DE69434196T3 - Einen eingefügten Promotor enthaltendes rekombinantes Milchsäure Bakterium - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft das Gebiet von genetisch verbesserten Milchsäurebakterien in Lebensmittelqualität. Insbesondere wird ein rekombinantes Milchsäurebakterium bereitgestellt, bei dem Promotoren von einem Milchsäurebakterium verwendet werden, um verbesserte Milchsäurebakterien zu erhalten, die bei der Herstellung von Lebensmitteln, Tierfutter und probiotisch aktiven Zusammensetzungen von Nutzen sind.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND UND STAND DER TECHNIK
  • Seit Jahrhunderten werden Milchsäurebakterienkulturen wegen ihrer Fähigkeit, bei der Fermentation Zucker in konservierende organische Säuren umzuwandeln, vorwiegend Milchsäure, und verschiedene Metabolite, die mit der Entwicklung von erwünschtem Geschmack und Aroma bei den fermentierten Lebensmittelprodukten assoziiert sind, bei der Lebensmittelherstellung verwendet. Mehrere Milchsäurebakterien produzieren hydrolytische Enzyme, einschließlich Peptidasen und Proteasen, und lipolytische Enzyme, deren Produktion z. B. zur Entwicklung eines erwünschten Geschmacks in Käse beitragen kann.
  • Zur industriellen Produktion eines weiten Bereichs an fermentierten Lebensmittelprodukten, wie all die bekannten traditionellen Milchprodukte einschließlich Joghurt, Acidophilus-Milch, Butter und Käse; fermentiertem Gemüse; fermentierten Fleischprodukten und Tierfutter, ist jedoch eine weiter Bereich an Milchsäurebakterienstarterkulturen erforderlich, von denen jeder an die spezielle Art von Lebensmittelprodukt angepasst ist. Solche Kulturen werden zur Zeit aus natürlicherweise vorkommenden Stämmen an Milchsäurebakterien ausgesucht auf der Basis von Charakteristika wie ihrer Fähigkeit zur Fermentation von Zuckern, die in dem zu fermentierenden Lebensmittelprodukt vorkommen, spezifischen Erfordernissen der Wachstumstemperatur, der Produktion von erwünschten Geschmacksstoffen, wobei die spezifische Kombination der Charakteristika eine spezifisch ausgewählte Wildtypkultur für die Produktion eines speziellen Lebensmittelprodukts nützlich macht, aber üblicherweise weniger nützlich für die Produktion von anderen.
  • Offensichtlich ist das gegenwärtig verwendete Verfahren zur Entwicklung von nützlichen Milchsäurebakterienkulturen durch Selektion von natürlicherweise vorkommenden Stämmen mühsam und teuer. Darüber hinaus hat es sich als schwierig herausgestellt, Starterkulturstämme bereitzustellen, die alle erforderlichen Charakteristika auf optimalem Niveau kombinieren. Zur Zeit wird dieses Problem üblicherweise durch die Verwendung von Starterkulturen gelöst, die eine Vielzahl an ausgewählten Milchsäurebakterienkulturen umfassen, wobei jeder eine oder mehrere der Charakteristika besitzt, die für ein spezielles Lebensmittelprodukt wünschenswert sind. Die Notwendigkeit der Verwendung solcher Mischkulturen wird natürlich die Kosten bei der Herstellung von Milchsäurebakterienstarterkulturen erhöhen.
  • Basierend auf ihrer traditionellen und langzeitlichen Anwendung bei der Lebensmittelherstellung und der Tatsache, dass sie als nicht pathogen betrachtet werden, werden die Milchsäurebakterien üblicherweise als sichere (GRAS) Lebensmittelinhaltsstoffe anerkannt, selbst wenn sie in dem fermentierten Lebensmittelprodukt zu sehr hohen Zahlen wie 108 bis 109 pro g als lebende Bakterien vorhanden sind.
  • Zur Zeit wird allgemein erkannt, dass ein beträchtlicher industrieller Bedarf besteht, ökonomisch und technisch einfachere Wege zur Entwicklung von Starterkulturen zu finden. Es ist offensichtlich, dass die Gentechnik die Mittel zur Deckung dieses Bedarfs bereitstellen kann. In diesem Kontext ist es entscheidend, dass Milchsäurebakterien für die Lebensmittelherstellung, die durch Einbringung von gewünschten Genen unter Verwendung der Gentechnik entwickelt werden, immer noch als sicher für den Verzehr betrachtet werden können. Es wird daher von der Industrie so gesehen, dass es essentiell ist, dass rekombinante Milchsäurebakterien nur DNA milchsäurebakteriellen Ursprungs enthalten, einschließlich Wildtyp-DNA von extrachromosomalen Plasmiden, die häufig in Starterkulturstämmen gefunden werden, oder nicht-milchsäurebakterielle DNA, die den rekombinanten Stämmen keine gefährlichen phänotypischen Eigenschaften überträgt.
  • Es gab mehrere Versuche, genetisch verbesserte Milchsäurebakterien bereitzustellen. Die meisten dieser Versuche waren auf die Konstruktion von rekombinanten Expressionsvektoren gerichtet, die gewünschte Genprodukte codieren und die in der Lage sind, in Milchsäurebakterien zu replizieren. Nur sehr wenige dieser Versuche resultierten jedoch in Vektoren, die nur milchsäurebakterielle DNA umfassen.
  • Ein anderer Weg zur Verbesserung von Milchsäurebakterien wäre der, nützliche Gene in das Chromosom der Bakterien zu inserieren oder die Expression von chromosomalen Genen zu erhöhen, die gewünschte Genprodukte codieren. Ein solcher Weg könnte, wenn er erfolgreich ist, das Problem umgehen, dem man häufig begegnet, wenn neue Gene auf einem Plasmid eingebracht werden, nämlich den Verlust solcher Plasmide wegen der inhärenten Instabilität oder als Ergebnis der Gegenwart von anderen Plasmiden, die zu einer anderen inkompatiblen Gruppe gehören. Im Gegensatz dazu wird ein eingebrachtes Gen, das in das Chromosom integriert wird, im Allgemeinen stabil auf Tochterzellen vererbt.
  • Dieser letzte Weg ist jedoch wegen des Mangels von detailliertem Wissen über die Chromosomen der Milchsäurebakterien in Milchsäurebakterien und wegen des Fehlens von geeigneten Verfahren zum Erreichen von chromosomaler Integration von heterologer DNA noch nicht gut untersucht, obgleich neuere Publikationen über eine solche chromosomale Integration in Lactococcus lactis ssp. lactis mittels sogenannter Intergrationsvektoren (Referenz 46) berichtet haben.
  • Es ist bekannt, dass die Expression eines homologen oder heterologen Gens durch z. B. den Ersatz einer Promotorsequenz, die natürlicherweise mit dem Gen assoziiert ist, durch eine stärkere Promotorsequenz verstärkt werden kann, was in einer erhöhten Expression des Gens auf der Ebene der Transkription resultiert. So offenbart die DD 228 564 ein Verfahren zur Herstellung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, sich in E. coli und/oder B. subtilis zu vermehren, welches die Inserierung eines promotorlosen basischen E. coli- und/oder B. subtilis-Plasmids in eine einzelne Restriktionsstelle umfasst, welches ein Strukturgen umfasst, ein DNA-Fragment, das eines Promotor enthält und das aus einer Streptococcus-Art mit einem Restriktionsenzym isoliert wurde, das der einzelnen Restriktionsstelle des zugrundeliegenden Plasmids entspricht, und die Isolierung des somit rekombinanten Vektors aus E. coli und/oder B. subtilis, das mit dem Vektor transformiert wurde und das Strukturgen exprimiert.
  • Youngman et al. (1987) offenbarten ein Verfahren für die Isolierung von Promotoren in Bacillus spp. unter Verwendung des Transposons Tn917. Dieses Verfahren beruht jedoch auf der Fähigkeit von Bacillus spp. bei Temperaturen oberhalb von 37°C zu wachsen und es wurde außerdem gefunden, dass dieses Transpositionsverfahren in Bacillus spp. in einer Integration des Transposons in einen dominierenden heißen Flecken resultiert, wodurch ein einzelner dominanter Integrant auftritt.
  • Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass Sequenzen, die einen Milchsäurebakterienpromotor umfassen und/oder Promotor-Signal-Peptidsequenzen, verwendet werden können, um schwächere native Promotoren und/oder Promotor-Signal-Peptidsequenzen in Plasmiden zu ersetzen, um eine effizientere Expression und Sezernierung eines E. coli-Genprodukts zu erhalten, z. B. von β-Lactamase in dem Milchsäurebakterium Lactococcus lactis. (Referenz 28). Diese Autoren identifizierten die Lactococcus-Promotorsequenzen mittels eines Promotorsondenvektors, der in der Lage ist, in E. coli und/oder B. subtilis zu replizieren und ein promotorloses cat-Gen umfasste und geeignete Restriktionsstellen, in die Fragmente des Lactococcus-Chromosoms inseriert werden konnten, gefolgt von Durchmusterung auf rekombinante Plamide, die aus E. coli oder B. subtilis isoliert wurden und die das cat-Gen exprimierten.
  • Ein solches Verfahren, das Durchmustern in einem nicht-Milchsäurebakterium nach der Inserierung von Milchsäurebakterienpromotoren in einem Vektor umfasst, der nicht von milchsäurebakteriellem Ursprung ist und der sich in einem nicht-Milchsäurebakterium repliziert, erlaubt jedoch nicht die direkte in situ-Identifizierung eines nützlichen Milchsäurebakterienpromotors, während er in dem Milchsäurebakterium seines Ursprungs funktioniert.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Lactococcus spp. umfassend ein Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, und funktionell verknüpft damit einen Promotor, der ausgewählt ist aus P170 und dem Promotor stromaufwärts des LacZ-proximalen Endes von Tn917-LTV1 in einem der Integranten, die als DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 oder DSM 8859 hinterlegt wurden, wobei die Anwesenheit des Promotors zu einer veränderten Expression des Gens im Vergleich zur Expression des funktionell mit seinem nativen Promotor verbundenen Gens führt.
  • In noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Fragment, umfassend den regulierten Promotor, welcher in dem Lacotcoccus lactis ssp. lactis MG1363 integrierenden Clon enthalten ist, der unter einer Zugangsnummer ausgewählt aus DSM 7360, DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 und DSM 8859 hinterlegt wurde, und funktionell damit verknüpft ein Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, wobei es sich bei dem Promotor um einen Promotor handelt, der natürlicherweise nicht mit dem Gen verbunden ist.
  • AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung der Mittel zur Konstruktion verbesserter Milchsäurebakterien, die von Lebensmittelqualität sind in dem Sinn, dass sie nur DNA enthalten, die von einer Milchsäurebakterienart abgeleitet ist oder DNA von einer nicht-Milchsäurebakterienart, deren Anwesenheit allgemein als sicher anerkannt werden kann. Wie hier verwendet, betrifft der Ausdruck ”Milchsäurebakterium” grampositive, mikroaerophile oder anaerobe Bakterien, die Zucker mit der Produktion von Säuren fermentieren, einschließlich Milchsäure als überwiegend produzierter Säure, Essigsäure und Propionsäure. Die industriell nützlichsten Milchsäurebakterien werden unter Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pedoicoccus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. und Bifidobacterium spp. gefunden.
  • Wie vorstehend erwähnt wird, beschreibt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung eines Milchsäurebakterien-DNA-Fragments, das einen Promotor umfasst. Bei einem ersten Schritt dieses Verfahrens wird ein DNA-Molekül bereitgestellt, das in der Lage ist, in einem Milchsäurebakterium zu replizieren, wobei das besagte Molekül ein transposables Element umfasst, ein promotorloses Strukturgen als Promotorsondengen, ein nachweisbares selektives Markergen und einen Replikationsursprung, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist. Unter der Voraussetzung, dass ein solches Fragment in ein Milchsäurebakterium eingebracht werden kann und anschließend in das Replikon (einschließlich des Chromosoms und/oder der Plasmide, die in dem Wirt vorkommen) der Wirtszelle als Ergebnis von Transpositionsereignissen integriert wird, können durch den Nachweis der Expression des promotorlosen Strukturgens des integrierten DNA-Fragments in der Wirtszelle Wirtszellpromotoren nachgewiesen werden, da das Strukturgen, dem ein Promotorbereich fehlt, nicht exprimiert werden kann, außer die Inserierung des transposablen Elements erfolgt an einer Stelle eines Replikons, wo ein Promotorbereich, der auf dem gespaltenen Replikonmolekül anwesend ist, funktionell mit dem Gen verbunden wird.
  • In diesem Kontext wird der Ausdruck ”transposables Element” verwendet, um doppelsträngige DNA-Moleküle zu bezeichnen, die die Fähigkeit besitzen, sich selbst in andere DNA-Moleküle zu inserieren. Der Prozeß, mit dem sich ein transposables Element selbst inseriert, wird als ”Transposition” bezeichnet und dieser Prozeß braucht ein Protein, das als ”Transposase” (vgl. Referenz 3 für eine detaillierte Erklärung) bekannt ist. Der Transpositionsprozeß resultiert in der Inserierung des transposablen Elements in eine spezielle Stelle in einem zweiten DNA-Molekül. Diese Inserierung hat mehrere signifikante Konsequenzen. Erstens wird die ursprüngliche DNA-Sequenz des zweiten (empfangenden) DNA-Moleküls physikalisch und funktionell gespalten. Zweitens stellt sie die Mittel zur Einführung von homologer oder heterologer DNA in eine spezielle DNA-Sequenz bereit, da die Transposition im Einbau von neuer DNA in einem zweiten DNA-Molekül resultiert. Drittens ist es möglich, ein transposables Element so zu konstruieren, dass seine Inserierung in eine DNA-Sequenz Informationen bezüglich der Expression und Organisation der DNA-Sequenzen liefern kann, welche die Stelle der Inserierung flankieren. Zum Beispiel ist es möglich, ein Gen, das ein nicht exprimiertes oder ein nicht sezerniertes Genprodukt codiert, in der Nähe des Endes des transposablen Elements zu inserieren, und somit stellt ein solches transposables Element eine Sonde für Promotoren und ein Sezernierungs-Signalpeptid dar.
  • Transposable Elemente, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind bezüglich ihrer Größe und funktionellen Organisation verschieden. Dabei codieren einfache transposable Elemente, die als ”Inserierungssequenzen” bezeichnet werden, keine Funktionen, die nicht mit ihrer eigenen Bewegung in Verbindung stehen und sind im Allgemeinen kürzer als 2 kb. Wie alle transposablen Elemente besitzen die Inserierungssequenzen spezialisierte Termini, die komplementäre Sequenzen enthalten, die umgekehrte Wiederholungen voneinander sind. Die Anwesenheit von solchen umgekehrten Wiederholungssequenzen scheint für die Transposition essentiell zu sein. Man nimmt an, dass Transposaseenzyme die Transposition durch Bindung an DNA-Sequenzen an beiden Enden des transposablen Elements bewirken.
  • Nützliche transposable Elemente umfassen Transposons. Der Ausdruck ”Transposons” bezeichnet transposable Elemente, die größer als Inserierungssequenzen sind und die zusätzlich zum Transposasesystem mehrere Genprodukte codieren, wie Proteine, die zelluläre Resistenz gegen Antibiotika oder andere selektierbare Determinanten verleihen.
  • Obwohl die meisten Arbeiten bezüglich der Ausnutzung von transposablen Elementen als Werkzeuge der Gentechnik in gramnegativen Bakterienarten durchgeführt wurden, wurden mehrere Transposons, die in grampositiven Arten funktionell sind, isoliert und untersucht, hauptsächlich in Bacillus spp, Listeria spp und Corynebacterium spp, aber auch in geringerem Maß in Milchsäurebakterien. Beispiele für Transposons, die in Milchsäurebakterien verwendet werden können, umfassen Tn916, isoliert aus Streptococcus und funktionell in u. a. Listeria spp, Mycoplasma spp und Staphylococcus spp; Tn919, isoliert aus Streptococcus sanguis, von dem gezeigt wurde, dass er in die Milchsäurebakterienarten Lactobacillus plantarum, Leuconostoc cremoris und Lactococcus lactis transponiert; und Tn917, isoliert aus Streptococcus faecalis, von dem bekannt ist, dass er in Bacillus spp und Listeria spp transponiert.
  • Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein nützliches transposables Element eines, das die Operon-Fusion und die transkriptionelle Fusion veranlaßt. Dem entsprechend können solche, die Fusion erzeugende Derivate eines Transposons, das Milchsäurebakterien-DNA-Moleküle als sein Ziel hat, einschließlich Derivate der vorstehend erwähnten grampositiven Transposons, bei dem vorstehenden Verfahren verwendet werden. Als ein Beispiel können die Fusion erzeugende Derivate eines Transposons ein promotorloses Strukturgen umfassen, dessen Expression leicht nachzuweisen ist. Solch eine promotorloses Strukturgen kann von einem Gen ausgewählt werden, das für ein Genprodukt codiert, das Antibiotikaresistenz verleiht, einem Gen, das für ein Genprodukt codiert, das eine auxotrophe Defizienz ergänzt, oder einem Gen, das für ein Enzym codiert, das ein leicht nachweisbares Endprodukt hat, wie ein Produkt, das in einem geeigneten festen oder flüssigen Medium in einer Farbreaktion resultiert.
  • Zum Beispiel resultiert die Inserierung eines promotorlosen lacZ-Gens in ein Plasmid, das das Transposon in einer Orientierung umfasst, die zum Erreichen der durch die Transposition vermittelten Fusionen geeignet ist, in einem Plasmidvektor, der Bakterien, wenn sie ihn enthalten, als Ergebnis der Expression von β-Galactosidase blau werden läßt, wenn sie auf Platten gezüchtet werden, die 5-Brom-4-chlor-2-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) enthalten. Transpositionale Inserierungen in das Chromosom oder in ein Plasmid, die mit solchen Vektoren erzeugt werden, produzieren weiße Kolonien, außer die Inserierungen treten stromabwärts eines funktionellen Promotors und in der richtigen Orientierung auf, um die transkriptionelle Fusion zu bewirken. Auf diese Weise dient das promotorlose Gen als Promotor- und/oder Operonsondengen. Als anderes Beispiel kann ein geeignetes, die Fusion erzeugendes Derivat eines Transposons das promotorlose Gen cat-86-Gen umfassen, dessen Genprodukt Chloramphenicol-Resistenz verleiht.
  • In diesem Kontext ist ein essentielles Charakteristikum eines geeigneten transposablen Elements seine Fähigkeit mit einem hohen Maß an Zufall zu transponieren. Transposable Elemente variieren stark bei der Zielspezifität, und ihre Inserierungsstellen zeigen oft wenig oder keine Ähnlichkeit mit Elementsequenzen. Einige Elemente können in jedem Gen wenige bis Hunderte von Zielstellen haben, obwohl kein Element gefunden wurde, das vollkommen zufällig inseriert. Andere Elemente sind sehr stellenspezifisch und inserieren nur in eine einzige Stelle des Chromosoms. Noch andere Elemente scheinen in einigen Arten quasi-zufällig zu inserieren, bevorzugen aber entweder spezielle Bereiche von DNAs oder gewisse Bereiche von DNA-Molekülen. Zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein transposables Element bevorzugt, das zufällig oder quasi-zufällig integriert, wobei der Ausdruck ”quasi-zufällig” hier als das Maß an Integrationszufälligkeit hinsichtlich der Gesamtzahl an Inserierungsereignissen definiert wird, die bei einem Ziel-DNA-Fragment von bekannter Größe beobachtet wird, im Verhältnis zu den Anteilen an Inserierungen, die bei diesem DNA-Fragment zu erwarten sind, was höchstens 5 ist, vorzugsweise höchstens 4, mehr bevorzugt höchstens 3 und insbesondere höchstens 2,5. In nützlichen Ausführungsformen können transposable Elemente bevorzugt werden, die eine Präferenz für chromosomale DNA haben.
  • Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen kann für das vorliegende Verfahren ein DNA-Molekül ausgewählt werden, das in der Lage ist, in einem Milchsäurebakterium zu replizieren und ein Fusion erzeugendes Derivat des Tn917-Transposons umfasst. Solche Derivate umfassen Plasmide der pTV-Serie, welche pTV32, pLTV1, pLTV3, pTV51, pTV52 und pTV53 umfasst. Von denen können pTV32 und pLTV1 insbesondere von Nutzen sein.
  • Darüber hinaus umfasst das DNA-Molekül, wie es bei Schritt (i) des Verfahrens bereitgestellt wird, ein nachweisbares selektierbares Markergen, das die Selektion von Zellen erlaubt, in die das DNA-Fragment eingebracht wurde. In diesem Zusammenhang umfassen geeignete Markergene solche, die Genprodukte codieren, die Resistenz gegen Antibiotika vermitteln, z. B. Resistenz gegen Macrolid-Antibiotika wie Erythromycin und Lincomycin; Tetracyclin, β-Lactam-Antibiotika und Chloramphenicol. Als andere Beispiele kann das Markergen die Komplementierung einer Auxotrophie in der Wirtszelle codieren, in die das DNA-Fragment eingebracht wurde, oder es kann ein Gen sein, das ein Enzym codiert, das ein leicht nachweisbares Endprodukt erzeugt, so wie z. B. das vorstehend erwähnte lacZ-Gen.
  • In einem zweiten Schritt des Verfahrens wird das vorstehend definierte DNA-Molekül in eine Population von Zellen von Milchsäurebakterium eingebracht. Eine solche Einbringung kann gemäß bekannten Verfahren für die Einbringung von DNA in Wirtszellen durchgeführt werden, einschließlich der Transformation von Protoplastenzellen, der Transformation durch Elektroporation, oder, wenn das DNA-Fragment ein konjugatives Element ist, durch Konjugation. Das ausgewählte Verfahren sollte vorzugsweise in einer Frequenz der Einbringung von DNA resultieren, die mindestens 104 rekombinante Zellen pro μg DNA, so wie mindestens 5 × 104 pro μg DNA, z. B. mindestens 105 pro μg DNA.
  • Um eine hohe Wahrscheinlichkeit sicherzustellen, dass man eine Integration des transposablen Elements in die DNA der Wirtszellen erhält, ist es essentiell, dass das DNA-Molekül eines ist, das in der Lage ist, in der Wirtszelle zu replizieren. Dem entsprechend kann Schritt (ii) einen Unterschritt umfassen, der dem eingebrachten Replicon die Replikation erlaubt, gefolgt von einem Verfahren, um zu untersuchen, in welchem Ausmaß in der Transformante oder Exkonjuganten die Replikation eingetreten ist. In diesem Kontext wird ein geeignetes Ausmaß der Replikation als eine Kopienzahl angesehen, die im Bereich von 5 bis 20 pro Zelle liegt. Man nimmt an, dass eine Kopienzahl, die diesen Bereich substantiell übertrifft, das Heilen der Replicons, eine essentielle Voraussetzung zum Eintreten der anschließenden Transposition, schwerer erreichen läßt.
  • In einem weiteren Unterschritt umfasst Schritt (ii) das Unterwerfen der transformanten oder exkonjuganten Zellen unter Bedingungen, die zulassen, dass die Transposition eintritt. Die Transposition in nicht-Milchsäurebakterien kann durch eine oder mehrere Veränderungen bei den Umgebungsbedingungen der Zellen induziert werden. Als ein Beispiel dafür umfasst das Verfahren für die Tn917-Mutagenese auf pTV-Basis in B. subtilis einen Schritt, der eine Veränderung beim Antibiotikum kombiniert mit einem Heraufsetzen der Temperatur umfasst. Die Tn917-erm-Genexpression und die Transposition werden in B. subtilis durch Erythromycin induziert (Referenz 57). Bei B. subtilis ist die Replikationsaktivität von pE194Ts-rep durch Temperaturen über 37°C blockiert (Referenz 56). Folglich werden das Heilen der pTV-Plasmide, die Induktion von und die Selektion auf Transpositionen durch Züchten von B. subtilis bei Temperaturen oberhalb von 42°C in der Gegenwart von Erythromycin durchgeführt.
  • Während der Experimente, die zu der vorliegenden Erfindung führten, wurde jedoch gefunden, dass das vorstehende Verfahren, das in B. subtilis verwendet wurde, auf Milchsäurebakterien nicht anwendbar war, wie den beispielhaften Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 und MG1363. Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, dass weder pTV32 noch pLTV1 aus Lactococcus-Zellen extrahiert werden konnten, die mit diesen Plasmiden transformiert worden waren, wenn sie bei 30°C in der Gegenwart von Erythromycin gezüchtet wurden. Dies zeigte an, dass die Transposition (Integration) der Tn917-Derivate in das Chromosom mit einem einhergehenden Verlust des Plasmids unter diesen Bedingungen eingetreten war.
  • Dem entsprechend umfasst Schritt (ii) des Verfahrens einen Unterschritt, bei dem die Transposition von freie transposable Elemente enthaltenden DNA-Molekülen in transformierte Milchsäurebakterien mit einer einhergehenden Heilung solcher freier Moleküle durch Züchtung der Transformanten bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 35°C, wie 30°C, in der Gegenwart eines Antibiotikums, gegen das das transposable Element Resistenz verleiht, induziert wird.
