Eine cDNS der humanen DHFR wurde mittels der Primerkombination HDFR 5' CGC TAT CGA TAT GGT TGG TTC GCT AAA CTG und HDFR 3' ACA CCT CGA GAT TAA TCA TTC TTC TCA TAT AC aus einer cDNS Genbank amplifiziert und wie oben beschrieben ebenfalls in pDE95 kloniert. Dieser Vektor besitzt den Namen pDE95-HDFR.
Beispiel 4:
Herstellung der Teststämme für das PDS-Substitutionsverfahren.
Als Testorganismus wurde S. cerevisiae gewählt. Pro Test, d.h. pro zu untersuchendem Target müssen zwei S. cerevisiae Stämme hergestellt werden, einen Targetstamm, dem die eigene Dihydrofolat-reduktase fehlt (durch eine Deletion des endogenen DFR1 -Gen), der dafür aber das Gen für die bakterielle Dihydrofolatreduktase enthält und ein Kontrollstamm dem ebenfalls die eigene Dihydrofolatreduktase fehlt, der dafür aber das Gen für die humane Dihydrofolatreduktase exprimiert.
Einer der beiden Teststämme wird zusätzlich mit einer phänotypischen Marke versehen, hierfür wurde die ADE2-Deletion ausgewählt. Eine Deletion dieses Genlokus führt bei S. cerevisiae zur Akkumulation eines roten Zwischenproduktes (Dorfman, 1969) in der Vakuole. Dieses Pigment besitzt fluoreszierende Eigenschaften und kann mit Licht der Wellenlänge 488 nm (blau) angeregt werden. Das Emmisionsmaximum des Pigmentes liegt im Rotlichtbereich bei 569 nm (Brushi und Chuba, 1988).
Ausgangspunkt zur Herstellung der Teststämme war ein diploider S. cerevisiae Laborstamm (BY4743). Bei diesem wurde eines der beiden Allele des DFR1-Genes deletiert. Dies erfolgt über eine PCR-vermittelte Gendeletion mit kurzen homologen Flanken wie sie beispielsweise in Patent-Nr. WO 99/55907 beschrieben ist und den Stand der Technik darstellt. In diesem diploiden Stamm, der nun heterozygot für den Genlokus DFR1 war, wurde zum einen das Plasmid pDE95-ecfolA und zum anderen das Plasmid pDE95-HDFR eingebracht. Beide resultierende Stämme wurden einer Tetradenanalyse unterzogen, bei der eine Reduktionsteilung induziert wird mit 4 haploiden Sporen als Ergebnis. Zwei der Sporen enthielten die DFR1 Deletion und konnten nur wachsen, weil sie das funktionshomologe Protein/Gen aus E. coli (folA) bzw. des Menschen (HDFR) exprimierten, das nun die Funktion von Dfr1p übernahm.
Um einen der beiden Stämme mit der phänotypischen Marke zu versehen, wurde ein Allel des ADE2-Genes mit dem oben beschriebenen Verfahren in dem S. cerevisiae Laborstamm (BY4743) deletiert. Bei dem resultierenden Stamm wurde die Sporulation induziert. Zwei der Sporen trugen nun die ADE2 Deletion. Eine der ADE2 Mutanten wurde mit den hergestellten Teststämmen gekreuzt und bei den resultierenden Stämmen erneut die Sporulation induziert. In den so erzeugten haploiden Stämmen wurde nach solchen gesucht, die sowohl die DFR1 als auch ADE2 Deletion trugen.
Nach Herstellung der hier beschriebenen Testtämme standen folgende Teststamm-Kombinationen für das weitere Screening zur Verfügung:
Stamm-Kombination A
Targetstamm: BY4743 Δdfr1 + pDE95-ecfolA
Kontrollstamm: BY4743 Δdfr1 Δade2 + pDE95-HDFR und
Stamm-Kombination B
Targetstamm: BY4743 Δdfr1 Δade2 + pDE95-ecfolA
Kontrollstamm: BY4743 Δdfr1 + pDE95-HDFR
Beispiel 5:
Analyse Target-spezifischer Inhibitoren durch das PDS-Substitutionsverfahren (Testorganismus: S. cerevisiae).
