JP2000509607A

JP2000509607A - 必須生存遺伝子の同定

Info

Publication number: JP2000509607A
Application number: JP9540039A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムティンバーレイク; ビクトリアガブリアス
Original assignee: ミリニウムファーマシューティカルズインク．
Priority date: 1996-05-06
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2000-08-02
Also published as: CA2253600A1; EP0912594A4; AU715699B2; US5756305A; US5976828A; US6207407B1; EP0912594A1; US5821076A; WO1997042210A1; AU2930697A

Abstract

(57)【要約】制限増殖条件下にて株をインキュベーションするとき、生存に必須である条件致死変異を有する株を同定するための方法、ならびにその遺伝子産物および遺伝子機能を同定する方法について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】必須生存遺伝子の同定発明の背景本発明は、生存に必要な遺伝子および対応する遺伝子産物を同定する方法に関する。発明の概要本発明は、生存に必須の遺伝子中に致死条件感受性突然変異を保有する株を同定するための方法を特徴とする。この方法は、（a）第1の許容条件下にて生物（例えば、細胞）を増殖させる段階と；（b）少なくとも2サイクルの増殖周期（例えば、細胞周期）と同等な期間にわたって、段階（a）の生物を制限条件に暴露する段階と；（c）少なくとも10サイクルの増殖周期（例えば、細胞周期）と同等な期間にわたって、第2の許容条件に段階（b）の生物を移行する段階を含む。この処理後に、（i）段階（b）の制限条件に暴露したとき増殖せず、（ii）段階（c）の第2の許容条件に戻したとき増殖を再開しなかった変異生物を選択する（段階（d））。この選択過程は、非致死変異または静的変異を有する株から、致死変異を有する株を分離する。一般に、選択された株は、制限条件に感受性を示し、且つ増殖に必須である遺伝子を有する。制限条件に一時的に移行することによって、遺伝子産物が損失する；この損失は生物にとって致死的である。例えば、変異遺伝子の遺伝子産物は制限条件下では機能を示さない。本発明の別の局面は、株中の必須遺伝子を同定するための方法を特徴とする。この方法は、（a）第1の許容条件下にて生物（例えば、細胞）を増殖させる段階と；（b）少なくとも2サイクルの細胞周期と同等な期間にわたって、段階（a）の生物を制限条件に暴露する段階と；（c）少なくとも10サイクルの細胞周期と同等な期間にわたって、段階（b）の生物を第2の許容条件に移行する段階と；（ d）致死変異を有し、（i）段階（b）の制限条件に暴露したとき増殖せず、（ii ）第2の許容条件に移行したとき増殖しなかった株を選択する段階と；（e）段階（d）で選択され、劣性条件致死変異を保有する株を同定する段階と；（f）段階（e）の株から、劣性条件致死変異をコードする遺伝子に相当する遺伝子を同定する段階とを含む。好ましくは、増殖しないということは、少なくとも3対数分の死滅と定義され、すなわち、1000個の細胞を許容条件下にて増殖させ、制限条件に移行し、次いで第2の許容条件に移行する場合に、統計学的に999個の細胞が死滅する。この閾値は、より感受性の強い条件変異を同定することを意図している。増殖しないということはまた、1.5、2、3.5、4または5対数分の死滅と規定することもできる。別の局面は、殺生物剤（例えば、抗菌、抗寄生虫または殺虫）の遺伝子産物標的を同定するための方法であって：（a）第1の許容条件下にて株（例えば、真菌、細菌、寄生虫または昆虫）を増殖させる段階と；（b）少なくとも2サイクルの増殖周期と同等な期間にわたって、段階（a）の株を制限条件に暴露する段階と；（c）少なくとも10サイクルの増殖周期と同等な期間にわたって、段階（b）の株を第2の許容条件に移行する段階と；（d）条件致死変異を保有する遺伝子を有する株を選択する段階と；（e）条件致死変異に相当する遺伝子産物を同定することによって、殺生物剤の遺伝子産物標的を同定する段階とを含む方法である。変異生物（株）が同定されたら、一般に、変異を保有する遺伝子を形質転換、増幅、単離、精製および配列決定するための通常の技法を使用することができる。必須生存遺伝子は増殖（例えば、代謝、分割または生殖）に必要である。このような遺伝子および遺伝子産物は、抗真菌剤、抗菌剤および抗寄生虫剤；殺虫剤ならびに予防抗菌剤などの治療薬を開発する際に有用である。治療薬は増殖を低下もしくは防止、または病原性もしくは病毒性を低減することができ、好ましくは生物を死滅させることができる。本発明によって同定される遺伝子および遺伝子産物はまた、確立された感染を治療する際に有用である薬剤に加えて、例えば細菌のバイオフィルムの確立を阻止することによって、微生物の感染を予防する際に有効である抗菌剤を開発するために使用することができる。本発明の他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明、実施例および添付の請求の範囲から明らかになると思われる。発明の詳細な説明本発明は、条件感受性致死変異、および結果として生ずるその遺伝子産物を有する変異生物を同定する方法を特徴とする。開示する方法は、生存に必須である遺伝子および対応する遺伝子産物を迅速に同定するための、ゲノムまたは変異ライブラリーの高分析量（例えば、96穴プレートの使用）スクリーニングに有用である。インキュベーション期間、温度、抗生物質の濃度、塩、pH等を含む制限条件を変更することによって、および「致死」（どれだけの対数分の死滅）の閾値レベルを変更することによって、株を条件ごとに分類することができる。選択された株は制限条件下では生存できない。この致死変異の影響は、生物を許容条件に移行しても復帰または克服され得ない。従って、選択された遺伝子およびその産物は、制限条件下でのその生物の生存に必須である。一方、非致死的または静的変異を有する株は制限条件下では非常に緩徐にしか増殖しないか、または活動していないとも思われるほどである。静的変異の影響は回復可能である；静的変異を有する生物は許容条件に移行すると、代謝および増殖を再開する。条件感受性致死変異生物を選択することによって、致死変異を保有する遺伝子を同定すること、および対応する遺伝子産物が存在するならそれを同定することが可能になる。