JPH07170987A

JPH07170987A - ファージ耐性機構含有核酸配列およびプラスミド、それらが存在する細菌、ならびにファージ耐性機構を与える方法

Info

Publication number: JPH07170987A
Application number: JP6185737A
Authority: JP
Inventors: Fabien Prevots; ファビアン・プレボ; Elisabeth Remy; エリザベト・レミー; Paul Ritzenthaler; ポール・リッツェンターラー
Original assignee: Societe National Elf Aquitaine; Sanofi SA
Current assignee: Societe National Elf Aquitaine; Sanofi SA
Priority date: 1993-08-09
Filing date: 1994-08-08
Publication date: 1995-07-11
Also published as: DE69429315T2; AU681887B2; NZ264191A; US5658770A; ES2170088T3; EP0643134A1; FR2708937B1; CA2129812A1; DK0643134T3; FR2708937A1; ATE210183T1; EP0643134B1; PT643134E; DE69429315D1; AU6888094A

Abstract

(57)【要約】【目的】新規核酸配列およびプラスミドの提供。【構成】配列番号１の核酸配列を有するＤＮＡ配列、
該配列またはそのフラグメントと一緒にハイブリダイズ
されるＤＮＡ配列、および対応するｍＲＮＡおよびｃＤ
ＮＡ配列からなる、少なくとも１つのファージ耐性メカ
ニズムを有する核酸配列、該核酸配列を含有するプラス
ミド、該プラスミドを含有するファージ耐性乳酸菌、な
らびに、該乳酸菌を使用して菌株に対してファージ耐性
メカニズムを与える方法。【効果】得られた新規核酸配列およびプラスミドは、
少なくとも１つのファージ耐性メカニズムを有してい
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、少なくとも１つのファ
ージ耐性機構を有する新規核酸配列および該核酸配列と
のハイブリダイジング能を有するプラスミド、この配列
またはプラスミドが存在する乳酸菌、特に、ラクトコッ
カス・ラクティス(Ｌactococcus lactis)種に属するラ
クトコッカス、これらのラクトコッカスの特定菌株の使
用による、産業的に重要な、特に酪農業において重要な
菌株への、特にコンジュゲーションによる、ファージ耐
性機構のトランスファー方法、ラクトコッカス・ラクテ
ィス(Ｌactococcus lactis)の特定菌株の使用によるこ
れらのプラスミドの調製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】乳酸
菌は、チーズ、バター、ヨーグルト、ソーセージまたは
漬物にしたキャベツなどの多くの食品の製造および貯蔵
において含まれる。これらの食品のうち、酪農製品は特
に重要なものである。牛乳の工業的加工は、かなり大き
な発酵バット中で行われ、乳酸菌のファージの出現は、
重大なまたはかなり破滅的な結果、すなわち、最終製品
の特徴、特に感覚刺激性特徴の変化、バット中に存在す
る製品の損失、ならびに、後のおよび周囲の装置を除染
する必要性を有することがある。したがって、酪農業で
は、乳酸菌をファージに対してより耐性にさせることが
できる新しい手段および新しい方法の必要性が差し迫っ
ている。

【０００３】乳酸菌のファージは、レラノ・ピー(ＲＥ
ＬＡＮＯＰ.)ら[(１９８７)、ジャーナル・オブ・ゼネ
ラル・マイクロバイオロジー(Ｊ.Ｇen.Ｍicrobiol.)、
１３３、３０５３−３０６３]に従ってＤＮＡ／ＤＮＡ
ハイブリダイゼーション研究によって定義された３つの
主なホモロジーグループ(Ｉ)、(II)および(III)に属す
る。グループ(Ｉ)および(III)は、ビルレントファージ
のみからなっている。グループ(II)は、ビルレントファ
ージおよびテンペレートファージからなっている。ホモ
ロジーは、１つの同一グループ内では強く、グループ間
では非常に弱い。グループ(Ｉ)ファージは、楕円形のヌ
クレオキャプシドを有するが、グループ(II)および(II
I)ファージは、等長性ヌクレオキャプシドを有する。

