EP1097214A2 - Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendung - Google Patents
Gene zur biosynthese von anticapsin und bacilysin, ihre isolierung und verwendungInfo
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- EP1097214A2 EP1097214A2 EP99947209A EP99947209A EP1097214A2 EP 1097214 A2 EP1097214 A2 EP 1097214A2 EP 99947209 A EP99947209 A EP 99947209A EP 99947209 A EP99947209 A EP 99947209A EP 1097214 A2 EP1097214 A2 EP 1097214A2
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Classifications
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
Definitions
- the invention relates to genes for the biosynthesis of anticapsin and bacilysin, their isolation and use, in particular in medicine and agriculture.
- Bacilysin is a well-known dipeptide that has been described as an antibiotic agent (Zuber and Marahiel, 1992). It is species-specific from Bacillus subtle and also from individual strains of other Bacillus species from the Bacillus subtilis group (Loeffler et al., 1986) and is secreted from the cell into the surrounding culture medium.
- Bacilysin consists of the N-terminal of L-alanine and the C-terminal of the non-proteinogenic epoxy amino acid L-anticapsin (Rogers et al., 1965; Walker and Abraham, 1970a; Neuss et al., 1970) and was chemically described as L-alanyl- L- ⁇ - (2,3-epoxycyclohexanono-4) alanine (Walker and Abraham, 1970b; Chmara et al., 1981). After absorption into sensitive cells, bacilysin is proteolytically cleaved, releasing the antibiotic anticapsin.
- Anticapsin inhibits glucosamine synthetase in bacteria and fungi and thereby the biosynthesis of the aminosugars glucosamine and N-acetylglucosamine, which are required for cell wall synthesis. This inhibits cell wall synthesis and causes cell lysis (Whitney and Funderburk, 1970; Kenig et al., 1976; Milewski, 1993). Bacilysin and anticapsin are competitively inhibited by other di- and tripeptides (Perry and Abraham, 1979) as well as by glucosamine and N-acetylglucosamine (Walton and Rickes, 1962; Chmara, 1985). a. thereby be distinguished from other antibiotic agents.
- Another way of identifying anticapsin and bacilysin is to prevent their biosynthesis by mutations in ⁇ roGenes for the biosynthesis of the aromatic amino acids phenylalanine and tyrosine (Hilton et al., 1988a).
- Bacillus subtilis AI 4 (Walker and Abraham, 1970a, b) and a strain of Streptomyces griseoplanus (Whitney et al., 1970) also immediately produce extracellular anticapsin, but such findings are limited to these exceptional cases. It is also known that bacilysin has a relatively broad, nonspecific activity against Gram-positive and negative bacteria as well as against shoot and filamentous fungi and from sensitive cells via a dipeptide and oligopeptide permease system (Diddens et al., 1979; Perry and Abraham , 1979; Chmara et al., 1981) is effectively included. Defect mutations in this permease system lead to resistance to bacylisin.
- Extracellular anticapsin is usually not incorporated by bacteria and therefore has a relatively low antibacterial activity, except against Streptococcus pyogenes and Salmonella gallinarum (Neuss et al., 1970). In contrast, anticapsin has a strong antifungal Effect, inter alia against Candida albicans and Botrytis an ea and other filamentous fungi (Neuss et al, 1970, Kenig et al, 1976, Chmara et al, 1980)
- Bacillus subtilis 168 is known to branch off from the aromatic amino acid synthesis pathway in the prephenate, which apparently serves as a metaphoric precursor for the synthesis of anticapsin (Hilton et al, 1988a).
- the enzymatic reactions to this and also to the following compound from anticapsin with L-alanm to bacilysin are still unknown
- the excretion of the bacilysm formed from the cell is presumably carried out by means of a peptide transport system (Diddens et al, 1979)
- halogenated Bacilysmde ⁇ vate chlorotetam, bromotetain
- halogenated Bacilysmde ⁇ vate chlorotetam, bromotetain
- these halogen derivatives are of interest insofar as they have some differences in their mode of action and spectrum compared to bacilysin of their producers (Loeffler et al, 1990, Katzer, 1991)
- the object is achieved in that genes or a gene group for the biosynthesis of anticapsin and bacilysin are first genetically engineered using a suitable bacterial host-vector system is cloned and amphfected and thereby accessible to a structural and functional characterization due to the gene amphfication and the resulting gene dose effect and possibly using other bacterial host vector systems with increased gene amphfication and Increased and / or producible gene expression achieves an economically usable biosynthesis of the active substances, which are then used against microbial pathogens and putrefactive agents.
- An excretion of the active substances is advantageous, so that they can be isolated more cost-effectively from the culture supernatants.
- Such organisms are available as host strains to the naturally anticapsin or bacilysin from the cell is also advantageous to suppress the end product inhibition, as in bacilysin biosynthesis by accumulated bacilysin, so that the overproduction of the antibiotics is not caused by a high concentration of the ant ibiotics itself is inhibited
- the present invention can also be used for the biotechnological production of chlorotetam and bromotetain or of new, stronger or more specific effective Bacilysin and Anticapsindenvaten
- the recombined active substance formers can be used as cellular antagonists by applying them in the environment of microbial putrefaction and pathogens, for example in the soil, in culture fluids or on the surface of other organisms, and by activating the secreted antibiotics
- moniated bacilysin genes Another possibility of using the moniated bacilysin genes is to insert them into the organisms to be protected against antibiotics, so that they themselves form the antibiotic active ingredient and thus achieve self-protection against microbial pathogens and putrefactive organisms.
- the genes that are directly used for the biosynthesis of Anticapsin or bacilysin are required, transferred and useful in crops and thus an increased tolerance or resistance to a broad spectrum of different types of phytopathogenic pathogens can be achieved by transgenic synthesis of anticapsin or bacilysin
- the object of the invention is achieved in particular in that corresponding genes according to the invention are isolated from a bacterial strain of the Bacillus subtilis group, preferably from Bacillus subtilis 168, using methods customary in genetic engineering
- the invention relates to genes for the m-vitro and m-vivo biosynthesis of anticapsin and bacilysin and their fragments, variants and mutants which are characterized by base exchanges or other mutations, and also RNA nucleic acid sequences in which T is replaced by U, and nuclear acid sequences that are completely or partially complementary or homologous
- the genes and their products themselves represent diagnostic and / or therapeutic substances or serve as targets for the search for new therapeutically active substances.
- these are preferably bacilysin genes from Bacillus subtilis 168, hereinafter referred to as “Z> ⁇ c” genes, within a 7471 bps DNA sequence according to SEQ ID No. 1 (Appendix 1), their mutants, variants and their fully or partially complementary DNA sequences.
- positive-selective cloning vectors with high cloning capacity and stability are preferably used and gene banks with large chromosomal DNA inserts are isolated, so that not only individual genes but also gene groups with sufficient probability can be isolated.
- the palindromic, simply positive selective cloning vector pPS15 has proven to be an advantageous cloning vector (Steinborn, 1996).
- This palindrome plasmid vector and also the non-palindrome plasmid vector pSB595 (see below) used for subsequent clonings belong to the incompatibility group inc ⁇ 8, and their particularly high cloning capacity and structural and segregative plasmid stability are due to their theta replication or a partition gene parS.
- Bacterial bacilysin-negative strains preferably of Bacillus subtilis 168, are used as the host strain for the primary cloning of the genes according to the invention. Because of a chromosomal ⁇ ⁇ c mutation, they have no chromosomally encoded bacilysin formation, and the cloning of the ⁇ c genes can be demonstrated due to the complementation of the chromosomal mutation.
- a mutant NG79 bac- (Hilton et al, 1988b) or derivatives of NG79 from the Bacillus subtilis 168 family are preferably used as Bacilysin-negative host strains.
- a stabilizing strain Bacillus subtilis GSB298 hip-X bac-X or a comparable strain as a bacilysin-negative host strain is used, which has an increased transformability and stabilizing effect on recombinant plasmid derivatives with a large insert, this GSB298 as spontaneous hip (host increased plasmid stability) mutant derived from NG79 bac-X and isolated due to its stabilizing effect on palindromic, double positive selective cloning vectors (Steinborn, 1996).
- Gene banks with large chromosomal DNA inserts are obtained preferably by partial restriction cleavage of the donor DNA and insertion of preselected, large (> 10 kb) DNA fragments.
- a gene bank is isolated from which a recombinant strain Bacillus subtilis GSB298 (pSB657) with t ⁇ c genes from Bacillus subtilis 168 is isolated. This excretes plasmid-encoded bacilysin, which is detected by the inhibition of a bacilysin-sensitive indicator strain, preferably Escherichia coli B or Proteus vulgaris, and the inhibition of bacilysin by N-acetylglucosamine.
- pSB657 does not contain it a host strain Bacillus subtilis GSB285 aroI906 (Steinborn, 1996) because the aro ⁇ 906 mutation inhibits the biosynthesis of prephenate as a precursor for anticapsin.
- Optimal formation and antibiotic effectiveness of bacilysin is achieved by using a minimal PA medium (Perry and Abraham, 1979) and cultivation at 30 ° C. Agar diffusion tests are used for the semi-quantitative determination of bacilysin activity using zones of inhibition around growing colonies or punch holes that are loaded with culture supernatants.
- the bac genes are contained in the recombinant plasmid pSB657 generated by primary cloning within a 21.5 kb BamHI insert.
- a further recombinant strain Bacillus subtilis GSB298 (pSB660) is derived from the 21.5 kb BamHI insert of pSB657 by subcloning, the bac genes contained in a 7.5 kb PstI insert in the recombinant plasmid pSB660 thus obtained are (embodiment 2).
- the PstI insert of pSB660 is localized in the region from bp 3867455 to bp 3 874 925 of the genomic DNA sequence on the basis of DNA homologies and corresponding restriction data (Fig. 1) as a 7471 bps DNA sequence (Fig. 2) (SubtiList database, Institut Pasteur, Moszer et al., 1995; Moszer, 1998) of the genome of Bacillus subtilis 168, identified (embodiment 3). This position lies within the 90 kb region in which the ⁇ c-1 locus has been mapped by transduction (Hilton, H, et al., 1988b); this confirms the location and function of the bac genes.