条件致死変異によって、制限条件下では機能しない遺伝子またはタンパク質が生ずる。非機能遺伝子はプロモーターに欠陥があり、その結果、遺伝子の発現が低下したりまたは異常となることがある。非機能タンパク質は立体配座に欠陥を有し、タンパク質の不適正な折りたたみやタンパク質の異常な分解を生じることがある。不適正なタンパク質の折りたたみによって、折りたたみ、未変性基質の認識および／または基質との結合および放出が部分的または完全に不可能となることがある。細菌または真菌などの生物の必須遺伝子を同定することより治療薬を開発することができる。好ましくは、本明細書に開示する方法によって同定される遺伝子産物（例えば、タンパク質またはRNA分子）は殺生物剤または抗真菌剤などの既存の薬物によって標的とされる遺伝子産物とは異なる。開示する遺伝子の選択方法により、遺伝子産物がその生物の生存に必須であることが確認される。従って、このように同定される遺伝子産物は、既存の薬物の機序とはおそらく異なる機序に基づく治療の新規標的となる。同様に、例えば元の変異株に見られるものに似た表現型または形態を形成することにより、本明細書に開示する方法によって同定される遺伝子産物の機能を阻害する化合物も既知の化合物とは異なる。本発明の一局面によると、薬物の標的である遺伝子および好ましくは遺伝子産物を同定するために変異体集合物を系統的にスクリーニングする。例えば、抗微生物剤（例えば、抗菌剤または抗真菌剤）は、同定された遺伝子または遺伝子産物標的に可逆的または好ましくは非可逆的に結合することにより、その機能を損なうことによって殺生物剤となりうる。遺伝子産物標的の機能（または合成もしくは全過程）が損失することにより、微生物の増殖が阻止され、好ましくは微生物が死滅する。この局面は、本明細書に開示する方法によって同定される変異配列のうち野生型配列に相当する遺伝子産物を試験薬剤に暴露する段階と；遺伝子産物の機能を（好ましくは選択的に）損なう薬剤を選択する段階とを含む殺生物剤を同定するための方法を含む。この選択は、結合定数、用量−応答曲線または他の阻害および結合測定値などの通常測定されるパラメーターに基づいていてもよい。一局面において、制限条件には健康または感染哺乳類（例えば、ヒト）の体温と同じ温度または体温付近温度が含まれる。この場合には、選択された遺伝子は、人体温度または人体温度付近における例えば真菌の生存に必須である。本発明の一局面において、変異は温度感受性である（ts）。致死変異を保有する株を同定した後、遺伝子の配座、機能および配列並びに対応するタンパク質を決定することができる。これらの標的の作用機序を解明することは、本方法に使用する細胞および関連する細胞種に致死的または死滅的な治療薬を設計するための合理的な基礎となる。殺生物剤の遺伝子産物標的を同定するための方法の一態様において、制限条件は温度を変更することを含み、条件致死変異は温度−感受性変異または低温感受性変異である。一般に、本方法は大規模スクリーニングに使用されるので、少なくとも50株または75株を含み、好ましくは96穴プレートを使用することによって段階（a）〜（c）では96株の整数倍を含む。A ．致死変異本発明は、一部には、制限増殖条件下で増殖できない少なくとも2種の株（例えば、細胞）：（a）致死変異を有する株、および（b）非致死または静的変異を有する株が存在するということを認識することに、基づいている。殺菌薬は例えば、静菌薬より一般に望ましいので、一般に、致死変異を有する株は治療に関する研究に対して大きな関心となる。本発明によると、致死変異を有する株は2つの基準を満たさなければならない。第1に、生物は、少なくとも2サイクルの増殖周期にわたって制限条件に暴露されると、増殖することができない。少なくとも2サイクルの増殖周期の例としては、少なくとも3、4、5、7、8、10またはそれ以上の増殖周期が含まれる。増殖の測定には、RNA合成、DNA合成、タンパク質合成、膜の形態、細胞分裂または生殖の有無およびATP濃度が含まれる。従って、増殖ができないことの例としては、重篤な膜の変形、DNA（またはRNAもしくはタンパク質）合成の低下または損失、溶菌、ATP枯渇、細胞分裂または生殖の失敗、さらに生物の死滅も含まれる。第2の基準は、所与の期間にわたってこのような生物を制限条件から第2の許容増殖条件に移行しても、その生物を蘇生しないかまたは増殖を回復しないことである。この生物は少なくとも1つの致死変異を保有し、その産物は制限条件に感受性を示し、回復しない。この変異を保有する遺伝子は、制限条件下でのインキュベーション期間中の増殖に必須である。本発明の一局面によると、非致死的または静的変異を保有する株は、発現が回避される、すなわち選択されない。非致死または静的変異を有する株は制限条件下で増殖および生殖することができないが、制限条件から第2の許容増殖条件に移行すると増殖を再開する。実質的に正常な増殖のこのような再開は、許容条件下での2サイクル以上の増殖周期の後に一般に見られる。ある場合には、代謝または増殖が遷移期間中は最初は緩徐であることがある；また、増殖は、増殖の数サイクルにわたって、通常より緩徐であることがある。どちらの場合でも、静的変異を有する株は、本明細書に使用する致死変異の第2の基準を満たさない。致死的変異を静的または非致死的変異から識別できるほど十分な期間にわたって、株を第2の許容増殖条件に移行する。この期間は、増殖または死滅を検出する方法によって異なるが、一般に増殖周期の複数倍と同等である（例えば、少なくとも2、4、6、8、10、15または20周期）。生物および制限条件と許容条件との差に応じて、増殖は遅延することもあり、また増殖率は安定化の前の遷移期間中に増加することもある。増殖は、コロニー細胞塊の拡大、細胞培養懸濁液の濁度の増加、細胞または生物の染色、DNA合成およびタンパク質合成を含む、当業者に周知の方法によって測定することができる。本発明の一局面は、許容温度で機能的であるタンパク質を産生する致死変異を同定するための方法を提供する。許容条件は、変異体の増殖（または増殖率）が、許容条件下での野生型の増殖（または増殖率）の少なくとも約75%である任意の条件である。一般に、制限条件下での野生型の増殖率は、許容条件下での野生型の増殖率の約25%以上であり、好ましくは約50%以上である。細菌では、制限条件は温度を含み、第1の許容温度と制限温度との差は5〜20℃であり、好ましくは5〜15℃である。本発明によると、真菌生物における温度感受性致死変異は、許容温度から5 〜15℃異なる温度、好ましくは5〜12℃異なる温度での真菌の増殖に必要な遺伝子の変異である。少なくとも2サイクルの細胞周期の間、許容温度（例えば、至適増殖温度の数度以内）と数度異なる温度（例えば、少なくとも5、7、8または1 0℃高いまたは低い）に一旦暴露すると、条件ts致死変異を有する株は、許容条件に移行したとき、増殖を再開しない。