【０００４】いくつかのファージ耐性機構が存在するこ
とが知られており、３つの主な機構は、以下のとおりで
ある。ファージ吸着の阻害：この機構では、細菌によるファー
ジの吸着が阻害または遅延される。制限／修飾系：この系は、細菌に進入するとすぐにファ
ージＤＮＡを分解させる制限酵素を含む。不稔感染：この第３の機構によって、ファージは、通
常、吸着されるが、増加しない。これらの機構は、ビオシミィ(Ｂiochimie)７０、(１９
８８)、４１１−４２１においてサンダーズ・エム(ＳＡ
ＮＤＥＲＳＭ.)によって詳細に開示されている。

【０００５】ファージ耐性乳酸菌を開発するために多く
の研究が既に行われた。これに関係して、特に、以下の
文献に言及されている。ブレゲルズ(ＶＬＥＧＥＬＳ)ら、ネザーランズ・ミルク
・アンド・デーリィ・ジャーナル(Ｎeth.Ｍilk and Ｄa
iry Ｊ.)、４３、(１９８９)、２４５−２５９；サンダ
ーズ(ＳＡＮＤＥＲＳ)およびクレンハマー(ＫＬＡＥＮ
ＨＡＭＭＥＲ)、アプライド・アンド・エンバイロンメ
ンタル・マイクロバイオロジー(Ａppliedand Ｅnviron.
Ｍicrobiol.)(１９８３)、第４６巻、１１２５−１１３
３、ファージ吸着を阻害するプラスミドに関係する；オ
ードリィ・ダブリュ・ジャーヴィス(Ａudrey Ｗ.ＪＡＲ
ＶＩＳ)、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル
・マイクロバイオロジー、１９８８年３月、第７７７〜
７８３頁；ＥＰ−Ａ３−０２０８４６８；コフィ(ＣＯ
ＦＦＥＹ)ら、ネザーランズ・ミルク・アンド・デーリ
ィ・ジャーナル、４３、(１９８９)、２２９−２４４；
クレンハマーおよびサノスキィ(ＳＡＮＯＺＫＹ)、ジャ
ーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー(Ｊour
nal of Ｇeneral Ｍicrobiology)(１９８５)、１３１、
１５３１−１５４１、不稔感染機構によってファージ耐
性を与えるプスミドを開示している；ジョウジフセン
(ＪＯＳＥＰＨＳＥＮ)およびクレンハマー、プラスミド
(Ｐlasmid)２３、７１−７５、(１９９０)；ＵＳ特許第
４８８３７５６号；ゴーチェ(ＧＡＵＴＩＥＲ)およびチ
ョピン(ＣＨＯＰＩＮ)、アプライド・アンド・エンバイ
ロンメンタル・マイクロバイオロジー(１９８７)、５
３、第９２３−９２７頁。特に、最後の２つの文献は、
制限／修飾機構によってファージ耐性を与えるプラスミ
ドを開示している。

【０００６】本発明者らは、この技術分野でも研究を行
っており、ＥＰ−Ａ１−４５２２２４において、１９９
１年４月９日に番号Ｉ−１０７０の下に、パリのパスツ
ール研究所のザ・ナショナル・コレクション・オブ・カ
ルチャーズ・オブ・マイクロオーガニズムズ(the Ｎati
onal Ｃollection of Ｃultures of Ｍicroorganisms)
(ＣＮＣＭ)に寄託されたエシェリキア・コリ(Ｅscheric
hia coli)の菌株中に存在するプラスミドpＰＦ１４４−
１の約３.３kbのＨindIII−ＨindIIIフラグメントの機
能的な部分を含有する、少なくとも１つのファージ耐性
機構を有するＤＮＡ分子を開示した。