- the recombinant plasmid pSB660 in Bacillus subtilis GSB298 encodes an increased or at least comparable bacilysin formation (Fig. 3) with the gene donor strain Bacillus subtilis 168 (Fig. 3), so that the bac-X mutation (Hilton et al., 1988b) caused this Defect in the ligase reaction in GSB298 is fully complemented by pSB660.
- a different course of bacilysin formation is observed, which begins immediately with the start of growth in the recombinant strain GSB298 (pSB660).
- the chromosomally coded bacilysin formation takes place with a clear lag phase and only adapts to the level of the plasmid-coded bacilysin formation in the stationary phase. This approximation of the maximum values is interpreted as an expression of the end product inhibition by accumulated bacilysin.
- the Pstl insert contains 6 open reading frames (ORF 's) with previously unknown function and the original name (see SubtiList database) ywfk to w F, which due to the described complementation and further findings (see below) on their function in the Bacilysin biosynthesis renamed back to bacY (Fig. 1) and claimed according to the invention.
- a deletion derivative pSB674 pSB672 AbacE even causes a complete failure of the formation of extracellular bacilysin and a complete inhibition of growth and cell lysis in GSB298, correlated with conspicuous bloating of the naturally rod-shaped cells to protoplast-like cell forms, such as those for the antibiotic effect of anticapsin are typical.
- bacE encodes an enzyme required for the ligase reaction of bacilysin formation and in GSB298 (pSB674) with inactive bacE gene in both pSB674 and in GSB298 bac-X (as demonstrated for the bac-X mutation; Hilton et al., 1988b) intracellularly, a lethal concentration of anticapsin for the host cell.
- an additional gene is mutated in GSB298, e.g. B. a transport gene so that the excretion of bacilysin and / or anticapsin is inhibited.
- Fig. 1 Restriction map of the PstI insert of pSB660 corresponding to the DNA sequence in Appendix 1 with the genes back, bacB, bacC, bacD, bacE and bacF from Bacillus subtilis 168. Only those restriction sites that are required for the construction of Plasmid derivatives can be used.
- Fig. 2 Growth and bacilysin formation in the recombinant strain Bacillus subtilis GSB298 (pSB672) compared to the gene donor strain Bacillus subtilis 168 and the bacilysin-negative host strain GSB298 bac-X at 30 ° C in PA minimal medium
- Fig. 3 Growth and bacilysin formation in the recombinant strains Bacillus subtilis GSB298 (pSB672), GSB298 (pSB674) and GSB298 (pSB676) at 30 ° C in PA minimal medium
- Bacillus subtilis bacterial strain GSB285 h ⁇ X (Steinborn, 1996/98) as recipient strain for subcloning of bac genes; derived as a spontaneous, plasmid-stabilizing (for recombinant plasmids with large insert) mutant of GSB26 .s ⁇ cA321 ⁇ roI906 metB5 amyE strX from the strain line of Bacillus subtilis 168.
- the ⁇ roI906 mutation prevents the biosynthesis of anticapsin and bacilysin, so that these do not alter the plasmid transformation in protoplasts)
- Plasmid vector pPS15 (15.4 kb; MLS 1 ) as a palindromic, positive selective cloning vector with high cloning capacity and stability (Steinbom, 1996/98), so that when cloned almost all plasmid transformants contain a recombinant plasmid and also recombinant plasmids with a large insert remain stable
- Plasmid vector pSB595 (7 kb; MLS r ) as a non-palindromic cloning vector with high cloning capacity and stability, derived from a plasmid pSB472 (Steinborn, 1996/98) by introducing a multiple cloning site
- Both plasmid vectors belong to the incompatibility group / «cl8 and their high structural and segregative stability is due to the theta type of their replication or to a partition gene parS
- Insertion mutagenesis (Niaudet et al., 1982) for the inactivation of chromosomal bac genes of the gene donor Bacillus subtilis 168 by chromosomal insertion.
- Exemplary embodiment 1 Primary cloning of the Bacillus subtilis 168 bac genes.
- the primary cloning is carried out by “shot gun” after partial fragmentation cleavage of the chromosomal donor DNA and preselection of large DNA fragments (> 10 kb) for ligation.
- a positively selective cloning vector pPS15 used, transformed into a stabilizing, Bacilysin-negative (Bac) recipient strain Bacillus subtilis GSB298 bac-1 and a screening for Bacilysin-positive (Bac ⁇ ) clones on PA agar plates with Escherichia coli B designed as a bacilysin-sensitive indicator organism.
- GSB298 pSB657
- a 21.5 kb BamHI insert is determined in pSB657 and the plasmid-encoded formation of bacilysin confirmed by all (see above) biological and biochemical evidence.
- pSB657 complements the bac-X mutation in GSB298, so that GSB298 (pSB657) compared to the donor strain Bacillus subtilis 168 gives at least comparable or increased bacilysin formation ((as for GSB298 (pSB672) in Fig. 3)) With comparable growth, a strongly delayed formation of bacilysin is observed for the donor strain.
- Exemplary embodiment 2 Localization of the bac genes in the primary insert of pSB657
- subcloning is carried out after cleavage of the insert of pSB657 by various restrictases and pPS15 and GSB298 are again used as the host vector system.
- Highly expressing clones comparable to GSB298 (pSB657), are obtained after Pstl cleavage and these are referred to as "GSB298 (pSB660)".
- PSB660 contains a 7.5 kb Pstl insert which, after recloning in pPS15 and retransformation in GSB298 high bacilysin formation (Fig. 3) is reproducibly encoded.
- Exemplary embodiment 3 Localization of the bac genes in the genomic DNA sequence of Bacillus subtilis 168
- the 7.5 kb-Pstl insert contained in pSB660 (exemplary embodiment 2) is cloned in pUC18 and the recombinant strain Escherichia coh XL1 (pSB661) is thereby obtained. Sequencing is then carried out from both ends of the Pstl insert and a homology comparison with the genomic DNA sequence (SubtiList database) of the gene donor Bacillus subtilis 168 is carried out with the DNA sequences obtained (429 bps or 226 bps). Complete DNA homology is found for the region from bp 3 867 455 to bp 3 874 925 of the genomic DNA sequence so that the PstI insert contains 7 471 bps. Restriction cleavage sites (FIG.
- the PstI fragment 6 contains complete, functionally still unknown ORF's ywfk to ywfi, which are renamed back to bacF because of their function in bacilysin biosynthesis (Fig. 1).
- First indications of their function are obtained by a homology comparison of the proteins BacA to BacF, which are putatively encoded by the genes back to bacF, to known proteins of other organisms using the “SWISS- PROT database "(ExPASY Molecular Biology Server, Fasta 3): High homologies for BacB to a prephenate dehydratase from Streptomyces coelicolor (28%), for BacE to D-alanine-D-alanine ligases from Haemophüus influenzae (29%) and from Bacillus subtilis (21.5%) and for BacF to a macrolide efflux protein (24.8%) indicate functions in the synthesis from prephenate to Antikapsin, ligation of Antikapsin with L-Alanine to Bacily
- promoter motifs are determined upstream to bacB (from bp 3874425 to bp 3874360 of the genomic DNA sequence), while a transcription terminator is probably only present downstream from back (from bp 3873120 to bp 3873061).
- Embodiment 4 mutants of pSB660
- PSB672 also complements the bac-X mutation in GSB298 and encodes a level of bacilysin comparable to that of pSB657 and pSB660 (Fig. 3).
- pSB679 pSB660 A (back bacD bacE bacF) is generated by cloning a subfragment from PvuII (bp 1680) to Sacl (bp 3558) into the plasmid vector pSB595.
- GSB298 (pSB674) forms no bacilysin
- PA medium ie under conditions of bacilysin formation
- PA medium does not grow, forms atypical, bloated cell forms and finally lyses.
- Example 5 Insertion mutagenesis of chromosomal bac genes in Bacillus subtilis 168 by double crossover
- chromosomal bac genes of the gene donor are deactivated by insertion in order to determine their function in bacilysin biosynthesis.
- the insertion is carried out by general recombination via double cross-over and is carried out using integration plasmids.
- integration plasmids a selection marker is inserted within the bac gene to be inactivated and is thus flanked by fragments of the bac gene which in a homologous host strain have the double cross - over effect.
- Chloramphenicol resistance introduced as a selection marker in the mutated site.
- pSB682 pSB672 bacB * .cmlH
- pSB683 pSB672 AbacC: .cmlR
- pSB684 pSB672 bacDv.cmlW
- pSB680 pSB672 AbacEv.cmlR
- pSB685 is derived from pSB660 (see Fig. 1) after deletion from PvuII (bp 1680) to EcoRV (bp 5681).
- the integration plasmids are linearized (as a prerequisite for double cross-over) and transformed into competent cells from Bacillus subtilis 168.
- the selection is made via chloramphenicol resistance, and double cross-over (to exclude single cross-over and mutations) is demonstrated by the absence of plasmid-coded MLS antibiotic resistance (coded by the plasmid-specific selection marker of the integration plasmid) and by free plasmid DNA of the integration vector, by Southern hybridization with the cmRI gene as a labeled sample and by cloning and restriction analysis of the relevant chromosomal region.
- the insertion mutants are streaked on PA minimal agar and identified as prototrophic for the amino acids phenylalanine and tyrosine, whose biosynthesis (as well as for anticapsin) branches off from prephenate in the biosynthetic pathway of the aromatic amino acids.
- Exemplary embodiment 6 Function of the bac genes for protecting the cells of Bacillus subtilis 168 against extracellular bacilysin
- insertion mutants are tested for bacylis insensitivity. All insertion mutants, including GSB322 with deletion in back to bacF, show no Zones of inhibition and (as GSB298 and Bacillus subtilis 168) prove to be unchanged bacilysin-resistant.
- Embodiment 7 Effect of deletion plasmids on chromosomal insertion mutants
- # GSB322 shows a plasmid-encoded bacilysin formation comparable to GSB298 (pSB660) or GSB298 (pSB672), so that bacB to bacE can be rated as essential or sufficient, while back and bacF can be assessed as insignificant or not relevant for high bacilysin formation
- # GSB322 (pSB674) (but not plasmid transformants of pSB674 with other chromosomal insertion mutants) behaves with respect to defects in bacilysin formation, aberrant cell forms and cell lysis like GSB298 (pSB674) when cultivated in PA minimal medium, so that this mutant phenotype (as also with NG79 or GSB298) cannot be traced back to the defect in only one & ac structure gene.