Es ist bekannt, das Diamino-Benzylpyrimidine spezifisch die bakterielle Dihydrofolatreduktase inhibieren und eine um mehrere Zehnerpotenzen geringere Affinität zu Dihydrofolatreduktasen von Säugern besitzen. Ein Wirkstoff dieser Substanzklasse ist Trimethoprim, das in der Medizin bereits seit langem zur Behandlung bakterieller Infektionen eingesetzt wird. Diese Substanz bot die Möglichkeit das PDS im Substitutionsverfahren bezüglich seiner Funktionalität und Empfindlichkeit genauer zu analysieren.
Hierzu wurden die Stämme aus Beispiel 4 (Stamm-Kombination A und Stamm-Kombination B) über Nacht angezogen und jeweils Kavitäten einer 96 well Mikrotiterplatte, die 100 μl frisches Medium enthielten mit Stamm-Kombination A bzw. Stammkombination B in einer 1:2000 Verdünnung beimpft. Anschließend wurden 1,5 μl Trimethoprim-Lösung unterschiedlicher Konzentration (500 mM, 250 mM 100 mM, 50 mM, 25 mM, 10 mM, 5 mM, 2,5 mM, 1 mM, 0,5 mM, 0,25 mM, 0,1 mM, 0,05 mM – alle gelöst in DMSO) in die Kavitäten pipettiert.
Die Mikrotiterplatte wurde nun bei 30°C stehend (d.h. nicht schüttelnd) inkubiert. Die Zellen setzen sich dabei rasch ab und das Wachstum findet ausschließlich am Grund der einzelnen Kavitäten statt. Hier existieren nahezu anaerobe Bedingungen, was die Bildung des toxischen roten Pigmentes im ADE2 Deletionsstamm verhindert. Nach 2 Tagen Inkubation befanden sich die Zellgemische in der stationären Wachstumsphase und die Umsetzung des untoxischen Phosphoribosylaminoimidazol zu einem roten Pigment konnte induziert werden. Dazu wurde das Medium in jeder Kavität bis auf wenige μl abgezogen, anschließend das Zell-Sediment in dem Restmedium durch schütteln resuspendiert und diese Suspension für 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Nun erfolgte eine durch den Luftsauerstoff vermittelte Oxidation des akkumulierten farblosen Zwischenproduktes Phosphoribosylaminoimidazol und es wurde in ein nicht näher charakterisiertes farbiges Endprodukt überführt.
Die Auswertung konnte nun ohne weitere Auswertegeräte erfolgen, da der phänotypische Marker das Sediment der Kulturen rot färbte, was mit dem Auge deutlich zu erkennen war. Alle Kavitäten, denen nichts bzw. nur DMSO zugesetzt wurde zeigten einheitlich eine schwache Rosafärbung. In dem Konzentrationsbereich 500 mM – 2,5 mM zeigten die Sedimente der Mischkulturen bei Stamm-Kombination A eine deutliche Rotfärbung (Endkonzentrationen 2,1 mg/ml – 10,5 μg/ml). Im Konzentrationsbereich 1 mM – 0,1 mM zeigten die Sedimente der Stamm-Kombination A eine abgestuft schwächer werdende Rotfärbung hin zur Rosafärbung, die jedoch noch deutlich intensiver und damit gut unterscheidbar von der Rosafärbung der Kontrollen war (Endkonzentrationen 4,2 μg/ml – 0,42 μg/ml). Bei der Konzentration von 0,05 mM zeigte das Sediment der Stamm-Kombination A keinen erkennbaren Unterschied zu den Sedimenten der unbehandelten Kulturen bzw. den DMSO applizierten Kulturen (Kontrollen).
Im Konzentrationsbereich 500 mM – 0,5 mM zeigten die Kavitäten der Stamm-Kombination B einheitlich weiße Sedimente (Endkonzentrationen 2,1 mg/ml – 2,1 μg/ml).
Im Konzentrationsbereich 0,5 mM – 0,05 mM zeigten die Sedimente der Stamm-Kombination B keinen erkennbaren Unterschied zu den Sedimenten der unbehandelten Kulturen bzw. den DMSO applizierten Kulturen (Kontrollen).
Somit steht ein hochempfindlicher Assay zur Verfügung, mit dessen Hilfe Substanzen identifiziert werden, die gegen Targets aus ausgewählten Organismen gerichtet sind ohne ein Kontrollproteine von anderen Organismen (z.B. des Menschen) übermäßig zu inhibieren. Der Assay arbeitet über weite Konzentrationsbereiche, so dass sowohl sehr spezifische als auch weniger spezifische Substanzen identifiziert werden können.