  • Bei einem folgenden Schritt (iii) des Verfahrens werden integrante Zellen cloniert und einem Selektionsverfahren unterworfen, um integrante Zellen nachzuweisen, in denen das promotorlose Gen des transposablen Elements exprimierbar ist. Dieses Selektionsverfahren wird von der Art des promotorlosen Gens abhängen. Wenn z. B. ein promotorloses lacZ-Gen verwendet wird, kann die Selektion durch Ausplattieren der clonierten Integranten auf einem Medium durchgeführt werden, das eine Verbindung enthält, die von β-Galactosidase unter Entwicklung einer Farbe abgebaut wird, oder, wenn ein Antibiotika-Resistenzgen verwendet wird, können die Integranten auf einem Medium selektioniert werden, das mit dem entsprechenden Antibiotikum ergänzt ist.
  • Beim Schritt (iv) des Verfahrens wird ein selektierter Integrant, der das promotorlose Strukturgen exprimiert, cloniert und es wird ein milchsäurebakterieller Repliconbereich unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme aus den clonierten Zellen isoliert, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit dem ursprünglich promotorlosen Gen verknüpft ist und möglicherweise Sequenzen, die die Funktion des Promotors regulieren. Die resultierenden primären, einen Promotor enthaltenden DNA-Sequenzen können, in Abhängigkeit von der Lage der Restriktionsstellen für das ausgewählte Enzym/die ausgewählten Enzyme, verschiedene Größen haben.
  • Für die weitere Anwendung der isolierten, einen Promotor enthaltenden DNA-Sequenzen/Fragmente kann es von Vorteil sein, Subsequenzen dieser primären Sequenzen herzustelle, um kleinere Fragmente zu erhalten, die den isolierten Promotor umfassen und möglicherweise Sequenzen, die die Funktion des Promotors regulieren. Während ein primäres, einen Promotor enthaltendes Fragment z. B. eine Größe im Bereich von 40 bis 600 kb haben kann, wird versucht, dass eine Subsequenz, die den Promotor und möglicherweise andere Sequenzen enthält, die für seine Regulierung erforderlich sind, in geeigneterer Weise eine Größe haben können, die im Bereich von 50 bis 10.000 Basenpaaren liegt.
  • Gemäß dem vorliegenden Patent wird die Population der Zellen eines Milchsäurebakteriums, in die das DNA-Fragment, das das transposable Element umfasst, im vorstehend definierten Schritt (ii) eingebracht wird, vorzugsweise ausgewählt aus Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. und Bifidobacterium spp. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Milchsäurebakterium ausgewählt aus Lactococcus lactis Subspezies lactis, wie die Lactococcus lactis ssp. lactis-Stämme MG1614 und MG1363. Bei der industriellen Nutzung von genetisch verbesserten Milchsäurebakterien, wie sie hier definiert werden, bei der Lebensmittelherstellung kann es von Vorteil sein, dass die Funktion der Bakterien regulierbar ist, so dass spezifische phänotypische Eigenschaften der Milchsäurebakterienstarterkulturen an- oder abgestellt werden können oder dass die Expressionrate der Eigenschaften während spezifischer Perioden des Herstellungsverfahrens einschließlich eines Reifungsvorgangs erhöht oder reduziert werden kann. Als ein Beispiel kann es bei der Käseherstellung wünschenswert sein, Kulturen zu verwenden, die proteolytisch oder lipolytisch während des Gerinnungsvorgangs nicht in hohem Maße aktiv sind, dies aber während der Reifung des Käses sind.
  • Dem entsprechend kann das Verfahren ein Verfahren sein, bei dem der Promotor, der in dem DNA-Fragment enthalten ist, das isoliert und selektiert wird, ein regulierbarer Promotor ist. Ein solches Verfahren umfasst Schritte, wobei die isolierten, einen Promotor enthaltenden Sequenzen, die möglicherweise regulatorische Sequenzen enthalten, auf ihre Art der Regulierung durchmustert werden. Im diesem Kontext kann ein regulierbarer Promotor durch einen Faktor regulierbar sein, der ausgewählt ist aus dem pH-Wert und/oder dem Gehalt von Arginin in der Umgebung, der Wachstumstemperatur, einer Temperaturänderung, die die Expression von Hitzeschockgenen anregt, der Zusammensetzung des Wachstumsmediums einschließlich der Ionenstärke/des NaCl-Gehalts, und der Wachstumsphase/der Wachstumsrate des Milchsäurebakteriums, in das das einen Promotor enthaltende DNA-Molekül eingebracht wird. Ein Beispiel einer Art der Regulierung des Promotors ist das Phänomen der stringenten Kontrolle, unter der verstanden wird, dass die RNA-Synthese einer Zelle in dem Fall suspendiert ist, wo die Zelle für einen essentiellen Nährstoff ausgehungert wird, wie eine Aminosäure. Dem entsprechend kann ein geeigneter regulierbarer Promotor gemäß der vorliegenden Erfindung einer sein, der unter stringenter Kontrolle ist.
  • Ein anderes Beispiel einer nützlichen Art der Regulierung eines Promotors ist die Auswahl eines Promotors, der ein Gen reguliert, das ein Enzym codiert, das in die de novo-Synthese von Purinnucleotiden aus ihren Vorläufern involviert ist. Durch die Inserierung eines solchen Promotors, der dadurch reguliert ist, dass er in der Anwesenheit von Purinverbindungen herabgeregelt wird, in ein Milchsäurebakterium vor einem Gen, dessen Expression reguliert werden soll, wird dieses Gen nur dann exprimiert, wenn das Bakterium in einem Medium gezüchtet wird, das keine Vorläufer von Purinverbindungen enthält. Ein Beispiel eines so regulierten Promotors ist der Lactococcus-purD-Promotor, wie hier nachstehend beschrieben.
  • Als ein Beispiel der Durchmusterung auf die Art der Regulierung eines Promotors kann der isolierte Promotor auf die Regulierung durch die Temperatur/Wachstumsphase durchmustert werden, indem man Zellen, in die der Promotor, funktionell verknüpft mit einem Gen, das ein Genprodukt codiert, dessen Expression leicht nachweisbar ist, durch Transposition eingebracht wurde, auf einem geeigneten Medium ausplattiert und die Platten bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, wie verschiedenen Temperaturen im Bereich von 10 bis 30°C, und die temperaturabhängige Expression beobachtet. Da jedoch die Wachstumsrate der integranten Zellen von der Wachstumstemperatur abhängig sein wird, kann nicht bestimmt werden, ob ein beobachtete, offensichtlich temperaturabhängige Expression ein Resultat einer direkten Temperaturregulierung ist oder ob die Abhängigkeit wegen der Wachstumsregulierung ist.
  • In ähnlicher Weise kann auf eine mögliche vom pH-Wert und/oder von Arginin abhängige Regulierung der Genexpression durch Ausplattieren der vorstehenden integranten Zellen auf Medien durchmustert werden, die verschiedenen Zusammensetzungen haben, die nach der Züchtung der integranten Zellkulturen in verschiedenen pH-Werten resultieren. Als ein Beispiel können die Zellen auf GM17-Medium gezüchtet werden, wo der End-pH-Wert etwa 5 sein wird, und auf modifiziertem GM17-Medium, das 1/5 des normalen Glucosegehalts hat und mit 0,5% Arginin ergänzt ist. Der pH-Wert in einem solchen Medium nach der Züchtung einer Kultur von integranten Lactococcus lactis-Zellen, wie sie vorstehend definiert sind, wird etwa 9 sein. Wenn die Expression des Gens unter der Kontrolle des isolierten Gens nur bei einem der beiden pH-Werte beobachtet wird, wird eine vom pH-Wert und/oder von Arginin abhängige Regulierung gezeigt.
  • Da ein Ziel der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Mitteln zur Konstruktion von verbesserten rekombinanten Milchsäurebakterien durch Inserierung von einen Promotor enthaltenden Sequenzen ist, was in einer erhöhten Expression des Milchsäurebakteriengens/der Milchsäurebakteriengene resultiert, das/die für gewünschte Genprodukte codiert/codieren, ist es ein Teil der Erfindung, Promotorsequenzen auf ihre Stärke zu durchmustern. Diese Durchmusterung wird gemäß Verfahren durchgeführt, die per se bekannt sind.
  • Das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein homologes Gen sein oder es kann ein inseriertes heterologes Gen sein, das ein Gen einschließt, das von einem Milchsäurebakterium abgeleitet ist. Wenn das Gen ein inseriertes Gen ist, kann es bei derselben DNA-Sequenz inseriert sein wie diejenige, welche die Promotorsequenz umfasst, oder es kann bei einer separaten DNA-Sequenz inseriert sein.
  • Bei einer nützliche Ausführungsform kann die Inserierung der vorstehend isolierten, einen Promotor enthaltenden Sequenz im Chromosom des Milchsäurebakteriums sein und in einer anderen nützliche Ausführungsform kann die Sequenz extrachromosomal inseriert sein, z. B. auf einem Plamid, das das Bakterium beherbergt. Wie vorstehend erwähnt wurde, kann es von Vorteil sein, wenn man die einen Promotor enthaltende Sequenz in das Chromosom integriert hat, da die Sequenz und das Gen, an das sie funktionell gebunden ist, dadurch stabiler enthalten ist im Vergleich mit einer Lage auf einem extrachromosomalen Element. Die Inserierung der einen Promotor enthaltenden Sequenz wird gemäß gentechnischer Verfahren durchgeführt, die per se bekannt sind, wie mittels Inserierung in ein Plasmid mit herkömmlichen Verfahren der Restriktion und Ligierung oder durch Integration in das Chromosom unter Verwendung von Transposons oder Bakteriophagen oder mittels herkömmlicher rekombinatorischer Verfahren. Bei einer interessanten Ausführungsform umfasst die isolierte, einen Promotor enthaltende Sequenz eine weitere Sequenz, wodurch der isolierte Promotor durch ein stochastisches Ereignis reguliert wird. Eine solche Regulierung kann z. B. bei Milchsäurekulturen von Nutzen sein, bei denen es von Vorteil ist, dass sie eine graduell abnehmende Aktivität des Gens unter der Kontrolle der inserierten, einen Promotor enthaltenden Sequenz haben. Solche weiteren Sequenzen können z. B. Sequenzen sein, die in einem rekombinatorischen Ausschneiden des Promotors resultieren oder von Genen, die Substanzen codieren, die positiv für die Promotorfunktion benötigt werden.
  • Eine stochastische Regulierung der Promotorfunktion kann auch in der Form des rekombinatorischen Ausschneidens einer regulatorischen Sequenz sein, die die Funktion des Promotors inhibiert, wodurch ein graduelles Anwachsen der Promotoraktivität im Niveau der rekombinanten Zellpopulationen erhalten wird.
  • Wie vorstehend erwähnt wird, beschreibt das vorliegende Patent ein weiteres Verfahren für die Konstruktion eines rekombinanten Milchsäurebakteriums, wobei das Bakterium ein Gen umfasst, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, dessen Expression verändert ist im Vergleich mit der Expression des Gens, das funktionell mit seinem nativen Promotor verbunden ist. Bei diesem Verfahren wird ein vorstehend definiertes DNA-Molekül, das ein transposables Element mit einem Promotorsondengen enthält, verwendet, um eine Stelle/Stellen im Replicon eines Milchsäurebakteriums (Chromosom oder Plasmid) zu identifizieren, in die das transposable Element integrierbar ist und wo das promotorlose Sondengen funktionell verbunden wird mit einer Promotorsequenz in dem Replicon, und anschließender Inserierung eines Gens, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, in eine nicht integrante Milchsäurebakterienzelle an dieser oder diesen Stellen oder an einer Stelle/an Stellen, die damit funktionell äquivalent sind, wobei diese Gen funktionell mit der identifizierten Promotorsequenz verbunden wird.
  • Während das transposable Element zwischen diesen beiden Paaren inseriert werden wird, wird man verstehen, dass ein Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, neben der Inserierung zwischen diesen beiden Paaren, auch an einer benachbarten Stelle inseriert werden kann, die in einer Entfernung von der spezifischen Insertions-(Integrations-)Stelle liegt, die es noch zulässt, dass die identifizierte Promotorsequenz die Transkription des inserierten Gens kontrolliert. In diesem Kontext bezeichnet man solche benachbarten Stellen als funktionell äquivalente Stellen. Man nimmt an, dass die Entfernung von der spezifischen Transposon-Integrationsstelle, wo solche funktionell äquivalenten Stellen gefunden werden können, in einem Bereich von 1 bis 2000 Basenpaaren ist.
  • Gemäß der Erfindung kann das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert und das in die vorstehend definierte Stelle inseriert ist, ein homologes oder ein heterologes Gen sein, einschließlich eines Gens, das von einem Milchsäurebakterium abgeleitet ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes Milchsäurebakterium bereit, das ein Gen umfasst, das ein gewünschtes Genprodukt codiert und damit funktionell verbunden einen Milchsäurebakterienpromotor, der nativ nicht mit dem Gen assoziiert ist, wobei die Anwesenheit des besagten Promotors in einer Expression des Gens resultiert, die im Vergleich mit der Expression des Gens verändert ist, wenn es funktionell mit seinem nativen Promotor verbunden ist.
  • Wie hier verwendet wird der Ausdruck ”veränderte Expression” verwendet, um anzudeuten, dass die Regulierung der Expression des Gens quantitativ oder qualitativ unterschiedlich ist von der Regulierung des Gens, wenn es funktionell mit seinem nativen Promotor verbunden ist. Eine quantitativ unterschiedliche Expression kann als ein erhöhtes Niveau der Expression der Genprodukte erkennbar sein, wie eine um mindestens 10% erhöhte Expression. Es kann z. B. von Vorteil sein, dass die Expression um mindestens 25% erhöht ist, so wie mindestens um 50%. Bei gewissen Ausführungsformen kann es von Vorteil sein, rekombinante Milchsäurebakterien bereitzustellen, bei denen die Expression des Gens, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, niedriger ist als diejenige des Gens, wenn es unter der Kontrolle seines nativen Promotors ist. Dem entsprechend kann ein nützliches rekombinantes Bakterium ein Expression haben, deren Niveau um mindestens 10% reduziert ist, vorzugsweise um mindestens 25% und mehr bevorzugt um mindestens 50% reduziert ist.
  • Qualitativ kann die Expression eines Gens, das ein gewünschtes Genprodukt codiert und dessen nativer Promotor ein konstitutiver Promotor ist, durch funktionelle Verbindung mit einem regulierbaren Promotor verändert werden, oder die Expression eines Gens, das einen nativen regulierbaren Promotor hat, kann durch Verbindung mit einem konstitutiven Promotor verändert werden. In weiteren Ausführungsformen kann die Expression eines Gens, das einen regulierbaren Promotor hat, durch Verbindung mit einem regulierbaren Promotor, der eine andere Art der Regulierung hat, qualitativ verändert werden.
  • In einer nützlichen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung das rekombinante Milchsäurebakterium als eines bereit, das eine inserierte, einen Milchsäurebakterienpromotor umfassende DNA-Sequenz, wie vorstehend definiert, enthält, wobei der Milchsäurebakterienpromotor funktionell mit einem Gen verknüpft ist, das ein gewünschtes Genprodukt codiert. Das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, kann gemäß der Erfindung ein chromosomales Gen sein oder ein extrachromosomal gelegenes Gen.
  • In gewissen bevorzugten Ausführungsformen kann das vorstehende Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein natives Gen sein, das in diesem Kontext als ein homologes Gen definiert ist, das in seiner natürlichen Position auf einem Chromosom oder auf einem Plasmid ist, das natürlicherweise in einem speziellen Milchsäurebakterium vorkommt, oder es kann ein homologes Gen sein, das aus seiner natürlichen Position isoliert wurde und in den gleichen Milchsäurebakterienstamm reinseriert wurde, aber an einer anderen Position. In noch anderen nützlichen Ausführungsformen ist das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein heterologes Gen, das aus einer nicht-Milchsäurebakterienart oder von einer anderen Milchsäurebakterienart isoliert wurde.
  • Obwohl es in gewissen Ausführungsformen bevorzugt sein kann, dass der inserierte Promotor ein regulierbarer Promotor ist, kann es auch in anderen nützlichen Ausführungsformen von Vorteil sein, ein rekombinantes Milchsäurebakterium bereitzustellen, in dem der inserierte Promotor ein konstitutiver Promotor ist. Wenn der ausgewählte Promotor, der inseriert werden soll, ein regulierbarer Promotor ist, kann die Art der Regulierung aus den Faktoren ausgewählt werden, die hier vorstehend definiert wurden, einschließlich der Regulierung durch ein stochastisches Ereignis.
  • Es kann von Vorteil sein, das Milchsäurebakterium gemäß der vorliegenden Erfindung als eines bereitzustellen, bei dem eine inserierte DNA-Sequenz, die einen milchsäurebakteriellen Promotor umfasst, in ein Plasmid inseriert ist. Bei gewissen bevorzugten Ausführungsformen ist ein solches Plasmid eines, das weiterhin ein Gen umfasst, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, wie hier definiert, ein Milchsäurebakterienreplicon, das in Milchsäurebakterien funktionell ist, eine Inserierungsstelle, die erlaubt, dass die DNA-Sequenz inseriert wird, so dass das Gen, das das gewünschtes Genprodukt codiert, funktionell mit dem Promotor verknüpft ist, wobei das Gen transkribiert werden kann, wenn das Plasmid in einem Milchsäurebakterium vorhanden ist.
  • Der Promotor, der in das Plamid inseriert ist, kann vorzugsweise ein Promotor sein, der so wie hier beschrieben regulierbar ist.
  • In diesem Kontext ist ein geeignetes Milchsäurebakterium eines, das das Plasmid pAK80 enthält, das im Folgenden beschrieben wird, oder ein Derivat davon, einschließlich pAK80:SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:163, pAK80:170, pAK80:224 und pAK80:242.
  • Bei einer interessanten Ausführungsform kann das Milchsäurebakterium, das gemäß der vorliegenden Erfindung rekombiniert werden soll, das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, auf einem Plasmid tragen, das ein konditionales Replikationsverhalten hat, so dass die Kopienzahl des Plasmids unter gewissen Bedingungen substantiell erhöht ist, z. B. auf mehrere Hunderte oder Tausende. Plasmide, die ein solches Replikationsverhalten haben, werden auch als „run-away”-Plasmide bezeichnet.
  • Ein rekombinantes Milchsäurebakterium, wie hier definiert, kann eines sein, das aus Lactococcus ssp. ausgewählt ist, einschließlich Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. diacetylactis und Lactococcus lactis ssp. cremoris.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das rekombinante Milchsäurebakterium eines, bei dem die inserierte, einen Promotor enthaltende Sequenz, wie hier definiert, abgeleitet ist von Lactococcus ssp., wie Lactococcus lactis Unterart lactis. Bei gewissen spezifischen Ausführungsformen kann der inserierte Promotor aus Lactococcus lactis Unterart lactis Stämme MG1614, MG1363 oder CHCC285 (Chr. Hansens Laboratorium A/S) isoliert sein. Interessante Promotoren sind tRNA- und rRNA-Promotoren, einschließlich der PI- und PII-Promotoren und des purD-Promotors von Lactococcus lactis Unterart lactis, wie im Folgenden beschrieben. Insbesondere interessante Promotoren sind starke Promotoren wie die tRNA- und rRNA-Promotoren, die die konservierte Sequenz (Motiv) AGTT umfassen.
  • Das vorliegende rekombinante Milchsäurebakterium ist vorzugsweise eines, bei dem das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ausgewählt ist aus einem Gen, das eine Lipase codiert, einem Gen, das eine Nuclease codiert, einem Gen, das eine Peptidase codiert, wie eine Aminopeptidase, einem Gen, das eine Protease codiert, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in den Kohlenhydratstoffwechsel involviert ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in den Citratstoffwechsel involviert ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in die Resistenz gegen Bakteriophagen involviert ist, einem Gen, das ein lytisches Enzym codiert, wie ein Lysozym, oder ein lytisches Enzym für einen Phagen, und einem Gen, das ein Bakteriocin codiert, einschließlich Nisin. In einem interessanten Aspekt kann das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, eines sein, dessen Genprodukt Resistenz gegen ein Bakteriocin wie Nisin oder Pediocin verleiht.
  • Die vorstehenden Gene, die ein gewünschtes Genprodukt codieren, können Gene sein, die von einem Milchsäurebakterium abgeleitet sind, oder sie können in geeigneter Weise Gene sein, die von einer nicht-milchsäurebakteriellen mikrobiellen Art oder von eukaryontischen Zellen einschließlich Pflanzenzellen und menschlichen und tierischen Zellen abgeleitet sein. Als ein Beispiel eines nützlichen Gens, das von einer eukaryontischen Zelle abgeleitet ist, kann man Plasminogen erwähnen.
  • Bei einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Gen ausgewählt von dem lacL-Gen von Leuconostoc spp., dem lacM-Gen von Leuconostoc spp. und einem Lactococcus lactis ssp. lactis-Gen, das für eine Peptidase wie eine Lysin-Aminopeptidase codiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das rekombinante Milchsäurebakterium, wie es hier definiert ist, in geeigneter Weise eines sein, bei dem das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, an einer Stelle in einem Replicon inseriert ist, wo es unter der Kontrolle eines Promotors ist, der in dem Replicon vorhanden ist, wobei die Stelle durch Inserierung eines promotorlosen Strukturgens mittels eines transposablen Elements, das das promotorlose Strukturgen umfasst, identifiziert werden kann, wodurch das ursprünglich promotorlose Gen dadurch exprimierbar wird, dass es funktionell mit dem Promotor verbunden wird, der in dem besagten Replicon vorhanden ist, wobei die Inserierung des Gens an der besagten Stelle darin resultierte, dass das besagte Gen funktionell mit dem Promotor verbunden wird, der in dem Replicon vorhanden ist.
  • Man wird verstehen, dass die Stelle, an der das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, inseriert werden kann, nicht beschränkt ist auf die spezifische Stelle zwischen zwei Basenpaaren, wie sie durch die Inserierung des transposablen Elements identifiziert wird, sondern jede Stelle innerhalb einer Entfernung von dieser spezifischen Stelle sein kann, die dem Milchsäurebakterienpromotor, an den das promotorlose Gen des transposablen Elements funktionell gebunden werden kann, noch die Kontrolle der Expression des inserierten Gens erlaubt. Inserierungsstellen, die in einer solchen Entfernung von der spezifisch identifizierten Stelle liegen, können im vorliegenden Kontext als funktionell äquivalente Inserierungsstellen bezeichnet werden.
  • Es kann auch gemäß der vorliegenden Erfindung ein rekombinantes Lactococcus bereitgestellt werden, in das eine einen Promotor umfassende Sequenz, wie vorstehend definiert, inseriert wurde, sowie ein Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ebenso wie vorstehend definiert.
  • Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung in noch einem weiteren Aspekt ein isoliertes DNA-Fragment gemäß den Ansprüchen bereit.
  • Ein solches DNA-Fragment wird gemäß dem hier beschriebenen Verfahren isoliert. Bei einer nützlichen Ausführungsform ist das DNA-Fragment eines, das weiterhin mindestens einen Transkriptionsterminator umfasst. Das vorliegende DNA-Fragment ist vorzugsweise ein Fragment, das eine Größe im Bereich von 100 bis 10000 Basenpaaren hat, wie eine Größe im Bereich von 200 bis 5000 Basenpaaren. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das DNA-Fragment auch eines sein, das weiterhin Sequenzen umfasst, die Genprodukte codieren, die in die Regulierung des Promotors involviert sind.
  • In nützlichen Ausführungsformen ist das DNA-Fragment eines, bei dem das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ausgewählt ist aus einem Gen, das eine Lipase codiert, einem Gen, das eine Peptidase codiert, einem Gen, das eine Protease codiert, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in den Kohlenhydratstoffwechsel involviert ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in den Citratstoffwechsel involviert ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, das in die Resistenz gegen Bakteriophagen involviert ist, einem Gen, das ein lytisches Enzym codiert, und einem Gen, das ein Bakteriocin codiert. Das Gen kann auch eines sein, das ein Genprodukt codiert, das Resistenz gegen ein Antibiotikum oder ein Bakteriocin wie z. B. Nisin oder Pediocin verleiht.
  • Das vorstehend definierte DNA-Fragment kann auch ein Gen umfassen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, welches ein homologes oder ein heterologes Gen ist, einschließlich eines Gens, das von einem Milchsäurebakterium abgeleitet ist. Dem entsprechend kann das Gen in gewissen bevorzugten Ausführungsformen eines sein, das ausgewählt ist aus dem lacL-Gen von Leuconostoc spp., dem lacM-Gen von Leuconostoc spp. und einem Lactococcus lactis ssp. lactis-Gen, das für eine Lysin-Aminopeptidase codiert.
  • Der Milchsäurebakterienpromotor, der in dem DNA-Fragment enthalten ist, kann von einem Lactococcus lactis isoliert werden. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist der Promotor der regulierbare Promotor, der in dem integranten Clon P139-170 von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 enthalten ist, der unter der Zugangsnummer DSM 7360 hinterlegt wurde.