【０００７】この約３.３kbのＨindIII−ＨindIIIフラ
グメントは、１９９０年４月１２日に番号Ｉ−９４０の
下にＣＮＣＭに寄託されたラクトコッカス・ラクティス
亜種ラクティス(Ｌactococcus lactis ssp lactis)Ｓ９
１供与株の、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティ
ス(Ｌactococcus lactis ssp lactis)Ｃ２菌株[エル・
エル・マッケイ(Ｌ.Ｌ.ＭcＫay)ら、１９７７、ジャー
ナル・オブ・バクテリオロジー(Ｊ.Ｂacteriol.)２５７
−２６５]から誘導されたラクトコッカス・ラクティス
亜種ラクティス(Ｌactococcus lactis ssp lactis)Ｓ４
５受容株との交雑から誘導された接合完了体である、番
号Ｉ−９４５の下にＣＮＣＭに寄託されたラクトコッカ
ス・ラクティス亜種ラクティス(Ｌactococcus lactis s
sp lactis)菌株に含まれるプラスミドpＰＦ１４４から
単離された。このフラグメントは、１つ以上のファージ
耐性機構を有している。

【０００８】それらの研究を続けるうちに、本発明者ら
は、この３.３kbのＨindIII−ＨindIII ＤＮＡ配列か
ら、独力でファージ耐性を与える１.９kbのＤＮＡ配列
を単離した。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、約１.９kbで
あり、かつ、ａ)配列番号１の核酸配列を有するＤＮＡ配列；ｂ)前記配列またはそのフラグメントとハイブリダイズ
するＤＮＡ配列；およびｃ)対応するｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列からなること
を特徴とする、少なくとも１つのファージ耐性機構を有
する新規核酸配列に関する。

【００１０】配列[配列番号２]は、配列番号１から導き
出されたアミノ酸配列である。

【００１１】ＤＮＡ配列[配列番号１]は、以下の２つの
オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ法によって、番
号Ｉ−９４５の下にＣＮＣＭに寄託されたラクトコッカ
ス・ラクティス亜種ラクティス(Ｌactococcus lactis s
sp lactis)菌株に含まれる３.３kbのＨindIII−ＨindII
I ＤＮＡ配列から得ることができる：

【００１２】オリゴヌクレオチド１[配列番号３]：

【化１】

【００１３】オリゴヌクレオチド２[配列番号４]：

【化２】

【００１４】本発明は、さらに、前記ＤＮＡ配列[配列
番号１]との高い相同性を有するＤＮＡ配列に関する。
ここで、「高い相同性」なる語は、ニードルマン(Ｎeedle
man)およびウンシュ(Ｗunsch)、１９７０、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Ｊ.Ｍol.Ｂio
l.)、４８、４４３−４５３の最適な配列決定方法を使
用して、ヌクレオチド配列が最大相同性に従って配置さ
れる場合、ヌクレオチド配列の少なくとも７０％、好ま
しくは、少なくとも８０％の相同性(ヌクレオチドの総
数に対する同一ヌクレオチドの比率)を意味する。この
方法は、特に、ユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン
(Ｕniversity of Ｗisconsin)のＵＷＧＣＧソフトウエ
アにおいて使用される：デベリュックス(Ｄevereux)
ら、１９８４、ニュークリイック・アシッズ・リサーチ
(Ｎucl.Ａc.Ｒes.)１２、８７１１−８７２１ − オプ
ションＧＡＰ。

【００１５】本発明は、特に、ＤＮＡ配列[配列番号１]
またはそのフラグメントとハイブリダイズするＤＮＡ配
列に関する。本明細書において、「ハイブリダイゼーシ
ョン」なる語は、慣用のハイブリダイゼーション条件、
より詳しくは、ストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件を示す。本発明は、さらに、本発明の核酸配列の
うちの１つで形質転換されたプラスミドに関する。これ
らのプラスミドは、例えば、本発明のＤＮＡ配列を当業
者によく知られている常法によってクローン化されたプ
ラスミドpＰＦ１４４−１２であってもよい。

【００１６】本発明は、さらに、前記定義の少なくとも
１つの核酸配列または１つのプラスミドを含有する、好
ましくはラクトコッカス・ラクティス(Ｌactococcu lac
tis)種に属する、ファージ耐性乳酸菌に関する。