- Exemplary embodiment 8 plasmid-coded bacilysin formation in heterologous Bacillus cells pSB660 and various deletion plasmids (see exemplary embodiment 4) are tested in Bacillus amyloliquefaciens GSB272, Bacillus licheniformis ATCC9789, Bacillus megaterium PV361, and Bacillus plasmid plasmid-transformed 404 pilbumid .
- Plasmid transformants of Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis ATCC9789 and Bacillus megaterium ATCC 12140 do not form extracellular bacilysin, while in Bacillus pumilus ATCC 12140 (as in Bacillus subtilis GSB298) pSB672 with bacB to bacE as active genes already encodes a high Bacilysin.
- a particularly high plasmid-coded bacilysin formation up to 5-fold compared to GSB298 (pSB660) or GSB298 (pSB672), is achieved in Bacillus amyloliquefaciens GSB272, for which the deletion plasmid pSB679 (exemplary embodiment 4) with bacB and bacC is sufficient.
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Abstract
Die Erfindung betrifft Gene für die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und Verwendung, insbesondere in der Medizin und Landwirtschaft. Bevorzugt handelt es sich um Gen-Produkte, die generell als Antagonisten der Glukosaminsynthese einsetzbar sind und als Mittel zur Antibiose gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger verwendet werden können.
Description
Gene zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und Verwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Gene für die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, ihre Isolierung und Verwendung, insbesondere in der Medizin und Landwirtschaft.
Bacilysin ist ein bekanntes Dipeptid, das als antibiotischer Wirkstoff beschrieben wurde (Zuber und Marahiel, 1992). Es wird artspezifisch von Bacillus subtil is und auch von einzelnen Stämmen anderer Bacillus-Spezii s der Bacillus subtilis - Gruppe gebildet (Loeffler et al., 1986) und aus der Zelle in das umgebende Kulturmedium ausgeschieden. Bacilysin besteht N-terminal aus L-Alanin und C-terminal aus der nicht proteinogenen Epoxyaminosäure L- Anticapsin (Rogers et al., 1965; Walker und Abraham, 1970a; Neuss et al., 1970 ) und wurde chemisch als L-Alanyl-L-ß-(2,3-epoxycyclohexanono-4)Alanin (Walker und Abraham, 1970b; Chmara et al., 1981) beschrieben. Nach Aufnahme in sensible Zellen wird Bacilysin proteolytisch gespalten und dadurch das antibiotisch wirksame Anticapsin freigesetzt. Anticapsin hemmt bei Bakterien und Pilzen die Glokosaminsynthetase und dadurch die Biosynthese der Aminozucker Glukosamin und N-Acetylglukosamin, die für die Zellwandsynthese benötigt werden. So wird die Synthese der Zellwand gehemmt und Zellyse verursacht (Whitney and Funderburk, 1970; Kenig et al., 1976; Milewski, 1993). Bacilysin und Anticapsin werden durch andere Di- und Tripeptide (Perry and Abraham, 1979) sowie durch Glukosamin und N-Acetylglukosamin (Walton and Rickes, 1962; Chmara, 1985) kompetitiv gehemmt und können u. a. dadurch von anderen antibiotischen Wirkstoffen unterschieden werden. Ein weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Anticapsin und Bacilysin besteht darin, daß ihre Biosynthese durch Mutationen in αroGenen für die Biosynthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin unterbunden wird (Hilton et al., 1988a).
Durch Bacillus subtilis AI 4 (Walker and Abraham, 1970a, b) und einen Stamm von Streptomyces griseoplanus (Whitney et al., 1970) wird unmittelbar auch extrazelluläres Anticapsin gebildet, doch beschränken sich solche Befunde auf diese Ausnahmefalle. Bekannt ist weiterhin, daß Bacilysin eine relativ breite, unspezifϊsche Wirkung gegen Gram-positive und -negative Bakterien sowie gegen Sproß- und Fadenpilze besitzt und von sensiblen Zellen über ein Dipeptid-und Oligopeptid-Permeasesysteme (Diddens et al., 1979; Perry and Abraham, 1979; Chmara et al., 1981) effektiv aufgenommen wird. Defektmutationen in diesem Permeasesystem führen zu Resistenz gegen Bacylisin. Extrazelluläres Anticapsin wird von Bakterien meist nicht inkorporiert und hat deshalb eine relativ geringe antibakterielle Aktivität, ausgenommen gegen Streptococcus pyogenes und Salmonella gallinarum (Neuss et al., 1970). Dagegen hat Anticapsin eine stark antifungische
Wirkung, u a gegen Candida albicans sowie Botrytis einer ea und andere filamentose Pilze (Neuss et al , 1970, Kenig et al , 1976, Chmara et al , 1980)
Zur Biosynthese von Bacilysin ist für Bacillus subtilis 168 bekannt, daß sie vom Syntheseweg für aromatische Aminosäuren beim Prephenat abzweigt, das offenbar als pπmarer metabohscher Precursor zur Synthese von Anticapsin dient (Hilton et al , 1988a) Die enzymatischen Reaktionen dazu und auch zu der folgenden Verbindung von Anticapsin mit L-Alanm zu Bacilysin sind noch unbekannt Die Ausscheidung (Exkretion) des gebildeten Bacilysms aus der Zelle erfolgt vermutlich mittels eines Peptidtransport-Systems (Diddens et al , 1979)
Befunde zur Regulation der Bacilysinbiosynthese lassen auf ihre Suppression durch wachstumsfordernde Supplemente (u a Ammonium, Nitrat, Protemhydrolysate, Phenylalanin, L-Alamn) und durch andere wachstumsfordernde Bedingungen (z B Vollmedien oder eine optimale Temperatur bei 37°C) schließen Von besonderem Interesse für eine Überproduktion ist auch die Endprodukthemmung durch akkumuliertes Bacilysin (Ozcengiz and Alaeddinoglu, 1991)
Zur Genetik der Bacilysinbiosynthese wurde mittels konventioneller genetischer Methoden (chemische Mutagenese, Transduktion) lediglich die grobe Kartierung eines bac-\ -Locus innerhalb einer ca 90 kb- Region zwischen den Genen ctrA und sack erreicht (Hilton et al , 1988b), wahrend kodierende Gene oder Gen-Gruppen und die Gen-Produkte noch unbekannt sind Für eine dazu verwendete Bacilysin-negative (Bac ) Mutante Bacillus subtilis NG79 bac-\ wurde ein Defekt in der Bindungsreaktion von L-Alanm mit L- Anticapsin zu Bacilysin ermittelt, doch wurde eine entsprechende Ammosäurehgase noch nicht isoliert Von einigen Bacillus-Stammen werden auch halogemerte Bacilysmdeπvate (Chlorotetam, Bromotetain) gebildet, deren Biosynthese und Genetik ebenso wenig charakterisiert sind Diese Halogenderivate smd jedoch insofern von Interesse, als sie gegenüber dem Bacilysin einige Unterschiede in ihrer Wirkungsweise und im Spektrum ihrer Produzenten aufweisen (Loeffler et al , 1990, Katzer, 1991)
Zum Ergebnisstand sind schließlich noch erfolgreiche Arbeiten (Wild, 1994, Baldwm et al . 1995) zu chemischen Synthesen von Anticapsin, Bacilysin und Chlorotetam zu erwähnen, die zwar zu detaillierten Kenntnissen der Molekulstruktur, mcht jedoch, ebenso wie die Bacilysinbiosynthese, zu einem ökonomisch nutzbaren Produktionsverfahren geführt haben
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, Gene für die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin zu isolieren sowie strukturell und funktionell zu charakterisieren und dadurch gezielt für eine Überproduktion von Antibiotika und eine wirksame und vielseitige Antibiose gegen mikrobielle Krankheits- und Faulmserreger nutzbar zu machen
Erfϊndungsgemaß wird die Aufgabe dadurch gelost, daß Gene oder eine Gen-Gruppe zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin gentechnisch zunächst mittels eines geeigneten
bakteriellen Wirts- Vektor-Systems kloniert und amphfiziert und dadurch einer strukturellen und funktionellen Charakteπsierung zugänglich werden Aufgrund der Gen-Amphfikation und des dadurch bedingten Gen-Dosis-Effektes sowie gegebenenfalls unter Nutzung von anderen bakteriellen Wirts- Vektor-Systemen mit erhöhter Gen-Amphfikation und verstärkter und/oder mduzierbarer Gen-Expression wird eine ökonomisch nutzbare Biosynthese der Wirkstoffe erreicht, die dann gegen mikrobielle Krankheits- und Faulniserreger eingesetzt werden Vorteilhaft ist eine Exkretion der Wirkstoffe, so daß sie kostengünstiger aus den Kulturuberstanden isolierbar sind Als Wirtsstamme bieten sich dafür solche Orgamsmen an die natürlicherweise Anticapsin oder Bacilysin aus der Zelle ausscheiden Vorteilhaft ist außerdem die Unterdrückung der Endprodukthemmung, wie bei der Bacilysinbiosynthese durch akkumuliertes Bacilysin, so daß die Überproduktion der Antibiotika nicht durch eine hohe Konzentration der Antibiotika selbst gehemmt wird Wegen der strukturellen Ähnlichkeit der halogemerten Bacilysmdeπvate und ihrer zumindest partiell gleichen Biosynthese kann die vorliegende Erfindung auch zur biotechnologischen Herstellung von Chlorotetam und Bromotetain oder von neuen, starker oder spezifischer wirksamen Bacilysin- und Anticapsindenvaten genutzt werden
Alternativ können die rekombmanten Wirkstofϊbildner als zellulare Antagonisten angewendet werden, indem sie in der Umgebung von mikrobiellen Fäulnis- und Krankheitserregern, z B im Boden, in Kulturflussigkeiten oder auf die Oberflache anderer Organismen, ausgebracht und die ausgeschiedenen Antibiotika wirksam werden
Eine weitere Möglichkeit der Anwendung der Monierten Bacilysin-Gene besteht in ihrer Einfuhrung in die antibiotisch zu schutzenden Orgamsmen, so daß diese selbst den antibiotischen Wirkstoff bilden und so einen Selbstschutz gegen mikrobielle Krankheits- und Faulniserreger erlangen Beispielhaft können die Gene, die unmittelbar zur Biosynthese von Anticapsin oder Bacilysin benotigt werden, in Nutzpflanzen transferiert und expπmiert werden und so durch transgene Synthese von Anticapsin oder Bacilysin eine erhöhte Toleranz oder Resistenz gegen em breites Spektrum verschiedenartiger phytopathogener Erreger erzielt werden
Die Aufgabe der Erfindung wird insbesondere dadurch gelost, daß entsprechende erfϊndungsgemaße Gene aus einem Bakteπenstamm der Bacillus subtilis -Gruppe, vorzugsweise aus Bacillus subtilis 168 , mit in der Gentechnik üblichen Methoden isoliert werden
Gegenstand der Erfindung sind Gene zur m-vitro- und m-vivo- Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin sowie ihre Fragmente, Varianten und Mutanten, die durch Basenaustausche oder andere Mutationen gekennzeichnet sind, ebenso RNA-Nukleinsauresequenzen, in denen T durch U ausgetauscht ist, und Nuklemsauresequenzen, die vollständig oder partiell komplementär bzw homolog sind
Die Gene und ihre Produkte stellen selbst diagnostische und/oder therapeutische Substanzen dar oder dienen als Targets zur Suche nach neuen therapeutisch wirksamen Substanzen. Erfindungsgemäß handelt es sich vorzugsweise um Bacilysin-Gene von Bacillus subtilis 168, im weiteren als „Z>αc"-Gene bezeichnet, innerhalb einer 7471 bps-DNA-Sequenz gemäß SEQ ID No. 1 (Anhang 1), ihre Mutanten, Varianten sowie ihre vollständig oder partiell komplementären DNA-Sequenzen.