  • Das rekombinante Bakterium kann gemäß der Erfindung eines sein, bei dem die inserierte DNA-Sequenz, die einen regulierbaren milchsäurebakteriellen Promotor umfasst, in einen Vektor inseriert ist, der ein promotorloses Gen enthält, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein Theta-replizierendes Milchsäurebakterienreplicon, das in dem Bakterium funktionell ist, eine Inserierungsstelle, die zulässt, dass die DNA-Sequenz inseriert wird, so dass das Gen, das das gewünschtes Genprodukt codiert, funktionell mit dem Promotor verbunden ist, wodurch das Gen transkribiert wird. Bei einer Ausführungsform kann ein solches Bakterium als den Vektor, in den die inserierte DNA-Sequenz inseriert ist, das Plasmid pAK80 umfassen. Das hier bereitgestellte rekombinante Milchsäurebakterium kann bei Starterkulturen für die Herstellung von Lebensmittelprodukten, einschließlich Milchprodukten, Fleischprodukten und Gemüseprodukten von Nutzen sein und bei der Konservierung von Tierfutter. In dem letzteren Kontext sind die vorliegenden rekombinanten Bakterien insbesondere interessant als Inokulat bei Feldfrüchten für die Silage. Wenn die Bakterien für diese Zwecke verwendet werden sollen, können sie in geeigneter Weise in der Form von getrockneten oder gefrorenen Bakterienkonzentraten, bereitgestellt werden, die z. B. 1010 bis 1012 koloniebildende Einheiten (CFUs) pro g Konzentrat enthalten.
  • Eine interessante Verwendung eines Milchsäurebakteriums, wie es hier definiert ist, ist bei der Herstellung von probiotisch aktiven Zusammensetzungen, Der Ausdruck ”probiotisch aktiv” bedeutet, dass die Bakterien, die für diesen Zweck ausgewählt wurden, Charakteristika haben, die sie befähigen, den Verdauungstrakt zu besiedeln und dabei eine positive regulatorische Wirkung auf die mikrobielle Flora in diesem Lebensraum auszuüben. Eine solche Wirkung kann als eine verbesserte Lebensmittel- oder Futterumwandlung im Menschen oder im Tier, dem die Bakterien verabreicht werden, erkennbar sein, oder als eine erhöhte Resistenz gegen eindringende pathogene Mikroorganismen.
  • Weiterhin nimmt man an, dass die vorliegenden rekombinanten Milchsäurebakterien bei der Herstellung von rekombinanten Impfstoffstämmen von Nutzen sein können, in die eines oder mehrere Gene, die antigene Determinanten codieren, inseriert werden.
  • Das rekombinante Plasmid gemäß der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eines, bei dem der Milchsäurebakterienpromotor ein Promotor ist, der auf eine Weise regulierbar ist, wie sie hier vorstehend definiert wurde. In diesem Kontext können nützliche Plasmide ausgewählt werden aus dem Plasmid pAK80 oder Derivaten davon, einschließlich pAK80:SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:163, pAK80:170, pAK80:224 und pAK80:242.
  • Die Erfindung wird des Weiteren in den folgenden Beispielen und Figuren illustriert, wo:
  • 1 eine Karte von pTV32 ist, bei der die folgenden Abkürzungen Restriktionsenzymstellen anzeigen: SalI, EcoRI, PstI, XbaI, KnpI und SmaI, Tn917 steht für den Transposon-Teil, erm steht für das Gen, das Erythromycin-Resistenz codiert, bla für das Gen, das β-Lactamase codiert, ColEI rep für den Replikationsursprung des ColEI-Plamids, cat für das Gen, das Chloramphenicol-Acetyltransferase codiert, die Resistenz gegen Chloramphenicol verleiht, lacZ das promotorlose β-Galactosidasegen oder E. coli, tet für das Gen, das Resistenz gegen Tetracyclin codiert und pE194 steht für den temperaturempfindlichen Replikationsursprung, der von dem Plasmid pE194 abgeleitet ist,
  • 2 eine Karte von pLTV1 ist (Abkürzungen vgl. Legende zu 1),
  • 3 die Analyse mit Southern-Hybridisierung von 12 unabhängigen TV32-Integranten von L. lactis ssp. lactis zeigt. Die DNA von den Integranten, oben an jeder Spur angegeben, wurde mit EcoRI verdaut, einer Elektrophorese durch ein Agarosegel unterzogen, auf eine Nylon-Membran übertragen und hybridisiert mit A: 32P markiertem pLTV1; B: einer mit 32P markierten, für das pE194 Replicon spezifischen Sonde. Die Größenmarker sind in Kilobasenpaaren angegeben;
  • 4 die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) von mit SmaI verdauter DNA von TV32-Integranten von L. lactis ssp. lactis zeigt. Die Nummern der Integranten sind oben an den Spuren angegeben. A: Lambda-Leiter (Promega, Madison, USA), beginnend von unten mit 48,5 kb, 97,0 kb, 145,5 kb usw. B: Delta 39-Lambda-Leiter (Promega), beginnend von unten mit 39,0 kb, 78,0 kb, 117 kb usw. M ist mit SmaI verdaute DNA von L. lactis ssp. lactis MG1614;
  • 5 die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) von 19 Clonen (E1–E19) zeigt, die von einer Kultur von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 entnommen wurden, der eine dominante TV32-Integrante enthielt. Die Spuren A, B und M sind wie vorstehend für 5 angegeben. Der Verdau von Clon E5 resultierte in Fragmenten, die nicht als einzelne Banden sichtbar gemacht werden konnten;
  • 6 die Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) von 18 Clonen (K1–K2, K4–K14, K16–K20) zeigt, die zufällig von einer vereinten Kultur von TV32-Integranten von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 entnommen wurden. Die mit A, B und M bezeichneten Spuren sind wie vorstehend für 5 angegeben.
  • 7 das Ausstreichmuster zur Untersuchung der regulierten Expression von lacZ in der Sammlung Nr. 1 von Promotorfusionclonen zeigt. Jeder Clon wurde auf einer Platte ausgestrichen, die 1 μg/ml Erythromycin und 320 μg/ml X-Gal in einer geraden Linie von etwa 0,5 cm enthielt;
  • 8 die Konstruktion von pAK67,7 zeigt, wie in Beispiel 6 beschrieben. P steht für den β-Galactosidasepromotor von Leuconostoc mesenteroides Subsp. cremoris, und rbs für die Ribosomenbindungsstelle. Die Homologiestellen mit den Primern lac-1 und lac-2 sind mit kleinen Pfeilen angegeben. Die Ribosomenbindungsstelle ist auch in pAK67,7 vorhanden;
  • 9 das Wachstum und die β-Galactosidaseaktivität des LTV1-Integranten 170 zeigt, der bei einem pH-Wert von 5,5 und 7,0 gezüchtet wurde;
  • 10 das Wachstum und die β-Galactosidaseaktivität des LTV1-Integranten SB zeigt, der bei einem pH-Wert von 5,5 und 7,0 gezüchtet wurde;
  • 11 ein DNA-Fragment vom Stamm CHCC285 von Lactococcus lactis Subsp. lactis zeigt, das sieben tRNA-Gene enthielt und ein 5S rRNA-Gen, die in einem einzigen Operon arrangiert waren, einschließlich zweier Promotoren und zweier mutmaßlicher Transkriptionsterminatoren;
  • 12 die Genorganisation und die Nucleotidsequenz von trnA zeigt. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von 'tma ist unten im Ein-Buchstaben-Code gezeigt, das Stop-Codon mit einem Stern markiert. Mutmaßliche -35- und -10-Promotorsequenzen (PI, PII), ein konserviertes Motiv im -44-Bereich und eine konservierte Sequenz, die in die stringente Kontrolle (Chiaruttini & Milet, 1993; Ogasawara et al., 1983) involviert sein könnte, sind doppelt unterstrichen. Die codierenden Bereiche der tRNA-Gene und rrfU sind unterstrichen. Vermutliche Transkriptionsterminatoren sind durch Pfeile oberhalb der Sequenz angezeigt. Die Lage der Restriktionsenzymstellen für ScaI und SpeI, die für die Clonierung und die Promotorclonierung verwendet werden, ist oberhalb der Sequenz angezeigt;
  • 13 einen Vergleich der tRNA- und rRNA-Promotorsequenzen von Lactococcus lactis und Lactococcus cremoris zeigt. Der konservierte -44-Bereich, -35-Bereich, ein doppeltes TG (vgl. Referenz 19), -10 und eine konservierte Sequenz, von der vorgeschlagen wird, dass sie während der stringenten Antwort auf Bacillus subtilis (Ogasawara et al., 1983) in die Kontrolle der Expression involviert ist, sind unterstrichen. A: PI von trnA; B: PII von trnA; C: P21 vom Lactococcus cremoris-tRNAleu-Gen (van der Vossen et al., 1987; diese Untersuchung); D: P2 von Lactococcus lactis (Koivula et al., 1991); E: Promotorbereich vor dem Lactococcus lactis-ochre-Suppressorgen (F. Dickely & E. Bech Hansen, persönliche Mitteilung); F: P10 vom Lactococcus lactis-tRNAarg-Gen (Koivula et al., 1991; diese Untersuchung) G: Promotor eines Lactococcus lactis-rRNA-Operons (Chiaruttini & Milet, 1883) H: P2 von einem Lactococcus lactis-rRNA-Operon (Beresford & Condon, 1993); I: mutmaßlicher Promotor vor dem Lactococcus lactis-amber-Suppressorgen (E. Johansen, unveröffentlichte Ergebnisse); J: P21 von Lactococcus lactis (Koivula et al., 1991). Con., zeigt identische Nucleotide in den angeordneten Sequenzen A bis H;
  • 14 ein DNA-Fragment von Lactococcus lactis von 846 bp ist, das den gesamten purD-Promotorbereich enthält ebenso wie einen benachbarten Promotor, der die Transkription in die entgegengesetzte Richtung initiiert;
  • 15 die OD600 und die β-Galactosidaseaktivität gegen die Zeit während des Wachstums von pSMA344/MG-1363 in flüssigem Medium unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter darstellt;
  • 16 eine Restriktionskarte eines Lactococcus-EcoRI-ClaI-Fragments von 9,7 kb von p170 und Deletionderivaten davon ist;
  • 17 eine Restriktionskarte eines Lactococcus-NdeI-ClaI-Fragments von 4,0 kb von p170 und Deletionderivaten davon ist; und
  • 18 die Campbell-ähnliche Integration eines nicht replizierenden Plasmids in das Milchsäurebakterienchromosom zeigt, wobei P für einen Promotor steht, Erm für ein Erythromycin-Restriktionsgen steht, das Reportergen ist das β-Galactosidasegen von Leuconostoc mesenteroides und das E. coli-Replicon ist das pACYC-Replicon von pVA891 und wo die schwarzen Flächen den Bereich der DNA-Homologie zwischen dem Plasmid und dem Chromosom darstellen und die Pfeile die Richtung der Transkription von dem Promotor P anzeigen.
  • BEISPIEL 1
  • Transformation von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 mit pTV32 und pLTV1 und der Beweis der Replikation dieser Plasmide.
  • Mehrere Vektoren (pTV-Plasmide), die Derivate des Transposons Tn917 von der Milchsäurebakterienart Streptococcus faecalis enthalten, wurden für die Anwendung in Bacillus subtilis und anderen grampositiven Bakterien (Referenzen 10, 55 und 57) konstruiert. Zwei Derivate der Serie von pTV-Plasmiden pTV32 (Referenz 57) und pLTV1 (Referenz 55) wurden für dieses und die folgenden Experimente ausgewählt.
  • pTV32 (15,6 kb) und pLTV1 (20,6 kb) enthalten (i) ein temperaturempfindliches Replicon (pE194Ts-rep) von dem Plasmid E194, (ii) auf dem Repliconteil des Plasmids ein cat-Gen (pTV32), das Chloramphenicolresistenz verleiht (Cmr) oder ein Tetracyclinresistenz (Tcr)-Gen (pLTV1), (iii) Tn917, das ein erm-Gen enthält, das Erythromycinresistenz (Emr) verleiht, und (iv) ein promotorloses lacZ-Gen von E. coli mit einer ribosomalen Bindungsstelle von Bacillus subtilis, inseriert in nicht essentielle Tn917-DNA an dem erm benachbarten Ende (1 und 2). pTV32 und pLTV1 wurden aus E. coli PY1173 und Bacillus subtilis PY258 isoliert, Diese Stämme wurden von P. Youngman, University of Pennsylvania, erhalten.
  • Lactococcus lactis Subsp. lactis MG1614, der ein Prophagen-freies, Plasmid-freies und Streptomycin- und Rifampicin-resistentes Derivat vom Stamm NCDO 712 ist, wurde unter Verwendung des von Holo und Ness (Referenz 20) beschriebenen Elektroporationsverfahrens mit pTV32 oder pLTV1 transformiert und primäre Transformanten wurden durch Ausplattieren auf M17-Medium (Sigma Chemical Co.) selektiert, das 0,5% Glucose enthielt (GM17-Medium) und ergänzt war mit 0,5 M Saccharose, 2 mM CaCl2 (SGM17, Ca-Medium) und dem geeigneten selektiven Antibiotikum (Erythromycin oder Chloramphenicol) und bei 30°C inkubiert. Die Antibiotika wurden bei Sigma gekauft und mit den folgenden Konzentrationen verwendet: Erythromycin, 1,0 μg ml–1; Chloramphenicol, 5,0 μg ml–1.
  • Mit beiden Plamiden war die Transformationseffizienz 104 bis 105 Transformanten pro μg DNA, wenn auf Cmr oder Emr selektiert wurde.
  • Die selektierten primären Transformantenkolonien wurde in flüssiges GM17-Medium übertragen, das mit 5,0 μg ml–1 Chloramphenicol ergänzt war und die transformanten Zellen wurden bis zu einer Zahl von Generationen gezüchtet, die im Bereich von 10 bis 50 lag. Anschließend wurde die Plasmid-DNA aus diesen Transformanten mittels alkalischer Lyse der Zellen extrahiert, im Wesentlichen gemäß dem von Birnboim et al. (Referenz 6) beschriebenen Verfahren, mit Modifikationen, wie sie im Folgenden angegeben sind. Die Zellen wurden exponentiell bis zu einer A600 von 0,3 gezüchtet, und 5 ml an Kultur wurden mittels Zentrifugation bei 4.000 × g geerntet. Die Pellets wurden mit TS-Puffer gewaschen (25% Saccharose, 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0), in 0,25 ml S1-Lösung (5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 25% Saccharose, 50 mM Tris-Hydrochlorid, pH 8,0) mit 10 mg/ml Lysozym resuspendiert und bei 30°C 30 Min. inkubiert. 0,5 ml S2-Lösung (0,2 M NaOH, 1% SDS) wurden vorsichtig zugegeben und die Suspension 5 Min. in Eis gehalten. Anschließend wurden 0,4 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zugegeben und die Suspension 5 Min. in Eis gehalten. Nach der Zentrifugation der Suspension bei 10.000 × g wurden aus dem Überstand gemäß dem von Birnboim et al. (Referenz 6) beschriebenen Verfahren die Plasmide extrahiert.
  • Ein Teil der so extrahierten Plasmid-DNA und die Plasmide pTV32 und pLTV1, die aus E. coli PY1173 und Bacillus subtilis PY258 isoliert wurden, wurden einer Behandlung mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SalI und HindIII unter Standardbedingungen unterworfen. Nicht verdaute extrahierte Plasmid-DNA, die aus Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 und aus E. coli PY1173 und Bacillus subtilis PY258 isoliert wurde, ebenso wie die mit den Restriktionsenzymen behandelte Plasmid-DNA wurden dann einer Analyse mit Agarose-Gelelektrophorese unterworfen und es wurde gefunden, dass die Größen von pTV32 und pLTV1, die von dem transformierten Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 extrahiert worden waren, ebenso wie die Restriktionsenzymstellen EcoRI, SalI und HindIII im Vergleich mit den ursprünglichen Plasmiden erhalten waren. Unter der Annahme, dass das Niveau der Ausbeute bei dem vorstehenden Plasmidgewinnungsverfahen 100% ist, wurde mittels Durchführung eines Vergleichs auf Agarosegelen mit einem Standard an DNA des Phagen lambda bekannter Konzentration, verdaut mit HindIII, die durchschnittliche Kopienzahl der beiden Plasmide in dem transformierten Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 auf 6 bis 12 Kopien pro Zelle geschätzt. Dem entsprechend konnte aus diesem Experiment geschlossen werden, dass Milchsäurebakterien mit pTV32 und pLTV1 mit einer hohen Effizienz transformiert werden können und dass diese Plasmide zur Replikation in einem Milchsäurebakterium fähig sind.
  • BEISPIEL 2
  • Induktion der Tn917-Transposition in L. lactis ssp. lactis und die Heilung von pTV-Plasmiden
  • Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 hört bei Temperaturen über 37°C in M17-Brühe (Sigma Chemical Co.), die 0,5 Glucose enthält, auf zu wachsen. Da pTV32 und pLTV1 aus L. lactis ssp. lactis MG1614, das mit diesen Plasmiden transformiert worden war und bei 37°C unter Selektion auf Cmr gezüchtet wurde, extrahiert werden konnte, konnte das Temperaturheilungsverfahren, das für B. subtilis entwickelt wurde, in dem Lactococcus-Stamm nicht angewendet werden.
  • Es wurde jedoch gezeigt, dass weder pTV32-DNA noch pLTV1-DNA aus Lactococcus-Transformanten extrahiert werden konnte, die bei 30°C unter Selektion auf Emr gezüchtet wurden. Dies zeigte die Transposition (Integration) von Tn917 in das Chromosom mit gleichzeitigem Verlust des Plasmids.
  • Die Produktion von unabhängigen Tn917-Integranten von Lactococcus lactis ssp. lactis von individuellen Kulturen wurde gemäß dem folgenden Verfahren durchgeführt:

    Primär transformierte Zellen, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden waren, wurden auf SGM17, Ca-Agar ausplattiert, das Erythromycin enthielt, und etwa 40 Stunden bei 30°C inkubiert. 12 einzelne Kolonien wurden zweimal in M17-Brühenmedium subgezüchtet, das auf Emr selektierte. Um einzelne Kolonien zu erhalten, wurde jede Kultur auf GM17-Agar ausgestrichen, das Erythromycin enthielt, und eine einzelne Kolonie von jeder Kultur wurde einmal erneut ausgestrichen. Alle Inkubationen wurden bei 30°C durchgeführt.
  • Um zu verifizieren, dass diese vermutlich unabhängigen Integranten die Plasmide als freie Moleküle verloren hatten und Tn917 in das Chromosom integriert hatten, wurde mit der DNA von den 12 unabhängigen Emr MG1614-Clonen, die ursprünglich mit pTV32 transformiert und zweimal in flüssigem Medium, das auf Emr selektierte, subkultiviert worden waren, eine Southern-Hybridisierung durchgeführt. Aus den Isolaten wurde der gesamte DNA-Gehalt von Kulturen von 100 ml extrahiert, indem die Zellen durch 10 Minuten Zentrifugation bei 7000 rpm geerntet wurden. Die Zellen wurden in TE-Puffer (10 mM Tris-Hydrochlorid, 1 mM EDTA, pH 7,5) gewaschen und geerntet. Die Pellets wurden bei –20°C eingefroren und anschließend in 3 ml STET-Puffer (8% Gew./Vol. Saccharose, 5% Gew./Vol. Triton X-100, 50 mM EDTA [pH 8,0], 50 mM Tris-Hydrochlorid [pH 8,0]) gelöst. 750 μl Lysozym (10 mg/ml) wurden zugegeben und die Lösung wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Es wurden 750 μl 10%-iges SDS zugegeben und die Inkubation ½ Stunde bei 37°C fortgesetzt, gefolgt von ½ Stunde Inkubation bei 65°C. Es wurden zwei ml TE-Puffer zugegeben und die wässrige Lösung dreimal mit 5 ml Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert. Zu der Suspension wurde 1/10 des Volumens 5 M NaCl und 1 Volumen Isopropanol zugegeben. Die Lösung wurde sorgfältig gemischt, bis die DNA als lange weiße Fäden ausfiel. Die DNA wurde auf eine Inokulatiosnadel gewickelt und in Eppendorf-Röhrchen überführt und dreimal mit 70%-igem Ethanol gewaschen. Die DNA wurde in 500 μl TE-Puffer gelöst.
  • 1 μg der so hergestellten DNA von jedem Isolat wurde mit EcoRI verdaut und mittels Elektrophorese durch 1,0%-ige Agarosegele aufgetrennt und auf Hybond-N-Membranen (Amersham, UK) übertragen und der Hybridisierung unter Verwendung von mit 32P markierten DNA-Sonden unterworfen, nämlich pLTV1 und ein EcoRI-Fragment von pLTV1 von 4 kb, das das pE194-Replicon enthält. Das Fragment von 4 kb wurde mittels Elektroelution in Dialyseschläuche aus Agarosegelen isoliert. Die Sonden wurden einer Nick-Translation mit [α-32P]dCTP (Amersham, UK) unterworfen. Der Restriktionsenzymverdau, die Elektrophorese, die DNA-Übertragung, die Nick-Translation und die Hybridisierungen wurden wie bei Maniatis et al. (Referenz 34) beschrieben durchgeführt.
  • Die integranten Clone hybridisierten mit der mit 32P markierten pLTV1- und/oder der pTV-Replicon-spezifischen Sonde, wie in 3 gezeigt. PTV32 hat 15,6 kb und hat eine einzige EcoRI-Stelle, die im Replicon-Teil des Plasmids liegt. Der Tn917-Teil von PTV32 hat 8 kb. Bei 8 von 12 TV32-Integranten wurde mit pLTV1 als Sonde ein einziges Signal nachgewiesen (3A), während mit der pTV-Replicon-spezifischen Sonde kein Signal zu sehen war (3B). Diese 8 Integranten waren Emr und Cms, wie man erwarten würde, wenn TV32 in das Chromosom transponiert worden wäre und pTV32 verloren gegangen wäre. Bei den verbleibenden vier Integranten (Nummer 27, 33, 36 und 39) wurden mit pLTV1 als Sonde zwei Signale nachgewiesen (3A). Die selben zwei Banden hybridisierten mit der Replicon-spezifischen Sonde und es wurde kein Signal der Größe beobachtet, wie sie für frei replizierendes pTV32 zu erwarten wäre (3B). Dem entsprechend hatten diese vier Stämme die DNA von dem Replicon-Teil von PTV32 zusammen mit dem Transposon TV32 in das Chromosom integriert. Bei jeder der vier Integranten umfasste die DNA von dem Replicon-Teil das cat-gen, da alle vier Cmr waren.
  • BEISPIEL 3
  • Der Beweis der quasi-Zufälligkeit der Tn917-Inserierung in das Chromosom von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614
  • Damit Tn917 als effizientes Mutagenesewerkzeug bei L. lactis ssp. lactis verwendet werden kann, sollten die Inserierungen der Transposons zufällig sein. Eine Analyse der Zufälligkeit der Transposition wurde durch die Bestimmung der physikalischen Lage von TV32 auf chromosomalen SmaI-Fragmenten von 61 unabhängigen MG1614 TV32-Integranten durchgeführt, die gemäß dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurden. Die Herstellung und der SmaI-Restriktionsenzymverdau in situ von genomischer DNA wurde wie bei Tanskanen et al. (Referenz 52) beschrieben durchgeführt. Von diesen Integranten exprimierten 10 β-Galactosidase, wie durch Ausplattieren auf GM-Agar gezeigt wurde, das mit 160 μg/ml X-Gal ergänzt war.
  • Die SmaI-Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung eines Apparats Modell CHEF-DR II (Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien) mit Pulsfeld-Gelelektrophorese (PFGE) aufgetrennt. Die Gele waren 1,5%-ige Agarosegele in 0,5 × TBE (1 × TBE in 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA und 89 mM Tris-Borat [pH-Wert 8,3]). Die Elektrophoreseparameter waren wie folgt: 20 Stunden 175 V bei 14°C mit Rampenpulszeiten von 1 bis 70 Sekunden. Die Gele wurden mit einer Ethidiumbromidlösung (1 mg/ml) in 0,5 × TBE 30 Minuten gefärbt, 4 Stunden in 0,5 × TBE entfärbt und unter Verwendung eines UV-Transilluminators photographiert.
  • Das mit SmaI verdaute MG1614-Chromosom erzeugte die folgenden 10 Fragmente, die größer als 45 kb waren (4, Spur 3): 600, 310, 280, 200, 175, 140, 120, 105 und 65 kb. TV32 enthält eine einzige SmaI-Stelle. Die Inserierung von TV32 in jedes der zehn großen SmaI-Fragmente war deshalb mit Pulsfeld-Gelelektrophorese(PFGE)-Gelen nachweisbar, außer die Inserierung lag nahe am Fragmentende.