B ．条件変異条件変異は、タンパク質が制限条件下で正常に機能することができない（例えば、基質と結合する、または基質から遊離する）変異である。一局面において、遺伝子産物の立体配座の変化を生ずる劣性条件変異を保有する遺伝子は治療標的として好ましい。この局面により、劣性条件致死変異を保有する株を選択する段階を含む方法が提供される。株が制限条件下にて生存できないことによって証明されるように、ヌル変異によって、遺伝子産物が消失する。優性致死変異は、制限条件下で別のタンパク質などのリガンドと結合することができるが、リガンドから遊離することができないタンパク質を産生する。野生型DNAの細菌ライブラリーの形質転換は、劣性および優性変異の同定を可能にする。劣性変異は、変異を相補するクローンによって救済されるので、制限温度で株を増殖させることができる。優性変異を保有する株は形質転換によって救済されず、制限温度で増殖することができない。真菌では、野生型対立遺伝子および致死変異を保有する2倍体または部分的2倍体を単離することによって、変異が劣性であるか優性であるかを決定することが可能である。C ．優先順位決定、相補および遺伝子の機能開示する方法は、致死変異を保有する細胞を非致死または静的変異を保有する細胞から効率的に識別する。致死変異を同定することにより、種々の経路を介して、対応する遺伝子および遺伝子産物が効率的に同定される。次いで、分子生物学の当業者に公知のいくつかの方法の任意なものによって、望ましい条件変異をマッピングおよび／または配列決定する。株を選択したら、形質転換、増幅、単離および配列決定の従来の方法を使用して、遺伝子を同定し、配列を決定する。好ましくは、次の節または実施例に記載する任意の方法と組み合わせて従来の方法を使用する。例えば、一態様は、変異を保有する遺伝子を選択した株から単離するさらに別の段階を含む。他の態様は、変異を保有する遺伝子の機能を同定するさらに別の段階と、変異を保有する遺伝子の配列を決定するさらに別の段階とをそれぞれ含む。相補が複数遺伝子を有するDNAに関係する場合、トランスポゾン突然変異は、t s変異を相補する個々の遺伝子を同定することができる（実施例4）。DNA合成、R NA合成、タンパク質合成、タンパク質分泌または細胞エンベロープ強度などの、変異が影響する遺伝子機能または表現型を同定することによっても、遺伝子の優先順位を決定することができる（実施例5）。開示する方法により同定される遺伝子を、遺伝的相補性によってプラスミド、コスミドまたはファージ遺伝子ライブラリーからサブクローニングすることができる。開示する方法は、遺伝子ライブラリーの工業規模の高通過量スクリーニングに好適である。D ．生物許容条件下で株を増殖させる第1の段階（a）を始めるとき、原則的には1倍体である任意の種類の生物または細胞を使用することができる。同型接合変異を受けやすい非1倍体生物（例えば、シロイヌナズナ（arabidopsis)）を使用することもできる。速度が望ましい場合は、平板培養することができる生物または細胞が好ましい。症候性宿主もしくは無症候性宿主または天然の環境から生物を入手することができる（例えば、分解した有機材料上に増殖する細胞コロニー、空中浮遊細胞および氷中に補足された細胞または水溶液中で見つけられる細胞）。宿主としては植物（例えば、食用作物、樹木または繊維作物）、ならびに哺乳類（例えば、ヒト）または家畜（ウマ、ウシ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、マウス、ラット）、鳥類、魚類および両生類などの動物が含まれる。本方法に用いられる生物には、細菌、真菌、酵母、線虫（例えば、C.エレガンス（C．elegans））、原生生物（例えば、テトラヒメナおよびゾウリムシ）、ラマピペンス（Rama pipens ）およびキイロショウジョウバエ（Drosophila spp.）が含まれる。細菌株は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、化膿連鎖球菌（Strep tococcus pyogenes）（A群）、ストレプトコッカスspp.（Streptococcus spp.）（ビリダンス群）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus agal actie）（B群）、S.ボビス（S.bovis）、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、およびエンテロコッカスspp.（Ente rococcus spp.）などのグラム陽性球菌；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、およびブランハメラ・カタラリス（Branhame lla catarralis）などのグラム陰性球菌；炭疸菌（Bacillus anthracis）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）およびジフテロイドである（好気性および嫌気性）コリネバクテリウム（Corynebact erium）種、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、破傷風菌（Clostridium tetani）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロバクター（Enterobakuter ）種、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirablis）および他の種、緑膿菌（Ps eudomonas aeruginosa）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia e）、サルモネラ（Salmonella）、シゲラ（Shigella）、セラチア（Serratia）並びにカンピロバクター・ジェジュニ（Campyrobacter jejuni）などのグラム陽性桿菌を含む。細菌感染によって、菌血症、肺炎、髄膜炎、骨髄炎、心内膜炎、副鼻腔炎、関節炎、尿路感染症、破傷風、壊疸、大腸炎、急性胃腸炎、気管支炎および種々の膿瘍、院内感染症並びに日和見感染などの疾患が生じる。真菌生物は、皮膚糸状菌（例えば、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）および他のM.spp.；および紅色白癬菌（T．rubrum）および毛瘡菌（T.mentagrophyte s）などの白癬菌（Trichophyton）spp.）、酵母（例えば、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、C.