Zur Primärklonierung (Ausfuhrungsbeispiel 1) der bac-G e werden vorzugsweise positiv- selektive Klonierungsvektoren mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität eingesetzt und Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten isoliert, so daß nicht nur einzelne Gene, sondern auch Gen-Gruppen mit hinreichender Wahrscheinlichkeit isoliert werden können. Als ein vorteilhafter Klonierungsvektor erweist sich der palindrome, einfach positiv selektive Klonierungsvektor pPS15 (Steinborn, 1996). Dieser palindrome Plasmidvektor und auch der für nachfolgende Klonierungen verwendete nicht palindrome Plasmidvektor pSB595 (s. u.) gehören zu der Inkompatibilitätsgruppe inc\8, und ihre besonders hohe Klonierungskapazität sowie strukturelle und segregative Plasmidstabilität gehen auf ihre Theta-Replikation bzw. ein Partition-Gen parS zurück.
Als Wirtsstamm für die Primärklonierung der erfindungsgemäßen Gene werden bakterielle Bacilysin-negative Stämme, vorzugsweise von Bacillus subtilis 168, genutzt. Wegen einer chromosomalen ^αc-Mutation weisen sie keine chromosomal kodierte Bacilysinbildung auf, und die Klonierung der ό c-Gene kann aufgrund der Komplementation der chromosomalen Mutation nachgewiesen werden. Bevorzugt werden eine Mutante NG79 bac-\ (Hilton et al, 1988b) oder Derivate von NG79 aus der Stammfamilie Bacillus subtilis 168 als Bacilysin- negative Wirtsstämme eingesetzt. Insbesondere wird ein stabilisierender Stamm Bacillus subtilis GSB298 hip-X bac-X oder ein vergleichbarer Stamm als Bacilysin-negativer Wirtsstamm verwendet, der eine erhöhte Transformationsfähigkeit und stabilisierende Wirkung auf rekombinante Plasmidderivate mit einem großen Insert aufweist, wobei dieser GSB298 als spontane hip (host increased plasmid stability)-Mutante von NG79 bac-X abgeleitet und aufgrund seiner stabilisierenden Wirkung auf palindrome, zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren (Steinborn, 1996) isoliert wird.
Es werden Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten vorzugsweise mittels partieller Restriktasespaltung der Donor-DNA und Insertion von vorselektierten, großen (> 10 kb) DNA-Fragmenten erhalten. Beispielhaft wird nach partieller BamHI-Spaltung eine Gen-Bank isoliert, aus der ein rekombinanter Stamm Bacillus subtilis GSB298 (pSB657) mit tαc-Genen aus Bacillus subtilis 168 isoliert wird. Dieser scheidet plasmidkodiertes Bacilysin aus, welches anhand der Hemmung eines Bacilysin-sensiblen Indikatorstammes, vorzugsweise von Escherichia coli B oder Proteus vulgaris, und der Hemmung von Bacilysin durch N-Acetylglukosamin nachgewiesen wird. Ein zusätzlicher Beweis für die plasmidkodierte Expression von Bacilysin wird dadurch erhalten, daß pSB657 dieses nicht in
einem Wirtsstamm Bacillus subtilis GSB285 aroI906 (Steinborn, 1996) exprimiert, da die Mutation aro\906 die Biosynthese von Prephenat als Precursor für Anticapsin unterbindet. Eine optimale Bildung und antibiotische Wirksamkeit von Bacilysin wird durch Nutzung eines PA-Minimalmediums (Perry and Abraham, 1979) und Kultivierung bei 30°C erreicht. Agar-Diffusionsteste dienen zur halbquantitativen Bestimmung der Bacilysinaktivität anhand von Inhibitionszonen um wachsende Kolonien oder Stanzlöcher, die mit Kulturüberständen beschickt werden.
Erfindungsgemäß sind die bac-Gene in dem durch Primärklonierung erzeugten rekombinanten Plasmid pSB657 innerhalb eines 21,5 kb-BamHI- Inserts enthalten. Durch Subklonierung wird aus dem 21,5 kb-BamHI-Insert von pSB657 ein weiterer rekombinanter Stamm Bacillus subtilis GSB298 (pSB660) abgeleitet, wobei in dem so erhaltenen rekombinanten Plasmid pSB660 die bac-Gene innerhalb eines 7,5 kb-Pstl-Inserts enthalten sind (Ausführungsbeispiel 2).
Das Pstl-Insert von pSB660 wird anhand von DNA-Homologien und übereinstimmender Restriktionsdaten (Abb. l) als 7471 bps-DNA-Sequenz (Abb. 2), lokalisiert in der Region von bp 3867455 bis bp 3 874 925 der genomischen DNA-Sequenz (SubtiList database, Institut Pasteur , Moszer et al., 1995; Moszer, 1998) des Genoms von Bacillus subtilis 168, identifiziert (Ausführungsbeispiel 3). Diese Position liegt innerhalb der 90 kb-Region, in der der έαc-1-Locus mittels Transduktion kartiert worden ist (Hilton, H, et al., 1988b); dadurch werden die Lokalisierung und Funktion der bac-Gene bestätigt.
Gemäß der Erfindung kodiert das rekombinante Plasmid pSB660 in Bacillus subtilis GSB298 eine erhöhte oder zumindest mit dem Gen-Donorstamm Bacillus subtilis 168 vergleichbare Bacilysinbildung (Abb. 3), so daß der durch die bac-X Mutation (Hilton et al., 1988b) bedingte Defekt in der Ligasereaktion in GSB298 durch pSB660 funktionell vollständig komplementiert wird. Im Unterschied zu vergleichbarem Wachstum und vergleichbaren maximalen Werten der Bacilysinbildung wird aber ein unterschiedlicher Verlauf der Bacilysinbildung beobachtet, die beim rekombinanten Stamm GSB298(pSB660) unverzüglich mit Beginn des Wachstums einsetzt. Dagegen erfolgt die chromosomal kodierte Bacilysinbildung mit einer deutlichen lag-Phase und gleicht sich erst zur stationären Phase dem Niveau der plasmidkodierten Bacilysinbildung an. Diese Angleichung der Maximalwerte wird als Ausdruck der Endprodukthemmung durch akkumuliertes Bacilysin gewertet. In dem Pstl-Insert sind 6 offene Leserahmen (ORF 's) mit bisher unbekannter Funktion und der ursprünglichen Bezeichnung (s. SubtiList database) ywfk bis w F enthalten, die aufgrund der beschriebenen Komplementation und weiterer Befunde (s. u.) zu ihrer Funktion in der Bacilysinbiosynthese zu back bis bacY (Abb. 1) umbenannt und erfindungsgemäß beansprucht werden. Damit wird jedoch nicht ausgeschlossen, daß nicht noch weitere Gene an einer optimalen Bacilysinbiosynthese beteiligt sind. Eine essentielle Funktion der Gene bacB bis bacE für die Bacilysinbiosynthese wird anhand von inaktivierenden Mutationen in
den einzelnen bac-Genen nachgewiesen, die die Bildung von extrazellulärem Bacilysin mehr oder weniger reduzieren oder eliminieren. Dazu werden Deletions (Δ)- und Insertionsmutationen (::) in Monierten bac-Genen (Ausführungsbeispiel 4) in rekombinanten Plasmiden und in chromosomalen bac-Genen (Ausführungsbeispiel 5) in Bacillus subtilis 168 erzeugt und ihr Einfluß auf die Bacilysinbildung untersucht. Eine wesentliche Rolle der Gene bacB bis bacE wird dadurch belegt, daß ein diese Gene enthaltenes Deletionsderivat pSB672 = pSB660 Aback AbacF in GSB298 eine mit pSB660 vergleichbare Bacilysinbildung kodiert (Abb. 3), während von pSB672 abgeleitete Mutanten pSB676 = pSB672 bacB* , pSB677 = pSB672 AbacC und pSB678 = pSB672 AbacD im Vergleich zu pSB660 und pSB672 nur etwa 1/10 Bacilysinbildung in GSB298 kodieren (Abb. 4). Ein Deletionsderivat pSB674 = pSB672 AbacE bewirkt in GSB298 sogar einen vollständigen Ausfall der Bildung von extrazellulärem Bacilysin und eine vollständige Inhibition des Wachstums sowie Zellyse, korreliert mit auffalligen Aufblähungen der natürlicherweise stäbchenförmigen Zellen bis zu Protoplasten-ähnlichen Zellformen, wie sie für die antibiotische Wirkung von Anticapsin typisch sind. Daraus ist zu schließen, daß bacE eine für die Ligasereaktion der Bacilysinbildung erforderliches Enzym kodiert und in GSB298(pSB674) bei inaktivem bacE- Gen sowohl in pSB674 wie auch in GSB298 bac-X (wie für die bac-X -Mutation nachgewiesen; Hilton et al., 1988b) intrazellulär eine für die Wirtszelle letale Konzentrierung von Anticapsin erfolgt. Es ist aber auch nicht auszuschließen, daß in GSB298 ein zusätzliches Gen mutiert ist, z. B. ein Transport-Gen, so daß die Exkretion von Bacilysin und/oder Anticapsin inhibiert ist. Diese Annahme wird dadurch belegt, daß pSB674 die gleichen aberranten Zellformen und Zellyse auch in einer multiplen Insertionsmutante GSB322 bewirkt, nicht aber in Insertionsmutanten, bei denen nur einzelne chromosomale bac-Gene inaktiviert wurden (Ausfuhrungsbeispiel 7). Hinweise auf die Transportfunktion eines bac- Gens in Beziehung zum Selbstschutz der Bakterienzellen gegen das von ihnen selbst gebildete und ausgeschiedene Bacilysin werden nicht erhalten, da sich alle chromosomalen Insertiosmutationen, auch multiple, nicht negativ auf ihre Resistenz gegen extrazelluläres Bacilysin auswirken (Ausführungsbeispiel 6).