  • Die Lagen von TV32 auf den SmaI-Fragmenten der 61 Integranten sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1: Zufällige TV32-Integranten in Lactococcus lactis ssp. lactis, die aufgrund der physikalischen Lage von TV32 auf chromosomalen SmaI-Fragmenten in zwei Gruppen geteilt wurden
    Gruppe TV32-Ziel: chromosomales SmaI-Fragment (kb) Fragmentlängen (kb) von mit SmaI verdauten Zielfragmenten mit inseriertem TV32a Gruppenmitglieder (Integrant Nr.)b
    1 600 540 + 70 (= 610) 70b
    2 600 535 + 75 (= 610) 21, 44
    3 600 530 + 80 (= 610) 4, 27, 31
    4 600 525 + 85 (= 610) 39, 49
    5 600 505 + 105 (= 610) 22
    6 600 485 + 125 (= 610) 3, 30
    7 600 470 + 140 (= 610) 34
    8 600 460 + 145 (= 605) 35, 40, 54
    9 600 450 + 160 (= 610) 41, 42
    10 600 445 + 165 (= 610) 61b, 62b, 68b
    11 600 440 + 170 (= 615) 33
    12 600 405 + 200 (= 605) 1, 20
    13 600 390 + 205 (= 605) 6
    14 600 380 + 225 (= 605) 12
    15 600 375 + 230 (= 605) 10, 43
    16 600 360 + 235 (= 595) 11, 23, 65b
    17 600 355 + 240 (= 595) 50
    18 600 350 + 245 (= 595) 16, 64b
    19 600 325 + 280 (= 605) 66b
    20 600 310 + 300 (= 610) 25, 38
    21 310 245 + 65 (= 310) 45
    22 310 185 + 135 (= 320) 60
    23 310 180 + 140 (= 320) 8
    24 200 150 + x 19c
    600 420 + 210 (= 630)
    25 175 155 + x 29
    26 175 140 + x 47
    27 175 105 + 75 (= 180) 24
    28 140 115 + x 13, 15
    29 140 110 + x 2, 26, 63b
    30 140 105 + x 18, 32, 51, 59
    31 140 100 + x 14
    32 140 90 + x 7
    33 140 85 + x 5, 36
    34 120 115 + x 69b
    35 120 110 + x 48
    36 120 105 + x 55
    37 120 90 + x 67b
    38 NDd 46
    • a x steht für ein Fragment, das auf PFGE-Gelen nicht nachgewiesen werden konnte
    • b Clone, deren Bezeichnung mit b endet, sind blau auf Platten, die 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid enthalten
    • c Doppelter Integrant
    • d ND, nicht bestimmt
  • Basierend auf der physikalischen Lage von TV32 auf den SmaI-Fragmenten konnten die 61 Integranten in 38 Gruppen aufgeteilt werden. 4 zeigt die PFGE von Integranten, die jede der Gruppen repräsentieren, die in Tabelle 1 aufgelistet sind. Eine Gruppe (Nr. 30) enthielt 4 Integranten, fünf Gruppen (Nr. 3, 8, 10, 16 und 29) enthielten drei Integranten und 10 Gruppen (Nr. 2, 4, 6, 9, 12, 15, 18, 120, 28 und 33) enthielten zwei Integranten. Die Mitglieder derselben Integrantengruppe enthalten jedoch nicht notwendigerweise das TV32 an derselben Stelle auf dem Fragment. Inserierungen, die symmetrisch auf einem Fragment liegen, sind auf PFGE-Gelen nicht zu unterscheiden und die Auflösungsgrenze variiert von zwei bis zehn kb in Abhängigkeit von der Fragmentlänge.
  • Die chromosomalen SmaI-Fragmente von 600, 310, 200, 175, 140 und 120 kb waren alle das Ziel von TV32 (Tabelle 1 und 4). Offensichtlich hatte keiner der Integranten Inserierungen in den Fragmenten von 280, 105 und 65 kb. Es konnte aufgrund der PFGE-Ergebnisse aber nicht festgestellt werden, ob TV32 in dem Integranten 46 am Ende eines Fragments von mehr als 45 kb lag oder in irgendeiner Lage auf einem Fragment von einer Größe von weniger als 65 kb. Der Integrant 19 enthielt eine doppelte Inserierung (4). Auf den Fragmenten von 200 kb und 600 kb liegen zwei Kopien von TV32. Diese doppelten Inserierungen ergeben eine Gesamtzahl von 62 Inserierungen bei dieser Untersuchung.
  • Die 62 TV32-Inserierungen in dem Chromosom von Lactococcus lactis ssp. lactis waren nicht gleichmäßig über das Chromosom verteilt. Dies wurde mittels einer chi-Quadrat-Analyse offenbart, wobei getestet wurde, ob die Wahrscheinlichkeit der Inserierung in ein SmaI-Fragment nur von der Länge des Fragments abhängig war (Tabelle 2).
  • Tabelle 2 gibt die Zahl der Integranten an, die bei jedem Fragment erhalten wurden, zusammen mit der erwarteten Zahl an Integranten unter der Annahme, dass die Wahrscheinlichkeit der Integration in ein Fragment nur von der Länge des Fragments abhängig ist. Ein chi-Quadrat-Test wurde verwendet, um diese Annahme zu testen. Der chi-Quadrat-Test zeigte (P < 0,005), dass die erhaltenen Inserierungen nicht absolut zufällig über das Chromosom verteilt waren. Der wichtigste Beitrag zu dieser Ungleichheit kam von einer 2,5-fachen Überrepräsentation an Inserierungen in dem Fragment von 600 kb und der Abwesenheit von Inserierungen in dem Fragment von 280 kb. Die 37 Inserierungen in dem Fragment von 600 kb lagen an mindesten 21 verschiedenen Positionen mit nicht mehr als 3 Inserierungen an derselben Position. Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorstehende Überrepräsentation nicht auf einen einzigen dominierenden heißen Ort zurückgeführt werden kann. Das Fragment von 280 kb ist nicht vollständig gefeit gegen TV32-Inserierungen, da solche Integranten in parallelen Experimenten erhalten wurden. Dem entsprechend wird in dem vorliegenden Kontext das Verteilungsmuster, wie es in dem Stamm Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 erhalten wird, als ”quasi-zufällig” bezeichnet.
  • Die folgenden Faktoren können zu der beobachteten ungleichmäßigen Verteilung von Inserierungen beigetragen haben: (1) Fragmente in der Nähe des chromosomalen Replikationsursprungs haben eine höhere Kopienzahl als Fragmente in der Nähe des Terminus; (2) essentielle Gene können ungleich verteilt worden sein; und (3) Tn917 könnte bevorzugt in Bereiche mit speziellen Eigenschaften inseriert werden. Tabelle 2: Verteilung von TV32 auf chromosomalen SmaI-Fragmenten von Lactococcus lactis ssp. lactis
    TV32-Ziel: chromosomales SmaI-Fragment (kb)a Zahl der beobachteten Inserierungenb Zahl der erwarteten Inserierungenc Zahl der beobachteten Inserierungen/Zahl der erwarteten Inserierungen Chi-Quadrat-Testd
    600 37 14,9 2,5 32,8
    175e 3 8,7 0,3 3,7
    310 3 7,7 0,4 2,9
    280 0 6,9 0,0 6,9
    200 1 5,0 0,2 3,2
    140 13 3,5 3,7
    120 4 3,0 1,3
    105 0 2,6 0,0 0,0
    65 0 1,6 0,0
    < 45 1 8,2 0,1
    • a) Insgesamt war die Größe der chromosomalen SmaI-Fragmente 2500 kb
    • b) Die Gesamtzahl der beobachteten Inserierungen war 62
    • c) Die Wahrscheinlichkeit an Inserierungen wurde angenommen mit gleicher Fragmentgröße relativ zur Größe des Chromosoms. Die erwartete Gesamtzahl an Inserierungen war 62,1.
    • d) Die Werte wurden wie folgt berechnet: (Zahl an beobachteten Inserierungen – Zahl an erwarteten Inserierungen)2/Zahl an erwarteten Inserierungen. Der chi-Quadrat-Test erfordert, dass die erwartete Zahl für jede Klasse höher oder gleich 5 sein soll; deshalb wurden Inserierungen in Fragmente kleiner als 205 kb wie eine behandelt. Der gesamten chi-Quadrat-Wert war 49,5. Bei einem chi-Quadrat-Test mit 5 Freiheitsgraden ist die Wahrscheinlichkeit, 16,7 zu überschreiten, 0,005 (0,5%), wenn die Hypothese korrekt ist.
    • e) Der Stamm MG1614 hatte zwei Fragmente von 175 kb, die auf PFGE-Gelen nicht unterschieden werden konnten. Dem entsprechend wurden die Inserierungen in diese Fragmente wie eine Klasse behandelt.
  • Trotz der etwas ungleichen Verteilung der TV32-Inserierungen in dem Chromosom von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 wurde geschlossen, dass die Tn917-Derivate sehr nützliche Werkzeuge für die genetische Analyse von Milchsäurebakterien sind, da in weiteren Experimenten auch gefunden wurde, dass mit diesen Transposonderivaten eine große Anzahl an Inserierungsstellen zusätzlich zu den vorstehend erwähnten gefunden werden konnten.
  • Der vorstehend erwähnte Clon von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614, der als 63b bezeichnet wurde, wurde am 21. Dezember 1992 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 7361 hinterlegt.
  • BEISPIEL 4
  • Die Produktion einer Sammlung von Tn917-Inserierungen in Lactococcus lactis
  • Um eine Sammlung von Tn917-Inserierungen in Lactococcus lactis herzustellen, wurde das folgende Verfahren angewendet:

    Eine einzelne Kolonie eines pTV32 enthaltenden Lactococcus lactis ssp. lactis Stamm MG1614 wurde in GM17-Medium inokuliert und für 8 bis 10 Generationen unter Selektion auf Cmr gezüchtet. Ein Prozent dieser Zellen wurde für 8 bis 10 Generationen in GM17-Medium unter Selektion auf Emr gezüchtet. Die Temperatur wurde bei 30°C gehalten. Die resultierenden Zellen wurden auf GM17-Agarplatten unter Selektion auf Emr ausplattiert. 19 Kolonien wurden zufällig entnommen und die Herstellung und der Verdau von genomischer DNA in situ in Agaroseblöcken wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die 5 und die Tabelle 3 zeigen, dass 12 von 18 (der Verdau von einem Clon resultierte in Fragmenten, die als diskrete Banden sichtbar gemacht werden konnten) Clonen das Transposon an derselben Stelle auf dem Chromosom inseriert hatten, was anzeigt, dass die Kultur von einem einzigen Integranten dominiert wurde. Tabelle 3: TV32-Integranten von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 aus einer Kultur, die einen dominanten Integranten enthält
    Gruppe TV32-Ziel: chromosomales SmaI-Fragment (kb) Fragmentlänge (kb) von mit SmaI verdauten Zielfragmenten mit inseriertem TV32a) Gruppenmitglied (Integrant Nr.)
    1 600 540 + 70 (= 610) E15
    2 600 475 + x E4
    3 600 400 + 210 (= 610) E13, E16
    4 310 190 + 140 (= 330) E1, E3, E6, E7, E8, E10, E11, E12, E14, E17, E18, E19
    5 200 x + x E9b)
    140 x + x
    6 175 160 + x E2
    • a) steht für ein Fragment, das auf PFGE-Gelen nicht nachgewiesen werden konnte
    • b) doppelter Integrant
  • Um einen dominanten Integranten in einer Kultur zu umgehen, wurde das folgende Verfahren ausgewählt:

    Der Stamm MG1614 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben mit pTV32 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf SGM17-Agarplatten ausplattiert, das 1 μg/ml Erythromycin enthielt. Nach 48 Stunden Inkubation bei 30°C wurden 20 Platten mit jeweils etwa 100 Kolonien replikativ auf Platen mit GM17-Agar unter Selektion auf Emr ausplattiert. Die replizierten Platten wurden 30 Stunden bei 30°C inkubiert. Der Replikationsschritt wurde wiederholt und die Kolonien wurden abgewaschen und vereint. Von den vereinten Kulturen wurden 18 Integranten zufällig selektiert und mit PFGE analysiert, wie vorstehend definiert. Auf der Basis der Lage der Tn917-Inserierungen bei chromosomalen SmaI-Fragmenten wurden die 18 Integranten in 13 Gruppen aufgeteilt, von denen keine mehr als 2 Inserierungen enthielt (6 und Tabelle 4). Es wurde daher geschlossen, dass die vereinten Kulturen eine Sammlung von quasi-zufälligen Inserierungen des Transposons TV32 im Stamm MG1614 enthielten. Tabelle 4: TV32-Integranten von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 aus einer Kultur, die quasi-zufällige Inserierungen von TV32 enthält
    Gruppe TV32-Ziel: chromosomales SmaI-Fragment (kb) Fragmentlänge (kb) von mit SmaI verdauten Zielfragmenten mit inserierter TV32a) Gruppenmitglied (Integrant Nr.)
    1 600 540 + 70 (= 610) K10, K20
    2 600 530 + 80 (= 610) K3, K12
    3 600 520 + 90 (= 610) K9, K18
    4 600 510 + 100 (= 610) K13
    5 600 470 + 120 (= 590) K14
    6 600 460 + 140 (= 600) K17
    7 600 375 + 220 (= 595) K4, K6
    8 310 185 + 140 (= 325) K2
    9 200 175 + x K11
    10 140 110 + x K1
    11 140 105 + x K5, K16
    12 140 x + x K7
    13 120 x + x k8
    • a) zeigt ein Fragment, das nicht auf PFGE-Gelen nachgewiesen werden konnte
  • Zu den vereinten Kulturen wurde steriles Glycerin mit einer Konzentration von bis zu 25% zugegeben und dieses Gemisch bei –80°C aufbewahrt.
  • Eine vereinte Kultur, die eine Sammlung an quasi-zufälligen LTV1-Inserierungen in Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 enthielt, wurde im Wesentlichen wie vorstehend beschrieben hergestellt. Vor dem Abwaschen und Vereinen der Kolonien wurde jedoch das folgende durchgeführt:
    320 μg/ml X-Gal wurden zu den Platten zugegeben, die für die zweite Replikation verwendet wurden. 242 Kolonien mit verschiedenen blauen Intensitäten wurden auf der zweiten Replikationsplatte gesehen. Im Gegensatz dazu waren auf den GM17-Agarplatten, die 40 μg/ml X-Gal enthielten und mehr als 48 Stunden inkubiert worden waren, weniger als 5% dieser Kolonien blau. (40 μg/ml X-Gal ist die Standardkonzentration zur Identifizierung der lacZ-Expression in E. coli). Jede der 242 blauen Kolonien, die auf der Platte erschienen, die 320 μg/ml X-Gal enthielt, wurden erneut ausgestrichen, um einzelne Kolonien auf GM17 zu erhalten, das 1 μg/ml Erythromycin und 320 μg/ml X-Gal enthielt, gefolgt von erneutem einmaligem Ausstreichen auf demselben Medium. Eine einzelne Kolonie von jeder dieser Subkulturen wurde in flüssiges GM17-Medium inokuliert, das mit 1 μg/ml Erythromycin ergänzt war, und über Nacht bei 30°C inkubiert und für die Lagerung bei –80°C wurde zu jeder dieser Subkulturen steriles Glycerin mit einer Konzentration von 25% zugegeben. Diese 242 Clone werden im Folgenden als Promotorfusionskollektion Nr. 1 bezeichnet (PFC-1).
  • Einer der PFC-1-Clone von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 mit der Bezeichnung P139-170 wurde am 21. Dezember 1992 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 7360 hinterlegt.
  • BEISPIEL 5
  • Identifikation und Clonierung von regulierbaren Promotoren vom Chromosom von Lactococcus lactis ssp. lactis
  • Die Sammlung von quasi-zufälligen Tn917-Inserierungen in das Chromosom von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363, die wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt wurde (PFC-1), wurde bei diesem Experiment verwendet, das als eine Durchmusterung auf die Anwesenheit von regulierbaren Promotoren in diesen Fragmenten geplant wurde.
  • Von der Temperatur/der Wachstumsphasen regulierte lacZ-Expression
  • Jeder Clon von PFC-1 wurde auf einem doppelten Satz an GM17-Platten ausgestrichen, die 1 μg/ml Erythromycin und 320 μg/ml X-Gal enthielten. Das Ausstreichmuster ist in 7 gezeigt. Bei einem Satz an Platten wurden die Clone ausgestrichen und an Tag 1 bei 15°C inkubiert. Beim zweiten Satz an Platten wurden die Clone ausgestrichen und an Tag 4 bei 30°C inkubiert. Am Tag 5 wurden beide Plattensätze inspiziert. Es wurden drei Hauptarten an lacZ-Expression für die PFC-1-Clone beobachtet:
    • (i) Typ 1T zeigt eine hohe lacZ-Expression (dunkelblauer Ausstrich) bei 30°C und eine niedrige oder keine lacZ-Expression (leicht blauer oder weißer Ausstrich) bei 15°C
    • (ii) Typ 2T zeigt ein ähnliches Niveau an lacZ-Expression bei beiden Temperaturen
    • (iii) Typ 3T zeigt eine niedrige oder keine lacZ-Expression bei 30°C und eine hohe lacZ-Expression bei 15°C.
  • Von insgesamt 242 getesteten Clonen waren 23 vom Typ 1T, 215 vom Typ 2T und 4 Clone waren vom Typ 3T. Wegen der verlängerten Wachstumsperiode bei 15°C ist es nicht möglich zu bestimmen, ob die regulierte lacZ-Expression eine Funktion der Wachstumsphase/-rate und/oder der Temperatur ist.
  • Von Arginin/vom pH-Wert regulierte lacZ-Expression
  • Jeder Clon von PFC-1 wurde auf einem Satz von M17-Platten ausgestrichen, die 0,1% Glucose, 0.5% Arginin, 1 μg/ml Erythromycin und 320 μg/ml X-Gal enthielten und auf einem Satz von GM17-Platten, die 1 μg/ml Erythromycin und 320 μg/ml X-Gal enthielten, unter Verwendung desselben Ausstreichmusters wie vorstehend beschrieben. Beide Sätze an Platten wurden bei 30°C 30 Stunden inkubiert. Es wurden drei Hauptarten an lacZ-Expression auf den inkubierten Platten beobachtet:
    • (i) Typ 1A zeigt eine hohe lacZ-Expression auf Platten, die nicht mit Arginin ergänzt sind und eine niedrige oder keine lacZ-Expression auf Platten, die mit Arginin ergänzt sind
    • (ii) Typ 2A zeigt eine ähnliche lacZ-Expression unabhängig von der Ergänzung mit Arginin
    • (iii) Typ 3A zeigte eine niedrige oder keine lacZ-Expression auf Platten ohne Arginin und eine hohe lacZ-Expression auf Platten, die mit Arginin ergänzt sind
  • Von den 242 getesteten Clonen waren 21 vom Typ 1A, 219 vom Typ 2A und 2 Clone vom Typ 3A. Der pH-Wert des sterilen GM17 ist etwa 6,8. Der pH-Wert im GM17-Medium, das mit Lactococcus lactis ssp. lactis inokuliert und übernacht inkubiert wurde, ist etwa 5,0. Der pH-Wert in M17 jedoch, das mit 0,1% Glucose und 0.5% Arginin ergänzt wurde und das mit Lactococcus lactis ssp. lactis inokuliert und übernacht gezüchtet wurde, übersteigt 9,0. Dem entsprechend wird die regulierte lacZ-Expression als Funktion der Argininkonzentration und/oder des pH-Werts in dem Medium beobachtet.
  • NaCl/Ionenstärke-Regulierung der lacZ-Expression
  • Jeder Clon der PFC-1-Sammlung wurde auf einem Satz von GM17-Platten ausgestrichen, die mit 1 μg/ml Erythromycin, 320 μg/ml X-Gal und 2% NaCl ergänzt waren und auf einen Satz an Platten mit demselben Medium ohne NaCl, unter Verwendung desselben Ausstreichmusters wie vorstehend definiert. Beide Sätze an Platten wurden bei 30°C 30 Stunden inkubiert. Es wurden zwei Hauptarten an lacZ-Expression auf den inkubierten Platten beobachtet:
    • (i) Typ 1S zeigt eine hohe lacZ-Expression auf Platten ohne NaCl und eine niedrige oder keine lacZ-Expression auf Platten, die mit NaCl ergänzt waren
    • (ii) Typ 2S zeigt eine ähnliche lacZ-Expression auf beiden Arten von Platten
  • Von den 242 getesteten Clonen waren 87 vom Typ 1S und 155 vom Typ 2S.
  • Wenn von einem Clon von PFC-1 gezeigt wurde, dass er eine regulierbare lacZ-Expression hat, wird ein Inserierungspunkt oder ein Bereich auf dem Lactococcus-Chromosom definiert, wo ein inseriertes Gen regulierbar in Lactococcus exprimiert wird. Zum Beispiel ist der Clon, der als P139-170 von PFC-1 bezeichnet wird, vom Typ 3T, Typ 1A und Typ 2S, was anzeigt, dass das lacZ-Gen an einer Position steht, wo die Expression eines inserierten Gens bei 30°C und auf M17 Platten, die mit Arginin ergänzt sind, zum Teil oder vollständig unterdrückt wird. Die Genexpression an dieser Position ist jedoch hoch bei 15°C auf GM17-Platten. Das Niveau der Genexpression auf GM17-Platten wird von der getesteten Konzentration an NaCl nicht beeinflusst.
  • Physiologische Untersuchung der regulierbaren lacZ-Expression des Clons P139-170
  • Von P139-170 wurde gezeigt, dass er vom Typ 1A ist. Das folgende Vorexperiment wurde durchgeführt, um bei diesem Clon die Abhängigkeit der lacZ-Expression vom pH-Wert zu untersuchen:

    Sechs Fermenter, von denen jeder 1 Liter GM17-Medium enthielt, das mit 1 μg/ml Erythromycin ergänzt war, wurden bei 30°C zum Laufen gebracht. Je zwei Fermenter wurden unter Verwendung von 5 M Schwefelsäure oder 5 M Natriumhydroxid bei pH-Wert 5,5, 6,5 and 7,5 zum Laufen gebracht. Einem der zwei Fermenter wurde eine 1%-ige Übernachtkultur von H25A (Stamm MG1614, der eine LTV1-Inserierung im Chromosom hatte und in der Lage war, β-Galactosidase auf GM17-Agar unabhängig von der Zugabe von Arginin oder NaCl zu exprimieren) inokuliert, und den anderen beiden Fermentern wurde eine 1%-ige Übernachtkultur von P139-170 inokuliert.
  • Das Wachstum der Clone in den Fermentern wurde durch Messung der OD600 und Ausplattieren auf GM17-Platten +/–1 μg/ml Erythromycin verfolgt. Die Wachstumskurve [log(OD600) gegen die Zeit] war fast gleich für die Clone in allen sechs Fermentern. Bei einer OD600 von 2,0 wurden 40 ml Kultur von jedem Fermenter 10-fach konzentriert und zweimal mit einer French Press behandelt. Die lysierten Lösungen wurden dem Verfahren der Messung der β-Galactosidase-Aktivität unterzogen, wie es von Miller, 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., beschrieben wird. Unglücklicherweise misslang ein Verfahren der Aufbewahrung der Lösungen ohne Verlust der β-Galactosidase-Aktivität. Deshalb sind lediglich die Ergebnisse der visuellen Überprüfung der Farbentwicklung bei der Messung der β-Galactosidaseaktivität verfügbar:
    pH-Wert H25A P139-170
    5,5 + +
    6,5 + –
    7,5 + –
    • +: β-Galactosidaseaktivität vorhanden
    • –: β-Galactosidaseaktivität abwesend
  • Basierend auf diesem Experiment wurde geschlossen, dass die lacZ-Expression bei P139-170 eine Funktion des pH-Werts im Wachstumsmedium war. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass der Gehalt an Arginin in dem Medium auch ein regulatorische Wirkung auf die Funktion des Promotors haben könnte.
  • Aus ausgewählten integranten PFC-1-Clonen, bei denen eine regulierte β-Galactosidase-Expression identifiziert wurde, wurde die DNA, die dem erm (oder lacZ) nahen Ende benachbart ist, unter Verwendung des folgenden Verfahrens cloniert:

    Die gesamte DNA wurde gemäß dem Verfahren, wie es in Beispiel 2 definiert ist, aus einem Clon extrahiert. Etwa 1 μg DNA wurde mit 50 Einheiten EcoRI verdaut und zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die Phenol- und Chloroform-Extraktion und die Ligierung in 200 μl Ligierungspuffer, der 50 Einheiten Ligase enthielt, wurde wie bei Maniatis (Referenz 34) beschrieben durchgeführt. Die DNA wurde durch Zugabe von drei Volumen eiskalten Ethanols und 1/10 Volumen Natriumacetat ausgefällt, gefolgt von 30 Minuten Zentrifugation bei 10.000 × g. Die DNA wurde in 20 μl TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Hydrochlorid [pH-Wert 8,0]) resuspendiert. 10 μl ligierte DNA-Lösung wurden für die CaCl2-Transformation in E. coli DH5α (F-, endA1, hsdR17(rk–, mk+), supE44, thi-1, lacΔU169, recA1, gyrA96, relA1, Φ80 dlacZΔM15 verwendet, wie beschrieben in Referenz 17. Etwa 1,5 × 103 Transformanten wurden pro μg DNA erhalten.