トロピカリス（Tropicalis）、または他のカンジダ（Candida）種）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ）、トルロプシス・グラブラータ（Torulopsis glabrata）、エピデルモフィトン・フロッコーサム（Epidermophyton floccosum）、癜風菌（Malassezia furfu r）（ピチロスポルム・オービキュラーレ（Pityropsoporon orbiculare）または P.オバーレ（ovale））、クリプトコッカス・ネオフルマンス（Cryptococcus ne oformans）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）および他のアスペルギルス（Aspergillus）spp.、接合菌綱（Zygomycetes）（例えば、クモノスカビ（Rhiz opus）、ケカビ（Mucor））、パラコクシディオイデス・ブラジリエンシス（Par acoccidioides brasiliensis）、ブラストミセス・デルマチジス（Blastomyces dermatitides）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、コクシディオイデス・イミチス（Coccidioides immitisi）、並びにスポロトリックス・ジェンキ（Sporothrix schenckii）を含む。真菌感染症（真菌症）は、表皮性、皮下性または全身性である。表在性真菌症は、頭部白癬、躯幹白癬、足部白癬、爪真菌症、爪周囲真菌症、癜風、口腔カンジダ症、並びに膣カンジダ症、気道カンジダ症、胆管カンジダ症、食道カンジダ症および尿路カンジダ症などの他のカンジダ症を含む。全身性真菌症は、全身性および粘膜皮膚カンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギルス症、ムコール症（藻菌症）、パラコクシジオイデス症、北米ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、およびスポロトリクム症を含む。真菌感染症も髄膜炎および肺または気道疾患の一因となる。日和見真菌感染症は、特にAIDS患者などの免疫寛容患者において増殖している。好ましい生物は、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎連鎖球菌（ Streptococcus pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、アスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）およびアスペルギルス・ニデュランス（A spergillus nidul ans）を含む。グッドマン（Goodman）・ギルマン（Gilman）の薬物治療の薬理学的基礎（Pharmacological Basis of Therapeutics）（8版、1990年)、表44-1、1 024〜1033ページ、病原菌、疾患および最新の治療薬の追加（Additional pathog ens，diseases，and current therapeutic agents）参照。上記の細胞は一般に、例えば、ATCC（American Type Culture Collection）から入手可能である。E ．変異誘発細胞の起源がなんであろうと、細胞を突然変異させることができる。変異原は、1つ以上の塩基に作用することにより、または核酸内に組み入れられることによりDNAの変更を誘発する。細菌では、死滅率は好ましくは90%である（生存は10 %以下である）。酵母および真菌では、望ましい致死変異を保有する株をクローニングするために許容条件下で生存可能な細胞が必要であるので、変異細胞を増殖させたとき（例えば、レプリカ平板培養）の生存率が20〜50%（例えば、30%）であることが好ましい。化学的変異原は、エチルメタンスルホネート（EMS）、メチルメタンスルホネート（MMS）、メチルニトロソグアニジン（NTG）、4-ニトロキノリン-1-オキサイド（NQO）、2-アミノプリン、5-ブロモウラシル、ICR 191および他のアクリジン誘導体、亜硫酸ナトリウム、臭化エチジウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、 N-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトログアニジン、およびアルキル化剤を含む。物理的な変異原は、紫外線およびx線照射を含む。変異誘発は、当技術分野で周知の方法によって実施される（例えば、分子生物学の最新のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）1995年、 2巻、13.3節、（引用された参考文献は全て日付が1990年またはそれ以前である）を参照）。好ましくは、濃度（化学的変異誘発）または強度（例えば、紫外線変異誘発）および期間などの変異誘発条件を最適化して、変異率を高めると共に暴露細胞中の死滅量を最小にする。一般に、準最適温度は細胞の死滅を低減することが判明しているので、この種の生物の最適増殖温度より低い温度で変異誘発を実施する。例えば、暴露時間を一定にし、変異原濃度を変化させて生存曲線を作図することもできるし、または暴露時間を変化させ、変異原濃度を一定にして生存曲線を作図することもできる。例えば、アデルバーグ（Adelberg）ら、バイオケミカルバイオフィジカルリザーチコミュニケーション（Biochem．Bioph ys．Res．Comm.）18:788 1965参照。死滅曲線または生存曲線は変異誘発頻度を示す。ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseu domonas aeruginosa）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、およびリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）について、ニトロソグアニジンの至適濃度がそれぞれ2、3、10、20、10〜20および50（μｇ/mL）であることが報告されている（例えば、モーリスフック（Moris Hooke）ら、Meth．E nzymol．34:448、特に451ページの表Iを参照）。F ．許容増殖条件および制限増殖条件増殖条件は、温度、pH、種類および炭素源および窒素源の濃度、微量のミネラル、ビタミン、塩、細胞抽出物、酸素と二酸化炭素の割合、湿度、DMSO、グリセロールおよび重水などの分生子形成材料の有無、スクロースおよび塩化カリウムなどの浸透圧安定化剤の有無を含む。