Eine essentielle Funktion der Gene bacB bis bacE für die Bacilysinbiosynthese wird auch durch Insertionsmutationen (Ausführungsbeispiel 5) der chromosomalen Gene bacB in GSB319, bacC in GSB320, bacO in GSB321 oder bacE in GSB315 belegt, da diese zum Verlust der chromosomal kodierten Bacilysinbildung fuhren. Keine wesentliche Funktion ist unter diesen Bedingungen für die Gene back und bac¥ nachweisbar, da die Inaktivierung der chromosomalen Gene back bis bacF in GSB322 durch pSB672 mit den aktiven Genen bacB bis bacE komplementiert werden kann (Ausfuhrungsbeispiel 7). Die essentielle Funktion der Gene bacB bis bacE, ihre Kopplung in einem Gen-Cluster mit gleicher Orientierung der ORF 's (s. Abb. 1) und Aktivierung durch gemeinsame regulatorische Sequenzen der Transkription stromaufwärts von bacB (Ausführungsbeispiel 3) lassen auf eine Transkriptionseinheit von bacB bis (zumindest) bacE schließen. Die experimentellen
Befunde und Schlußfolgerungen zur Funktion der bac-Gene in der Bacilysmbiosvnthese werden durch einen Vergleich der putativ kodierten Proteine BacB, BacE und BacF zu Proteinen der „SWISS-PROT database" im ExPASY Molecular Biology Server erhärtet (Ausfuhrungsbeispiel 3) Es werden hohe Homologien zu einer Prephenatdehydratase für BacB, zu D-Alanm-D-Alanin-Ligasen für BacE bzw einem Efflux-Protein für BacF nachgewiesen, die eine deutlich Beziehung zur Bacilysinbiosynthese erkennen lassen Eine Beziehung der Aαc-Gen-kodierten Proteine zum Prephenat als pπmaren Precursor der Anticapsinbiosynthese wird durch den experimentellen Befund verstärkt, daß von Bacillus subtilis 168 abgeleitete chromosomale όαc-Insertionsdenvate (s Ausfuhrungsbeispiel 5) GSB319, GSB320. GSB321, GSB315 und GSB322 keine Auxotrophie für aromatische Aminosäuren hervorrufen (Ausfuhrungsbeispiel 5) und deshalb die durch Äαc-Gen-Produkte katalysierten Reaktionen, ausgehend vom Prephenat, in der Biosynthese zu Anticapsin bzw Bacilysin (nicht aber in der Biosynthese zum Prephenat) wirken
In einer weiteren Ausfuhrungsvariante (Ausfuhrungsbeispiel 8) des Verfahrens werden verschiedene rekombinante Plasmide m heterologe Wirtsstamme von verschiedenen J3öc//7ws-Specιes transformiert, und überraschenderweise weisen die erhaltenen rekombinanten Stamme eine recht unterschiedliche plasmidkodierte Bacilysinbildung auf Selbst nach Transformation von pSB660, das back bis bacF in aktiver Form enthalt, ist für Bacillus coagulans (pSB660), Bacillus hchinijormis ATCC9789 (pSB660) und Bacillus megatenum PV361 (pSB660) kein extrazellulares Bacilysin nachweisbar Für diese Stamme ist noch nicht auszuschließen, daß zwar plasmidkodiertes Bacilysin intrazellular synthetisiert , dieses aber nicht exkretiert wird und deshalb mcht extrazellular nachgewiesen werden kann Dagegen ist für Bacillus pumilus ATCC12140, wie für GSB298 (s o ), schon durch ρSB674, das nur bacB bis bacE in aktiver Form enthalt, eine hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung feststellbar Damit wird nochmals die essentielle Funktion dieser Z>αc-Gene für die Bacilysinbiosynthese bestätigt Eine besonders hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung wird für den Wirtsstamm Bacillus amyloliquefaciens GSB272 ermittelt, so daß GSB272 (pSB660) und GSB272 (pSB672) eine gegenüber dem Donorstamm Bacillus subtilis 168 ca 5-fach erhöhte Bacilysinbildung aufweisen Besonders überraschend aber ist der Befund, daß ein rekombinantes Plasmid pSB679 = pSB660 A(back bacD bacE bacF), welches also nur noch bacB und bacC m aktiver Form enthalt, in GSB272 eine etwa gleich hohe Bacilysinbildung bewirkt Dieses Ergebnis belegt die essentielle Gen-Funktion von bacB und bacC in der Bacilysinbildung und läßt andererseits darauf schließen, daß in GSB272 die ubπgen essentiellen Z>αc-Gene funktionsfähig im bakteriellen Chromosom vorhanden sind Diese Annahme hegt sehr nahe, da die meisten Wildtypstamme von Bacillus amyloliquefaciens eine chromosomal kodierte Bacilysinbildung aufweisen (s o )
Aufgrund der Wirkung auf ein spezifisches Target, der begrenztenen Stabilität von Bacilysin und Anticapsin sowie des ubiquitären Vorkommens von Inhibitoren in Eukaryonten ist bei ihrer Applikation gegen mikrobielle Krankheits- und Fäulniserreger keine Toxizität bei Menschen, Tieren und Pflanzen zu erwarten.
Die Erfindung wird nachstehend anhand der folgenden Abbildungen und Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Die Abbildungen zeigen in
Abb. 1: Restriktionskarte des Pstl-lnserts von pSB660 entsprechend der DNA-Sequenz in Anlage 1 mit den Genen back, bacB, bacC, bacD, bacE und bacF aus Bacillus subtilis 168. Es sind nur solche Restriktaseschnittstellen angegeben, die für die Konstruktion von Plasmidderivaten genutzt werden.
Abb. 2: Wachstum und Bacilysinbildung bei dem rekombinanten Stamm Bacillus subtilis GSB298(pSB672) im Vergleich zum Gen-Donorstamm Bacillus subtilis 168 und dem Bacilysin-negativen Wirtsstamm GSB298 bac-X bei 30°C in PA-Minimalmedium
Abb. 3: Wachstum und Bacilysinbildung bei den rekombinanten Stämmen Bacillus subtilis GSB298(pSB672), GSB298(pSB674) und GSB298(pSB676) bei 30°C in PA-Minimalmedium
DNA-Sequenz des 7471 bps-Pstl-Inserts von pSB660, lokalisiert von bp 3 867 455 bis bp 3 874 925 in der DNA-Sequenz (SubtiList database) des Genoms von Bacillus subtilis 168 gemäß Sequenzprotokoll
Ausführungsbeispiele
Übliche Materialien und Methoden werden im folgenden nicht detailliert beschrieben. Kenntnisse zur Kultivierung von Bakterien, Stammselektion, Isolierung von chromosomaler DNA, Plasmid-DNA und DNA-Fragmenten, Restriktasespaltung von DNA, Ligation von DNA-Fragmenten, Plasmidtransformation, Elektrophorese und DNA-Sequenzanalyse werden vorausgesetzt und sind durch Publikationen (Sambrook et al., 1989; Harwood and Cutting, 1990; Nicholl, 1994) allgemein zugänglich. Bei Nutzung von käuflichen Kits, Enzymen und anderen Materialien wird nach den Protokollen der Hersteller oder Lieferfirmen verfahren.
Folgende spezielle Materialien und Methoden werden häufiger verwendet:
# Bakterienstamm Bacillus subtilis GSB285 hψX (Steinborn, 1996/98) als Rezipientenstamm für Subklonierungen von bac-Genen; abgeleitet als spontane, plasmidstabilisierende (für rekombinante Plasmide mit großem Insert) Mutante von GSB26 .sαcA321 αroI906 metB5 amyE strX aus der Stammlinie von Bacillus subtilis 168. Die αroI906-Mutation verhindert die Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin, so daß diese nicht die Plasmidtransformation (bes. in Protoplasten) beeinträchtigen können
# Plasmidvektor pPS15 (15,4 kb; MLS1) als palindromer, positiv selektiver Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität (Steinbom, 1996/98), so daß bei Klonierungen annähernd alle Plasmidtransformanten ein rekombinantes Plasmid enthalten und auch rekombinante Plasmide mit einem großen Insert stabil erhalten bleiben
Plasmidvektor pSB595 (7 kb; MLSr) als nicht palindromer Klonierungsvektor mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität, abgeleitet von einem Plasmid pSB472 (Steinborn, 1996/98) durch Einführung einer multiplen Klonierungsstelle
Beide Plasmidvektoren gehören zu der Inkompatibilitätsgruppe /«cl8 und ihre hohe strukturelle und segregative Stabilität geht auf den Theta-Typ ihrer Replikation bzw. auf ein Partition-Gen parS zurück
# DNA-Isolierungen aus Stammen von Bacillus und Escherichia coh:
- Plasmid-DNA und hochmolekulare chromosomale DNA und in großem Maßstab mittels QIAGEN Plasmid-Kit bzw. Genomic-Kit
- Plasmid-DNA in kleinem Maßstab (Minipräps) nach einer alkalischen Methode (Sambrook et al., 1989)
# Isolierung von DNA-Fragmenten aus Gelen mittels QIAGEN QIAEX II -Kit oder Elektro- elution für Fragmente <10 kb bzw. >10 kb
# DNA-Sequenzierungen an einem A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia LKB)
# Plasmidtransformation in Bacillus meist nach der PEG-Protoplasten-Methode (Chang and Cohen, 1979) oder (Ausführungsbeispiel 5) in kompetente Zellen (Dubnau and Davidoff- Abelson, 1971) von Bacillus subtilis 168
# Plasmidtransformation in kompetente Zellen von Escherichia coh nach Hanahan (1983)
# Selektion auf plasmidkodierte Chloramphenicolresistenz (Cmr) oder MLS- Antibioukaresistenz (MLS1), u. a. Erythromycinresistenz (Emr), durch Zusatz von 10 μg/ml Chloramphenicol (Cm) bzw. 5 μg/ml Erythromycin (Em)
# Insertionsmutagenese (Niaudet et al., 1982) zur Inaktivierung von chromosomalen bac- Genen des Gen-Donors Bacillus subtilis 168 durch chromosomale Insertion.
