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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue DNA-Sequenzen, die durch Konjugation
transferiert werden können,
die Plasmide, die diese Sequenzen enthalten, die Bakterien, die
diese DNA-Sequenzen oder diese Plasmide enthalten, sowie die Verwendung
dieser Bakterien.
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Milchsäurebakterien
sind an der Erzeugung und der Konservierung einer großen Zahl
von Lebensmittelprodukten, wie Käse,
Butter, Yoghurt, Wurst oder Sauerkraut, beteiligt. Unter diesen
Produkten nehmen die Milchprodukte einen besonders wichtigen Platz
ein. Die Umwandlung von Milch durch Milchsäurebakterien erfolgt in immer
größeren Behältern. Das
Verständnis
der Mechanismen beim Transfer von genetischem Material ist von essentieller
Bedeutung, um die Milchsäurebakterienstämme zu verbessern,
die bei diesen Fermentationen verwendet werden. Die verschiedenen
Mechanismen zur Übertragung
von genetischem Material sind die Transformation, die Transduktion,
die Fusion von Protoplasten und die Konjugation.
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Die
Transformation besteht darin, genetisches Material durch natürliche Kompetenz,
durch Protoplastenbildung oder durch die Elektropermeation von Zellen
in ein Bakterium einzubringen.
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Die
Transduktion besteht darin, genetisches Material mit Hilfe eines
Bakteriophagen-Vektors in ein Bakterium einzuschleusen.
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Die
Fusion von Protoplasten besteht darin, die Protoplastenbildung von
zwei Zelltypen so durchzuführen,
dass nach dem Kontakt genetisches Material von dem einem Stamm in
den anderen Stamm übergeht wird.
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Die
Konjugation besteht darin, zwei Zelltypen so in Kontakt zu bringen,
dass genetisches Material mit Hilfe natürlicher konjugativer Gene von
dem einen Stamm in den anderen Stamm übergehts.
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Es
können
zwei Fälle
unterschieden werden: entweder besitzt das Plasmid alle Gene, die
an der Konjugation beteiligt sind, und das Plasmid wird selbst auf
den Rezipientenstamm übertragen,
oder das Plasmid weist nur die Genelemente auf, die für seinen
Transfer ausreichend sind, während
die anderen Elemente beispielsweise auf einem anderen Plasmid vorhanden
sind (Mobilization of the relaxable Staphylococcus aureus plasmid
pC221 by the conjugative plasmid pG01 involves three pC221 loci,
S. J. Projan und G. L. Archer, J. Bacteriol. 1989; 171; 1841–1845).
Diese letztere Situation hat einen Vorteil: wenn das Plasmid ohne
das konjugative Plasmid in einen Rezipientenstamm übertragen
wird, kann es nicht erneut transferiert werden, wodurch seine Verbreitung
verhindert wird. Diese Technik des Plasmidtransfers durch Konjugation
weist ferner den Vorteil auf, dass genetisches Material in Stämme übertragen
wird, in die die Übertragung
durch die weiter oben beschriebenen Übertragungstechniken schwierig
ist.
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Einige
Untersuchungen haben es bereits ermöglicht, Konjugationssysteme
bei Milchsäurebakterien nachzuweisen:
- – Genetic
analysis of regions of the Lactococcus lactis subsp. lactis plasmid
pRS01 involved in conjugative transfer, D. A. Mills, C. K. Choi,
G. M. Dunny und L. L. McKay, Applied and Environ. Microbiol. 1994;
60 (12): 4413–4420;
dieses Dokument offenbart die Lokalisierung von vier nicht benachbarten
Regionen des Plasmids pRS01 von Lactococcus lactis ssp. lactis ML3,
die an der konjugativen Übertragung
beteiligt sind. Die Nucleotidsequenzen dieser Regionen sind nicht
bestimmt worden und waren nicht der Gegenstand einer Isolierung;
- – Splicing
of a group II intron involved in the conjugative transfer of pRS01
in lactococci, D. A. Mills, L. L. McKay und G. M. Dunny., J. Bacteriol.
1996; 178 (12): 3531–3538.