【００１７】この核酸配列またはこのプラスミドは、コ
ンジュゲーション、形質転換、プロトプラスト融合また
は別の遺伝子導入法によって乳酸菌に導入されてもよ
い。

【００１８】好都合には本発明の核酸配列または該配列
を含有するプラスミドで形質転換させることができる乳
酸菌の例としては、ラクトコッカス・ラクティス亜種ク
レモリス(Ｌactococcus lactis ssp cremoris)菌株、ラ
クトコッカス・ラクティス亜種ラクティス(Ｌactococcu
s lactis ssp lactis)菌株およびラクトコッカス・ラク
ティス亜種ラクティス・バー・ジアセチラス(Ｌactococ
cus lactis ssp lactis var.diacetylous)菌株が挙げら
れる。

【００１９】この方法で形質転換されたこれらの菌株
は、コンジュゲーション、形質転換、形質導入、プロト
プラスト融合または別の遺伝子導入法による、工業的に
関心のある菌株へのファージ耐性機構の導入のために使
用されうる。この機構は、プラスミドによって、または
細菌のゲノムの別の部分によって行われうる。該機構が
プラスミドによって行われる場合、コンジュゲーション
によって導入されるのが好都合である。

【００２０】本発明は、さらに、得られた工業的に関心
のあるファージ耐性菌株に関する。

【００２１】本発明は、実験結果およびその考察を含む
以下の実施例の助けをかりてさらに明確に理解されるで
あろう。これらの実施例のいくつかは、本発明を実施す
るために行われる実験に関しており、他の、本発明の実
施方法の実施例は、もちろん、単に説明のために記載さ
れる。

【００２２】これらの実施例に記載の全技術の大部分
は、当業者によく知られており、サムブルーク(Ｓambro
ok)、フリッツ(Ｆritsch)およびマニアティス(Ｍaniati
s)[ニューヨークのコールド・スプリング・ハーバー・
プレス(Ｃold Ｓpring ＨarborＰress)によって１９８
９年に発行された「モレキュラー・クローニング；ア・
ラボラトリー・マニュアル」(Ｍolecular cloning；a Ｌ
aboratory Ｍanual)(第２版)]による研究において詳細
に開示されている。

【００２３】以下の説明は、「図１」および「図２」の助け
によってさらに明確に理解されるであろう。

【００２４】「図１」は、pＰＦ１４４−１の３.３kbフラ
グメントの制限地図を示す。

【００２５】「図２」は、pＰＦ１４４−１の３.３kbの内
部フラグメントのＰＣＲ法による増幅を示す。

【００２６】フラグメント１−２は、ファージ耐性を与
える。フラグメント１−４、２−３および３−４は、フ
ラグメント耐性を与えない。

【００２７】

【実施例】

実施例１：３.３kbのＨindIII−ＨindIIIフラグメント
の配列１９９０年４月１２日に番号Ｉ−９４５の下にＣＮＣＭ
に寄託されたラクトコッカス・ラクティス(Ｌactococcu
s lactis)Ｓ４５−９１−１菌株は、ファージ耐性を与
える、pＰＦ１４４と称される１４４kbの大きさのプラ
スミドを含有している。この菌株は、全体的にファージ
φ５９(グループIII)に対して耐性である。他方、成長
させるが、ピンヘッドの大きさの異常に小さな溶菌プレ
ート(lysis plate)を生じさせるグループＩのファージ
φ５３に対して一部耐性を有する。ファージ耐性を与え
る３.３kbのＨindIII−ＨindIII制限フラグメントは、
ＥＰ−Ａ１−４５２２２４の実施例７に開示されている
方法に従って、マクリーナ・エフ・エル(ＭＡＣＲＩＮ
ＡＦ.Ｌ.)ら(１９８２)、ジーン(Ｇene)、１９、３４
５−３５３によって開示されているベクターpＶＡ８３
８においてプラスミドpＰＦ１４４からクローン化され
た。この組換えプラスミドpＰＦ１４４−２は、ラクト
コッカス・ラクティス亜種ラクティス(Ｌactococcus la
ctis ssp lactis)Ｓ５６菌株に対してプラスミドpＰＦ
１４４と同レベルのファージ耐性をそっくり全部与え
る。