# Kultivierung meist (s. u.) bei 37°C in flüssigem TBY- Vollmedium (1 % bactotryptone, Difco - 0,5 % yeast extract, Difco - 0,5 % NaCl; pH 7,0) oder auf TBY-Agar (1,8 % Agar- Agar)
# Kultivierung zur Bildung von Bacilysin bei 30°C in flüssigem PA-Minimalmedium (optimiert zur Biosynthese von Bacilysin; Perry and Abraham, 1979) - 0,2 % Glukose - 50 μg/ml essentielle Aminosäuren oder auf PA-Agar (1,5 % Agar-Agar)
# Screening auf Bacilysin-bildende Klone durch Replikatechnik oder Ausstriche auf PA- Minimalagar mit Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris oder vorzugsweise Escherichia coli B als Bacilysin-sensible Indikatororganismen anhand von Hemmhöfen um wachsende Kolonien.
Testplatten: 25 ml oder 50 ml PA-Agar in runden Platten, d = 10 cm, bzw. quadratischen Platten, 14x14 cm, pro 100 ml Agar mit 1 ml gewaschener Suspension des Indiktorstammes, E47o nm = suspendiert bei 50 °C
# halbquantitative Bestimmung der Bacilysinbildung in Kulturüberständen mittels Lochplattentest und beschriebener (s. o.) Testplatten. Durchmesser der Löcher: 5 mm, Probevolumen: 30 μl. Die Bacilysinaktivität wird durch relative Einheiten (Ure!) dargestellt, die an einer Eichkuve (linearer Auftrag der Hemmhofdurchmesser zu logarithmischem Auftrag von Verdünnungen eines repräsentativen Bacilysin-haltigen Kulturüberstandes) ermittelt werden.
# Die plasmidkodierte Synthese von Bacilysin, zur Unterscheidung von chromosomal kodierter Bacilysinsynthese und Synthese von anderen Hemmstoffen, wird biologisch durch positive Ergebnisse zu allen folgenden Nachweisen bestätigt:
- Bacilysinsynthese in Korrelation zur Anwesenheit des rekombinanten Plasmids in einem Bacilysin-negativen Wirtsstamm
- keine Bacilysinsynthese in Aro-auxotrophen (Aro') Wirtsstämmen, wie Bacillus subtilis
- kompetitive Hemmung der antibiotischen Aktivität durch N-Acetylglukosamin
- Hemmung der Bacilysinsynthese durch Supplemente (L-Alanin, casamino acids) im PA- Kulturmedium und Kultivierung bei 37°C
- antibiotische Aktivität (soweit getestet) gegen bekannte Bacilysin-sensible Indikatorstämme (Escherichia coli B, Escherichia co K12, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcuc aureus, Salmonella typhimurium, Saccharomyses cerevisiae)
# biochemischer Nachweis von Anticapsin und Bacilysin durch Dünnschichtchromatographie und Bioautographie, wie von Sakajoh et al. (1987) beschrieben
Ausfuhrungsbeispiel 1: Primärklonierung der bac-Gene von Bacillus subtilis 168 Die Primärklonierung erfolgt durch „shot gun" nach partieller Restiktasespaltung der chromosomalen Donor-DNA und Vorselektion von großen DNA-Fragmenten (> 10 kb) zur Ligation. Dazu wird ein positiv selektiver Klonierungsvektor pPS15 genutzt, in einen stabilisierenden, Bacilysin-negativen (Bac ) Rezipientenstamm Bacillus subtilis GSB298 bac- 1 transformiert und ein Screening auf Bacilysin-positve (Bacτ) Klone auf PA-Agarplatten mit
Escherichia coli B als Bacilysin-sensiblen Indikatororganismus ausgeführt. So wird nach partieller BamHI-Spaltung unter 2944 rekombinanten Transformanten ein hoch exprimierender Bac+-Klon gefunden, der mit „GSB298 (pSB657)" bezeichnet wird. In pSB657 wird ein 21,5 kb-BamHI-Insert ermittelt und die plasmidkodierte Bildung von Bacilysin durch alle (s. o.) biologischen und biochemischen Nachweise bestätigt. pSB657 komplementiert in GSB298 die bac-X -Mutation, so daß durch GSB298(pSB657) im Vergleich zum Donorstamm Bacillus subtilis 168 eine zumindest vergleichbare oder erhöhte Bacilysinbildung ((wie für GSB298(pSB672) in Abb. 3)) erfolgt. Bei vergleichbarem Wachstum wird für den Donorstamm eine zeitlich stark verzögerte Bacilysinbildung beobachtet.
Ausfuhrungsbeispiel 2: Lokalisierung der bac-Gene im Primärinsert von pSB657 Dazu werden Subklonierungen nach Spaltung des Inserts von pSB657 durch verschiedene Restriktasen ausgeführt und wieder pPS15 und GSB298 als Wirts- Vektor-System genutzt. Hoch exprimierende Klone, vergleichbar mit GSB298(pSB657), werden nach Pstl-Spaltung erhalten und diese mit ,,GSB298(pSB660)" bezeichnet. PSB660 enthält ein 7,5 kb-Pstl- Insert, das nach Reklonierung in pPS15 und Retransformation in GSB298 wieder reproduzierbar eine hohe Bacilysinbildung (Abb. 3) kodiert.
Ausf hrungsbeispiel 3: Lokalisierung der bac-Gene in der genomischen DNA-Sequenz von Bacillus subtilis 168
Das in pSB660 (Ausfuhrungsbeispiel 2) enthaltene 7,5 kb-Pstl-Insert wird in pUC18 rekloniert und dadurch der rekombinante Stamm Escherichia coh XL1 (pSB661) erhalten. Von beiden Enden des Pstl-lnserts wird dann sequenziert und mit den erhaltenen DNA- Sequenzen (429 bps bzw. 226 bps) ein Homologievergleich mit der genomischen DNA- Sequenz (SubtiList database) des Gen-Donors Bacillus subtilis 168 ausgeführt. Eine vollständige DNA-Homologie wird für die Region von bp 3 867 455 bis bp 3 874 925 der genomischen DNA-Sequenz gefunden, so daß das Pstl-Insert 7 471 bps enthält. Durch Restriktasespaltungen des Pstl-lnserts werden Restriktaseschnittstellen (Abb. 1) ermittelt, die alle durch das Restriktionsmuster der DNA-Sequenz der Datenbank bestätigt und für weitere Plasmidkonstruktionen (Ausführungsbeispiele 4 u. 5) genutzt werden. Außerdem wird durch diesen Homologievergleich das Pstl-Insert innerhalb der ca. 90 kb-Region zwischen den bekannten Genen ctrA und sack lokalisiert, in der nach Literaturangaben ein bac-X Locus kartiert worden ist.
Nach Angaben der Datenbank sind in dem Pstl-Fragment 6 vollständige, funktioneil noch unbekannte ORF's ywfk bis ywfi enthalten, die wegen ihrer Funktion in der Bacilysin- Biosynthese zu back bis bacF (Abb. 1) umbenannt werden. Erste Hinweise auf ihre Funktion werden durch einen Homologievergleich der durch die Gene back bis bacF putativ kodierten Proteine BacA bis BacF zu bekannten Proteinen anderer Organismen mittels der „SWISS-
PROT database" (ExPASY Molecular Biology Server, Fasta 3) erhalten: Hohe Homologien für BacB zu einer Prephenatdehydratase von Streptomyces coelicolor (28 %), für BacE zu D- Alanin-D-Alanin-Ligasen von Haemophüus influenzae (29 %) und von Bacillus subtilis (21.5 %) sowie für BacF zu einem Macrolid-Effluxprotein (24,8 %) weisen auf Funktionen in der Synthese vom Prephenat zum Antikapsin, Ligation von Antikapsin mit L-Alanin zu Bacilysin bzw. beim Transport hin.
Bei der Suche nach putativen Operonstrukturen werden stromaufwärts zu bacB (von bp 3874425 bis bp 3874360 der genomischen DNA-Sequenz) Promotermotive (acattg/taatat) ermittelt, während ein Transkriptionsterminator wahrscheinlich nur stromabwärts von back (von bp 3873120 bis bp 3873061) vorliegt.