- – Sequence
and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocinproducing plasmid
pMRC01 from Lactococcus lactis DPC3147, B. A. Dougherty, C. Hill,
J. F. Weidman, D. R. Richardson, J. C. Venter and R. P. Ross, Molecular
Microbiology 1998, Bd. 29(4): 1029–38. In diesem Dokument wird
die vollständige
Sequenz des konjugativen Plasmids pMRC01 von L. lactis ssp. lactis
DPC 3147 beschrieben. Von den drei in diesem Plasmid identifizierten
Regionen umfasst die Region, die an der konjugativen Übertragung
beteiligt ist, ein Operon, das aus 16 Genen zusammengesetzt ist,
von dem angenommen wird, dass es für die konjugativen Funktionen
des Plasmids pMRC01 verantwortlich ist.
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In
der vorliegenden Anmeldung wird eine DNA-Sequenz beschrieben, die
mindestens einen Transfermechanismus durch Konjugation umfasst;
diese DNA-Sequenz umfasst einen funktionellen Teil von 5333 bp, der
in dem Stamm Lactococcus lactis FL877 vorhanden ist, der am 30.
September 1998 bei der CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes) unter der Nummer I-2082 hinterlegt worden ist.
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Diese
DNA-Sequenz aus 5333 bp (SEQ ID N°:
1) wurde aus Plasmiden isoliert, die in dem Stamm FL877 enthalten
sind.
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Genauer
wurde das Fragment aus 5333 Basenpaaren (bp) durch einen totalen
Verdau von Plasmiden, die in dem Stamm Lactococcus lactis FL877
enthalten sind, mit Hilfe des Restriktionsenzyms EcoRI isoliert. Dieses
Fragment ist Träger
eines oder mehrerer Transferme chanismen durch Konjugation und ist
dafür geeignet,
in einen anderen Stamm übertragen
zu werden, insbesondere einen anderen Stamm von L. lactis, ausgehend
beispielsweise von dem Stamm MG1363 (GASSON M. J., J. Bacteriol.
1983; 154: 1–9).
Dieses Fragment ist ferner Träger
eines Systems einer funktionellen Replikation bei L. lactis.
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Anschließend hat
die Anmelderin aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 eine DNA-Sequenz
von 2590 bp isoliert, die alleine einem Plasmid die Eigenschaft
verleiht, durch Konjugation in einen anderen Stamm übertragen
zu werden, insbesondere ausgehend von dem Stamm MG 1363.
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Diese
Sequenz aus 2590 bp (SEQ ID NO: 2) kann durch die PCR-Methode (polymerase
chain reaction) mit Hilfe geeigneter Oligonucleotide erhalten werden.
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Nach
einem ersten Aspekt besteht ein erster Gegenstand der vorliegenden
Erfindung aus einer Nucleinsäure-Sequenz,
die durch Konjugation transferiert werden kann, die die Sequenz
SEQ ID NO: 2 oder ihren komplementären Strang enthält.
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Die
Erfindung hat vorzugsweise eine Nucleinsäure-Sequenz zum Gegenstand,
die durch Konjugation transferiert werden kann, wobei die Sequenz
ausgewählt
ist unter:
- a) der Nucleotidsequenz von 5333
bp (SEQ ID NO: 1) oder ihrem komplementären Strang;
- b) allen Sequenzen, die unter Stringenzbedingungen mit der Sequenz
a) hybridisieren.
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Die
Erfindung betrifft vor allem eine Nucleinsäure-Sequenz, die ausgewählt ist
unter:
- a) der Nucleotidsequenz von 2590 bp
(SEQ ID NO: 2) oder ihrem komplementären Strang;
- b) allen Sequenzen, die unter Stringenzbedingungen mit der Sequenz
a) hybridisieren.
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Erfindungsgemäß wird unter "Hybridisieren unter
Stringenzbedingungen" eine
Hybridisierung unter den folgenden Stringenzbedingungen verstanden:
42°C, in
einem 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6,5) mit 50% Formamid, 5 × SSC, 1 × Denhardt's, 0,1% SDS und 100 μg/ml RNA,
anschließend
Waschen bei 60°C
in einem Puffer 0,1 × SSC,
0,1% SDS.