  • BEISPIEL 6
  • Die Konstruktion eines Promotorsondenvektors für Milchsäurebakterien
  • Ein nützliches Werkzeug für die Analyse der Zustände, die ein Gen anschalten und zur Messung des Niveaus der Expression ist eine Promotorsonde. Für Lactococcus wurde pGKV210, ein Promotorsondenvektor, basierend auf Chloramphenicolacetyltransferase und angetrieben von dem pWV01-Replicon, konstruiert (van der Vossen et al., 1985). Unglücklicherweise stellt dieser Vektor nur eine leicht erhöhte Chloramphenicol-Resistenz bereit, wenn in ihn Promotoren cloniert werden (van der Vossen et al., 1987). Die Translation von mRNA, die das cat-86-Gen enthält, wird durch Chloramphenicol aktiviert (Alexieva et al., 1988), so dass das gemessene Niveau an Enzym von zwei Faktoren abhängt, der Stärke des Promotors und der Aktivierungseffizienz. Außerdem repliziert sich das pWV01-Replicon durch „rolling-circle”-Replikation und ist daher einer von der Größe abhängigen segregationalen Instabilität zugänglich (Kiewiet et al., 1993).
  • Ein Promotorsondenvektor für Lactococcus und vermutlich andere Milchsäurebakterien wurde auf der Basis der β-Galactosidasegene von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, des Citratplasmidreplicons der biovar diacetylactis von Lactococcus lactis subsp. lactis und eines Erythromycinresistenzmarkers konstruiert. Der Vektor wird als pAK80 bezeichnet. Die Clonierung des Promotors für das tRNA-Cluster neben dem tma-Gen von CHCC285 zeigte, dass dieser Vektor funktioniert. Die resultierende Konstruktion pAK90 produziert extrem hohe Niveaus von β-Galactosidase in MG1363.
  • Die β-Galactosidasegene von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris wurden cloniert und es wurde gefunden, dass sie nahezu identisch sind mit dem β-Galactosidasegen von Lactococcus lactis (David et al., 1992). Von beiden Genen wurde gezeigt, dass sie in Escherichia coli und im Stamm MG1363 von Lactococcus lactis exprimiert werden. Der Promotor des β-Galactosidasegens wurde mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) deletiert und durch einen Polylinker ersetzt, der die Clonierung verschiedener DNA-Fragmente und das Testen auf Promotoraktivität erlaubte. Diese Konstruktion wurde in einen Shuttle-Vektor cloniert, der das Citratplasmidreplicon der biovar diacetylactis von Lactococcus lactis subsp. lactis, das pACYC184-Replicon für E. coli und einen selektierbaren Marker (Erythromycin-Resistenz) für beide Organismen enthält. Die Clonierung des tRNA-Promotors in den Polylinker ergab hohe Niveaus von β-Galactosidase in MG1363, was beweist, dass der Vektor wie geplant arbeitet.
  • A. Materialien und Methoden
  • 1. Bakterienstämme, Plasmide und Medien
  • MG1363, der ein plasmidfreier Lactococcus lactis-Stamm ist (Gasson, 1983). Escherichia coli DH5α [supE44 lacΔU169 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 Φ80lacZΔM15] (Hanahan, 1983) wurde für die Clonierung verwendet.
  • Die Clonierungsvektoren und die relevanten Marker, die verwendet wurden, waren: pVA891 [Erythromycin-Resistenz; EmR] (Macrina et al., 1983) und pIC19H [Ampicillin-Resistenz; AmpR] (Marsh et al., 1983). Die verschiedenen Plasmide, die während der Konstruktion des Promotorsondenvektors konstruiert wurden, werden im Folgenden beschrieben.
  • Lactococcus-Stämme wurden bei 30°C in GM17-Medium gezüchtet. E. coli-Stämme wurden bei 37°C in LB-Medium gezüchtet. Die Antibiotika wurden mit den folgenden Konzentrationen verwendet: für E. coli; Erythromycin 250 μg/ml; und Ampicillin 50 μg/ml; für Lactococcus; Erythromycin 1 μg/ml.
  • 2. Plasmidherstellungen und Transformationen.
  • Die Plasmid-DNA für die Sequenzierung und Elektroporationen wurde mit dem Qiagen-Kit (Diagen, Düsseldorf, Deutschland) gewonnen.
  • Plasmidherstellungen aus Lactococcus in kleinem Maßstab wurden im Wesentlichen gemäß Israelsen et al. 1993, durchgeführt.
  • Die Plasmide wurden mittels Elektroporationen von mit Glycin gezüchteten kompetenten Zellen gemäß Holo und Nes, 1989, in MG1363 eingebracht.
  • 3. β-Galactosidasetests
  • Die Promotoraktivität wurde mittels Durchführung von β-Galactosidasetests bei Übernachtkulturen durchgeführt, die in GI.5M17-Medium gezüchtet wurden. 1 ml der Kultur wurde 10 Min. bei 10.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 500 μl Z-Puffer (Miller, 1972) resuspendiert. 100 μl Zellsuspension wurden mit 400 μl Z-Puffer, 12,5 μl 0,1%-igem SDS und 25 μl CHCl3 auf einem Vortex-Mischer 10 Sekunden gemischt. Nach dem Mischen mit dem Vortex-Mischer wurde die Suspension wie in Beispiel 7 beschrieben behandelt. Die Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt.
  • Die Testergebnisse sind als Miller-Einheiten angegeben. Eine Miller-Einheit = (1000 × A420)/(Zeit × Volumen × A600) (wobei die Zeit in Minuten ist und das Volumen in ml ist).
  • B. Konstruktion von pAK66
  • Zwei PCR-Primer wurden erhalten, die die Amplifikation des gesamten Replikationsbereichs des Citratplasmids erlaubten. Diese hatten die folgenden Sequenzen:
    Figure 00450001
  • Der Primer 1 entspricht den Nucleotiden 610–621 und der Primer 4 ist komplementär zu den Nucleotiden 2340–2361 des Citratplasmid-Replikationsbereichs (Jahns et al., 1991). Beide enthalten EcoRI-Stellen an ihren 5'-Enden, um die Clonierung zu erleichtern. Das Amplifikationsprodukt von 1,7 kb wurde als EcoRI-Fragment in pIC19H cloniert, um pKR41 zu ergeben. Das EcoRI-Fragment wurde dann in die einzige EcoRI-Stelle von pVA891 gebracht, um den Shuttle-Vektor pAK66 zu ergeben, der in E. coli und in L. Lactococcus MG1363 repliziert. Die Konstruktion von pKR41 wurde in einem Manuskript beschrieben, das zur Veröffentlichung eingereicht wurde (Pedersen et al., 1993).
  • C. Clonierung des β-Galactosidasegens von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris
  • Im Verlauf der Clonierung und Sequenzierung von IS1165 vom Stamm DB1165 von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris erhielten wir einen Clon, der pSB1 (Johansen und Kibenich, 1992) genannt wurde. Dieser Clon enthielt eine Inserierung von 5,8 kb im Polylinker von pIC19H. Normalerweise zerstört die Clonierung in pIC19H die β-Galactosidaseaktivität und Kolonien mit Inserierungen sind auf X-Gal weiß. pSB1 war insofern seltsam, als dass es auf X-Gal blaue Kolonien ergab. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte, dass die Inserierung in pSB1 das β-Galactosidasegen von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris enthielt und dass es nahezu identisch war mit dem von Leuconostoc lactis (David et al., 1992). Bei den sequenzierten 830 bp wurden nur 3 Unterschiede gefunden.
  • D. Konstruktion von pAK67.7
  • Diese Konstruktion involvierte den Ersatz des β-Galactosidasepromotors durch einen Polylinker und die Inserierung von Stopcodons bei alten 3 Vorwärtsleserahmen und ist in 8 dargestellt. Der Promotor wurde unter Verwendung von zwei Primern mittels PCR entfernt:
    Figure 00460001
  • Der unterstrichene Teil von lac-1 ist identisch mit dem Beginn des β-Galactosidasegens und enthält die Ribosomenbindungsstelle. Die restliche Sequenz enthält eine Vielzahl an Restriktionsstellen einschließlich BglII. Der Primer lac-2 lagert sich 20 bp stromabwärts von der einzigen NcoI-Stelle an das β-Galactosidasegen an. Die PCR-Amplifikation mit diesen Primern wird die Ribosomenbindungsstelle bis gerade über die NcoI-Stelle hinweg amplifizieren und ein Fragment von 360 bp produzieren, das an einem Ende mehrere Restriktionsstellen enthält, eine NcoI-Stelle am anderen Ende und keinen Promotor oder andere regulatorische Sequenzen vom β-Galactosidasegen. Dieses Fragment von 360 bp wurde gereinigt, mit BglII und NcoI verdaut und in mit BglII/NcoI verdauten pSB1 cloniert. Das resultierende Plasmid wurde pAK67 genannt und hatte den folgenden Polylinker, der dem β-Galactosidasegen vorrausgeht:
    Figure 00470001
  • Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte, dass dieser Polylinker vorhanden war und dass durch Fehler während der PCR keine Veränderungen in das β-Galactosidasegen eingeführt worden waren.
  • Wie man vorstehend sehen kann, gibt es zwei offene Leserahmen, die über den Polylinker hinweg in das β-Galactosidasegen hineingehen. Da diese möglicherweise mit der Expression des β-Galactosidasegens von den in den Polylinker inserierten Promotoren interferieren könnten, wurde beschlossen, Stopcodons in alle drei Vorwärtsleserahmen einzuführen. Dies wurde durch die Gewinnung von zwei Oligonucleotiden mit der folgenden Sequenz gemacht.
  • Figure 00470002
  • Diese Oligonucleotide sind komplementär und werden sich aneinanderlagern, um ein Stück doppelsträngiger DNA von 12 bp zu ergeben, das eine XbaI-Restriktionsstelle enthält. Dieses kleine Fragment wurde in die SmaI-Stelle von pAK67 cloniert. Diese Oligonucleotide wurden so geplant, dass die SmaI-Stelle erhalten bleiben würde, eine neue XbaI-Stelle in Plasmiden mit dieser winzigen Inserierungen vorhanden sein würde und dass Stopcodons in die zwei offenen Leserahmen eingeführt würden. Die Clonierung wurde durch Verdau von pAK67 mit SmaI, Phosphatase-Behandlung und Ligierung mit einem Gemisch der beiden Oligonucleotide gemacht, die mit Kinase behandelt worden waren und aneinanderlagern konnten. Die Transformanten wurden gereinigt und diejenigen, bei denen die das Plasmid eine XbaI-Stelle gewonnen hatte, wurden weiter analysiert. Die DNA-Sequenzanalyse offenbarte, dass ein Clon pAK67.7, die gewünschte Struktur hatte:
    Figure 00480001
  • E. Konstruktion von pAK80
  • Der letzte Schritt bei der Produktion des Promotorsondenvektors war die Kombination des manipulierten β-Galactosidasegens mit einem Replicon und einem selektierbaren Marker für Lactococcus. Dies wurde durch Verdau von pAK67.7 mit HindIII und SalI und Ligierung in pAK66 erreicht, das auch mit HindIII und SalI verdaut war. Unter den produzierten Plasmiden war pAK80, das exakt der ursprünglich geplante Promotorsondenvektor war.
  • Das Plasmid pAK80, aufgenommen von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 wurde am 27. August 1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 8496 hinterlegt.
  • F. Testen von pAK80 unter Verwendung von zwei regulierbaren tRNA-Promotoren
  • Ein DNA-Fragment von Lactococcus lactis subsp. lactis, das benachbart zum tma-Gen von CHCC285 ist, wurde isoliert und es wurde gefunden, dass es einen Cluster von tRNA-Genen enthält, dem ein Promotorbereich vorausgeht (11 und 12), der zwei potentielle Promotoren (PI, Nucleotide 107–134; PII, Nucleotide 215–242) enthält. Der PI- und der PII-Promotor, enthalten in einem HindIII-ScaI-Fragment von 501 bp, das aus dem Clon pLN39 isoliert wurde, wurde durch Inserierung vor dem promotorlosen β-Galactosidasegen von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris in pAK80 cloniert, das mit HindIII und SmaI verdaut worden war. Nach der Ligierung wurde MG1363 elektroporiert und die Zellen wurden auf Regenerationsmedium (Holo und Nes, 1989) ausplattiert, das Erythromycin und X-Gal enthielt. Es wurden insgesamt sieben blaue Kolonien erhalten. Die Plasmidanalyse offenbarte, dass alle sieben identische Plasmide hatten und dass jede die gewünschte Inserierung in pAK80 enthielt. Ein Plasmid wurde isoliert und als pAK90 bezeichnet. β-Galactosidasetests offenbarte, dass MG-1363/pAK90 5000 Miller-Einheiten Enzym produzierte, während MG-1363/pAK80 1 Miller-Einheit produzierte. Somit enthält der Bereich, der den tRNA-Genen vorausgeht, einen sehr starken Promotor.
  • Die Suche nach Sequenzen mit Ähnlichkeit mit der Sequenz des vorstehenden Promotorbereichs (13) offenbarte eine Consensus-Sequenz von Promotoren, die den rRNA-Operons und den tRNA-Operons von Lactococcus-Arten vorausgehen, einschließlich einer zuvor nicht beschriebenen konservierten Sequenz (Motiv) AGTT. Diese Sequenz endet 5 bp stromaufwärts des -35-Bereichs und ist nicht konserviert in tRNA- un rRNA-Promotoren von Escherichia coli oder Bacillus subtilis. Bei allen Lactococcus-Arten, wo dieses Motiv als potentiellen rRNA- oder tRNA-Promotoren vorausgehend gefunden wurde, waren diese Promotoren alle aus Plasmiden isoliert worden, wo die Promotoren vor dem cat-86-Gen inseriert waren, das Chloramphenicol-Acetyltransferase codiert. Da dieses Enzym in Lactococcus lactis schlecht exprimiert wird, kann Resistenz gegen Chloramphenicol in diesem Organismus nur durch Clonierung von starken Promotoren vor dem cat-86-Gen erhalten werden. Es scheint daher, dass das Motiv AGTT nur in starken Promotoren von Lactococcus lactis gefunden wird.
  • Die vorstehenden Promotoren PI und PII enthalten beide konservierte Sequenzen, die vermutlich in die stringente Kontrolle (13) involviert sind und dem entsprechend scheinen diese Promotoren regulierbare Promotoren zu sein.
  • Ein HindIII-EcoRI-Fragment von 1,0 kb aus pLN39 wurde in das Plasmid pCI3340 inseriert, das mit HindIII und EcoRI verdaut war, und das resultierende Plasmid pLN40 wurde in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. pLN40/MG1363 wurde am 22. Dezember 1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 8858 hinterlegt.
  • G. Schlussfolgerungen
  • Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines neuen Promotorsondenvektors für Lactococcus und vermutlich andere Milchsäurebakterien. Dieser Vektor hat mehrere Vorteile gegenüber zuvor beschriebenen Vektoren. Er basiert auf dem Citratplasmid-Replicon der biovar diacetylactis von Lactococcus lactis subsp. lactis, einem theta-replizierenden Plasmid, und ist so stabiler. Das gewählte Reportergen unterliegt nicht der posttranskriptionalen Kontrolle, somit können die Enzymniveaus ohne Anwesenheit von Induktoren gemessen werden. Das steht im Gegensatz zu Plasmiden, die auf dem cat-86-Gen basieren, wo Chloramphenicol tatsächlich die Translation der mRNA (Alexieva et al., 1988) aktiviert. Enzymtest und Plattentests für das Reportergen sind einfach und in den meisten Laboratorien Standardverfahren.
  • BEISPIEL 7
  • Messungen der β-Galactosidaseexpression in PFC-1-Integranten, die in flüssigem Medium unter kontrollierten Bedingungen gezüchtet wurden
  • PFC-1-Clone von Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 (LTV1-Integranten), wie sie in Beispiel 4 definiert sind, werden üblicherweise mit P139- bezeichnet, gefolgt von einer Indikationsnummer, z. B. P139-170. Im Folgenden jedoch werden die PFC-1-Integranten nur mit ihrer Nummer benannt, z. B. 170. In diese Untersuchung schlossen wir auch den LTV1-Integranten in Lactococcus lactis ssp. lactis MG1614 ein, der in Beispiel 5 mit der Bezeichnung H25A erwähnt ist. Dieser Integrant wird jedoch im Folgenden als SB bezeichnet.
  • Die folgenden Experimente wurden mit dem Ziel der Untersuchung der Abhängigkeit der lacZ-Expression der beiden Integranten 170 und SB vom pH-Wert durchgeführt.
  • Von dem Integranten 170 wurde gezeigt, dass er vom Typ 1A ist, während der Integrant SB offensichtlich nicht zu diesem Typ gehörte. Beide Integranten sind vom Typ 2S, was bedeutet, dass die Expression von β-Galactosidase auf GM17-Platten nicht durch 2% NaCl beeinflusst wird.
  • Vier Fermenter, von denen jeder 1 Liter G1.5M17-Medium enthielt, d. h. 1,5 × M17-Brühe (Sigma Chemical Co.), die 0,5% Glucose enthielt und mit 1 mg/ml Erythromycin ergänzt war, wurden bei 30°C zum Laufen gebracht. Es wurde ohne aktive Luft-/O2-Zufuhr fortwährend mit 150 UpM gerührt. Es wurden je 2 Fermenter unter Verwendung von 5 M Salzsäure und 5 M Natronlauge bei einem pH-Wert von 5,2 bzw. 7,0 zum Laufen gebracht. Einer der zwei Fermenter wurde mit einer 1%-igen Übernachtkultur des Integranten SB inokuliert und der andere wurde mit einer 1%-igen Übernachtkultur des Integranten 170 inokuliert.
  • Die Fermentation wurde 45 Std. laufen gelassen und das Wachstum wurde durch Messung der OD600 verfolgt. Bei ausgesuchten OD600-Werten und Zeitpunkten wurde die β-Galactosidaseaktivität wie folgt gemessen: Teilmengen von 10 ml von jedem Fermenter wurden bei 10.000 × g 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Z-Puffer (Miller, 1972) resuspendiert und es wurden 0,4 ml der Bakteriensuspension und 0,1 ml Z-Puffer mit 12,5 μl 0,1%-igem SDS und 25 μl CHCl3 10 Sekunden mit einem Vortex-Mischgerät gemischt. Die mit dem Vortex-Mischgerät gemischte Suspension wurde 5 Minuten in ein Wasserbad von 30°C gestellt und es wurden 100 μl einer Lösung zugegeben, die 4 mg/ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) in A-Medium (Miller, 1972) enthielt. Die Suspension wurde 2 Sekunden mit einem Vortex-Mischgerät gemischt und in ein Wasserbad von 30°C gestellt.
  • Die Zeit bei der Zugabe von ONPG wurde notiert und dann wieder, wenn die Enzymreaktion durch die Zugabe von 250 μl 1 M Na2CO3 gestoppt wurde, gefolgt von Mischen mit einem Vortex-Mischgerät und Stellen der Suspension auf Eis. Nach zehn Minuten Zentrifugation bei bei 10.000 × g bei 4°C wurden OD420 und OD550 des Überstands gemessen. Wenn die OD550-Werte 0,050 überschritten, wurde die Suspension erneut zentrifugiert und OD420 und OD550 dieses Überstands gemessen. Die β-Galactosidaseaktivität wurde unter Verwendung der fogenden Formel bestimmt:
    Figure 00520001
  • In 9 sind die OD600 und die β-Galactosidaseaktivität gegen die Zeit für den Integranten 170 bei pH-Wert 5,2 und pH-Wert 7,0 gezeigt. In 10 sind die entsprechenden Daten für den Integranten SB gezeigt. Durch die Daten in diesen beiden Figuren wird klar gezeigt, dass die Expression von β-Galactosidase der Integranten 170 und SB durch den pH-Wert gegensätzlich geregelt werden. Der Integrant 170 stellt bei pH-Wert 7,0 die β-Galactosidaseexpression ab. Bei beiden Integranten wird die β-Galactosidaseexpression auch durch die Wachstumsphase beeinflusst. Dieses Experiment schließt nicht aus, dass die Konzentration von Arginin in dem Medium auch eine regulatorische Wirkung auf die β-Galactosidaseexpression in den beiden untersuchten Integranten haben kann.
  • BEISPIEL 8
  • Clonierung von DNA-Fragmenten, die einen Milchsäurebakterienpromotor enthalten und Bewertung der Promotoraktivität in Lactococcus lactis
  • A. Clonierung von EcoRI-Fragmenten, die Lactococcus lactis-DNA und das ColE1-Replicon von Tn917-LTV1-Integranten enthalten, in E. coli.
  • Chromosomale EcoRI-Fragmente, die Lactococcus-DNA, lacZ, cat, bla und das ColE1-Replicon enthalten, wurden gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren aus den Tn917-LTV1-Integranten hergestellt, die nachstehend in Tabelle 5 aufgelistet sind. Die Fragmente wurden anschließend religiert und mit der bei Maniatis 1982 beschriebenen Transformation in E. coli DH5α eingebracht.
  • Die resultierenden Tn917-LTV1-Integrantenfragmentplasmide wurden als p[Integrant Nr], z. B. p86, p143 und pSB bezeichnet. Alle Tn917-LTV1-Integranten, aus denen die Fragmente isoliert wurden, sind in Lactococcus lactis MG1363, außer SB, das Tn917-LTV1 in Lactococcus lactis MG1614 ist. Tabelle 5: Regulierungsparameter für die β-Galactosidaseexpression in ausgewählten Integranten. Die Parameter sind von Plattentests abgeleitet.
    Integrant Nr. Parameter
    86 Arg./pH
    143 Temp./Wachstumsrate
    159 Temp./Wachstumsrate
    162 Arg./pH
    163 Arg./pH; pO2
    170 Temp./Wachstumsrate; Arg./pH
    172 Temp./Wachstumsrate
    179 Arg./pH; NaCl/Ionenstärke
    187 Temp./Wachstumsrate
    188 Temp./Wachstumsrate
    189 NaCl/Ionenstärke
    192 Temp./Wachstumsrate; Arg./pH
    199 NaCl/Ionenstärke; Arg./pH
    201 Temp./Wachstumsrate
    202 Temp./Wachstumsrate
    222 Arg./pH
    224 Arg./pH
    241 NaCl/Ionenstärke
    242 Arg./pH
    SB Temp./Wachstumsrate; Arg./pH
  • B. Subclonierung von Tn917-LTV1-Integrantenfragmentplasmide in den Promotorselektionsvektor pGKV210.
  • pGKV210 ist ein Promotorselektionsvektor, der ein erm-Gen als einen Selektionsvektor enthält und ein promotorloses cat-86-Gen, dem ein Polylinker vorausgeht (van der Vossen et al., 1987). Das cat-86-Gen wird exprimiert, wenn ein DNA-Fragment, das einen Promotor enthält, in der richtigen Orientierung in den Polylinker inseriert wird. Das Niveau an Chloramphenicolresistenz, das auf den Wirt übertragen wird, hängt von der Stärke des Promotors ab.
  • Die Integrantenfragmentplasmide haben alle eine ClaI-Stelle, die in der DNA liegt, die vom lacZ-Teil von Tn917-LTV1 abstammt. Um die EcoRI-ClaI-Fragmente von den Fragmenten zu clonieren, wurde zunächst auf die folgende Weise eine ClaI-Stelle in den Polylinker von pGKV210 eingeführt: Der synthetische DNA-Linker
    Figure 00540001
    der eine ClaI-Stelle enthält, wurde in die einzige BamHI-Stelle von pGKV210 cloniert, wie von Maniatis, 1982, beschrieben. Das erhalten Plamid wurde als pGKV210(ClaI) bezeichnet. 50 ng von pGKV210(ClaI), die mit ClaI und EcoRI verdaut waren, wurden mit 200 ng gereinigtem ClaI-EcoRI-Fragment, wie vorstehend definiert, gemischt und ligiert. Dies wurde mit ClaI-EcoRI-Fragmenten von den folgenden Integrantenfragmentplasmiden gemacht: p143, p162, p163, p170, p172, p224, p237, p242 und pSB.
  • p162 enthält eine zusätzliche ClaI-Stelle die auf der Lactococcus-DNA liegt. Das Fragment von der EcoRI-Stelle dieses Plasmids bis zur zusätzlichen ClaI-Stelle wurde in pGKV210(ClaI) inseriert. Alle DNA-Rekombinationsarbeiten in diesem Beispiel wurden gemäß Maniatis, 1982, durchgeführt.
  • Die resultierenden pGKV210-Derivatkonstrukte wurden als pGKV210:[Integrant Nr] bezeichnet, z. B. pGKV210:143, pGKV210:162 und pGKV210:SB. Die pGKV210-Derivate wurden in gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren in E. coli MC1000 (F-, araD139(Δara-leu)7679, ga1U, galK(Δlac)X74, rpsL(Strr), thi) eingebracht. Die pGKV210-Derivate wurden wie bei Maniatis, 1982, beschrieben aus den transformierten Wirtsstämmem extrahiert. Für jedes extrahierte pGKV-Derivate wurde gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren 1 μg DNA in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Die resultierenden Transformanten (pGKV/MG1363-Derivate) wurden als pGKV210:[Integrant Nr]/MG1363 bezeichnet, z. B. pGKV210:143/MG1363.