Ausführungsbeispiel 4: Mutanten von pSB660
Zur Ermittlung der biologischen Funktion der einzelnen bac-Gene werden zunächst die flankierenden Gene back und bacB deletiert, indem aus dem Insert von pSB660 (s. Abb. 1 ) ein Subfragment von PvuII (bp 1680) bis Sall (bp 5642) in einen Plasmidvektor pSB595 kloniert und so ein rekombinantes Derivat pSB672 = pSB660 Aback AbacV isoliert wird. Auch pSB672 komplementiert die bac-X -Mutation in GSB298 und kodiert eine mit pSB657 und pSB660 vergleichbar hohe Bacilysinbildung (Abb. 3). Ebenfalls durch Subklonierung aus dem Insert von pSB660 wird pSB679 = pSB660 A(back bacD bacE bacF) erzeugt, indem ein Subfragment von PvuII (bp 1680) bis Sacl (bp 3558) in den Plasmidvektor pSB595 kloniert wird. Weitere Mutanten pSB676 = pSB672 bacB*, pSB677 = pSB672 AbacC, pSB678 = pSB672 AbacD und pSB674 = pSB672 AbacE werden von pSB672 abgeleitet (Positionen der folgenden Restriktaseschnittstellen s. Abb. 1) durch „Klenow-fill-in" (*;Kit von Stratagene) in BgHI (bp 2236), Deletion in EcoRV (bp 2863) bis Nrul (bp 3144), Deletion in Ehel (bp 3539) bis Ecll36II (bp 3558) bzw. Deletion in Pvul (bp 4816) bis Pvul (bp 5242). pSB676, pSB677 und pSB678 kodieren in GSB298 eine im Vergleich zu den Ausgangsplasmiden auf 1/10 reduzierte Bacilysinbildung (Abb. 4). Sehr drastische Auswirkungen hat dagegen die Deletion in bacE: GSB298(pSB674) bildet kein Bacilysin, kann bei Kultivierung in PA- Medium (also unter Bedingungen der Bacilysinbildung) nicht wachsen, bildet untypische, aufgeblähte Zellformen und lysiert schließlich.
Ausfuhrungsbeispiel 5: Insertionsmutagenese von chromosomalen bac-Genen in Bacillus subtilis 168 durch doppeltes Cross-over
Im Unterschied zu Ausfuhrungsbeispiel 4 werden hier chromosomale bac-Gene des Gen- Donors durch Insertion inaktiviert, um ihre Funktion in der Bacilysinbiosynthese zu ermitteln. Die Insertion erfolgt durch generelle Rekombination über doppeltes Cross-over und wird mittels Integrationsplasmide ausgeführt. In den Integrationsplasmiden ist ein Selektionsmarker innerhalb des zu inaktivierenden bac-Gens inseriert und wird so von Fragmenten des bac-Gens flankiert, die in einem homologen Wirtstamm das doppelte Cross -
over bewirken. Meist (Ausnahmen: Klenow-fill-in bei pSB676 bzw. pSB682, s. u.) wird vorher ein interner Teil des bac-Gens deletiert , so daß nach doppeltem Cross-over eine Reversion zur Reaktivierung des bac-Gens ausgeschlossen wird. Durch das doppelte Cross- over wird nur ein chromosomales DNA-Fragment mit dem aktiven bac-Gen gegen ein homologes Fragment mit dem inaktivierten Z>αc-Gen-Derivat aus dem Integrationsplasmid rekombinativ ausgetauscht, so daß der Vektoranteil von der Integration ausgeschlossen bleibt. Integrationsplasmide werden entsprechend den Mutanten pSB674 bis pSB678 (Ausfuhrungsbeispiel 4) konstruiert und zusätzlich ein cmlR-Gen für
Chloramphenicolresistenz als Selektionsmarker in die mutierte Stelle eingeführt. Als Gen- Donor für den c R-Selektionsmarker dienen ein Plasmid pSB523 und pSB573, in denen das cmlR-Gen innerhalb von multiplen Klonierungsstellen enthalten ist. Es werden die Integrationsplasmide pSB682 = pSB672 bacB* .cmlH, pSB683 = pSB672 AbacC:.cmlR, pSB684 = pSB672 bacDv.cmlW, pSB680 = pSB672 AbacEv.cmlR und pSB685 = pSB660Δ(όαcA bis bac¥)::cmlK erhalten. pSB685 wird von pSB660 (s. Abb. 1) nach Deletion von PvuII (bp 1680) bis EcoRV (bp 5681) abgeleitet. Zur chromosomalen Integration werden die Inegrationsplasmide linearisiert (als Voraussetzung für doppeltes Cross-over) und in kompetente Zellen von Bacillus subtilis 168 transformiert. Die Selektion erfolgt über Chloramphenicolresistenz, und doppeltes Cross-over (zum Ausschluß von einfachem Cross-over und Mutationen) wird nachgewiesen durch die Abwesenheit von plasmidkodierter MLS-Antibiotikaresistenz (kodiert durch den plasmideigenen Selektionsmarker des Integrationsplasmides) und von freier Plasmid-DNA des Integrationsvektors, durch Southernhybridisierung mit dem cmlR-Gen als markierte Probe sowie durch Klonierung und Restriktionsanalyse der betreffenden chromosomalen Region. Als Insertionsmutanten werden GSB319 = Bacillus subtilis 168 bacB*::cmlR, GSB320 = Bacillus subtilis 168 AbacC::cmli\, GSB321 = Bacillus subtilis 168 AbacO/.cmlR, GSB315 = Bacillus subtilis 168 AbacE::cmlR und GSB322 = Bacillus subtilis 168 A(back bis bacV)::cmlR isoliert, und alle erweisen sich als Bacilysin-negativ.
Zur Prüfung auf Auxotrophie werden die Insertionsmutanten auf PA-Minimalagar ausgestrichen und als prototroph für die Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin identifiziert, deren Biosynthese (ebenso wie für Anticapsin) vom Prephenat im Biosyntheseweg der aromatischen Aminosäuren abzweigt.
Ausfuhrungsbeispiel 6: Funktion der bac-Gene zum Schutz der Zellen von Bacillus subtilis 168 gegen extrazelluläres Bacilysin
In einem Lochplattentest mit verschiedenen chromosomalen Insertionsmutanten (s. Ausf hrungsbeispiel 5) als Indikatorstämme und einem Bacilysin-haltigen Kulturüberstand als Probe werden die Insertionsmutanten auf Bacylisinsensibilität geprüft. Alle Insertionsmutanten, auch GSB322 mit Deletion in back bis bacF, zeigen kein
Inhibitionszonen und erweisen sich dadurch (wie GSB298 und Bacillus subtilis 168) als unverändert Bacilysin-resistent.
Ausführungsbeispiel 7: Wirkung von Deletionsplasmiden auf chromosomale Insertionsmutanten
Verschiedene Deletionsplasmide (s. Ausführungsbeispiel 4) werden in unterschiedliche chromosomale Insertionsmutanten (s. Ausfuhrungsbeispiel 5) transformiert und die so erzeugten Plasmidtransformanten auf Effekte hinsichtlich der Bacilysinbildung oder korrelierter Merkmale untersucht. Bemerkenswert sind die folgenden Ergebnisse:
# GSB322(pSB672) zeigt eine mit GSB298(pSB660) oder GSB298(pSB672) vergleichbar hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung, so daß bacB bis bacE als essentiell oder hinreichend, back und bacF dagegen als unwesentlich oder nicht relevant für eine hohe Bacilysinbildung gewertet werden können
# GSB322(pSB674) (nicht aber Plasmidtransformanten von pSB674 mit anderen chromosomalen Insertionsmutanten) verhält sich bei Kultivierung in PA-Minimalmedium hinsichtlich Defekt in der Bacilysinbildung, aberranter Zellformen und Zellyse wie GSB298(pSB674), so daß dieser Mutantenphänotyp (wie auch bei NG79 oder GSB298) nicht auf den Defekt in nur einem &αc-Stnιktur-Gen zurückgehen kann.
Ausfuhrungsbeispiel 8: plasmidkodierte Bacilysinbildung in heterologen Bacillus-kτten pSB660 und verschiedene Deletionsplasmide (s. Ausführungsbeispiel 4) werden in Bacillus amyloliquefaciens GSB272, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis ATCC9789, Bacillus megaterium PV361 und Bacillus pumilus ATCC 12140 transformiert und die erhaltenen Plasmidtransfomanten auf plasmidkodierte Bacilysinbildung getestet. Plasmidtransformanten von Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis ATCC9789 und Bacillus megaterium ATCC 12140 bilden kein extrazelluläres Bacilysin, während in Bacillus pumilus ATCC 12140 (wie in Bacillus subtilis GSB298) schon pSB672 mit bacB bis bacE als aktive Gene eine hohe Bacilysinbildung kodiert. Eine besonders hohe plasmidkodierte Bacilysinbildung, bis 5 -fach im Vergleich zu GSB298(pSB660) oder GSB298(pSB672), wird in Bacillus amyloliquefaciens GSB272 erreicht, wozu bereits das Deletionsplasmid pSB679 (Ausfuhrungsbeispiel 4) mit bacB und bacC hinreichend ist.
Literatur
Baldwin, J. E„ et al., Tetrahedron 51, 5193-5206 (1995)
Chang, S., and S. N. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168, 111-1 15 (1979)
Chmara, H., et al., Drugs under Experimental and Clinical Res. 6, 7-14 (1980)
Chmara, H, et al., J. Antibiotics 34, 1608-1612 (1981)
Chmara, HL, J. Gen. Microbiol. 131, 265-271 (1985)
Diddens, H, et al., J. Antibiotics 32, 87-90 (1979)
Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol. 56, 209-221 (1971)
Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166, 557- (1983)
Hilton, M. D., et al, J. Bacteriol. 170, 482-484 (1988a)
Hilton, M. D., et al., J. Bacteriol. 170, 1018-1020 (1988b)
Katzer, W., Dissertation, Universität Tübingen, 1991
Kenig M. D., et al., J. Gen. Microbiol. 94, 46-54 (1976)
Kenig, M. D., and E. P. Abraham, J. Gen. Microbiol. 94, 37-45 (1976)
Loeffler, W., et al., J. Phytopathology 115, 204-213 (1986)
Loeffler, W., et al., Forum Mikrobiologie 3, 156-163 (1990)
Milewski, S., Biochim. Biophys. Acta 1161, 269 (1993)
Moszer, I, FEBS Letters 430, 28-36 (1998)
Moszer, L, et al., Microbiology 141, 259-289 (1995)
Neuss, N., et al., Biochem. J. 118, 571-575 (1970)
Niaudet, B., et al., Gene 19, 277-284
NichoU, D. S. T., Gentechnische Methoden. Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg,
Berlin, Oxford (1995)
Özcengiz, G., and N. G. Alaeddinoglu, Folia Microbiol. 6, 522-526 (1991)
Perry, D., and E. P. Abraham, J. Gen. Microbiol. 115, 213-221 (1979)
Rogers, H. J., et al., Biochem. J. 97, 579-586 (1965)
Sambrook, J., et al., Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Laboratory Press
(1989)
Steinborn, G., DE-Al 196 54 841 (1996)
Walker, J.E., and E. P. Abraham, Biochem. J. 118, 557-561 (1970a)
Walker, J. E., and E. P. Abraham, Biochem. J. 118, 563-570 (1970b)
Walton, R. B., and E. L. Rickes, J. Bacteriol. 84, 1148-1151 (1962)
Whitney, J. G., and S. S. Funderburk, Abstracts for the X. International Congress for
Microbiology, Mexico City, p 101 (1970)
Whitney, J. G., et al., Bacteriological Proceedings 7 (1970)
Wild, H., J. Org. Chem. 59, 2748-2761 (1994)
Zuber, P., et al., in Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria. Sonenshein, A. L., et al.