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Die
Erfindung hat ferner die mit einer der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen transformierten
Plasmide zum Gegenstand. Bei diesen Plasmiden kann es sich beispielsweise
um das Plasmid pLDP1 (PREVOTS F. et al, FEMS Microbiol. Lett. 1996;
142: 295–299)
und das Plasmid pLAB510, das von pPF107-3 (PREVOTS F. et al. FEMS
Microbiol. Lett. 1998; 159: 331–336)
abstammt, handeln, in die nach den üblichen, dem Fachmann bekannten
Techniken eine der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
kloniert wurde.
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Die
Erfindung bezieht sich ferner auf Bakterien, insbesondere Milchsäurebakterien,
die vorzugsweise zu der Spezies Lactococcus lactis gehören, die
mindestens eine der wie weiter oben definierten DNA-Sequenzen oder mindestens
eines der wie weiter oben definierten Plasmide enthalten.
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Diese
Bakterien können
verwendet werden, um genetisches Material, an dem insbesondere ein
industrielles Interesse besteht, durch Konjugation auf einen industriell
interessanten Stamm zu übertragen.
Der Mechanismus zum Transfer durch Konjugation kann von einem Plasmid
oder einen anderen Teil des Genoms des Bakteriums getragen werden.
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Diese
Bakterien können
verwendet werden, um durch Konjugation Eigenschaften, wie die Phagenresistenz,
die Fähigkeit
zur Fermentation von Lactose, die Proteolyse, die Peptidolyse, die
Erzeugung von Bacteriocinen, und Gene, die Proteine von pharmazeutischem
Interesse codieren, auf industriell interessante Stämme zu übertragen,
insbesondere in der Milchindustrie, aber auch in der pharmazeutischen
Industrie.
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Die
industriell interessanten Stämme,
die vorteilhaft genetisches Material mit Hilfe der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
oder eines Plasmids, das diese Sequenzen enthält, aufnehmen können, werden
unter den Stämmen
L. lactis ssp lactis und L. lactis ssp cremoris ausgewählt.
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Die
Erfindung wird besser verstanden mit Hilfe der folgenden Beispiele,
die experimentelle Ergebnisse und eine Diskussion dieser Ergebnisse
umfassen. Einige dieser Beispiele betreffen Experimente, die mit
dem Ziel der Ausführung
der Erfindung durchgeführt
wurden, andere betreffen Ausführungsbeispiele
der Erfindung, die selbstverständlich
ausschließlich
zur Veranschaulichung angegeben werden.
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Ein
großer
Teil der Gesamtheit der in diesen Beispielen beschriebenen Techniken,
die dem Fachmann wohlbekannt sind, wird detailliert in dem Buch
von Sambrook, Fritsch und Maniatis: "Molecular Cloning; a laboratory manual", veröffentlicht
im Jahr 1989, herausgegeben von dem Verlag Cold Spring Harbor Press
in New York (2. Auflage), beschrieben.
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Die
folgende Beschreibung wird mit Hilfe der 1 und 2 besser
verstanden, die folgenden Inhalt haben:
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1: Subklonierung
interner Fragmente des Plasmids pLAB500.
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In
dieser Figur werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
Rep+
oder Rep–:
replizierendes (+) oder nicht replizierendes (–) Fragment in MG 1363.
Rel+
oder Rel–:
Relaxation (+) oder keine Relaxation (–) in MG 1363
Mob+ oder
Mob–:
hohe Effizienz (+) oder geringe Effizienz (–) des Transfers des Plasmids
von MG1363 auf LM2301.
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Die
Zahlen oberhalb der Sequenzen geben übrigens die Basenposition auf
dem Plasmid pLAB500 an.
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2: Kinetik
des Transfers des Plasmids pLAB500.
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Beispiel 1: Sequenz des
Fragments von 5333 bp.
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Die
PCR-Technik (polymerase chain reaction), die beispielsweise in dem
bereits zitierten Buch von Maniatis beschrieben wird, ermöglicht es,
ein DNA-Fragment zu vermehren, das zwischen 2 geeignet ausgewählten Oligonucleotiden
liegt. Diese amplifizierte DNA kann leicht mit sich selbst verknüpft werden,
wenn durch die Oligonucleotide Restriktionsstellen eingeführt werden.
So können
die Sequenzen dieser Oligonucleotide an ihrem 5'-Ende einen heterologen Teil der zu
amplifizierenden DNA aufweisen, der beispielsweise aus 10 bis 12
Basenpaaren besteht, von denen sechs Basenpaare eine Restriktionsstelle
bilden.