本発明の態様は、個別にまたは併用して以下の限定を含む。許容条件は：アミノ酸生合成などの栄養要求性が欠損する変異体を細胞が排除する完全培地；および細胞壁または細胞表面の欠損変異を有する変異体を排除する低浸透圧強度培地を含む。一般に許容条件は、野生型の増殖または増殖率の少なくとも75%の株増殖または増殖率を可能にするべきである。第2の許容条件は、第1の許容条件と同じであっても、異なってもよい。第2の許容条件下での期間は少なくとも2、5、10、15、または20サイクル以上の増殖周期と同等であってもよい。期間は、回復不可能な致死変異を保有する生物を、回復可能な静的変異を保有する生物と識別しうるほど十分な長さであることが重要である。後者は、第2の許容条件に移行後に増殖を再開するための時間を必要としてもよい。制限条件は増殖を低下または停止させる。制限条件は至適増殖条件ではない（至適以上または至適以下）。好ましくは、制限条件は、変異遺伝子または遺伝子産物の機能に影響を与えるほどである。細菌では、野生型の至適増殖温度より5 〜25℃（または、10〜15℃）低く；真菌では、野生型の至適増殖温度より5〜15 ℃（または5〜12℃）低い温度である。一般に、細菌の制限条件により、株の増殖は野生型の少なくとも50%増殖または増殖率となるべきである。 S.セレビシエ（cerevisiae）、A.ニデュランス（nidulans）、およびA.フミガーツス（fumigatus）の至適温度は、それぞれ30℃、 37℃および37℃である；至適増殖温度より高い試料の制限温度はそれぞれ、36℃、42℃および42℃である。制限インキュベーション期間は、時間の長さが少なくとも2サイクルの増殖周期であるべきであり、一般に70サイクルの増殖周期以下であるべきである。多数の微生物では、インキュベーションは3、4、5、7または10サイクルの細胞周期であるが、24時間以下である。制限条件は、細胞の至適増殖温度から細胞の至適増殖温度より15℃高い温度までの温度を含む。制限／許容条件の対は、高／低塩濃度、高／低温度、低／高温度（低温感受性変異）、高／低浸透圧、低／高浸透圧、好気性／嫌気性インキュベーション、嫌気性/好気性インキュベーション、グリセロール添加／グリセロール無添加、DMSO無添加／DMSO添加、重水添加／重水無添加、重水無添加／重水添加、低／高pHおよび高／低pHを含む。G ．制限条件下での増殖性または非増殖性本発明によると、制限増殖条件期間中の遺伝子機能の一過的な破壊により細胞は死滅する。第2の許容条件下での数増殖周期にわたって、同じサイズまたは縮小したサイズのコロニー中に生物の死滅が顕微鏡によって観察されることがある。光学顕微鏡および染色により、細胞の死滅を示す、当業者に周知の細胞の変形または他の形態が明らかとなる。許容条件下または少なくとも最適条件下では、名目上生存する細胞中にはタンパク質の合成が生じる。死滅細胞は、一部には、溶菌またはDNA、RNAまたはタンパク質合成の欠損によって特徴づけられる。他の発明者が使用する「温度感受性変異体」は、2種以上の変異体を含むということに注意すること。例えば、1種の変異体が、熱ショックによって生じる遺伝子の異常と、制限温度への移行中に生じる必須機能とを有する。この種の変異体は至適増殖温度より高い温度に暴露しても生存することができる。別の種類の ts変異体は、制限温度に暴露することによって影響されるが、回復可能である。これらの2種のどちらも温度感受性致死変異ではない。さらに、以下の実施例によってガイダンスを提供する。実施例実施例１温度感受性大腸菌（Escherichia coli）変異体対数期の大腸菌（E．coli）（ATCC #K802）を通気しない37℃のLB培地で突然変異させた。4種のインキュベーション処理を使用した：（i）EMS（10μL/mL）、120分、（ii）NQO（20μｇ/mL）、60分、（iii）NTG（30μｇ/mL）、15分、および（iv）NTG（10μｇ/mL）、30分。処理後、細胞を洗浄し、新鮮なLB培地に再懸濁し、30℃で終夜増殖させた。LB培地は、バクトトリプトン（bactotryptone ）10g、塩化ナトリウム10g、および酵母5gに蒸留水を加えて1Lにしたものからなる。終夜培養物を新鮮なLB培地で100倍希釈し、30℃で対数期まで増殖させた。対数期の培養物にアンピシリン（100μｇ/mL）を添加した後、培養物を通気せずに、42℃で2時間インキュベーションした。細胞を洗浄して、新鮮なLB培地に再懸濁し、30℃で終夜増殖させた。 LB培地で10⁷倍に希釈後、培養物の100μＬ分をLB寒天平板培地に塗抹し、至適増殖温度より低い30℃で終夜インキュベーションした。LB寒天平板培地は、LB培地およびLB培地1リッターあたり15gのバクトアガー（bactoagar）を用いて調製した。各平板（100〜200cfu/平板）を別のLB寒天平板培地上に移し、次いで42℃で7 時間インキュベーションした。マスター平板は30℃で7時間インキュベーションした。30℃では十分に増殖するが、42℃ではほとんどまたは全く増殖しなかったコロニーを重複LB寒天平板培地に移した。1つの重複平板培地を30℃で、別の重複平板培地を42℃で終夜インキュベーションし、再度コロニーを比較することによって、表現型を確認した。最小培地の合計1500株をLB培地上に単離した。12の遺伝子を単離して配列決定し、そのうち1つがこれまでに未知の機能を有する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevesiae）をスクリーニングすることによって17の遺伝子を単離して配列決定し、そのうち2つがこれまでに未知の機能を有する。実施例2 温度感受性アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）変異体変異原として4-ニトロキノリンを使用して、S.D.ハリス（Harris）ら、ジェネティクス（Genetics）136巻、517〜532ページ、1994年に従って、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）（ATCC #FGSC4）を突然変異させた。最小培地（MN）培地（カーファー（Kafer）のAdv．Genet．19:33〜131,1977の付録に記載される、pH6.5、1%グルコース、硝酸塩および微量元素）で、28℃にて16時間インキュベーションした後に、1150変異株を単離した。微量元素溶液は暗所で4℃にて保存した：1リッターあたり、Na₂B₄O₇（10H₂O）を40mg、硫酸第二銅（5H₂O）を400mg、リン酸第二鉄（4H₂O）を1g、硫酸マンガン（4H₂O）を600mg 、モリブデン酸二ナトリウム（2H₂O）を800mg、および硫酸亜鉛（7H₂O）を8gを含有した。