Durch die Wahl unterschiedlicher Start-Verdünnungen der Stamm-Kombinationen kann zudem die Empfindlichkeit des Tests modifiziert werden. Je stärker verdünnt die beiden Teststämme angeimpft werden, umso stärker macht sich eine differentielle Hemmung der Target-/Kontrollstämme bemerkbar (auslesbar durch den phänotypischen Marker).
Beispiel 6:
Übertragung der Assays in das 384 well Format für die Suche nach Targetspezifischen Inhibitoren im High-Throughput Screening (HTS)
Der in Beispiel 5 verwendete Test (Stamm-Kombination A) wurde in Mikrotiterplatten des 384 well Formats übertragen. Diese Mikrotiterplatten stellen ein gängiges Format dar, um im Hochdurchsatzverfahren (High-Throughput Screening) in Substanzbibliotheken nach interessanten Wirkstoffen zu suchen. Hier kann mit Hilfe des neuen Assays nach Wirkstoffen gesucht werden, die spezifisch das bakterielle Targetprotein inhibieren ohne die Funktion des humanen Kontrollproteins übermäßig zu stören.
Die Teststämme wurden über Nacht in Vollmedium angezogen und die Zelldichte der Kulturen auf identische Werte eingestellt. Anschließend wurden die Kulturen ca. 5000fach in frischem Medium verdünnt und vereinigt. Die so erhaltene Zellsuspension wurde gut gemischt und damit die Kavitäten von 384 well Mikrotiterplatten (100 μl) befüllt. Nach Zugabe von 0,8 μl Trimethoprim-Lösung unterschiedlicher Konzentration (5 mM, 1 mM 0,25 mM, 0,1 mM) wurden die Platten für 2 Tage bei 30°C inkubiert und anschließend wie in Beispiel 5 beschrieben behandelt. Die farbliche Auswertung zeigte, dass im Konzentrationsbereich von 5 mM bis 0,25 mM die Sedimente der Mischkulturen deutlich rot gefärbt waren und sich von den unbehandelten Kulturen deutlich unterschieden.
Wird mit Substanzbibliotheken gearbeitet, so ist diese bereits in den Mikrotiterplatten vorgelegt oder wird mittels Pipettierroboter zugegeben. Neben Reinsubstanzen können auch komplexe Extrakte auf Wirksamkeit untersucht werden, da Hefezellen und damit das Screening-Verfahren sehr robust bezüglich Störungen durch Lösungsmittel oder andere Substanzen ist und keine falschpositiven Treffer oder unerwünschtes „Hintergrund-Rauschen" entsteht.
Es werden nur Signale generiert, wenn das Target- und/oder das Kontrollprotein getroffen werden und damit der entsprechende Stamm inhibiert wird. Dies erspart ein zeit- und kostenaufwändiges Aufreinigen komplexer Extrakte. Die Platten werden nun für 2 Tage bei 30°C bebrütet und anschließend ausgewertet. Zur Auswertung eignen sich Fluorimeter (aufgrund der fluoreszierenden Eigenschaften des akkumulierten Pigmentes) oder Systeme die Farbintensitäten (CCD-Kameras) messen können.
Mit Hilfe eines FACS Gerätes kann sogar die zahlenmäßige Zusammensetzung der einzelnen Kavität-Kulturen bestimmt werden, was eine sehr genaue Aussage über das spezifisch hemmende Potential einer Substanz zulässt.
Um falsch-positive auszuschließen, werden alle Substanzen, die ein Signal erzeugt haben („Hits") überprüft, ob sie auch ein Signal mit Stamm-Kombination B erzeugen. Hierzu werden die Stämme dieser Stamm-Kombination über Nacht in Vollmedium angezogen und die Zelldichte der Kulturen auf identische Werte eingestellt. Anschließend werden die Kulturen ca. 5000fach in frischem Medium verdünnt und in einem Verhältnis 80% Targetstamm (BY4743 Δdfr1 Δade2 + pDE95-ecfolA) zu 20% Kontrollstamm (BY4743 Δdfr1 + pDE95-HDFR) vereinigt. Die so erhaltene Zellsuspension wird gut gemischt und damit erneut die Kavitäten von 384 well Mikrotiterplatten (50 μl) befüllt. Nun werden die Hit-Substanzen des ersten Screeningdurchlaufs (Screening mit Stamm-Kombination A) zugesetzt.