【００２８】サンガー(Ｓanger)ら(ＰＮＡＳ−ＵＳＡ、
１４、５４６３、１９７７)の方法によって決定され
た、この３.３kbフラグメントの核酸配列は、下記配列
[配列番号７]である。この３.３kbフラグメントの酵素
的制限分析によって、酵素ＢstＢＩの認識のためのシグ
ナル部位がこのフラグメントに存在することが判明し
た。２つのＨindIII−ＢstＢＩ制限フラグメントのサブ
クローニングおよびそれらのラクトコッカス・ラクティ
ス(Ｌ.lactis)Ｓ５６菌株中への導入によって、それら
のどちらファージ耐性を与えないことを示すことが可能
になった。これから、ＢatＢＩ部位は、推測された耐性
遺伝子内にあると推論された。この仮説は、２つのフラ
グメントのヌクレオチド配列の決定によって強められ、
ＢstＢＩ部位が、耐性遺伝子に対応する１.６２kbのオ
ープンリーティングフレーム(ＯＲＦ)内にあることを示
した。「図１」は、３.３kbのＨindIII−ＨindIIIフラグ
メントの制限地図を示す。

【００２９】別の分析によって、３.３kbのＨindIII−
ＨindIIIフラグメントがトランスポゾンＴn５５２の一
部との高い相同性を有する領域Ｔn５５２[参考文献：Ｔ
n５５２,ア・ノベル・トランスポーザブル・エレメント
・フロム・スタフィロコッカス・アウレウス(Ｔn５２
２, a novel transposable element fromＳtaphylococc
us aureus)(１９９０)、エス・ジェイ・ロウランド(Ｓ.
Ｊ.ＲＯＷＬＡＮＤ)、ケイ・ジー・エイチ・ダイク(Ｋ.
Ｇ.Ｈ.ＤＹＫＥ)、モレキュラー・マイクロバイオロジ
ー(Ｍolecular Ｍicrobiology)４、９６１−９７５]；
耐性遺伝子に対応する１６２０bpのＯＲＦ；挿入配列Ｉ
Ｓ９８１の一部との高い相同性を有する領域ＩＳ９８１
[参考文献：アイデンティフィケイション,ＤＮＡ・シー
ケンス・アンド・ディストリビューション・オブ・ＩＳ
９８１,ア・ニュー・ハイ−コピー−ナンバー・インサ
ーション・シーケンス・イン・ラクトコックサイ(Ｉden
tification, ＤＮＡ sequence and distribution of Ｉ
Ｓ９８１, a new high-copy-number insertion sequenc
e in Ｌactococci)(１９９１)、ケイ・エム・ポルジン
(Ｋ.Ｍ.ＰＯＬＺＩＮ)、エル・エル・マッケイ(Ｌ.Ｌ.
ＭcＫＡＹ)、アプライド・アンドメエンバイロンメンタ
ル・マイクロバイオロジー、５７、７３４−７４３]；
オープンリーティングフレーム(orf)の開始を有するこ
とも判明した。

【００３０】実施例２：３.３kbのＨindIII−ＨindIII
フラグメントの内部フラグメントのＰＣＲ法による増幅例えば、前記マニアティスによる研究において開示され
ているようなＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)法によっ
て、２つのオリゴヌクレオチド間に位置するＤＮＡフラ
グメントを増幅させることを可能にする。この増幅され
たＤＮＡは、制限部位がオリゴヌクレオチドによって与
えられる場合には、容易にクローン化されうる。事実、
これらのオリゴヌクレオチドの配列は、それらの５'位
に、例えば、８塩基対からなり、そのうちの６つが制限
部位を構成する、増幅されるべきＤＮＡの異なる部分を
含有してもよい。この方法は、３.３kbフラグメントの
ヌクレオチド配列において示されたＯＲＦが実際にファ
ージ耐性遺伝子に対応するか否かを測定するために、な
らびに、このＯＲＦに対して特異的なプローブを形成す
るためにも適用された。２８塩基(そのうちの６つが制
限部位を構成する)の４オリゴヌクレオチドを合成し
た。