塩溶液は、保存剤としてクロロホルム2mlを添加してから、4℃で保存した；1リッターあたり、塩化カリウムを26g、硫酸マンガン（7H₂O）を26g、第一リン酸カリウムを76gおよび微量元素溶液を50mLを含有した。補足溶液は、15 分間加圧滅菌し、リボフラビンの反応による遮光容器中に保存した。1リッターあたり、ニコチン酸を100mg、リボフラビンを250mg、パントテン酸を200mg、ピリドキシンを50mg、ビオチンを1mg、およびp-アミノ安息香酸を20mg含有した。常に振とうしながら37℃で30分間NQO（4μｇ/mL）で処理することにより分生子（滅菌蒸留水中2×10⁶/mL）を突然変異させた。分生子を等容量の5%チオ硫酸ナトリウムで希釈することにより、NQOを不活性化した。変異分生子を希釈し、C M+TRIT0N^TM+X-100平板培地（ユニオンカーバイドケミカルズ（Union Carbide Ch emicals）の登録）上で平板培養し、28℃にて3日間インキュベーションした。コロニーをレプリカ平板培養し、レプリカ平板培地を28℃と42℃にてインキュベーションした。ts変異体と思われるものを取り出して再試験し、次いでコロニープラグとして15%グリセロール中で-70℃にて保存した。細胞をレプリカ平板培養し、24時間42℃に移行した。ほとんどまたは全く増殖しなかった株を選択した。1150の元の株のうち、10株が42℃のインキユベーション期間から回収されなかった。これらの10株を、pCosAXベクターのアスペルギルス（Aspergillus）ゲノムコスライブラリーで形質転換した（アダムス（Adams）およびボルギア（Borgia）ら、 FEMS Microbiol．Lett．122:227〜231 1994を参照）。株を28℃にて3〜4日間増殖し、レプリカ平板培養し、最長3日間42℃に移行した。増殖した株を採取した；採取した株のDNAからコスミドを回収した。GIGAPACK^TM IIIゴールドパッケージングシステム（Gold packaging system）（ストラタジーン（Stratagene）、カリフォルニア州ラジョラ）を使用してコスミドをパッケージングしてプラスミドを形成し、これを単離、精製して、増幅、単離、精製および配列決定する細菌を形質転換するために使用した。3つの遺伝子を単離して配列決定した。このうち2つは周知で、1つがこれまでに周知の機能を有さない。実施例3 温度感受性酵母変異体 2セットのアベルソン（Abelson）ライブラリーを中等度に変異させた（AおよびB）（カリフォルニア州パサデナのカルテック（CalTech）社製））。セットA はSS328 MATα ade2-101 ura3-52 his3 Δ200 lys2-800であり；セットBはSS330 MATα ade2-101 ura3-101 ura3-52 his3 Δ200 tyrlであった。ハートウェル（ Hartwell）ライブラリーを重度に変異させた（ワシントン大学）；セットCはA36 4aMATα ade-1 ade-2 uro-1 his-7 lys-2 tyr-1 gal（-）であった。クローンは全て温度感受性であり、増殖のためにウラシルの外部からの供給を要求した。1.8%寒天中2%ペプトン、1%酵母抽出液および2%グルコースを含有する YPD培地中で26℃にて2日間増殖させた。クローンをマイクロタイターウェル中で 37℃にて5時間増殖させ、次いで16時間26℃に移行した。OD_650nmを読みとることによって細胞の増殖を測定した。増殖によってクローンを判定した後、最低の第 35パーセンタイルのクローンを選択した。これらのクローンを顕微鏡で調査することにより、不規則な形態または異常な形態に基づいて、2回めの選択を行った。原料としてマスター平板を使用して、1Mソルビトールを含有するYPD培地上で、浸透圧安定下で低増殖クローンを増殖させた。99のアベルソン（Abelson）クローンのうち22がソルビトールに感受性であった。実施例4 抗菌薬標的遺伝子および遺伝子産物 a．Ts変異体の単離ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネート、またはヒドロキシルアミンを使用して生存曲線を作成する。温度感受性変異体を、以下のように大規模に単離する。細胞を変異させ、30℃にて生存細胞を平板培養する。アンピシリンなどの細胞壁作用薬剤の存在下にて選択し、培養物を42℃に2時間移行し、細胞を30℃に戻すことによって、42℃にて増殖できないTs変異体を精製する。ts変異体と思われる厚みのある線状物を42℃および30℃にて試験する。30℃の平板培地の1つのコロニーを線状に接種する。変異体を保存する。実施例5に考察するように変異体の優先順位を決定する。 b．ライブラリー構築変異した生物の野生型DNAをクローニングするためのベクターを選択する。変異が大腸菌（E.coli）以外の生物中に生じる場合には、シャトルベクターを使用する。ベクターは、lacZ遺伝子の挿入失活による青色−白色選択などの挿入断片の存在を示すシグナル要素を含んでもよい。5〜10kb挿入断片のSauIIIA1部分消化断片などの大型の野生型染色体DNAを作成する。約3000形質転換体より少ない場合には、白色の形質転換体を96ウェルトレイにプールする（または、約10,000 形質転換体より多い場合には、スクレーププレートにプールする）。プールした DNAを調製し、大腸菌（E.coli）および大腸菌（E.coli）以外の場合には、変異させた、黄色ブドウ球菌（S.aureus）などの生物に形質転換する。挿入断片を確実に高頻度に存在させるために、両生物の形質転換体の24の小調製物を調製する。 c．ts変異体の相補性ゲノムライブラリーを有するts変異体を42℃にて形質転換する。挿入断片を含まない対照プラスミドを含める。形質転換体をプールして、DNAを調製し、生成物を作成する。生成物を30℃にて形質転換する。30℃の平板培地の形質転換体を 42℃および30℃の平板に移し、相補クローンと思われるものを同定する。30℃の平板培地の1つのコロニーの候補物を42℃および30℃の平板培地に線状に接種する。相補クローンから、数（例えば、5）配列決定段階のプラスミド調製物を作成する。この配列決定段階のプラスミドを用いて30℃にてts変異体を形質転換する。42℃および30℃の各形質転換のうち5つの形質転換体を線状に接種し、配列決定の候補を同定するために対照と比較する。 d．ts変異体の重複性以下に記載するいずれかの方法によって重複性をモニターすることができる。相補性を有した10個のts変異体の各採取物について、相補性のあるプラスミドのプールを形成する。