  • Die Promotoraktivität der vorstehend clonierten Fragmente und der kürzlich publizierten pGKV210-Derivate in Lactococcus lactis IL1403 (van der Vossen et al., 1987) wurde durch Ausplattieren von Übernachtkulturen der pGKV/MG1363-Derivate auf GM17-Platten bestimmt, die mit 5 mg/l Erythromycin und steigenden Konzentrationen an Chloramphenicol ergänzt waren. Die Konzentrationen an Chloramphenicol waren 4, 6, 8, 12, 16 und 20 mg/l. 50 μl einer 104-fach verdünnten Kultur in einer 0,9%-igen wässrigen NaCl-Suspension wurden auf Platten mit 4–8 mg/l Chloramphenicol ausplattiert. 100 μl einer 104-fach verdünnten Kultur in einer 0,9%-igem NaCl wurde auf Platten ausplattiert, die 12–20 mg/l Chloramphenicol enthielten. Die Platten wurden etwa 80 Std. bei 30°C inkubiert und die maximale Konzentration an Chloramphenicol bestimmt, die noch Wachstum zuließ. Die Resultate sind nachstehend in Tabelle 6 gezeigt.
  • Nur zwei pGKV/MG1363-Derivate waren gegen mehr als 4 mg/l Chloramphenicol resistent. Bei der Interpretation der Resultate traten jedoch Schwierigkeiten auf, z. B. wegen des Auftretens von kleinen Kolonien und dieser Test scheint für Promotoren von mittlerer und geringer Stärke ungeeignet. pGKV244/IL1403 und pGKV259/IL1403 produzieren 0,2 und 5,1 Einheiten, wenn sie auf die Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivität getestet werden (van der Vossen, 1987). Tabelle 6: Maximale Chloramphenicol (Cm)-Niveaus, die das Wachstum von Stamm MG1363 zulassen, der pGKV210 und pGKV210-Derivate aufgenommen hat
    Von MG1363 aufgenommenes Plasmid Konzentration an Cm (g/ml)
    pGKV210 < 4
    pGKV244 8
    Von MG1363 aufgenommenes Plasmid Konzentration an Cm (g/ml)
    pGKV259 16
    pGKV210:143 4
    pGKV210:162 4
    pGKV210:163 < 4
    pGKV210:170 < 4
    pGKV210:172 8
    pGKV210:224 < 4
    pGKV210:237 4
    pGKV210:242 < 4
    pGKV210:SB 12
  • C. Subclonierung von Tn917-LTV1-Integrantenfragmentplasmiden in den Promotorselektionsvektor pAK80.
  • PAK80 ist ein Promotorselektionsvektor, der ein erm-Gen als Selektionsmarker enthält und ein promotorloses β-Galactosidasegen, dem ein Polylinker vorausgeht. Die Konstruktion von pAK80 ist in Beispiel 6 beschrieben.
  • Die folgenden DNA-Handhabungen und Transformationen wurden gemäß Maniatis, 1982, durchgeführt. Die vorstehend beschriebenen Integrantenfragmentplasmide wurden wegen des Fehlens geeigneter Restriktionsstellen in PAK80 zunächst in den Clonierungsvektor pGEM-7Zf(+) (Promega) subcloniert. 50 ng an pGEM-7Zf(+), der mit ClaI und EcoRI verdaut war, wurden unter Ligierungsbedingungen mit 200 ng gereinigten ClaI-EcoRI-Fragmenten gemischt, die Lactococcus-DNA von einem Integrantenfragmentplasmid enthielten. Dies wurde mit ClaI-EcoRI-Fragmenten von den folgenden Plasmiden gemacht: p143, p162, p163, p224, p242 und pSB.
  • p170 enthält eine SalI-Stelle, die in der Lactococcus-DNA liegt. Das Fragment von der ClaI-Stelle bis zu dieser SalI-Stelle wurde in den Clonierungsvektor pBluescript II KS (Stratagene) inseriert, der mit ClaI und SalI verdaut war. Dieses Konstrukt wurde als pBluescript:170 bezeichnet. Die extrahierte Plasmid-DNA aus dieser Konstruktion wurde mit XhoI und ClaI verdaut und mit pGEM-7Zf(+) ligiert, das mit XhoI und ClaI verdaut war. Die pGEM-7Zf(+)-Konstruktionen wurden als pGEM:[Integrant Nr] bezeichnet, z. B. pGEM:143 und pGEM:170 und allgemein als pGEM-Derivate bezeichnet. Die pGEM-Derivate wurden wie in Beispiel 5 beschrieben in den E. coli-Stamm DH5α eingebracht. Die DH5α-Transformanten wurden als pGEM/DH5α-Derivate bezeichnet.
  • Die Plasmid-DNA aus den pGEM/DH5α-Derivaten wurde extrahiert, mit XhoI und BamHI verdaut und mit pAK80 ligiert, das mit XhoI und BamHI verdaut war. Die resultierenden Konstruktionen wurden als pAK80:[Integrant Nr] bezeichnet, z. B. pAK80:143 und pAK80:170 und allgemein als pAK80-Derivate bezeichnet. Die pAK80-Derivate wurden wie in Beispiel 5 beschrieben in E. coli MC1000 eingebracht. Die MC1000-Transformanten wurden als pAK80/MC1000-Derivate bezeichnet. Die pAK80-Derivate wurden aus den pAK80/MC1000-Derivaten extrahiert. Von jedem extrahierten pAK80-Derivat wurde wie in Beispiel 5 beschrieben 1 μg DNA in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Die resultierenden Transformanten wurden als pAK80:[Integrant Nr]/MG1363 bezeichnet, z. B pAK80:143/MG1363 und pAK80:170/MG1363 und allgemein als pAK80/MG1363-Derivate bezeichnet.
  • Die Promotoraktivität der clonierten Fragmente wurde durch Durchführung von β-Galactosidasetests bei Übernachtkulturen der pAK80/MG1363-Derivate bestimmt, die in GI.5M17-Medium gezüchtet wurden. 1 ml Kultur wurden 10 Min. bei 10.000 × g zentrifigiert. Das Pellet wurde in 500 μl Z-Puffer (Miller, 1972) resuspendiert. 100 μl Zellsuspension wurden 10 Sekunden mit 400 μl Z-Puffer, 12,5 μl 0,15-igem SDS und 25 μl CHCl3 in einem Vortex-Mischgerät gemischt. Nach dem Mischen mit dem Vortex-Mischgerät wurde die Suspension wie in Beispiel 7 beschrieben behandelt. Die Resultate sind in Tabelle 7 gezeigt, Tabelle 7: β-Galactosidaseaktivität von Stamm MG1363, der pAK80 und pAK80-Derivate aufgenommen hat.
    Von MG1363 aufgenommenes Plasmid β-Galactosidaseaktivität (Miller-Einheiten)
    pAK80 1
    pAK80:SB 820
    pAK80:143 240
    pAK80:162 80
    pAK80:163 1
    pAK80:170 30
    pAK80:224 1
    pAK80:242 1
  • Die vorstehenden Resultate zeigen klar, dass der Promotorselektionsvektor pAK80 in der Lage ist, sogar zwischen schwachen Promotoren zu unterscheiden, da pAK80:163/MG1363, pAK80:170/MG1363, pAK80:224/MG1363 und pAK80:242:MG1363 ohne Promotoraktivität zu sein scheinen, wenn sie auf Resistenz gegen Chloramphenicol getestet werden, wenn sie aber auf β-Galactosidaseaktivität getestet werden, ist offensichtlich, dass pAK80:170/MG1363, im Gegensatz zu den drei anderen pAK80/MG1363-Derivaten, Promotoraktivität hat.
  • Die folgenden pAK80/MG1363-Derivate: pAK80:SB/MG1363, pAK80:143:MG1363, pAK80:162/MG1363, pAK80:163/MG1363 und pAK80:170/MG1363 wurden am 27. August 1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter den Hinterlegungsnummern DSM 8495, DSM 8497, DSM 8498, DSM 8499 und DSM 8500 hinterlegt.
  • Die ClaI-EcoRI-Fragmente von p172 und p215, die die Lactococcus-DNA enthielten, wurden in pGEM-7Zf(+) cloniert. Die pGEM-7Zf(+)-Konstruktionen wurden wie vorstehend in diesem Beispiel beschrieben bezeichnet.
  • Die pGEM-7Zf(+)-Konstruktionen wurden mit BamHI und XhoI verdaut und mit pAK80 ligiert, das auch mit BamHI und XhoI verdaut war. Die Details der Clonierungsexperimente waren wie vorstehend beschrieben. pGEM:172 wurde mit XhoI und BamHI verdaut. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht und das resultierende Plasmid pAK80:172 wurde in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. pAK80:172/MG1363 ist blau auf GM17, das X-Gal enthält, was die Anwesenheit eines Promotors auf dem ClaI-EcoRI-Fragment von p172 von 4,5 kb zeigt.
  • Das Lactococcus-DNA-Segment von pGEM:215 enthält eine interne BamHI-Stelle. Das distale BamHI-XhoI-Fragment von pGEM:215 wurde mit pAK80 ligiert, das mit BamHI und XhoI verdaut war und das Lactococcus-BamHI-BamHI-Fragment wurde mit pAK80 ligiert, das mit BamHI verdaut war. Jedes Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht. Die resultierenden Plasmide wurden als pAK80:215A und pAK80:215B bezeichnet. Die korrekte Orientierung des BamHI-Fragments in pAK80:215B wurde durch die Analyse der Restriktionskarte bestätigt. Eine folgende Einbringung von pAK80:215A und pAK80:215B in Lactococcus lactis offenbarte, dass keines der Plasmide einen Promotor enthielt. Dieses Resultat legt nahe, dass ein potentieller Promotor auf den ClaI-EcoRI-Fragmenten von p215 während der Clonierung der beiden Subfragmente inaktiviert worden war oder dass der Promotor, der für die Expression von β-Galactosidase in dem Integranten 215 verantwortlich ist, stromaufwärts der EcoRI-Stelle liegt.
  • Die Messungen an Übernachtkulturen von Lactococcus lactis MG1363, das die Plasmide pAK80:SB, pAK80:143, pAK80:162, pAK80:170 und pAK80:172 enthält, werden nachstehend in Beispiel 13 beschrieben. In Beispiel 13 werden die Plasmide jedoch als pSMA332, pSMA337, pSMA338, pSMA339 und pSMA345 bezeichnet.
  • BEISPIEL 9
  • Charakterisierung eines Lactococcus lactis-Promotors, der durch externe Purinverbindungen reguliert wird.
  • Die de novo-Synthese von Purinnucleotiden aus kleinen Vorläufern benötigt im Allgemeinen 10 enzymatische Reaktionen, die zu Inosinmonophosphat (IMP) führen. IMP wird bei der Synthese von AMP und GMP verwendet. Die Purinbasen und -nucleoside, die intrazellulär oder von exogenen Quellen stammen, werden über „Rettungswege” in Nucleotide umgewandelt, von denen gezeigt wurde, dass sie bei verschiedenen Organismen unterschiedlich sind (für einen Überblick vgl. Nygaard 1983). Anders als beschrieben (Nilsson und Lauridsen, 1992) ist praktisch nichts über den Purinmetabolismus in dem anaeroben gramnegativen Bakterium Lactococcus lactis bekannt.
  • Die Medien, die für das Wachstum von Milchsäurebakterien verwendet werden, können Purinverbindungen enthalten. Solche Medien unterdrücken die Synthese von Enzymen, die bei der Bildung von Purinnucleotiden verwendet werden. Wenn die Molkereien die Kulturen in die purinfreie Milch inokulieren, wird diese Unterdrückung beseitigt. Dieses Regulierungsmuster der Synthese von Enzymen, das bei dem de novo-Purinsyntheseweg verwendet wird, kann kommerziell verwendet werden. Es kann mehrere Gene geben, die Enzyme codieren, von denen es wünschenswert ist, dass sie in Milch hoch exprimiert sind, die aber bei der Herstellung von Molkereistarterkulturen unerwünscht sind, die solche Gene primär wegen ihrer das Wachstum inhibierenden Wirkung umfassen, die durch die hohe Expression verursacht sind. Daher wurde ein durch Purin regulierter Promotor in Lactococcus lactis gesucht und der Promotorbereich wurde isoliert, von dem die Expression von purD initiiert wird. Das purD-Gen codiert ein Enzym des de novo-Purinsynthesewegs.
  • Bakterienstämme und Wachstumsmedien
  • Der Stamm MG1363 von Lactococcus lactis wurde in M17-Medium (Oxoid) oder in definiertem Medium, DN-Medium, gezüchtet. Dieses Medium setzt sich wie folgt zusammen (pro Liter): 100 ml 10%-iger Salzpuffer mit der folgenden Zusammensetzung: 10 g (NH4)2SO4, 33,2 g Na2HPO4·2H2O, 15 g KH2PO4, 5 g NaCl, 10 g Na-Acetat·2H2O, Ionenaustauscherwasser bis 500 ml; 900 ml an Basismedium, das 10 ml 1,0 M MgCl2, 1,0 ml 0,5 M CaCl2, 1,5 ml 0,01 M FeCl3, Ionenaustauscherwasser bis 4500 ml, 15 g Agar pro Liter enthält; 25 ml 20%-ige Kohlenstoffquelle; 25 ml 20%-ige Casaminosäuren (Difco); 10 ml Vitaminlösung und 10 ml 0,8%-ige Asparaginlösung.
  • Als Kohlenstoffquelle wurde bei M17-Medium und DN-Medium Glucose verwendet. Für Lactococcus lactis verwendete Antibiotika: Erythromycin, 1 mg/l. Wenn nötig wurden Purinverbindungen als Ergänzung pro l zugegeben: 15 mg Adenin und Hypoxanthin; 30 mg Guanosin.
  • DNA-Manipulation
  • Plasmid-DNA von Lactococcus lactis wurde gemäß Johansen und Kibenich (1992) isoliert. Lactococcus lactis wurde mittels Elektroporation, wie von Holo und Nes (1989) empfohlen, transformiert. Die Verwendung des Lactococcus lactis-Promotorsondenplasmids pKA80 ist in Beispiel 6 beschrieben.
  • Resultate
  • Ein DNA-Fragment von 846 bp (14) enthält den gesamten purD-Promotorbereich ebenso wie einen benachbarten Promotor, der die Transkription in die entgegengesetzte Richtung initiiert. Dieser Bereich wurde mit dem Reportergen (das β-Galactosidase codiert) in dem Promotorsondenplasmid pAK80 fusioniert, was pLN71 (purD-Promotorexpression) und pLN72 (Promotorexpression in der entgegengesetzten Richtung) ergab. Die Transformation von pLN71 in den Stamm MG1363 von Lactococcus lactis gibt uns die Möglichkeit, die Expression des Reportergens zu messen, die von dem purD-Promotor initiiert wurde. Die Resultate sind in Tabelle 8 gezeigt.
  • Das Plasmid pLN71 im Stamm MG1363 von Lactococcus lactis wurde am 22. Dezember 1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 8859 hinterlegt. Tabelle 8: Expression von β-Galactosidase in pLN71
    Stamm Akt.a in DN-Medium Akt.b in DN-Medium + A, Hx, GRc
    MG1363/pLN71 310 5
    MG1363/pLN72 23 6
    MG1363/pAK80 < 2 < 2
    • a Die Zellen wurden exponentiell bei 30°C in DN-Medium gezüchtet, das Purine enthielt, geerntet, gewaschen und in purinfreiem DN-Medium resuspendiert und weiterhin 1,5 Stunden inkubiert. Die β-Galactosidaseaktivität, die von den jeweiligen Promotor exprimiert wurde, wurde gemessen.
    • b Die Zellen wurden exponentiell in definiertem Medium gezüchtet, das Purine enthielt. Die β-Galactosidaseaktivität, die von den jeweiligen Promotor exprimiert wurde, wurde gemessen.
    • c A, Adenin; Hx, Hypoxanthin; GR, Guanosin
  • Diese Resultate zeigen, dass die Expression des Reportergens, das β-Galactosidase codiert, durch Purinverbindungen in den Medien reguliert wird und dass die Differenz in diesem Experiment bis zu 60-fach ist.
  • BEISPIEL 10
  • Messung der Expression des β-Galactosidasegens in pSMA344/MG-1363, gezüchtet in flüssigem Medium unter kontrollierten Bedingungen.
  • Das Plasmid pSMA344 besteht aus dem EcoRI-ClaI-Fragment von p170 von 9,7 kb (vgl. Beispiel 8), inseriert in den Promotorclonierungsvektor pAK80. Im Integranten 170 wurde von der Expression des inserierten β-Galactosidasegens gezeigt, dass sie vom pH-Wert und der Wachstumsphase reguliert wird (Beispiel 7). Das folgende Experiment wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob das clonierte DNA-Fragment Sequenzen enthält, die für die vom pH-Wert regulierte Expression von stromabwärts liegenden Genen notwendig sind.
  • Lactococcus lactis MG1363, der das Plamid pSMA344 aufgenommen hat, wurden in zwei Fermentern gezüchtet, von denen jeder 1 Liter Medium enthielt. Die Fermenter wurden durch automatische Zugabe von 5 M Natronlauge und 5 M Salzsäure bei einem pH-Wert von 7,0 bzw. 5,2 zum Laufen gebracht. Alle anderen Parameter (Zusammensetzung des Mediums, Größe des Inokulums, Rührrate, Temperatur usw.) waren wie in Beispiel 7 beschrieben. Die Fermentationen wurden 45 Stunden durchgeführt und das Wachstum wurde durch Messen der OD600 in Kulturproben verfolgt. Die Probennahme und die Ernte von Kulturteilmengen ebenso wie die Messung der β-Galactosidaseaktivität wurden wie in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, außer dass das entnommene Kulturvolumen und das Volumen der Zellsuspension, das zu dem Test zugegeben wurde, gemäß der Zelldichte und der erwarteten β-Galactosidaseaktivität variierten. Die 15 zeigt die OD600 und die β-Galactosidaseaktivität gegen die Zeit während der Fermentation. Von den Resultaten ist klar, dass die Expression von dem Promotor, der von pSMA344 aufgenommen wurde, auf dieselbe Weise kontrolliert wird wie die in Integrant 170 beobachtete. In der Kultur, die bei pH-Wert 7,0 gezüchtet wurde, war die β-Galactosidaseaktivität pro OD600 während der Fermentation weniger als 1,0 Miller-Einheiten, außer bei der ersten Probe, wo man erwartet, dass eine gewisse Aktivität von der Präkultur verbleibt. In der Kultur, die bei pH-Wert 5,2 gezüchtet wurde, nahm die β-Galactosidaseaktivität pro OD600 während der logarithmischen Wachstumsphase zu und nahm während der ersten 14–20 Stunden der stationären Phase fortwährend zu. Sowohl die induzierten als auch die unterdrückten Niveaus waren 5 bis 10 mal höher als die Werte, die bei Integrant 170 unter denselben Kulturbedingungen erhalten wurden. Dies wurde erwartet, da das Gen, das von dem Plasmid getragen wird, in hoher Kopienzahl vorhanden ist und da die beiden β-Galactosidaseenzyme, die das lacZ-Gen (in Tn917-LTV1) und die lacL-lacM-Gene (in pAK80) codieren, verschiedene spezifische Aktivitäten haben können.
  • BEISPIEL 11
  • Messung der β-Galactosidaseaktivität in ausgewählten PFC-1-Integranten, die in flüssigem Medium mit einem standardisierten Verfahren gezüchtet wurden
  • Wie in Beispiel 5 beschrieben, wurde bei einer Reihe von Integranten gefunden, dass sie eine regulierte Expression von β-Galactosidase haben, wenn sie auf Platten unter variierenden Bedingungen und Mediumzusammensetzungen gezüchtet wurden.
  • Die nachstehend beschriebenen Experimente wurden durchgeführt, um die Regulierung der Expression des β-Galactosidasegens in 25 ausgewählten Integranten zu analysieren, die übernacht in flüssiger Kultur gezüchtet wurden. Die analysierten Regulierungsparameter umfassten den pH-Wert und/oder der Argininkonzentration, die Natriumchloridkonzentration und die Wachstumstemperatur.
  • Wachstumsmedien und Methoden
  • Die Medien, die für die flüssigen Kulturen verwendet wurden, sind in der nachstehenden Tabelle aufgelistet. Das Grundmedium für alle Experimente war 1,5 × M17-Brühe (Oxoid, Unipath Ltd., UK), das 1 mg/l Erythromycin enthielt. Tabelle 9: Medien, die für die flüssigen Kulturen von Integranten verwendet wurden
    Medium Zusammensetzung Endgültiger pH-Wert der Kultur
    G1.5M17 1,5 × M17-Brühe, enthaltend 0,5% Glucose und 1 mg/ml Erythromycin 5,5–5,8
    ArgG1.5M17 1,5 × M17-Brühe, enthaltend 0,1% Glucose, 0,1% L-Arginin und 1 mg/ml Erythromycin 6,6–6,8
    5ArgG1.5M17 1,5 × M17-Brühe, enthaltend 0,1% Glucose, 0,5% L-Arginin und 1 mg/ml Erythromycin 7,7–7,8
    G1,5M17-NaCl G1,5M17, enthaltend 1% NaCl 5,5–5,6
    G1,5M17-2NaCl G1,5M17, enthaltend 2% NaCl 5,4–5,5
  • Alle Kulturen wurden bei 30°C inkubiert, außer in dem Experiment zur Untersuchung der Wirkung der Temperatur auf die Expression von β-Galactosidase, wo ein Satz an Kulturen bei 15°C inkubiert wurde. Im letzteren Fall wurde die Inkubation verlängert, um die niedrigere Wachstumrate auszugleichen.
  • Um bei allen Kulturen einheitliche Ausgangsbedingungen sicherzustellen, wurden 5–10 ml Präkultur von jedem Integranten in flüssigem G1.5M17 mit einer einzelnen Kolonie von GM17-Agar (siehe nachstehend Beispiel 15) inokuliert und durch 12–18 Stunden Inkubation bei 30°C bis zur stationären Phase gezüchtet. Von den Präkulturen wurden 10 μl von jedem Stamm in 10 ml von jedem Medium inokuliert und die Kulturen wurden 20 Stunden bei 30°C oder 165 Stunden bei 15°C inkubiert. Unmittelbar vor der Ernte wurde von jeder Kultur eine Probe für die Messung der OD600 entnommen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10 Minuten bei 10.000 × g, 4°C) geerntet und einmal in 1 ml eiskaltem 0,15 M NaCl gewaschen. In dem Überstand des Mediums wurde der pH-Wert gemessen. Im Falle der doppelten Kulturen, die bei verschiedenen Temperaturen gezüchtet wurden und wo die Kulturen an verschiedenen Tagen geerntet wurden, wurden die Zellpellets bei –20°C eingefroren und später für den β-Galactosidaseaktivitätstest aufgetaut. Die Zellen wurden in 1,0 ml Z-Puffer (Miller, 1972) resuspendiert und alle Zellsuspensionen wurden anschließend für Tests der β-Galactosidaseaktivität verwendet, wie beschrieben in Beispiel 7, außer dass die Verhältnisse zwischen Zellsuspension und Z-Puffer, die in den Tests verwendet wurden, entsprechend der Enzymaktivität angepasst wurden, um die Reaktionsrate in vernünftigen Grenzen zu halten.
  • Resultate von β-Galactosidasetests bei ausgewählten Integranten, die in flüssiger Kultur gezüchtet wurden
  • Die Aktivität, die in demselben Stamm an verschiedenen Tagen gefunden wurde, variierte in gewissem Ausmaß. Bei zehn unabhängigen G1.5M17-Kulturen des Integranten SB waren die gemessenen Aktivitäten zwischen 3,9 und 8,0 mit einem Mittelwert von 6,3 und einer Standardabweichung von 1,4. Fünf unabhängige Kulturen von 170 in demselben Medium ergaben Resultate zwischen 0,9 und 2,8 mit einem Mittelwert von 1,7 und einer Standardabweichung von 0,7. Die beobachteten Abweichungen können durch einen gewissen Einfluss von nicht bemerkten Unterschieden zwischen den Mediumchargen auf die Genexpression oder die Enzymstabilität verursacht sein. Bei jedem der Fälle war jedoch der Unterschied zwischen den Aktivitäten bei hohem und niedrigem pH-Wert offensichtlich signifikant (Tabelle 10). Aktivitäten unterhalb von 0,1 wurden bei dem verwendeten Verfahren nicht akkurat bestimmt.
  • Die Tabelle 10 zeigt die β-Galactosidaseaktivitäten, die in den Kulturen von 17 verschiedenen integranten Stämmen in Medien mit und ohne Arginin gemessen wurden. Die meisten der Integranten, die eine vom pH-Wert und/oder von Arginin regulierte β-Galactosidaseexpression zeigten, waren durch Plattentests identifiziert worden. Bei den Integranten 237, 241 und SB war bei der Betrachtung der Platten eine solche Kontrolle der Expression nicht klar beobachtet worden. Ein möglicher Grund ist, dass es oberhalb eines gewissen Aktivitätsniveaus schwierig ist, mit dem Plattentest zwischen verschiedenen Aktivitäten zu unterscheiden. Tabelle 10: Expression von β-Galactosidase, die von Arginin und/oder vom pH-Wert des Mediums kontrolliert wird, als Aktivität in Zellen von flüssigen Kulturen von PFC-1-Integranten, die 20 Stunden bei 30°C von einem 1:1000-Inokulum gezüchtet wurden
    Integrant Nr. G1.5M17 (End-pH-Wert 5,6–5,8) ArgG1.5M17 (End-pH-Wert 6,6–6,8) 5ArgG1.5M17 (End-pH-Wert 7,7–7,8)
    86 0,8 18
    142 1 2–3 2,7
    159 1 3
    162 18 50 140
    163 8,5 0,3
    168 0,3 0,6
    170 1,7 0,05 0,08
    179 4 1
    193 7 18
    203 0,7 0,2
    222 9 5
    224 0,4 0,6 5
    229 2,0 ≤ 0,1
    237 7 15
    241 2 5
    242 2 0,01
    SB 6 18 36
  • Eine Leerstelle bedeutet, dass diese spezielle Kombination von Stamm und Medium nicht getestet wurde.