【００３１】これらの４オリゴヌクレオチドは、以下の
配列を有している。

【００３２】オリゴヌクレオチド１[配列番号３]：

【化３】

【００３３】オリゴヌクレオチド２[配列番号４]：

【化４】

【００３４】オリゴヌクレオチド３[配列番号５]：

【化５】

【００３５】オリゴヌクレオチド４[配列番号６]：

【化６】

【００３６】３.３kbフラグメント上のそれらの位置を
「図２」に示す。オリゴヌクレオチド１および２によっ
て、全ＯＲＦ＋そのすぐ上流の、遺伝子発現シグナルを
含有させることができる領域２０１bpを含有する１８７
５bpのＤＮＡフラグメントを増幅させることが可能にな
った。このＤＮＡを、シャトルベクターpＶＡ８３８に
おいて指向性クローニングさせ、該オリゴヌクレオチド
によって与えられた制限部位によってＥcoＲＩ−ＢamＨ
Ｉフラグメントの形態で増幅させた。同様の方法で、オ
リゴヌクレオチド３および４によって、ＥcoＲＩ−Ｅco
ＲＩフラグメントの形態で、ＢstＢＩ部位と重複する５
００bpの領域を増幅させることが可能になった。３.３k
bフラグメントの２つのＨindIII−ＢstＢＩサブフラグ
メントがそれら自身ではファージ耐性を与えず、したが
って、ＢstＢＩ部位の領域が遺伝子の活性のために必須
であることが示されたので、特異的なプローブを形成す
るために、これらの領域を選択した。

【００３７】オリゴヌクレオチド対１および２ならびに
２および３によって、ＰＣＲ法によって、ＯＲＦ内の２
つの別のフラグメントを増幅することができた。ＣsＣl
上で精製したプラスミドpＰＦ１４４−２から出発させ
る場合、慣用のＴaqポリメラーゼと比較して適合度をフ
ァクター１５増加させるエキソヌクレアーゼ活性を有す
るＶentポリメラーゼ(バイオラブズ(Ｂiolabs))を用い
て、ＰＣＲ法によって、４ＤＮＡフララグメントを増幅
させた。ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルムでの
抽出によって精製し、エタノールで沈殿させ、フラグメ
ントに応じてＥcoＲＩまたはＢamＨＩおよびＥcoＲＩで
消化させ、次いで、ベクターpＶＡ８３８中でクローン
化させた。ベクターpＶＡ８３８におけるフラグメント
のクローニングによって、菌株イー・コリ(Ｅ.coli)Ｔ
Ｇ１中で組換えプラスミドを増幅させた後、それらをラ
クトコッカス・ラクティス(Ｌ.lactis)の菌株中に導入
させ、次いで、それらがファージ耐性を与えるか否かを
測定することが可能になった。種々の増幅ＤＮＡフラグ
メントのクローニングに関係する結果の概要を下記「表
１」に示す。

【００３８】

【表１】

【００３９】実施例３：プラスミドpＰＦ１４４−２に
よって与えられたファージ耐性プラスミドpＰＦ１４４−１２、pＰＦ１４４−１４、p
ＰＦ１４４−２３およびpＰＦ１４４−４３をラクトコ
ッカス・ラクティス(Ｌ.lactis)Ｓ５６菌株中に導入さ
せた。得られたクローンのファージ耐性を、ファージφ
５３およびφ５９を用いる滴定(ＰＦＵ／ml)を行うこと
によって試験した。結果を下記「表２」に示す。

【００４０】

【表２】

【００４１】ＰＣＲ法によって増幅された１８７５bpフ
ラグメントを含有するプラスミドpＰＦ１４４−１２
は、プラスミドpＰＦ１４４−１と同じファージ耐性を
与える。１.６２kbのＯＲＦの部分だけからなる別のプ
ラスミド、すなわち、pＰＦ−１４４−１４、pＰＦ１４
４−２３およびpＰＦ１４４−４３は、ファージ耐性を
与えない。