変異体を単離するとき、またはキラーts表現型によって優先順位を確立したらすぐに、結果として生じる10個の逆方向ts変異体の各プールを試験する。または、90個の形質転換体を使用して10個の群内の重複性を試験する。変異体1〜10と相補性であるプラスミドのプールA〜Eを形成する。プールAは、変異体1〜5と相補性であるプラスミドを含む；プールBは変異体6〜10と相補性であるプラスミドを含む；プールCは変異体3〜7と相補性であるプラスミドを含む；プールDはプラスミド8、9、2および3を含む；プールEはプラスミド1、4、6、8 および10を含む。変異体および対応する形質転換体のプールは以下のようである：1（B、C、D）；2（B、C、E）；3（B、E）は2および5を検出しない；4（B、D）は1および5を検出しない；5（B、D、E）；6（A、D）は7および10を検出しない;7 （A、D、E）；8（A、C）は9および10を検出しない；9（A、C、E）；および10（A 、C、D）。 e．トランスポゾン突然変異 F'にγ-Δを含むが、リゾルベースを欠損するドナー株に形質転換する。形質転換体を、NalRリゾルベース＋ApR NalR KmR選択株に組み入れる。プールしたDN Aを調製し、プールしたDNAをts変異体に形質転換する。相補性を生じない形質転換体を単離する。配列決定段階のプラスミド調製物を調製するが、2つの非相補性プラスミド／ts変異体が最適であると思われ、次いで配列決定する。 ZK1328（CBK884）Δ{Δsrl-recA）306：：Tn 10Δtet}277/pIF200[pOX38（45k b HindIII F断片/接合堪能）：：mγδ-1,Kan）/pXRD4043（pACVC184-tnpA，cat ，IPTG-誘導性トランスポザーゼ）を使用するTn 1000突然変異。受容株はZK1329 （LW49）F^-recA56,chr：：γ^δ,NAl^δである。関心のある相補性のあるプラスミドを用いて供与株ZK1328を形質転換する。組み入れたプラスミドの抗生物質耐性、Cm（40μｇ/ml）−耐性およびKan耐性（30μｇ/ml）を選択する。LB 1mlプラス1mM IPTG中で、振とうしないで37℃にて1つの形質転換体を増殖させることによって、株中にトランスポザーゼを誘導し、F-線毛の発現を可能にする。培養物は、 5×10⁷〜1×10⁸細胞/mlまで増殖させるべきである（わずかに濁る）。同時に、L B中の受容株ZK1329の1mlを早期定常期まで増殖させる（2×10⁸細胞/ml）。50ml 培養管中で供与細胞0.5mlを受容細胞0.2mlと混合する。振とうしないで、37℃にて30分間インキュベーションする。予め加熱しておいたLB+1mM IPTGを5ml添加し、振とうしないで37℃にて3時間インキュベーションする。LB+150μｇ/ml Ampおよび10μｇ/ml Nal上で細胞0.1mlを平板培養することによって、供与株に対して選択する。接合完了体をプールし、プラスミドを抽出する。平板あたり約100〜1 000の接合完了体が存在するはずである。元の変異体をプールで形質転換する。相補性のないクローン（42℃にて相補性でないもの）をチェックする。2つの相補性のないクローンおよび配列からプラスミドを単離する。または、Tn10を使用してもよい。実施例5 ts変異体の優先順位決定ある種の検定法を制限条件（例えば、制限温度）下にて表現型に対応させることによって、変異の性質を測定することができる。例えば、2、6および24時間にわたって制限温度にて細胞を増殖し、次いで許容温度に移行することによって、温度の移行による生存性が測定される。これは欠損の回復不可能性を考慮している；制限温度への短時間の移行後の生存性の消失にいたる変異は、理想的な殺滅（致死）標的遺伝子産物を有する遺伝子を示唆する。制限温度での培養物の光学密度をモニタリングすると、その機能の損失によって細胞溶解が生じる遺伝子産物を検出することができる。同様に、顕微鏡観察は細胞分裂の繊維化および異常を検出することができる。さらに浸透圧の安定化に対する溶菌変異を調査することができる。細胞壁の強度または生合成に必須の過去に未知の遺伝子は非常に関心が高い。前駆体標識研究も有用である。短時間のパルス実験（例えば、温度移行後30分、1時間、および6時間）において標識チミンの取り込みは、DNA合成の停止を調査する。細菌では、チミンの取り込みは許容温度での取り込みと関連しうる；しかしながら、チミンの取り込みは制限温度ではウラシルまたはアミノ酸、全ての取り込みと関連しうる。同様の取り込み（表現型）対は、標識ウラシル（転写の阻害）；標識アミノ酸（翻訳の停止）；標識脂肪酸前駆体または脂肪酸（膜生合成の停止）；細菌のD-アラニンまたは真菌の短時間パルスのグルコース（細胞壁合成の阻害）を含む。抗生物質に対する感受性は別の重要な表現型である。許容温度および制限温度に近い種々の温度において種々の抗生物質に耐性の「フィンガープリント」を入手することは有用である。例えば、リファンピシンに対する過敏性がある場合、変異はおそらく転写に影響を与える。いくつかの薬剤に対する過敏性は、細胞エンベロープに影響を与える異常を示唆する。カナマイシンに対する部分的な耐性は電気化学的勾配の変化に関連しうる。ts異常が複数コピーのプラスミド上の野生型DNAによって相補性を示される株は、野生型DNAをクローニングするとき、抗生物質に対する耐性が増大することがある。大腸菌（E.coli）では、異常をsecA -lacZインジケーター株に転移することは、分泌を遮断することを示唆する。制限温度への移行後の細菌におけるカリウム流出の変化は、おそらくカナマイシン耐性と組合わさって、電位の崩壊などの電気化学的勾配の変化を示唆する。ts変異体の温度抵抗性偽復帰変異体の単離および特徴づけは突然変異の抑制を示唆する。許容温度および制限温度での遺伝子発現の変化は、2-Dゲル、HPLCまたはFPL Cタンパク質プロフィールによって示すことができる。総タンパク質およびパルス標識タンパク質を検出することができる。パターンのある変化の相関（例えば、特定の抗生物質を含有する培地に細胞を移行すること）は、タンパク質の発現に影響を与える変異を示唆する。 ts変異体の単離、野生型DNAによる相補性形成および選択的な優先順位決定後に、DNA配列および相同性を決定する。ライブラリーによる相補性形成前に重複変異体を同定することも望ましい。相補性形成クローンが他の変異株のts変異と相補性を形成する能力を試験することによって、重複ts変異体を同定することができる。1つのts変異体と相補性を形成する各プラスミドを、他のts変異体と相補性を形成する能力について試験することはやっかいである。