  • Zehn Stämme, bei denen die β-Galactosidaseaktivität während des Wachstums auf GM17-Agarplatten mit der Temperatur variierte, wurden in doppelten Kulturen in G1,5M17 bei 30°C und bei 15°C bis zur stationären Phase gezüchtet. Die in den Zellen gemessene Aktivitäten sind in Tabelle 11 gezeigt. Tabelle 11: Temperaturabhängigkeit der β-Galactosidaseaktivität, die in ausgewählten PFC-1-Integranten exprimiert wurde, die in flüssigem Medium gezüchtet wurden, gemessen nach 20 Stunden Wachstum bei 30°C und nach 165 Stunden bei 15°C in G1.5M17 von 1:1000-Inokulaten
    Integrant NR. 30°C, 20 Std. 15°C, 165 Std.
    143 0,8 1,5
    159 0,6 1,4
    170 1,8 11
    172 1,4 0,9
    187 1,3 1,0
    188 1,3 0,9
    192 0,14 1,7
    201 1,0 0,8
    SB 3,9 8,5
  • Die Integranten 170 und 192 zeigten die Regulation der Expression des β-Galactosidasegens, wie sie auch auf der Platte gefunden wurde, wobei beide bei der niedrigen Temperatur eine höhere Aktivität ergaben. Für die Integranten SB, 143 und 159 war die Wirkung der Temperatur auf die Expression des β-Galactosidasegens gegensätzlich zu der, die von den Resultaten der Plattentests erwartet wurde, und für die Integranten 172, 187, 188 und 201 war die Wirkung schwächer als erwartet. Es muss in Betracht gezogen werden, dass die Zellen von den flüssigen Kulturen in der stationären Phase geerntet wurden, während die β-Galactosidaseaktivität, die in den Plattentests nachgewiesen wurde, von der Wachstumphase und der stationären Phase akkumuliert wird.
  • Die Plattentests der PFC-1-Integranten hatten entweder eine sich vermindernde Expression des β-Galactosidasegens oder keine Veränderung als Reaktion auf die Zugabe von NaCl zu dem Wachstumsmedium offenbart. Die Resultate der Aktivitätsmessung in Kulturen, die in flüssigem Medium gezüchtet wurden, das 1% oder 2% NaCl enthielt, sind in der Tabelle 12 gezeigt. Für die Integranten 179, 199, 230 und 241 wurde von den Plattentests erwartet, dass NaCl die β-Galactosidaseaktivität reduzieren würde. Mehrere Integranten, die bei den Plattentests keinen Einfluss von NaCl auf die β-Galactosidaseaktivität gezeigt hatten, wurden in diese Experimente eingeschlossen, und die Resultate von dreien davon, nämlich 224, 229 und SB, sind auch in der Tabelle dargestellt.
  • Bei allen getesteten Stämmen hatten die Aktivitäten in Medien, die NaCl enthielten, um einen Faktor von 3–30 abgenommen, und offensichtlich war bei SB die stärkste Wirkung auf die Aktivität. Wie früher erwähnt, war der endgültige pH-Wert der Kulturen in den Medien, die NaCl enthielten, leicht niedriger als in den Kulturen, die ohne zusätzliches NaCl gezüchtet wurden. Dieses Differenz im pH-Wert ist jedoch vielleicht nicht groß genug, um die eindeutige Wirkung auf die Genexpression bei SB zu erklären, noch ist sie geeignet, um die Ähnlichkeit der Wirkung bei allen getesteten Stämmen zu erklären. Es werden mehr kontrollierte Experimente benötigt, um den offensichtlichen Widerspruch zwischen den Resultaten der Plattentests und den Aktivitäten, die in flüssigen Übernachtkulturen gemessen wurden, aufzuklären. Tabelle 12: Wirkung von NaCl im Medium auf die β-Galactosidaseaktivität in Kulturen von ausgewählten PFC-1-Integranten, die 20 Stunden bei 30°C von einem 1:1000-Inokulum gezüchtet wurden. Eine Leerstelle bedeutet, dass diese spezielle Kombination von Stamm und Medium nicht getestet wurde.
    Integrant Nr. G1.5M17 (End-pH-Wert 5,6–5,7) G1.5M17-NaCl (End-pH-Wert 5,5) G1.5M17-2 NaCl (End-pH-Wert 5,4)
    179 3 2 0,7 0,4 0,09
    199 0,12 0,04 0,02
    230 0,15 0,3 0,1 0,01 0,01
    241 2 0,3
    224 0,5 0,04
    229 2 0,14
    SB 6 0,6 0,3
  • Die folgenden Integranten (Wirtsorganismus: Lactococcus lactis MG1363): SB, P139-86, P139-142, P139-143, P139-159, P139-162, P139-163, P139-168, P139-172, P139-179, P139-187, P139-188, P139-192, P139-193, P139-199, P139-201, P139-203, P139-222, P139-224, P139-229, P139-230, P139-237, P139-241 und P139-242 wurden am 22. Dezember 1993 bei der DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Deutschland unter den Hinterlegungsnummern DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856 und DSM 8857 hinterlegt.
  • BEISPIEL 12
  • Sequenzierung chromosomaler DNA von Lactococcus lactis stromaufwärts und stromabwärts von Tn917-Inserierungen in ausgewählten Tn917-LTV1-Promotorfusionsintegranten.
  • Die chromosomale Sequenz von etwa 200 bp bis 1500 bp stromaufwärts der Tn917-Inserierung wurde bei sechs ausgewählten Tn917-LTV1-Lactococcus lactis-Promotorfusionsintegranten bestimmt. Bei einem der ausgewählten Integranten wurde auch die Sequenz stromabwärts der Inserierung des Transposons bestimmt. Die Sequenzierung wurde durchgeführt, um Beispiele von Stellen und Bereichen auf dem Chromosom von Lactococcus lactis darzustellen, die eine regulierte Expression von einem inserierten promotorlosen Gen/inserierten promotorlosen Genen zeigen. Die Sequenzierung wurde bei beiden Strängen durchgeführt, im Wesentlichen wie im Handbuch für den Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing-Kit von USB, Cleveland, Ohio, USA, dargestellt, unter Verwendung der integranten Fragmentplasmide (vgl. Beispiel 8) pSB, p170, p143, p242, p224 und p163 als Matrizen und den nachstehend beschriebenen Primern. Wir definierten Lactococcus-DNA, die in der Nähe des lacZ benachbarten Endes von Tn917-LTV1 liegt, stromaufwärts von der Inserierung des Transposons zu sein. Unabhängig vom erwähnten Strang heißt die Entfernung weg vom lacZ-Ende die Bewegung stromaufwärts auf der Lactococcus-DNA. Die Strategie für die Sequenzierung stromaufwärts auf jeder Matrize war wie folgt:
    • 1. Die erste Sequenzreaktion wurde unter Verwendung des Primers pp1 durchgeführt (5' GTTAAATGTACAAAATAACAGCG 3') (DNA Technology, Århus, Dänemark). pp1 ist homolog zu einer Sequenz in dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1. Wenn das erste bp stromaufwärts von Tn917-LTV1 als Nr. 1 bezeichnet wird, liegt die komplementäre Sequenz zu pp1 bei bp Nr. -58 bis Nr. -80. Die erhaltene Sequenz, als pp1-Sequenz bezeichnet, bestand aus etwa 20 bp des lacZ benachbarten Endes von Tn917-LTV1, gefolgt von 200 bis 300 bp der benachbarten, stromaufwärts liegenden Lactococcus lactis-DNA-Sequenz.
    • 2. Basierend auf der pp1-Sequenz wurde der Primer p1 synthetisiert (DNA Technology). p1 ist homolog mit einer Sequenz von 20 bis 24 bp, die etwa 60 bp vom 3'-Ende der pp1-Sequenz liegt. Die zweite Sequenzreaktion wurde unter Verwendung des Primers p1 durchgeführt. Die erhaltene Sequenz, als p1-Sequenz bezeichent, war eine Überlappung von etwa 20 bp des 3'-Endes der pp1-Sequenz und erstreckte sich 200 bis 300 bp weiter stromaufwärts auf der Lactococcus lactis-DNA.
    • 3. Basierend auf der p1-Sequenz wurden zwei Primer, p2 und p1r, synthetisiert (DNA Technology). p2 ist homolog mit einer Sequenz von 20 bis 24 bp, die etwa 60 bp vom 3'-Ende der p1-Sequenz liegt und p1r ist homolog mit der komplementären Lactococcus lactis-DNA-Sequenz, die etwa 250 bp stromaufwärts der Inserierung des Transposons liegt. Die dritte und vierte Sequenzreaktion wurde unter Verwendung der Primer p2 und p1r durchgeführt. Unter Verwendung des Primers p2 war die erhaltene Sequenz, die als p2-Sequenz bezeichnet wurde, eine Überlappung von etwa 20 bp des 3'-Endes der p1-Sequenz und 200 bis 300 bp weiter stromaufwärts auf der Lactococcus lactis-DNA. Unter Verwendung des Primers p1r war die erhaltene Sequenz, die als p1r-Sequenz bezeichnet wurde, komplementär zur pp1-Sequenz.
    • 4. Zusätzliche Sequenzreaktionen wurden unter Verwendung der Primer p3, p4 usw. durchgeführt, wobei jeder Primer homolog zu einer Sequenz war, die etwa 300 bp stromaufwärts des zuvor verwendeten Primers lag. Es wurden auch unter Verwendung der Primer p2r, p3r usw., von denen jeder homolog zu einer Sequenz war, die etwa 300 bp stromaufwärts des zuvor verwendeten Primers lag, Sequenzreaktion durchgeführt.
    • 5. Clonierung der Sequenz, die stromabwärts von der Tn917-LTV1-Inserierung im Integranten SB liegt: Wenn das Tn917-Derivat Tn917-LTV1 für die Transposon-Mutagenese verwendet wird, kann die DNA, die stromaufwärts vom Inserierungspunkt liegt, leicht in E. coli cloniert werden, wie in Beispiel 5 beschrieben. Dieses Clonierungsverfahren kann jedoch nicht für die Clonierung von DNA verwendet werden, die stromabwärts von der Tn917-LTV1-Inserierung liegt. Unter Verwendung der Strategie der Inversen Polymerase-Kettenreaktion (Ochman et al. 1988) wurde jedoch die DNA, die stromabwärts des Transposons im Integranten SB liegt, auf die folgende Weise amplifiziert und in E. coli cloniert: 60 ng an chromosomaler DNA von Lactococcus lactis MG1614 wurden vollständig mit EcoRI verdaut. Die verdaute DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit NaAc und EtOH ausgefällt. Die DNA wurde anschließend in einem Gesamtvolumen von 20 μl ligiert. Die verdünnte Konzentration favorisiert die Bildung von monomeren Ringen. Von diesem Ligierungsgemisch wurde eine Probe von 5 μl entnommen und in einem Gesamtvolumen von 100 μl wurde eine PCR-Amplifikation durchgeführt. Die beiden Primer
      Figure 00720001
      wurden für die PCR-Amplifikation verwendet. Es wurde ein GeneAmp DNA Amplification Reagent Kit von Perkin Elmer Cetus, 761 Main Ave., Norwalk, CT 06859, verwendet. Die Konzentration des Reaktionspuffers, der dNTPs und der Taq-Polymerase waren wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben. Die Endkonzentration der Primer in dem Reaktionsgemisch war 10 ng/μl. Das folgende Temperaturprofil wurde verwendet: 1 Min. Denaturierung bei 94°C; 1 Min. Anlagerung bei 53°C; 2 Min. Verlängerung bei 72°C. Die Gesamtzahl an PCR-Zyklen war 40.
  • Wenn 10 μl PCR-Reraktionsprodukt auf einem Agarosegel analysiert wurden, wurde eine spezifische Bande von etwa 1400 bp beobachtet, was die Clonierung von etwa 1100 bp stromabwärts von der Tn917-Inserierung im Integranten SB anzeigt.
  • Das Fragment von 1400 bp von der PCR-Reaktion wurde mit dem pT7Blue(R)-Vektor (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) unter Standardligierungsbedingungen ligiert, wie sie bei Maniatis et al. 1982, beschrieben sind. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid wurde als pSBC1 bezeichnet.
  • Die anschließenden Sequenzreaktionen wurden unter Verwendung derselben Strategie durchgeführt, wie sie vorstehend in den Paragraphen 2, 3 und 4 erwähnt ist.
  • Im Folgenden sind die DNA-Sequenzen stromaufwärts von der Tn917-LTV1-Inserierung im Integranten SB, 170, 143, 242, 224 und 163 gezeigt [(i)–(vi)]. Für den Integranten SB ist auch eine DNA-Sequenz stromabwärts der Tn917-LTV1-Inserierung im Integranten SB angegeben. Die Stelle der Inserierung des Transposons und die Orientierung von Tn917-LTV1 ist durch [lacZ-- Tn917-LTV1-] gezeigt, das in die Sequenzen inseriert ist.
  • (i) Die DNA-Sequenz von 117 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 und eine DNA-Sequenz von 1.083 Nucleotiden stromabwärts von dem lacZ entfernten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten SB.
  • Ein mutmaßlicher Transkriptionsterminator ist mit kleingeschriebenen Buchstaben angezeigt und die -35- und -10-Consensus-Sequenzen des Promotors, PSB ist unterstrichen.
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
  • (ii) Die DNA-Sequenz von 1.430 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten 143.
    Figure 00750001
  • (iii) Die DNA-Sequenz von 994 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten 163.
    Figure 00760001
  • (iv) Die DNA-Sequenz von 1.120 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten 170.
    Figure 00770001
  • (v) Die DNA-Sequenz von 480 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten 224.
    Figure 00780001
  • (vi) Die DNA-Sequenz von 853 Nucleotiden stromaufwärts von dem lacZ benachbarten Ende von Tn917-LTV1 im Integranten 242.
    Figure 00790001
  • BEISPIEL 13
  • Kartierung des Promotors P170 auf dem EcoRI-ClaI-DNA-Fragment von 9,7 kb von p170
  • Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Lage des vom pH-Wert/von der Wachstumsphase regulierten Promotors P170 auf dem ClaI-EcoRI-DNA-Fragment von 9,7 kb von p170 zu kartieren.
  • Das ClaI-EcoRI-DNA-Fragment von 9,7 kb von p170 wurde in Subfragmente gespalten und es wurde eine Restriktionskarte erstellt (vgl. 16). Geeignete Subfragmente wurden anschließend in den Promotorsondenvektor pAK80 cloniert. Es war jedoch erforderlich, auf den Subfragmenten und pAK80 kompatible Restriktionsstellen zu schaffen.
  • (i) Konstruktion von pSMA344
  • Die Clonierung des großen ClaI-EcoRI-DNA-Fragments von 9,7 kb von p170 in pGEM-7Zf(+) wurde durch Verdau von p170 mit ClaI und EcoRI durchgeführt, gefolgt von Ligierung des Fragments von 9,7 kb mit pGEM-7Zf(+), das mit ClaI und EcoRI verdaut war. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht und das resultierende Plasmid wurde als pSMA212 bezeichnet. pSMA212 wurde mit XhoI und BamHI verdaut und mit pAK80 ligiert, das ebenfalls mit XhoI und BamHI verdaut war. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid pSMA344 wurde anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht.
  • (ii) Konstruktion und Clonierung von Deletionsderivaten des ClaI-EcoRI-DNA-Fragments von 9,7 kb von p170.
  • Das Plasmid pSMA342 wurde auf die folgende Weise konstruiert: pSMA212 wurde mit ClaI und NdeI verdaut und die überstehenden Enden wurden, wie bei Maniatis et al. 1982, beschrieben unter Verwendung von Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das große Fragment von 8,7 kb [3 kb von pGEM-7Zf(+) und 5,7 kb vom Lactococcus-Chromosom] wurde gereinigt, religiert und in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid pSMA213 wurde mit XhoI und BamHI verdaut und das gereinigte Fragment von 5,7 kb wurde mit pAK80 ligiert, das auch mit XhoI und BamHI verdaut war. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht und das resultierende Plasmid pSMA342 wurde anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht.
  • Das Plasmid pSMA343 wurde auf die folgende Weise konstruiert: pSMA212 wurde mit ClaI und SalI verdaut und die überstehenden Enden wurden mit Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das Fragment von 6,2 kb [3 kb von pGEM-7Zf(+) und 3,2 kb vom Lactococcus-Chromosom] wurde gereinigt, religiert und in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid pSMA214 wurde mit XhoI und BamHI verdaut und das Lactococcus-Fragment von 3,2 kb wurde mit pAK80 ligiert, das auch mit XhoI und BamHI verdaut war. Das resultierende Plasmid pSMA343 wurde in E. coli DH5α und anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht.
  • Das Plasmid pAK80:170 (DSM 8500), wie es in Beispiel 8 beschrieben wird, wird im Folgenden als pSMA339 bezeichnet.
  • Das Plasmid pSMA340 wurde auf die folgende Weise konstruiert: Die Clonierung des ClaI-SalI-Lactococcus-Fragments von 6,5 kb von p170 in den Clonierungsvektor pBluescript II KS ist in Beispiel 8 beschrieben. Dieses Konstrukt, das in Beispiel 8 als pBluescript:170 bezeichnet wird, wird im Folgenden als pSMA201 bezeichnet. pSMA201 wird mit NdeI und SalI verdaut und mit Klenow-Polymerase behandelt, um die überstehenden Enden aufzufüllen. Das große Fragment von 7 kb [3 kb von pGEM-7Zf(+) und 4 kb vom Lactococcus-Chromosom] wurde gereinigt, religiert und in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid wurde als pSMA202 bezeichnet.
  • pSMA202 wurde mit XhoI und BamHI verdaut und das Lactococcus-Fragment von 4 kb wurde gereinigt und mit pAK80 ligiert, das auch mit XhoI und BamHI verdaut war. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht und das resultierende Plasmid, pSMA340, wurde anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht.
  • pSMA341 wurde auf die folgende Weise konstruiert: pSMA202 wurde mit NdeI und EcoRI verdaut und mit Klenow-Polymerase behandelt, um die überstehenden Enden aufzufüllen. Das große Fragment von 5,5 kb [3 kb von pGEM-7Zf(+) und 2,5 kb vom Lactococcus-Chromosom] wurde gereinigt, religiert und in E. coli DH5α eingebracht. Das resultierende Plasmid pSMA208 wurde mit XhoI und BamHI verdaut und das Lactococcus-Fragment von 2,5 kb wurde mit pAK80 ligiert, das auch mit XhoI und BamHI verdaut war. Das resultierende Plasmid pSMA341 wurde in E. coli DH5α und anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht.
  • (iii) Bewertung der Promotoraktivität auf den Subfragmenten des Fragments von 9,7 kb von p170 in Lactococcus lactis.
  • Ein Plattentest für die Bestimmung der Promotoraktivität der clonierten Lactococcus-Fragmente wurde durch Ausplattieren von Übernachtkulturen von Lactococcus lactis, das die Plasmide pSMA339, pSMA340, pSMA341 pSMA342, pSMA343 und pSMA344 enthielt, auf GM17-Medium durchgeführt, das mit 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal ergänzt war. Überraschenderweise erschienen alle Kulturen blau auf diesen Platten, was die Existenz mindestens eines funktionelle Promotors auf allen Plasmiden zeigte. Von diesen Resultaten ist offensichtlich, dass innerhalb des Fragments von 9,7 kb von p170 mindestens drei Promotoren liegen.
  • Die MG1363-Stämme von Lactococcus lactis, die pSMA339, pSMA340, pSMA341 pSMA342, pSMA343 und pSMA344 enthielten, wurden auf GM17-Platten und auf ArgM17-Platten ausgestrichen. Beide Arten von Platten enthielten 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal. Das Ausplattieren wurde vorgenommen, um den vom pH-Wert regulierten Promotor/die vom pH-Wert regulierten Promotoren unter diesen drei Promotoren zu identifizieren. Basierend auf diesen Tests wurde bei der β-Galactosidaseexpression, die sich bei pSMA339, pSMA340 und pSMA344 ergab, gefunden, dass sie vom pH-Wert/von Arginin reguliert wird. Die β-Galactosidaseexpression, die sich bei pSMA342 ergab, wurde schwach vom pH-Wert/von Arginin reguliert, während die Expression bei pSMA341 und pSMA343 unabhängig von diesen Faktoren war.
  • Die Resultate zeigen, dass der Promotor, der auf dem ClaI-NdeI-Fragment von 4 kb liegt, das benachbart zum β-Galactosidasereportergen ist, vom pH-Wert reguliert wird. Dieser Promotor wird im Folgenden als P170 bezeichnet. Das Plasmid pSMA342, das das Lactococcus-Fragment von 5,7 kb enthält, das sich von der NdeI-Stelle zur EcoRI-Stelle erstreckt, enthält höchstwahrscheinlich zwei Promotoren, von denen der eine, der benachbart zum Reportergen liegt, auch vom pH-Wert reguliert zu sein scheint. Diese Regulierung scheint jedoch abhängig zu sein von dem EcoRI-SalI-Fragment von 3,2 kb, das stromaufwärts liegt. Dieser Schluss basiert auf der Beobachtung, dass der Promotor, der von pSMA341 aufgenommen wurde, dem das EcoRI-SalI-Fragment von 3,2 kb fehlt, nicht vom pH-Wert/von Arginin reguliert wird.
  • Die Messungen der β-Galactosidaseexpression in Übernachtkulturen vom Stamm MG1363, der pSMA339, pSMA340, pSMA341 pSMA342, pSMA343 und pSMA344 enthielt, wurden wie in Beispiel 7 beschrieben durchgeführt. Alle Kulturen wurden in GM17-Medium und in ArgM17-Medium gezüchtet. Beide Medien waren ergänzt mit 1 μg/ml Em. Als eine Kontrolle der regulierten β-Galactosidaseexpression wurde der Integrant 170 in dem Experiment eingeschlossen. Die Resultate sind in Tabelle 13 gezeigt: Tabelle 13: β-Galactosidaseexpression in Deletionsderivaten des ClaI-EcoRI-Fragments von 9,7 kb von p170
    Miller-Einheiten in GM17 (End-pH-Wert 5,6–5,8) Miller-Einheiten in ArgM17 (End-pH-Wert 6,6–6,8) Miller-Einheiten in GM17 vs ArgM17
    Integrant 170 1,7 0,1 17
    L. lactis MG1363, enthaltend Plasmid
    pSMA339 15 1 15
    pSMA340 16 1 15
    pSMA341 7 7 1,0
    pSMA342 2,1 1,5 1,4
    pSMA343 22 8 2,8
    pSMA344 14 1 14
  • Lactococcus lactis, das PSMA339, PSMA340 oder PSMA344 enthielt, zeigt dieselbe regulierte Expression von β-Galactosidase wie Integrant 170. Dies zeigt, dass der Promotor P170 auch reguliert ist, wenn er auf einem Multikopie-Plasmid wie pAK80 liegt. Im Gegensatz dazu zeigt der Promotor, der auf pSMA342 liegt, keine regulierte Expression. Der Promotor, der auf pSMA343 liegt, wird vom pH-Wert oder Arginin reguliert. Dieses Regulierung wurde beim Plattentest nicht nachgewiesen. Dies könnte auf dem Unterschied des Wachstums auf Platten und in flüssigem Medium beruhen. Die Regulierung, die bei dem Promotor beobachtet wurde, der auf pSMA343 liegt, ist nicht so eng wie die Regulierung von P170.
  • Feinkartierung des Promotors P170, der auf dem ClaI-NdeI-Fragment von 4 kb auf p170 liegt.
  • Vor der Feinkartierung von P170, der auf dem ClaI-NdeI-Fragment von 4 kb auf p170 liegt, wurde eine detailliertere Restriktionskarte des ClaI-NdeI-Fragments von 4 kb hergestellt (17).
  • Das ClaI-NdeI-Lactococcus-Fragment von 4 kb von p170 wird von pSMA202 aufgenommen. pSMA202 enthält drei HindIII-Stellen, von denen zwei innerhalb der Lactococcus-DNA liegen und eine im Bereich des Polylinkers. Die Inserierung des HindIII-Fragments von 1,3 kb, das sich von der HindIII-Stelle im Polylinker zu der HindIII-Stelle in der Lactococcus-DNA erstreckte, in pAK80 resultierte in dem Plasmid pSMA357. Die Inserierung in pSMA357 enthielt keine Promotoraktivität, wenn sie in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht wurde.