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Die
folgenden Oligonucleotide wurden für die Konstruktion eines Resistenzgens
gegen Erythromycin verwendet, das auf beiden Seiten von einer EcoRI-Restriktionsstelle
begrenzt wird.
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Oligonucleotid 1:
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- TACATACGCGTCTCATATATACTTTAGATTG (SEQ ID NO: 3)
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Oligonucleotid 2:
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- TACATACGCGTGACTTAGAAGCAAACTTAAG (SEQ ID NO: 4)
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Oligonucleotid 3:
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- TTAAATGATCAGAGCTCCACCGCGGTGGCGG (SEQ ID NO: 5)
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Oligonucleotid 4:
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- TATTTTGATCAGAACAAAAGCTGGGTACCGG (SEQ ID NO: 6)
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Oligonucleotid 5:
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- ATTTATGATCATTTCCAGTCGGGAAACCTGT (SEQ ID NO: 7)
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Oligonucleotid 6:
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- AATTTTGATCAAGTATACCTAATAATTTATC (SEQ ID NO: 8)
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Oligonucleotid 7:
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- TATGTGAATTCGACTTAGAAGCAAACTTAAG (SEQ ID NO: 9)
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Oligonucleotid 8:
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- TATGTGAATTCAGTATACCTAATAATTTATC (SEQ ID NO: 10)
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Mit
den Oligonucleotiden 5 und 1 war es möglich, aus dem Plasmid pRC1
(LE BOURGEOIS P. et al., Gene 1992; 111: 109–114) ein Fragment von 1,1
kb, das den Replikationsursprung enthält, durch PCR zu amplifizieren.
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Mit
den Oligonucleotiden 2 und 6 war es möglich, aus dem Plasmid pRC1
ein Fragment von 1 kb, das das Resistenzgen gegen Erythromycin enthält, durch
PCR zu amplifizieren.
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Diese
beiden Fragmente wurden mit BclI und MluI verdaut, verknüpft, anschließend dienten
sie für
die Transformation von E. coli TG1 (GIBSON T. J., Studies on the
Epstein-Barr genome, Ph. D thesis, Cambridge University, Cambridge,
UK, 1984) unter Erhalt des Plasmids pRC1int.
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Mit
den Oligonucleotiden 3 und 4 war es möglich, aus dem Plasmid pRC1
ein Fragment von 0,3 kb, das mehrere einmal vorkommende Restriktionsstellen
enthält,
durch PCR zu amplifizieren. Dieses Fragment wurde mit BclI verdaut,
dann mit dem Plasmid pRC1int verknüpft, das selbst mit BclI verdaut
war. Diese erhaltene neue Plasmid, das das Resistenzgen gegen Erythromycin,
einen funktionellen Replikationsursprung bei E. coli, nicht jedoch
bei L. lactis, und mehrere einmal vorkommende Restriktionsstellen
enthält,
erhielt die Bezeichnung pRC1N.
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Die
Oligonucleotide 7 und 8 wurden für
die Amplifikation eines Fragments von 939 bp, das das Resistenzgen
gegen Erythromycin enthält,
aus dem Plasmid pRC1N unter Anwendung der PCR verwendet. Dieses Fragment
wurde anschließend
mit EcoRI verdaut und dann mit allen Plasmiden des Stammes L. lactis
FL877, die zuvor extrahiert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI
verdaut wurden, verknüpft.
Der Stamm MG 1363 wurde mit diesem Ligationsgemisch transformiert.
Die Gesamtheit der so erhaltenen, gegen Erythromycin resistenten
Klone wurde als Donor-Stamm in einem Konjugationsexperiment verwendet
(PREVOTS F. et al., FEMS Microbiol. Lett. 1994; 117: 7–14) mit
dem Rezipientenstamm LM2301 (WALSH P. M. et al., J. Bacteriol. 1981;
146: 937–944),
der resistent gegen Streptomycin und empfindlich für Erythromycin
ist. Die Transkonjugate werden für
ihre Resistenz gegen diese beiden Antibiotika selektiert. Die Plasmide,
die durch Konjugation in diesen Stamm LM2301 übertragen wurden, wurden extrahiert
und dienten für
die Retransformation des Stammes MG1363. Das Plasmid pLAB500 von
6,3 kb wurde auf diese Weise isoliert, das sowohl in dem Stamm LM2301
wie in dem Stamm MG 1363 imstande ist, sich zu replizieren, und
das imstande ist, mit einer hohen Effizienz vom Stamm MG 1363 in
den Stamm LM2301 transferiert zu werden.