Die Platten werden für 2 Tage bei 30°C bebrütet und anschließend ausgewertet. Die Sedimente der Kontrollen, d.h. Kavität-Kulturen denen nichts bzw. nur DMSO zugesetzt wurde, zeigen eine deutliche Rotfärbung. Substanzen, die Target-spezifisch die bakterielle Dihydrofolatreduktase inhibieren, führen zu einer Abnahme der roten Farbintensität (im Vergleich zur Kontrolle) bis hin zu weißen Sedimenten. Substanzen die nicht wirkortspezifisch den Stamm mit der bakteriellen Dihydrofolatreduktase inhibieren sondern möglicherweise im ersten Screeningdurchlauf ein Signal erzeugt haben, weil sie dem Kontrollstamm (BY4743 Δdfr1 Δade2 + pDE95-HDFR) einen Selektionsvorteil aufgrund der ADE2-Deletion verliehen haben, sind hier nicht in der Lage die Farbe des Se diments von rot nach weiß zu verschieben, sondern führen auch hier zu einer Farbintensivierung des roten Sediments.
Somit sind nach diesen beiden Screeningdurchläufen Substanzen identifiziert, die spezifisch an dem Wirkort Dihydrofolatreduktase ansetzen und zugleich selektiv das bakterielle Enzym stärker inhibieren als das humane Kontrollenzym.
Beispiel 7:
Analyse Target-spezifischer Inhibitoren durch das PDS-Verfahren (Testorganismus: E. coli)
Für das gleiche Target (Dihydrofolatreduktase) kann auch mit Hilfe eines bakteriellen Testorganismus (z.B. Escherichia coli) nach Wirkort-spezifischen Wachstumsinhibitoren gesucht werden.
Hierzu wird das Gen, das für die humane Dihydrofolatreduktase kodiert, in einen E. coli Expressionsvektor kloniert. Als Promotoren können hierbei sowohl regulierbare (lac, tac, trp, T7, araB, phoA) als auch konstitutive Promotoren Einsatz finden. Dieses Plasmid wird durch eine Transformation (z.B. Elektroporation) in den E. coli Kontrollstamm eingebracht. Der Targetstamm enthält kein Plasmid, bzw. nur einen leeren Vektor. Somit unterscheiden sich Kontroll- und Targetstamm nur in einem genetischen Merkmal und zwar in der zusätzlichen Expression der humanen Dihydrofolatreduktase in dem Kontrollstamm. Hemmt nun eine Substanz spezifisch die bakterielle Dihydrofolatreduktase (folA), so führt dies zu einer spezifischen Wachstumshemmung des Targetstammes.
Zusätzlich enthält der Kontrollstamm (alternativ der Targetstamm) noch ein Plasmid, das die konstitutive Expression des Grün-fluoreszierenden Proteins (GFP) gewährleistet. Der Kontroll- und der Targetstamm werden angezogen, gemischt und die Kavitäten einer Mikrotiterplatte (befüllt mit frischem Medium) dünn beimpft. Nun werden Substanzen (bzw. ganze Substanzbibliotheken) zugegeben und anschließend bei 37°C inkubiert.
Nach Erreichen der stationären Wachstumsphase (über Nacht Inkubation) wird die Zusammensetzung der Kavität-Kulturen mit Kontroll- und Targetstamm durch die GFP-Fluoreszenz jeder einzelnen Kavität mittels Fluorimeter ermittelt. Kavitäten, die eine erhöhte Fluoreszenz zeigen enthalten mehr Zellen des Kontrollstammes, was auf eine selektive Hemmung des Tagetstammes (und damit der bakteriellen Dihydrofolatreduktase) hinweist.
Beispiel 8:
PDS-Haploinsuffizienz-Screening
In diploiden Organismen ist unter optimalen Bedingungen (z.B. Vollmedien für Mikroorganismen) zumeist eine Kopie eines Genes ausreichend für das normale Wachstum des Organismus.