(eds); American Soc. Of Microbiol.. Washington, DC, pp. 897-916 (1993)
Claims
1. bac-Gene zur Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin sowie ihre Fragmente, Mutanten und Varianten
2. bac-Gene nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem bakteriellen Gen- Donorstamm, besonders aus Bacillus, isoliert werden
3. bac-Gene nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie vorzugsweise aus Bacillus subtilis 168 stammen
4. DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz ID No. 1 betrifft sowie Fragmente, Mutanten und Varianten dieser Sequenz
5. RNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie vollständig oder partiell komplementär sind
6. DNA-Sequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie vollständig oder partiell homolog sind
7. Rekombinante Vektoren, die für Anticapsin oder Bacilysin kodierende Gene enthalten
8. Rekombinante Plasmide, die für Anticapsin oder Bacilysin kodierende Gene enthalten
9. Ein rekombinantes Plasmid pSB657 nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es durch shot-gun-Klonierung von bac-Genen aus Bacillus subtilis 168 erhalten wird und in Wirtsstämmen von Bacillus extrazelluläres Bacilysin kodiert
10. Plasmid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß in dem durch Primärklonierung erzeugten rekombinanten Plasmid pSB657 die bac-Gene innerhalb eines 21,5 kb-BamJ-fl- Inserts enthalten sind
11. Ein rekombinantes Plasmid pSB660 nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Pstl-Subklonierung aus dem 21,5 kb-BamHI-Insert von pSB657 erhalten wird und die bac-Gene innerhalb eines 7.5 kb-Pstl-Inserts enthält
12. Plasmid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das 7.5 kb-Pstl-Insert von pSB660 mittels DNA-Sequenzierung und Vergleich der DNA-Homologie als 7471 bps-Pstl-
Fragment, lokalisiert von bp 3 867 455 bis bp 3 874 925 in der DNA-Sequenz (SubtiList database) des Genoms von Bacillus subtilis 168, identifiziert wird
13. Offene Leserahmen ywfk, ywjB, ywfC, ywfD, ywfE und ywfi (SubtiList database) im Insert des rekombinanten Plasmids pSB660, die an der Bacilysinbiosynthese in Bacillus- Wirtsstämmen beteiligte Funktionen kodieren und deshalb zu back bis bacF gemäß Abb. 1 umbenannt werden, die damit Gegenstand des Anspruchs ist
14. Ein rekombinantes Plasmid pSB672 nach Anspruch 8, 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Subklonierung von PvuII, bpl680, bis Sall, bp5642, aus dem Pstl-Insert von pSB660 erhalten wird und die Gene bacB bis bacE innerhalb eines 3 968 bps- Inserts enthält
15. Ein rekombinantes Plasmid pSB679 nach Anspruch 8, 11 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Subklonierung von PvuII, bp 1680, bis Sacl; bp 3558, aus dem Pstl lnsert von pSB660 erhalten wird und die Gene bacB und bacC innerhalb eines 1878 bps-Inserts enthält
16. Verwendung der rekombinanten Plasmide pSB657, pSB660, pSB672, pSB679 oder von Derivaten dieser Plasmide nach einem der Ansprüche 9 bis 15 in bakteriellen Wirtsstämmen, vorzugsweise in Bacillus subtilis und auch in heterologen Bacillus- Wirtsstämmen, zur Bacilysinbildung
17. Verwendung nach Anspruch 16 in den heterologen Wirtsstämmen Bacillus amyloliquefaciens GSB272 und Bacillus pumilus ATCC 12140
18. Verfahren zur Isolierung von bac-Genen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie mittels gentechnischer Methoden isoliert und in geeigneten Wirtsstämmen amplifiziert werden sowie ihre Funktion bei der Biosynthese von Anticapsin und Bacilysin charakterisiert wird
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß palindrome, posititiv selektive Plasmidvektoren und nichtpalindrome Plasmidvektoren mit hoher Klonierungskapazität und Stabilität zur Isolierung von Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten bzw. für Subklonierungen verwendet werden
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß ein palindromer, einfach positiv selektiver Plasmidvektor pPS15 und ein nichtpalindromer Plasmidvektor pSB595 eingesetzt werden
21 Verfahren nach Anspruch 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Bacyhsin-negative Wirtsstamme, vorzugsweise von Bacillus subtilis 168, für die pπmare Klonierung genutzt werden, die wegen einer chromosomalen Mutation keine chromosomal kodierte Bacilysinbildung aufweisen, und die Klonierung von bac-Genen aufgrund der Komplementation der chromosomalen Mutation nachgewiesen wird
22 Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mutante NG79 bac-X oder Derivate von NG79 aus der Stammfamihe Bacillus subtilis 168 als Bacyhsin-negative Wirtsstamme eingesetzt werden
23 Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß ein stabilisierender Stamm Bacillus subtilis GSB298 oder ein vergleichbarer Stamm als Bacilysm-negativer Wirtsstamm eingesetzt wird, der eine erhöhte Transformationsfahigkeit und stabilisierende Wirkung auf rekombinante Plasmiddeπvate mit einem großen Insert aufweist
24 Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß GSB298 als spontane Mutante von NG79 abgeleitet und aufgrund einer stabilisierenden Wirkung auf palindrome, zweifach positiv selektive Plasmidvektoren isoliert wird
25 Verfahren nach Anspruch 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß Gen-Banken mit großen chromosomalen DNA-Inserten vorzugsweise mittels partieller Restπktasespaltung der Donor- DNA und Insertion von vorselektierten, großen (> 10 kb) DNA-Fragmenten isoliert werden
26 Verfahren nach Anspruch 18, 20, 23 und 25, dadurch gekennzeichnet, daß nach partieller BamHI-Spaltung eine Gen-Bank erhalten und aus dieser ein rekombinanter Stamm Bacillus subtilis GSB298 (pSB657) mit klonierten bac-Genen von Bacillus subtilis 168 isoliert wird, die extrazelluläres Bacilysin kodieren
27 Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das plasmidkodierte extrazellulare Bacilysin anhand der Hemmung eines Bacilysin-sensiblen Indikatorstammes, vorzugsweise von Escherichia coli B oder Proteus vulgaris, und der Hemmung von Bacilysin durch N-Acetyl- glukosamin nachgewiesen wird und nicht in Wirtsstammen, wie Bacillus subtilis GSB285 aroϊ906, gebildet wird, die m der Synthese von aromatischen Aminosäuren defekt sind
28 Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß pSB660, pSB672 oder pSB679 oder Deπvate dieser rekombinanten Plasmide in bakteriellen Wirtsstammen,
vorzugsweise von Bacillus, aufgrund der Gen-Amplifikation eine Überproduktion von
Anticapsin oder Bacilysin bewirken und die rekombinanten Stämme zur industriellen
Produktion der Wirkstoffe genutzt werden
29. Verfahren nach Anspruch 16 und 28, dadurch gekennzeichnet, daß pSB660, pSB672 oder pSB679 in dem Wirtsstamm Bacillus amyloliquefaciens GSB272 eine mehrfach erhöhte Bacilysinbildung bewirkt
30. Verfahren nach Anspruch 28 und 29, dadurch gekennzeichnet, daß die plasmidkodierte Bacilysinbildung sofort mit Wachstumsbeginn startet und dadurch ein Vorteil gegenüber der chromosomal kodierten Bacilysinbildung des Donorstammes erzielt wird, die bei vergleichbarem Wachstum mit erheblicher zeitlicher Verzögerung erfolgt
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|---|---|---|---|---|
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| EP1767628A4 (de) * | 2004-06-25 | 2008-08-27 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur herstellung von dipeptiden oder dipeptidderivaten |
| ES2347875T3 (es) | 2004-06-25 | 2010-11-22 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Procedimiento para la produccion de dipeptidos. |
| DE602005017707D1 (de) * | 2004-06-25 | 2009-12-31 | Kyowa Hakko Bio Co Ltd | Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden oder Dipeptidderivaten. |
| EP2179652B1 (de) | 2008-09-10 | 2019-05-08 | ABiTEP GmbH Gesellschaft für AgroBioTechnische Entwicklung und Produktion | Verwendung eines antibakteriellen Mittels zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Kulturpflanzen |
| CN112226437B (zh) * | 2020-10-26 | 2022-02-15 | 湖北大学 | 梯度调控芽胞杆菌启动子启动效率的序列组合及应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19654841A1 (de) * | 1996-12-31 | 1998-07-02 | Inst Pflanzengenetik & Kultur | Zweifach positiv selektive Klonierungsvektoren |
-
1999
- 1999-07-12 CA CA002334079A patent/CA2334079A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-12 DE DE19932908A patent/DE19932908A1/de not_active Withdrawn
- 1999-07-12 AU AU60774/99A patent/AU6077499A/en not_active Abandoned
- 1999-07-12 WO PCT/DE1999/002179 patent/WO2000003009A2/de not_active Application Discontinuation
- 1999-07-12 EP EP99947209A patent/EP1097214A2/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| See references of WO0003009A3 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000003009A3 (de) | 2000-05-04 |
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| DE19932908A1 (de) | 2000-01-20 |
| WO2000003009A2 (de) | 2000-01-20 |
| AU6077499A (en) | 2000-02-01 |
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| Tandeau de Marsac et al. | Expression of the larvicidal gene of Bacillus sphaericus 1593M in the cyanobacterium Anacystis nidulans R2 | |
| O'connor et al. | Halocins and sulfolobicins: the emerging story of archaeal protein and peptide antibiotics | |
| Gow | Growth and guidance of the fungal hypha | |
| DE60212825T2 (de) | Selbsterhaltender lactococcus stamm | |
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