エレクトロポレーションを使用する場合には（例えば、黄色ブドウ球菌（S.aureus））、効率的な方法は、20種の異なるプラスミドを含有するプラスミドプールを使用することができる。いくつかのts変異体は形質転換頻度および復帰変異頻度が低いために、大規模なプラスミドプールを調製することは困難である。温度移行後に増殖を測定し、顕微鏡で細胞を詳しく調べること；取り込み試験を実施すること；および他の種々の詳細な試験を実施することも望ましい。H ．用途本発明は、条件致死変異を有する株を大規模群の変異体から迅速に同定する方法を特徴とする。株自体をスクリーニングまたは診断アッセイに使用することができるけれども、一般に、その後遺伝子および対応する遺伝子産物を同定する。同定した遺伝子および遺伝子産物の作用機序（複数の作用機序）は、静菌性があるだけではなく、例えば、本方法および関連ある種に使用する細菌に致死性である治療剤を設計するための合理的な基礎となる。例えば、本方法に使用する生物が真菌種または細菌種である場合には、治療剤は抗真菌剤または抗菌剤である。これらの薬剤は野生型株の遺伝子産物の作用を低下するので、薬学的に有効な量の薬剤を被験者に投与することによって、その種の感染症被験者または同様に感受性のある種の感染症被験者を治療する際に有用である。遺伝子産物の作用の低下は、酵素の作用部位すなわち受容体に対する遺伝子産物の競合的阻害；非競合的阻害；遺伝子産物を必要とする細胞内カスケード経路の妨害；翻訳後処理前または後の、遺伝子産物自体との結合；および遺伝子産物様物質として作用することによる、活性のダウンレギュレーションを含む。治療剤は遺伝子産物に対して生ずるモノクローナル抗体を含む。さらに、ある種の細胞（例えば、同じ属または似た種の病原菌）中の遺伝子配列の存在および宿主細胞の配列の不在または相違を測定することができる。宿主に存在しない遺伝子または遺伝子産物に対する治療剤は、副作用の少なさおよび過剰用量の低さを含む明らかな利点を有する。酵素またはリガンド結合活性も検定され得る。他の用途は、抗寄生虫薬または殺虫薬の標的の決定を含む。他の態様上記から、本発明の本質的な特徴が容易に理解され得る。本発明の精神と範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更および修正を加えて、それを種々の用途および条件に適合させることができる。従って、他の態様も本発明の請求の範囲内である。他の態様の例は、少なくとも段階（a）および（c）、細胞を制限条件に暴露する段階および細胞を第2の許容条件に移行する段階を実施する装置；および少なくとも段階（c）、選択的に、第２の許容条件に移行したとき増殖しない細胞を走査し、染色し、またはさもなければ同定および選択する段階を実施する装置を含む。請求の範囲を以下に示す：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ

Claims

【特許請求の範囲】 1．遺伝子の条件致死変異を有する株を同定するための方法であって：（a）第1の許容条件下にて株を増殖させる段階と；（b）少なくとも2サイクルの増殖周期と同等な期間にわたって、段階（a）の株を制限条件に暴露する段階と；（c）少なくとも10サイクルの増殖周期と同等な期間にわたって、段階（b）の株を第2の許容条件に移行する段階と；（d）致死変異を有する株を選択することによって、制限条件に感受性を示し、且つ生物の生存に必須である致死変異を有する株を同定する段階とを含む方法。 2．段階（d）の後に、劣性条件致死変異を有する株を選択する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。 3．段階（d）の後に、株から条件致死変異を有する株を単離する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。 4．遺伝子を単離する段階の後に、該遺伝子の機能を同定する段階、該遺伝子によって発現される産物を同定する段階、および該遺伝子の配列を決定する段階から選択される段階をさらに含む、請求項3記載の方法。 5．第1の許容条件が生物の完全培地を含む、請求項1記載の方法。 6．第1の許容条件が低浸透圧強度の培地を含む、請求項1記載の方法。 7．第1の許容条件が野生型の至適増殖温度より5〜15℃低い温度を含む、請求項1 記載の方法。 8．制限条件が、生物の至適増殖温度と生物の至適増殖温度より15℃高い温度との間の温度を含む、請求項1記載の方法。 9．第2の許容条件が、第1の許容条件と実質的に同じである、請求項1記載の方法。 10．増殖段階（a）の細胞がレプリカ平板培養細胞である、請求項1記載の方法。 11．段階（c）の期間が少なくとも15サイクルの増殖周期と同等である、請求項1 記載の方法。 12．段階（a）の株が、細菌、真菌、および酵母から選択される、請求項1記載の方法。 13．段階（a）の株が、大腸菌（Escherichia coli)株、肺炎連鎖球菌（Strepto coccus pneumoniae）株、または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）株である、請求項12記載の方法。 14．段階（a)の株が、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）株である、請求項12記載の方法。 15．段階（a）の株が、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia e）株である、請求項2記載の方法。 16．段階（a）の株が突然変異を誘発されている、請求項1記載の方法。 17．細胞が、メタンスルホン酸エチル、メタンスルホン酸メチル、メチルニトロソグアニジン、4-ニトロキノリン-1-オキサイド、2-アミノプリン、5-ブロモウラシル、ICR 191および他のアクリジン誘導体、臭化エチジウム、亜硝酸、ならびにN-メチル-N'-ニトロソ-N-ニトログアニジンから選択される化学的変異原物質で変異誘発されている、請求項16記載の方法。 18．抗菌剤の遺伝子産物標的を同定するための方法であって：（a）第1の許容条件下にて菌株を増殖させる段階と；（b）少なくとも2サイクルの増殖周期と同等の期間にわたって、段階（a）の菌株を制限条件に暴露する段階と；（c）少なくとも10サイクルの増殖周期と同等の期問にわたって、段階（b）の菌株を第2の許容条件に移行する段階と；（d）条件致死変異を保有する遺伝子を有する菌株を選択する段階と；（e）条件致死変異に相当する遺伝子産物を同定することによって、抗菌剤の遺伝子産物標的を同定する段階とを含む方法。 19．制限条件が温度を変更する段階を含み、条件致死変異が温度感受性致死変異である、請求項18記載の方法。 20．段階（a）〜（c）において少なくとも50株を含む、請求項18記載の方法。