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Nach
dem Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI liefert dieses Plasmid
zwei Fragmente von 1 kb und 5,3 kb. Das erste Fragment enthält das Resistenzgen
gegen Erythromycin. Das zweite Fragment von 5333 bp wurde mit Hilfe
der Methode von Sanger et al. (PNAS – USA 1977; 14: 5463) vollständig sequenziert.
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Die
Sequenzanalyse zeigte, dass das Fragment von 5333 bp 5 vollständige offene
Leserahmen von mehr als 150 bp (1) aufweist.
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Beispiel 2: Verkleinerung
der Größe des Plasmids
pLAB500.
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Die
PCR-Technik wurde angewendet, um zu ermitteln, welche die an der
Konjugation beteiligten offenen Leserahmen sind und welche an der
Replikation des Plasmids beteiligt sind.
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Hierfür wurden
9 Oligonucleotide synthetisiert, von denen jedes eine Restriktionsstelle
EcoRI oder HindIII aufweist. Diese Oligonucleotide haben die folgende
Sequenz:
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Oligonucleotid 9:
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- TATAAGAATTCCGCTCGTGTCGTCGCACC (SEQ ID NO: 11)
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Oligonucleotid 10:
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- TATAAGAATTCCATAAATCTACTCTATGC (SEQ ID NO: 12)
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Oligonucleotid 11:
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- TATAAGAATTCGTAGATGAGATTTTAAAGC (SEQ ID NO: 13)
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Oligonucleotid 12:
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- TATTAGAATTCTATTTAGGGGTATGTAAC (SEQ ID NO: 14)
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Oligonucleotid 13:
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- TATTAGAATTCCGTGATTTCTTTAGTGCTGTC (SEQ ID NO: 15)
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Oligonucleotid 14:
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- TATATAAGCTTAGTATACCTAATAATTTATC (SEQ ID NO: 16)
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Oligonucleotid 15:
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- TATATAAGCTTCACTTCGCAAAATTCGCG (SEQ ID NO: 17)
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Oligonucleotid 16:
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- TATATAAGCTTGAGGGTCGAGCTTGAGCG (SEQ ID NO: 18)
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Oligonucleotid 17:
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- TATATAAGCTTCACTCTTTATATGCTAATAC (SEQ ID NO: 19)
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Mit
den Oligonucleotiden 14 und 15 war es möglich ein DNA-Fragment von
2846 bp, das das Resistenzgen gegen Erythromycin und den ORF E enthält, in Form
eines HindIII-HindIII-Fragments zu amplifizieren, mit Hilfe von
Restriktionsstellen, die durch die Oligonucleotide eingeführt wurden,
die eine Verknüpfung
dieses Fragments mit sich selbst ermöglichen.
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In
gleicher Weise war es mit den Oligonucleotiden 14 und 16 möglich, ein
DNA-Fragment von 4808 bp zu amplifizieren, das das Erythromycin-Gen
und die ORF B, C, D und E enthält.
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Schließlich war
es mit den Oligonucleotiden 14 und 17 möglich, ein DNA-Fragment von
5169 bp zu amplifizieren, das das Erythromycin-Gen und die ORF B, C, D und E enthält.
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Diese
DNA-Fragmente wurden durch die PCR ausgehend von einer Zubereitung
des Plasmids pLAB500 mit dem Enzym ELONGASE® (BRL)
amplifiziert.
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Die
Produkte der PCR wurden durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion
gereinigt, mit Ethanol gefällt, mit
dem Restriktionsenzym HindIII verdaut, miteinander verknüpft. Die
Klonierung dieser Fragmente miteinander hat zu den Plasmiden pLAB501,
pLAB502 und pLAB503 geführt.
Diese Plasmide wurden in dem Stamm MG 1363 konstruiert. Ihre Fähigkeit,
sich in diesem Stamm zu replizieren, weist darauf hin, dass der
ORF E ein Protein codiert, das an der Replikation des Plasmids beteiligt
ist.