Werden jedoch die Wachstumsbedingungen geändert, z.B. durch Zugabe von Wirkstoffen, die spezifisch gegen das Genprodukt (Protein/Enzym) des verbliebenen Allels gerichtet sind, wird häufig eine Haplo-insuffizienz induziert, da der primäre Effekt des Wirkstoffes eine weitere Beinträchtigung der Funktion des verbliebenen Proteins bedingt. Nun ist die Menge und damit die Aktivität des Proteins (z.B. Enzym-katalytische Aktivität) bei Organismen, die nur ein Allel des entsprechenden Genes besitzen nicht mehr ausreichend, um ein normales Wachstum der Zelle zu gewährleisten. Es treten Wachstumsphänotypen auf, wohingegen Wildtypzellen (2 Allele des Genes) bei gleicher Wirkstoffkonzentration weniger oder noch gar nicht beeinflusst werden (Gendosiseffekt).
Haploinsuffizienz, d.h. Auftreten von Phänotypen beim Ausfall eines Allels der ca. 1100 essentiellen Gene wird insbesondere bei dem Testorganismus S. cerevisiae sehr selten beobachtet. Durch Zugabe Wirkort-spezifischer Wach stumsinhibitoren, kann jedoch sehr einfach eine Haploinsuffizienz induziert werden. Diese Tatsache wurde bereits genutzt, um in S. cerevisae die Wirkorte verschiedener Substanzen näher zu charakterisieren (Giaever et al., 1999). Hierzu werden zahlreiche 2n hetreozygote Stämme, bei denen je ein Allel eines essentiellen Genes deletiert wurde gemischt. Die Kultur wurde geteilt, eine Hälfte wurde mit einem Wirkstoff versetzt, der in höherer Konzentration toxisch auf die Hefe wirkt, währen die andere Hälfte unbehandelt blieb. Wirkt nun die Substanz ortspezifisch auf eines der essentiellen Gene/Proteine, dann wird der Stamm, der genau für dieses Gen haploid ist stärker gehemmt als die anderen Stämme des Gemisches.
Bisherige Verfahren haben sich zunutze gemacht, dass jede Deletionskassette mit der ein Allel in S. cerevisiae deletiert wurde eine Gen-spezifische 20bp lange Sequenz enthält. Mit Hilfe dieser Sequenzen ist jeder Gendeletionsstamm mittels molekularbiologischer Methoden identifizierbar (PCR). Von beiden Gesamtkulturen wird nun chromosomale DNS isoliert, die spezifischen Sequenzen aller Stämme mittels PCR amplifiziert und mit den so erhaltenen PCR-Produkten letztendlich über DNA-Array-Analysen die Repräsentation der einzelnen Stämme in den Kulturen ermittelt. Durch die Information, welche Stämme in der Kultur mit Wirkstoff selektiv gehemmt werden, können letztendlich Aussagen über den Wirkmechanismus gemacht werden, idealer Weise kann das Target identifiziert werden.
Dieses Verfahren ist sehr interessant um Wirkorte und Wirkmechanismen zytotoxischer Extrakte zu identifizieren. Durch dieses Wissen kann in einer sehr frühen Phase das Potential z.B. antifungaler Wirkstoffe abgeschätzt werden. Jedoch ist dieses Verfahren bisher nur mit Hilfe aufwendiger und technisch anspruchsvollen DNA-Array-Analysen durchführbar und völlig ungeeignet um Substanzen im HTS zu untersuchen.
Mit Hilfe des PDS-Haploinsuffizienz-Screening wird das Verfahren massiv vereinfacht. Eine Sammlung 2n heterozygoter Stämme, bei denen je ein Allel eines essentiellen Genes deletiert wurde (Δess. gen/ESS.GEAn, wurde stark verdünnt und in zwei Kavitäten einer Mikrotiterplatten vorgelegt. Ein diploider Stamm bei dem beide Allele des ADE2 Genes deletiert wurden (Δade2/Δade2), wurde mit frischem Medium verdünnt und je 100 μl in die Kavitäten zu den vorgelegten Stämmen gegeben. Die beiden Stämme einer Kavität lagen in gleicher Verdünnung vor. Nun wurde die Hälfte der Kavitäten (jedes Stammgemisch einmal) mit einer subletalen Dosis Ketoconazol (1,5 μl einer 0,05 mg Ketokonazol /ml DMSO), die andere Hälfte mit DMSO versetzt.