  • Das HindIII-Fragment von 2,3 kb auf dem ClaI-NdeI-Fragment von 4 kb wurde in pAK80 cloniert, das mit HindIII verdaut war. Das resultierende Plasmid pSMA348 wurde in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Von diesem Plasmid wurde β-Galactosidase exprimiert, was die Existenz eines funktionellen Promotors innerhalb dieses HindIII-Fragments zeigt. Ein HincII-Fragment von 1,5 kb wurde in die SmaI-Stelle von pAK80 inseriert und das resultierende Plasmid pSMA358 wurde in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Von pSMA358 wurde β-Galactosidase exprimiert. Das HincII-Fragment von 1,5 kb überdeckt das meiste von dem HindIII-Fragment von 1,3 kb und hat eine Überlappung von 400 bp mit dem benachbarten HindIII-Fragment von 2,3 kb. Basierend auf den Bewertungen der Promotoraktivität bei den Inserierungen in den Plasmiden pSMA348, pSMA357 und pSMA358 wurde der Promotor P170 auf dem HincII-HindIII-Fragment von 400 bp kartiert, das etwa 1,3 kb stromaufwärts der Tn917-LTV1-Inserierung im Integranten 170 liegt.
  • (iv) Kartierung des Promotors PSB.
  • Von der Sequenzierung der stromaufwärts gelegenen DNA auf SB wurde innerhalb eines HpaI-ClaI-Fragments von 190 bp ein Consensus-Promotor identifiziert [vgl. Beispiel 12 (i)]. pSB wurde mit HpaI und ClaI verdaut und das Fragment wurde mit pNZ336 (Simons et al. 1990) ligiert, das mit HpaI und ClaI verdaut war. Das resultierende Plasmid pNZ336:SB wurde mit SalI und BamHI verdaut. Das Fragment von 190 bp wurde mit pAK80 ligiert, das mit XhoI und BamHI verdaut war. Das Ligierungsgemisch wurde in E. coli DH5α eingebracht und das resultierende Plasmid pSMA347 wurde anschließend in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Der Stamm MG1363/pSMA347 exprimiert β-Galactosidase, was die Existenz eines funktionellen Promotors in dem Fragment von 190 bp zeigt.
  • (v) Messungen bei induzierten und nicht-induzierten Übernachtkulturen von Lactococcus lactis MG1363, das einen Promotor enthaltende pKA80-Derivate enthält.
  • In Tabelle 14 sind die β-Galactosidaseaktivitäten bei Übernachtkulturen angegeben, die unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen gezüchtet wurden. Die verschiedenen Wachstumsbedingungen sind Temperaturvariationen und Variationen des pH-Werts/der Argininkonzentration im Wachstumsmedium. Die analysierten Stämme umfassen sowohl pKA80-Derivate, die EcoRI-ClaI-Fragmente von den Rettungsplasmiden enthielten, und, basierend auf der vorstehenden Kartierungsanalyse, pKA80-Derivate, die Deletionen der EcoRI-ClaI-Fragmente enthielten. Das Wachstum der Kulturen ebenso wie der β-Galactosidasetest wurden wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt. Bei diesem Beispiel wird 5Arg1.5M17 als 5ArgM17 bezeichnet. Tabelle 14a: β-Galactosidaseaktivitäten in Übernachtkulturen, die unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen gezüchtet wurden. Die Expression wird durch Arginin und/oder den pH-Wert des Mediums kontrolliert (30°C). MEDIUM
    L. Lactis, enthaltend Plasmid GM17 ArgM17 5ArgM17
    (End-pH-Wert 5,6–5,8) (End-pH-Wert 6,6–6,8) (End-pH-Wert 7,7–7,8)
    pSMA332 680 560
    pSMA347 720 620
    Integrant SB: 6 18
    pSMA338 70 100 260
    Integrant 162 18 51 140
    pSMA339 15 1 0,4
    pSMA340 16 1 0,7
    pSMA344 14 1 0,5
    Integrant 170 1,7 0,05 0,08
    Tabelle 14b: β-Galactosidaseaktivitäten in Übernachtkulturen, die unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen gezüchtet wurden. Die Expression wird durch die Temperatur kontrolliert (G1,5M17-Medium)
    PLASMID 30°C, 20 Std. 15°C, 165 Std.
    pSMA337 190 35
    Integrant 143 0,8 1,5
    pSMA339 27 67
    pSMA344 21 75
    Integrant 170 1,7 14
    pSMA347 650 120
    Integrant SB 6 18
    pSMA345 36 1,4
    Integrant 172 1,4 0,9
  • Die Resultate zeigen, dass der Promotor von pSB nicht durch den pH-Wert reguliert ist, wenn er von pAK80 aufgenommen wird. Dieses Resultat sieht man bei pSMA332 und pSMA347. Die Temperaturregulierung des Promotors von pSB ist umgekehrt, wenn er auf pAK80 liegt. Der Promotor von p162 ist noch reguliert, wenn er auf pAK80 liegt. Die Gesamtexpression an β-Galactosidase von dem Promotor, der durch das Plasmid aufgenommen wurde, ist jedoch nicht so hoch, wie von der hohen Kopienzahl von pAK80 erwartet. Die Regulierung durch den pH-Wert von p170 ist vorstehend beschrieben. Die Temperaturregulierung von p170 ist konserviert, wenn auch in geringerem Ausmaße, wenn er auf pAK80 liegt. Der Promotor von p143 ist reguliert, wenn er auf pAK80 liegt. Diese Regulierung ist jedoch entgegengesetzt zu der Regulierung, die bei der Lage auf dem Chromosom beobachtet wird. Die Stärke des Promotors auf p143 erhöht sich dramatisch, wenn er auf einem Plasmid liegt. Die Expression an β-Galactosidase von dem Promotor auf p172 wird leicht von der Temperatur beeinflusst, wenn er auf dem Chromosom liegt. Diese Regulierung wird viel ausgeprägter, wenn der Promotor auf einem Plasmid liegt.
  • Die Resultate zeigen klar, dass die Regulierung eines chromosomalen Promotors im Allgemeinen von der Lage abhängig ist, d. h. ob er auf dem Chromosom oder mit vielen Kopien extrachromosomal liegt. Es ist anzunehmen, dass wenn eine herkömmliche Promotorclonierungsstrategie, einschließlich „Shotgun”-Clonierung in einen Promotorclonierungsvektor, angewendet worden wäre, die Resultate bezüglich der Regulierung in den meisten Fällen ziemlich unterschiedlich von denjenigen gewesen wären, die unter Verwendung der vorstehenden Strategie erhalten wurden, die Untersuchungen über eine direkte Regulierung über auf dem Chromosom gelegen Promotoren einschlossen.
  • BEISPIEL 14
  • Die Konstruktion eines Vektors pSMA500, der nicht in Lactococcus lactis repliziert
  • Es wurde für mehrere Mikroorganismen einschließlich Lactococcus gezeigt, dass sich ein nicht replizierender Vektor in das Chromosom integrieren kann, wenn der Vektor homologe DNA trägt (Leenhouts et al. 1989). Der benutzte Integrationsmechanismus ist ein einfaches „cross-over”-Ereignis (Campbell-ähnliche Integration) zwischen der homologen DNA, die in dem Vektor und in dem Chromosom enthalten ist. Das Ergebnis dieser Campbell-ähnlichen Integration ist ein doppelter Satz an homologer DNA auf dem Chromosom und zwischen dem doppelten Satz an homologer DNA liegt der nicht-replizierende Vektor.
  • Im Gegensatz zu der Inserierung von Tn917 resultiert diese Campbell-ähnliche Integration in einer nicht zerstörenden Inserierung, wenn ein geeigneter integrierbarer Vektor verwendet wird.
  • Ein nicht-replizierender Vektor pSMA500 wurde basierend auf dem E. coli-Plasmid pVA891 (Macrina et al. 1983) konstruiert, das einen Erythromycin-Resistenzmarker trägt und als Reportergen die promotorlosen β-Galactosidasegene, die von Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris abgeleitet sind.
  • Der Polylinker und die promotorlosen β-Galactosidasegene vom Plasmid pAK80 wurden in das Plasmid pVA891 cloniert, das nicht in der Lage ist, in Milchsäurebakterien zu replizieren. pAK80 wurde mit HindIII und SalI verdaut. Das Fragment von 4,1 kb, das den Polylinker und die β-Galactosidasegene enthielt, wurde gereinigt und mit pVA891 ligiert, das ebenfalls mit HindIII und SalI verdaut war. Dieses Ligierungsgemisch wurde unter Selektion auf Erythromycinresistenz (Emr) (250 μg/ml) in E. coli MC1000 eingebracht. Das resultierende Plasmid wurde als pSMA500 bezeichnet. Dieser Vektor ist zur Replikation in Milchsäurebakterien nicht in der Lage. Wenn jedoch das Plasmid in das bakterielle Chromosom inseriert wird, wird das Erythromycin-Resistenzgen in den meisten Milchsäurebakterien exprimiert. Wenn ein funktioneller Promotor in den Polylinker von pSMA500 cloniert wird, wird das Wirtsbakterium zusätzlich die β-Galactosidasegene exprimieren.
  • BEISPIEL 15
  • Inserierung eines regulierten Promotors in pSMA500 und Integration in das Lactococcus-Chromosom.
  • (i) Inserierung von Promotoren in pSMA500
  • Die Regulierung des Promotors von p170 und pSB wurde in Beispiel 8 beschrieben. Im vorliegenden Beispiel wird Lactococcus-DNA von p170, die den regulierten Promotor P170 enthält, in pSMA500 inseriert und dieses Konstrukt anschließend in das Chromosom von Lactococcus lactis MG1363 integriert. Parallel dazu wurde Lactococcus-DNA von pSB, die den regulierten Promotor PSB enthält, in pSMA500 inseriert und dieses Konstrukt anschließend in das Chromosom von Lactococcus lactis MG1614 integriert.
  • Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob ein regulierbarer Promotor und das β-Galactosidasegen, die über eine Campbell-ähnliche Integration in das Chromosom integriert waren, noch die regulierte Expression von β-Galactosidase zeigen würden.
  • (ii) Konstruktion der integrierbaren Vektoren pSMA501 und pSMA502.
  • pSMA212, wie beschrieben in Beispiel 13, enthält ein XhoI-BamHI-Fragment von 9,7 kb. Dieses Fragment ist im Wesentlichen dasselbe wie das Lactococcus-DNA-Segment von p170, das den regulierten Promotor P170 aufgenommen hat. Das Fragment von 9,7 kb von pSMA212 wurde in pSMA500 cloniert, das ebenfalls mit XhoI und BamHI verdaut war. Das resultierende Plasmid pSMA501 wurde in E. coli MC1000 eingebracht und Transformanten auf Emr (250 μg/ml) selektiert.
  • Parallel dazu wurde das XhoI-BamHI-Lactococcus-DNA-Fragment von 1,8 kb von pGEM:SB (vgl. Beispiel 8), das den regulierten Promotor PSB aufgenommen hat, in pSMA500 cloniert. Das resultierende Plasmid pSMA502 wurde in E. coli MC1000 eingebracht und Transformanten auf Emr (250 μg/ml) selektiert. Standard-DNA-Manipulationen und Transformationen waren gemäß Maniatis et al. 1982.
  • (iii) Integration von pSMA501 und pSMA502 in das Chromosom von Lactococcus.
  • Etwa 2 μg gemäß Qiagen (Qiagen Plasmid Kit, Diagen, Düsseldorf, Deutschland) gereinigte DNA von pSMA501 wurden in Lactococcus lactis MG1363 eingebracht. Parallel dazu wurden etwa 2 μg gemäß Qiagen gereinigte DNA von pSMA502 in Lactococcus lactis MG1614 eingebracht. Die Transformation von Lactococcus lactis war wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Transformanten wurden auf SGM17-Platten ausplattiert, die 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal enthielten. Nach 48 Stunden Züchten bei 30°C erschienen auf den beiden parallelen Sätzen von Platten nur blaue Transformanten. Diese Resultate zeigten, dass sich pSMA501 in das Chromosom des Stammes MG1363 integriert hatte und dass sich pSMA502 in das Chromosom des Stammes MG1614 integriert hatte. Die Resultate zeigten auch, dass die Promotoren auf pSMA501 und pSMA502 funktionell in das Chromosom integriert waren. Bei Verwendung der Konstruktion pSMA501 wurden etwa 5000 koloniebildende Einheiten/μg DNA erhalten und bei Verwendung von pSMA502 wurden etwa 500 CFU/μg DNA erhalten. Bei Verwendung des replizierenden Plasmids pAK80 war die Transformationseffizienz bei beiden Stämmen etwa 1 × 10EE7 CFU/μg. Die Transformation von Stamm MG1363 und von Stamm MG1614 mit pSMA500 zeigte weniger als 5 CFU/μg DNA, was klar zeigt, dass die Integration von pSMA501 und pSMA502 durch die chromosomalen Lactococcus-Inserierung in diesen Vektoren vermittelt wurde. Zehn primäre, zufällig genommene Transformanten von jedem parallelen Satz an Platten wurden auf GM17-Platten ausgestrichen, die 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal enthielten. Alle Kolonien, die nach dem Ausstreichen erschienen, waren homogen und blau. Extraktionen von Plasmid-DNA von Transformanten offenbarten keine nachweisbare extrachromosomale Plasmid-DNA in der Bakterienzelle. Dies deutet stark darauf hin, dass die Plasmide pSMA501 und pSMA502 in das Chromosom der Empfängerstämme integriert worden waren. In der 18 ist die Campbell-ähnliche Integration der nicht-replizierenden Plasmide dargestellt.
  • Um die Stabilität der integrierten Plasmide zu untersuchen, wurden beide Arten von Integranten für etwa 20 Generationen in der Abwesenheit von Em-Selektion gezüchtet. Geeignete Verdünnungen der resultierenden Kultur wurden auf GM17-Platten mit X-Gal ausplattiert und anschließend auf selektiven Platten repliziert, GM17 + X-Gal + 1 μg/ml Em. Bei diesem Plattentest wurde kein Verlust der β-Galactosidaseaktivität und der Em-Resistenz beobachtet.
  • (iv) Analyse der regulierten β-Galactosidaseexpression bei Lactococcus-Stämmen, die in ihrem Chromosom integrierbare Vektoren aufgenommen hatten.
  • Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um zu analysieren, ob die Expression von β-Galactosidase beim Stamm MG1363, der in das Chromosom integriert pSMA501 aufgenommen hat (Stamm MG1363::pSMA501) und beim Stamm MG1614, der in das Chromosom integriert pSMA502 aufgenommen hat (Stamm MG1614::pSMA502), reguliert ist.
  • Sechs zufällig entnommene Re-Isolate des Stamms MG1363::pSMA501 wurden auf GM17-Platten (1,2 × M17-Agar und 0,5% Glucose) und auf ArgM17- Platten (1,2 × M17-Agar, 0,1% Glucose und 0,1% Arginin) ausgestrichen. Beide Arten von Platten enthielten 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal. Die Isolate Nr. 6, 9, 10, 14 und 21 waren auf den GM17-Platten alle blau und auf den ArgM17-Platten weiß. Dieses Resultat zeigt, dass die β-Galactosidaseexpression in diesen Isolaten, wie bei Integrant 170 (vgl. Beispiel 7), noch auf eine vom pH-Wert abhängige Weise reguliert wird. Isolat Nr. 3 war blau auf den GM17-Platten und hellblau auf den ArgM17-Platten. Das höhere Niveau an β-Galactosidaseexpression dieses Isolats bei beiden Arten von Platten ist möglicherweise eine Konsequenz der Integration mehrerer Kopien des integrierbaren Vektors in das Chromosom oder eine Amplifikation der nicht tandemartig wiederholten chrosomalen DNA-Sequenz.
  • Acht zufällig entnommene Re-Isolate des Stamms MG1614::pSMA502 wurden auf GM17-Platten und auf ArgM17-Platten ausgestrichen. Beide Arten von Platten enthielten 1 μg/ml Em und 160 μg/ml X-Gal. Alle Isolate vom Stamm MG1614::pSMA502, d. h. die Isolate Nr. 7, 8, 10, 13, 14, 17, 18 und 22 waren blau auf den GM17-Platten und etwas blauer auf den ArgM17-Platten. Dieses Resultat zeigt zumindest ein gewisses Niveau an vom pH-Wert abhängiger β-Galactosidaseexpression im Stamm MG1614::pSMA502 an. Es war jedoch bei diesem Plattentest nicht möglich, die Niveaus an β-Galactosidaseexpression und damit die Enge der Regulierung im Stamm MG1614::pSMA502 und im Integranten SB zu vergleichen.
  • Bei den Beispielen 7 und 11 wurden die Medien, die aus 1,5 × M17, ergänzt mit 0,5% Glucose, und aus 1,5 × M17, ergänzt mit 0,1% Glucose und 0,1% Arginin bestehen, als G1.5M17 und Arg1.5M17 bezeichnet. Im Folgenden werden diese Medien als GM17 und ArgM17 bezeichnet.
  • Die Aktivität von β-Galactosidase wurde in Kulturen gemessen, die 17–18 Std. bei 30°C in GM17-Medium (nach dem Züchten pH-Wert 5,6) und in ArgM17-Medium (nach dem Züchten pH-Wert 6,7) gezüchtet wurden. Das GM17-Medium und das ArgM17-Medium enthielten 1 μg/ml Erythromycin. Drei Re-Isolate vom Stamm MG1363::pSMA501 und zwei Re-Isolate vom Stamm MG1614::pSMA502 wurden auf ihre β-Galactosidaseaktivität getestet. Als eine Kontrolle der regulierten β-Galactosidaseexpression wurden die Integranten 170 und SB in das Experiment mit aufgenommen. Die Resultate sind in nachstehend in den Tabellen 15a und 15b gezeigt: Tabelle 15a: β-Galactosidaseaktivität von MG1363::pSMA501
    Stamm Miller-Einheiten in GM17-Medium Miller-Einheiten in ArgM17-Medium Verhältnis von Miller-Einheiten in GM17 vs ArgM17
    Integrant 170 1,9 0,1 19
    MG1363::pSMA501 Isolat Nr. 3 23,0 1,2 19
    MG1363::pSMA501 Isolat Nr. 6 7,0 0,3 23
    MG1363::pSMA501 Isolat Nr. 21 2,6 0,2 13
    Tabelle 15b: β-Galactosidaseaktivität von MG1614::pSMA502
    Stamm Miller-Einheiten in GM17-Medium Miller-Einheiten in ArgM17-Medium Verhältnis von Miller-Einheiten in ArgM17 vs GM17
    Integrant SB 6,4 20,0 3,1
    MG1614::pSMA502 Isolat Nr. 8 77,0 120,0 1,6
    MG1614::pSMA502 Isolat Nr. 14 64,0 99,0 1,5
  • Es ist klar gezeigt, dass die Expression des β-Galactosidasegens bei allen drei Isolaten von Stamm MG1363::pSMA501 reguliert ist. Die Regulierung bei jedem Isolat ist ähnlich zu der Regulierung, die bei beim Integranten 170 beobachtet wird. Die Unterschiede in den Niveaus der β-Galactosidaseaktivität sind möglicherweise auf die Unterschiede bei der Kopienzahl von pSMA501 im Chromosom zurückzuführen. Es ist jedoch von den Resultaten, die in der Tabelle 15b gezeigt werden, schwierig zu entscheiden, ob es bei den beiden Isolaten von MG1614::pSMA502 eine regulierte oder eine nicht-regulierte β-Galactosidaseexpression ist.
  • BEISPIEL 16
  • Transformation von Lactobacillus helveticus mit pTV32 und pLTV1.
  • Jeder der Transpositionsvektoren pTV32 und pLTV1 wurde gemäß dem Verfahren, das von Bhowmik et al. 1993 beschrieben ist, per Elektroporation in Lactobacillus helveticus CNRZ32 eingebracht. Der Vektor pNZ18 (NIZO, BA Ede, Niederlande), der dem Wirt Resistenz gegen Cm vermittelt, wurde als Kontrolle der Transformationseffizienz ebenfalls in den Stamm CNZR32 eingebracht.
  • Nach der Elektroporation wurden die transformierten Zellen auf MRS-Agar (Oxoid) ausplattiert, das 10 mM CaCl2 und in Abhängigkeit vom für die Transformation benutzten Vektor ein Antibiotikum enthielt. Das Antibiotikum und die Konzentration, die für die Selektion der Transformanten verwendet wurden, sind nachstehend in Tabelle 16 dargestellt. Ebenfalls in Tabelle 16 sind die Resultate der Transformationen dargestellt. Eine Leerstelle in der Tabelle zeigt, dass dieses Experiment nicht durchgeführt wurde. Tabelle 16: Transformation von pTV32 und pLTV1 in Lactobacillus helveticus CNRZ 32
    Transformanten pro μg Plasmid
    pTV32 pLTV1 pNZ18 kein Plasmid
    Antibiotikum, Konzentration
    Tetracyclin, 20 μg/ml 0 0
    Chloramphenicol 10 μg/ml 0 0 0 0
    Erythromycin, 10 μg/ml 130 140 0
  • 10 pTV32-Transformanten und 10 pLTV1-Transformanten wurden auf MRS-Agar ausgestrichen, das 10 μg/ml Em enthielt. Eine re-isolierte Kolonie von jeder der 20 Transformanten wurde in MRS-Brühe (Oxoid) inokuliert, die 5 μg/ml Em enthielt und gemäß O'Sullivan et al. 1993, wurde eine Plasmidextraktion vorgenommen. Die Plasmidextraktionspräparate wurden mit EcoRI verdaut und dann einer Agarose-Gelelektrophorese-Analyse unterworfen.
  • In keiner dieser Plasmidextraktionen wurde Plasmid-DNA nachgewiesen. Von der vorstehenden Tabelle ist offensichtlich, dass bei den Transformanten, die Erythromycin-Resistenz exprimierten, 130 bzw. 140 Transformanten pro μg DNA erhalten wurden. Die einzige Schlussfolgerung, die aus der Tatsachen gezogen werden kann, dass bei keiner der getesteten Transformanten, die die Erythromycin-Resistenz exprimierten, Plasmid-DNA nachgewiesen wurde, ist, dass die in die Transformanten eingebrachte DNA in das Chromosom von Lactocobacillus helveticus integriert worden war.
  • Die vorstehenden Ergebnisse stellen einen starken Hinweis bereit, dass die vorstehenden Tn917-Derivate gemäß der Erfindung auch in Lactobacillus spp. verwendet werden können.
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Claims (10)

  1. Rekombinantes Lactococcus spp. umfassend ein Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, und funktionell verknüpft damit ein Promotor, der ausgewählt ist aus P170 und dem Promotor stromaufwärts des LacZ-proximalen Endes von Tn917-LTV1 in einem der Integranten, die als DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 oder DSM 8859 hinterlegt wurden, wobei die Anwesenheit des Promotors zu einer veränderten Expression des Gens im Vergleich zur Expression des funktionell mit seinem nativen Promotor verbundenen Gens führt.
  2. Bakterium nach Anspruch 1, wobei der Promotor ausgewählt ist aus SB, P170, P143, P242, P224 und P163.
  3. Bakterium nach Anspruch 1, wobei der Promotor P170 ist.
  4. Bakterium nach Anspruch 1, in welchem das Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein chromosomales Gen ist.
  5. Bakterium nach Anspruch 1, in welchem das Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein extrachromosomales Gen ist.
  6. Bakterium nach Anspruch 1, in welchem das Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein natives Gen ist.
  7. Bakterium nach Anspruch 1, in welchem das Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, ein heterologes Gen ist.
  8. Bakterium nach Anspruch 7, in welchem das heterologe Gen aus einem Milchsäurebakterium stammt.
  9. Bakterium nach Anspruch 1, in welchem das Gen, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, ausgewählt ist aus einem Gen, das eine Lipase codiert, einem Gen, das eine Peptidase codiert, einem Gen, das eine Protease codiert, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, welches am Kohlenhydratstoffwechsel beteiligt ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, welches am Citratstoffwechsel beteiligt ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, welches am Purinstoffwechsel beteiligt ist, einem Gen, das ein Genprodukt codiert, welches an der Resistenz gegenüber Bakteriophagen beteiligt ist, einem Gen, welches ein lytisches Enzym codiert, und einem Gen, welches ein Bacteriocin codiert.
  10. Isoliertes DNA Fragment, umfassend den regulierten Promotor, welcher in dem Lacotcoccus lactis ssp. lactis MG1363 integrierenden Clon enthalten ist, der unter einer Zugangsnummer ausgewählt aus DSM 7360, DSM 8834, DSM 8835, DSM 8836, DSM 8837, DSM 8838, DSM 8839, DSM 8840, DSM 8841, DSM 8842, DSM 8843, DSM 8844, DSM 8845, DSM 8846, DSM 8847, DSM 8848, DSM 8849, DSM 8850, DSM 8851, DSM 8852, DSM 8853, DSM 8854, DSM 8855, DSM 8856, DSM 8857, DSM 8858 und DSM 8859 hinterlegt wurde, und funktionell damit verknüpft ein Gen, welches ein gewünschtes Genprodukt codiert, wobei es sich bei dem Promotor um einen Promotor handelt, der natürlicherweise nicht mit dem Gen verbunden ist.
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