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Im übrigen zeigt
dieses Protein 21,7% Homologie bei 230 Aminosäuren mit dem Protein RepE,
das an der Replikation des F-Faktors von E. coli beteiligt ist.
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Diese
Plasmide wurden anschließend
hinsichtlich ihrer Fähigkeit
getestet, durch Konjugation in den Stamm LM2301 übertragen zu werden. Die Plasmide
pLAB502 und pLAB503 haben eine Transfereffizienz, die mit pLDP1,
dem negativen Vergleich, vergleichbar ist. Man kann demnach sagen,
dass diese Plasmide nicht die vollständige DNA besitzen, die für ihren
Transfer durch Konjugation erforderlich ist. Im Gegensatz hierzu hat
pLAB501 eine Transfereffizienz durch Konjuga tion, die mit pLAB500
vergleichbar ist. Die Gesamtheit der für die Übertragung durch Konjugation
von pLAB500 erforderliche DNA muss demnach in pLAB501 vorhanden sein.
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Beispiel 3: Subklonierung
von Fragmenten von pLAB500 in das Plasmid pLDP1.
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Mit
den Oligonucleotiden 9 und 12 war es möglich, durch PCR ein Fragment,
das die ORFs C und D enthält,
in Form eines EcoRI-EcoRI-Fragments
von 2068 bp zu amplifizieren.
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Mit
den Oligonucleotiden 9 und 13 war es möglich, durch PCR ein Fragment,
das den ORF C enthält, in
Form eines EcoRI-EcoRI-Fragments
von 1201 bp zu amplifizieren.
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Mit
den Oligonucleotiden 11 und 13 war es möglich, durch PCR ein Fragment,
das die ORFs B und C enthält,
in Form eines EcoRI-EcoRI-Fragments
von 2136 bp zu amplifizieren.
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Mit
den Oligonucleotiden 10 und 12 war es möglich, durch PCR ein Fragment,
das die ORFs B, C und D enthält,
in Form eines EcoRI-EcoRI-Fragments
von 2602 bp zu amplifizieren.
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Mit
den Oligonucleotiden 10 und 13 war es möglich, durch PCR ein Fragment,
das die ORF's B
und C enthält,
in Form eines EcoRI-EcoRI-Fragments
von 1735 bp zu amplifizieren.
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Jedes
dieser Fragmente, nach dem Verdau mit dem Enzym EcoRI, wurde in
pLDP1 kliniert, wodurch die Plasmide pLAB504, pLAB505, pLAB506,
pLAB507 bzw. pLAB508 erhalten wurden. Von diesen Plasmiden wurde
nur pLAB507 mit einer nennenswerten Effizienz transferiert, die
besser als für
die anderen Plasmide war, jedoch we niger gut als für pLAB500.
Es kann demnach gesagt werden, dass die ORFs B, C und D für den Transfer
durch Konjugation erforderlich sind.
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Beispiel 4: Subklonierung
eines Fragments von pLAB500 in pLAB510.
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Die
folgenden Oligonucleotide wurden bei dieser Subklonierung verwendet:
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Oligonucleotid 18:
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- AGGTTTCCCGACTGGAAATG (SEQ ID NO: 20)
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Oligonucleotid 19:
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- TACGTGAATTCAGTTTTAAATCAATCTAAAG (SEQ ID NO: 21)
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Oligonucleotid 20:
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- TACGTGGATCCATCGGCATAATCGTTAAAAC (SEQ ID NO: 22)
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Oligonucleotid 21:
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- TACGTGAATTCAGAAGAACCCTTAACTAAAC (SEQ ID NO: 23)
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Das
Plasmid pLDP1 wurde mit einer geringen, jedoch von Null verschiedenen
Effizienz durch Konjugation von MG1363 auf LM2301 transferiert.
Um das Einbringen diese Plasmids in den Transfer zu beseitigen, wurde
das mit den Oligonucleotiden 10 und 12 erhaltenen PCR-Fragment in
ein anderes Plasmid kloniert.