Die Platten wurden für zwei Tage bei 30°C inkubiert, die Bildung des roten Farbpigmentes induziert (wie in Bsp. 5 beschrieben) und anschließend ausgewertet. Ketokonazol ist eine antifungale Substanz, die spezifisch die Aktivität der Lanosterol Demethylase (Erg11p) hemmt. Im PDS-Haploinsuffizienz-Screening sah man dementsprechend ein deutliches rotes Signal in der Kavität mit der Stammkombination Δade2/Δade2 + Δerg11/ERG11, der Ketoconazol zugegeben wurde, im Vergleich zur Kontrolle mit DMSO. Dieses unterschiedliche Färbungsverhalten ist spezifisch für diese Stammkombination, alle anderen Stammkombinationen zeigten keine unterschiedliche Färbung zwischen der Wirkstoff- und der Kontroll-Kavität.
Mit Hilfe diese Verfahrens ist die weiter oben beschriebene DNA-Array-Analyse massiv vereinfacht worden und es kann nun mit einfachen Mitteln der Wirkmechanismus für eine Vielzahl antifungaler Substanzen näher charakterisiert werden, indem deren differenzielle Wirkung auf den Wildtyp im Vergleich zur Wirkung auf den 2n heterozygoten Deletionsstamm untersucht wird.

Claims

Hochdurchsatz-geeignetes Screening-Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) einen Zielorganismus auswählt, den die zu identifizierenden Wirkstoffe inhibieren oder abtöten sollen, b) ein Zielgen auswählt, das oder dessen Genprodukt durch die zu identifizierenden Wirkstoffe deaktiviert werden soll, c) einen zu schützenden Organismus auswählt, der vor Schädigung durch den Zielorganismus bewahrt werden soll, d) einen Testorganismus auswählt, der ein dem Zielgen funktionshomologes Testgen trägt, e) zwei Teststämme eines Testorganismus konstruiert, die sich genotypisch in genau zwei Merkmalen unterscheiden, nämlich i. in dem Zielgen, dadurch, daß einer der Teststämme eine höhere Dosis eines das Zielgen oder dessen Genprodukt deaktivierenden Wirkstoffes toleriert als der andere Teststamm und ii. in einem Gen, das für eine gut detektierbare Eigenschaft kodiert, für die Vitalität und Proliferationsfähigkeit des Testorganismus aber nicht essentiell ist, f) beide Teststämme mischt und gemeinsam inkubiert, g) einen potentiellen Wirkstoff zugibt und h) anhand des gegebenenfalls unterschiedlich starken Wachstums der beiden Teststämme einen Wirkstoff identifiziert
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Zielorganismus ausgewählt ist unter Menschen und Mikroorganismen, insbesondere pathogenen Organismen, vorzugsweise unter pflanzen-, tier- und/oder humanpathogenen Organismen, bevorzugt unter humanpathogenen Pilzen oder Bakterien.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Zielgen ausgewählt ist unter Genen, die essentiell für das vegetative Wachstum des Zielorganismus sind, insbesondere alle Zielgene eines Zielorganismus, die Funktionshomologe zu essentiellen Genen von S. cerevisiae darstellen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der zu schützende Organismus ausgewählt ist unter Tieren, Pflanzen und Mensch.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Testorganismus ausgewählt ist unter Prokaryoten, wie Spezies der Gattungen Bacillus (B. subtilis), Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. planticola), Lactobacillus (L. delbruckii, L. lactis), Pseudomonas (P. aeroginosa, P. fluorescens) Salmonella (S. typhimurium) Serratia (S. marcescens) Streptococcus (S. lactis, S. mutans, S. pyogenes), Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis) Vibrio (V. cholerae) Yersinia (Y. ruckeri), insbesondere Escherichia coli und Bacillus subtilis und Eukaryoten, wie Hefen, insbesondere Spezies aus den Gattungen Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Ashbya, Hansenula, Pichia, besonders bevorzugt Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe oder Candida albicans, ganz besonders bevorzugt Saccharomyces cerevisiae Stämme, bevorzugt die Stämme CEN.PK2, BY4743, BMA46 (W303), FY1679 sowie deren haploide Derivate.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es in einer Mehrzahl paralleler Ansätze durchgeführt wird.
Test-Kit zur Identifikation von Wirkstoffen, das Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß man c) das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 durchführt und so einen Wirkstoff ermittelt und d) als wirksam befundene Wirkstoffe mit kosmetisch und/oder pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder des Test-Kits nach Anspruch 7 zum Auffinden von Wirkstoffen.