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Das
Resistenzgen gegen Erythromycin wurde zunächst durch PCR aus dem Plasmid
pRC1N und mit den Oligonucleotiden 18 und 19 amplifiziert, dann
mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut. Ein replizierendes
Fragment des Plasmids pPF107-3 (Zu gangsnummer GenBank: Y12675) wurde
mit Hilfe der Oligonucleotide 20 und 21 aus der Gesamt-DNA des Stammes
I-942 (hinterlegt bei der C.N.C.M. am 12. April 1990) amplifiziert,
dann mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut. Diese
beiden PCR-Fragmente wurden verknüpft und dienten für die Transformation
von MG 1363. Das erhaltene neue Plasmid, das die Bezeichnung pLAB510
trägt,
wurde mit EcoRI verdaut, dann mit dem Fragment verknüpft, das
mit den Oligonucleotiden 10 und 12 erhalten wird, das durch PCR-Amplifikation
aus dem Plasmid pLAB500 erhalten wurde und mit EcoRI verdaut wurde.
Diese Verknüpfung
diente der Transformation von MG 1363. Dieses neue Plasmid, pLAB511,
wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit
getestet, von MG1363 in LM2301 transferiert zu werden (Tabelle 1).
Es kann festgestellt werden, dass dieses neue Plasmid pLAB511 gut
durch Konjugation zwischen diesen beiden Stämmen übertragbar ist. Tabelle
1: Effizienz der Transfers durch Konjugation
Effizienz = Quotient aus der Zahl der Transkonjungate
und der Zahl der Rezipienten.
Relative Effizienz = Quotient
aus der Effizienz der Konjugation für ein gegebenes Plasmid und
der Effizienz der Konjugation für
pLAB500, multipliziert mit 100.
ORF = vollständige offene
Leserahmen, die in dem Plasmid enthalten sind.
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Beispiel 5: Nachweis der
Relaxation, die durch die verschiedenen Plasmide verliehen wird
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Die
Relaxation (Bildung offener zirkulärer Formen von Plasmiden aus
Plasmiden mit überspiralisierter Form)
ist am Transfer bestimmter Plasmide beteiligt (Plasmid-protein relaxation
complexes in Staphylococcus aureus., R. Novick., J. Bacteriol. 1976;
127: 1177–1187).
Durch die Vergleiche mit den Informationsdatenbanken (GenBank) zeigt
das aus dem ORF C abgeleitete Protein 35,2% Homologie mit Rlx, einer
Relaxase von Staphylococcus aureus. Man kann demnach annehmen, dass
dieses vom ORF C abgeleitete Protein ebenfalls eine Relaxase ist.
Die Plasmide pLAB500 bis pLAB508, pLAB510, pLAB511 und pLDP1 wurden
daher extrahiert und auf Agarose-Gel gegeben. Nach Migration und
unter all diesen aus MG 1363 extrahierten Plasmiden weisen nur pLAB503,
pLAB510 und pLDP1 keine offene zirkuläre Form auf: Der ORF C ist
demnach an der Relaxation der Plasmide beteiligt.
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Beispiel 6: Kinetik des
Transfers von pLAB500
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Konjugationen
zwischen MG1363, das pLAB500 enthält, und LM2301 wurden zu verschiedenen
Zeiten durchgeführt,
um zu ermit teln, ab wann der Transfer stattfand. Es wird festgestellt
(siehe die folgende Tabelle 2 und
2), dass
die Konjugation bereits nach 1 Stunde anfing und dass ein Maximum
der Effizienz nach 4 Stunden erreicht wurde. Konjugationen alle
10 min zwischen 0 und einer Stunde haben ebenfalls gezeigt, dass
vor einer Stunde keinerlei Konjugation stattfand. Tabelle
2: Kinetik der Übertragung
von pLAB500.
| Zeitpunkt
der Konjugation (Stunden) | Effizienz
der Konjugation |
| 0 | < 1,1 × 10–8 |
| 1 | 6,6 × 10–5 |
| 2 | 9,8 × 10–5 |
| 3 | 1,7 × 10–4 |
| 4 | 3,4 × 10–4 |
| 5 | 2,7 × 10–4 |
| 6 | 2,2 × 10–4 |
| 7 | 6,7 × 10–5 |
| 8 | 4,2 × 10–5 |
| 9 | 3,0 × 10–5 |
| 29 | 7,9 × 10–5 |
Effizienz der Konjugation = Quotient aus der Zahl
der Transkonjugate und der Zahl der Rezipienten
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