【００４２】実施例４：プラスミドpＰＦ１４４−１２
の存在下でのファージＤＮＡの複製についての試験ファージφ５３およびφ５９は、各々、遺伝グループＩ
およびIIIに属する。これらのファージの遺伝地図を作
成した。この遺伝地図は、特に、二本鎖ＤＮＡからなる
これらのファージのゲノムが付着末端を有することを示
した。この結果から、これらのファージのＤＮＡの複製
によって、イー・コリ(Ｅ.coli)ファージラムダのもの
と同一のモデルに従って、溶菌サイクルの間のコンカテ
マーの形成、および、ファージのヌクレオキャプシドに
おけるエンカプシデイション(encapsidation)時のこれ
らのコンカテマーの特異的酵素による切断が生じること
が判明する。ヒル(Ｈill)ら[ヒル,シー(Ｈill,Ｃ.)、マ
ッセイ,アイ・ジェイ(Ｍassey,Ｉ.Ｊ.)、クレンハマー,
ティ・アール(Ｋlaenhammer,Ｔ.Ｒ.)(１９９１)、ラピ
ッド・メソッド・トゥ・キャラクタライズ・ラクトコカ
ル・バクテリオファージ・ゲノムズ(Ｒapid method to
characterize lactococcal bacteriophage genomes)、
アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロ
ジー、５７、２８３−２８８]の方法を使用して、細菌
中への注入後のファージＤＮＡの運命を追跡した。ベク
ターpＶＡ８３８またはプラスミドpＰＦ１４４−１２を
含有するラクトコッカス・ラクティス(Ｌ.lactis)Ｓ５
６菌株にファージφ５３およびφ５９を感染多重度２で
感染させた。感染培養物のアリコットを規則的な時間間
隔で採取した。各アリコットの全ＤＮＡ、すなわち、細
胞およびファージＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化し、
得られたフラグメントをアガロースゲル上での泳動によ
って電気泳動に付して分離した。次いで、ＤＮＡをナイ
ロン膜に移し、プローブとして使用したファージのＤＮ
Ａと一緒にハイブリダイズさせた(ＥＬＣキット、アマ
ーシャム(Ａmersham))。

【００４３】この方法によって、時間の関数として感染
細胞内のファージＤＮＡの出現および該ファージＤＮＡ
における変化を追跡することが可能になる。酵素ＥcoＲ
Ｉ、ＨindIIIおよびＥcoＲＶで得られた結果から、ファ
ージＤＮＡがベクターpＶＡ８３８またはプラスミドpＰ
Ｆ１４４−１２を用いてＳ５６菌株において複製するこ
とが判明した。コンカテマーの形態のファージＤＮＡの
蓄積は、プラスミドpＰＦ１４４−１２を用いて観察さ
れるが、ベクターpＶＡ８３８を含有する菌株において
は、これらのコンカテマーは、感染の２０分後に消失し
始める。

【００４４】実施例５：プラスミドpＰＦ１４４−１２
の存在下でのファージタンパクの生産についての試験塩化セシウム上で精製したファージφ５３およびφ５９
調製物を使用して、ウサギにおいてポリクローナル抗体
を調製した。ベクターpＶＡ８３８(対照)またはプラス
ミドpＰＦ１４４−１２を含有するＳ５６菌株をこれら
のファージの１つに多重度１で感染させた。感染後５分
毎に、細胞のフラクションを採取し、ＳＤＳ２.３％お
よびβ−メルカプトエタノール５％の存在下、１００℃
で３分間加熱し、該タンパクを１２.５％ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル上で分画させ[レムリ,ユー・ケイ
(Ｌaemmli,Ｕ.Ｋ.)１９７０、クリーヴィッジ・オブ・
ストラクチュラル・プロテインズ・デュアリング・ジ・
アセンブリー・オブ・ザ・ヘッド・オブ・バクテリオフ
ァージ・Ｔ４(Ｃleavage of structural proteins duri
ng the assembly of the head of bacteriophage Ｔ
４)、ネイチャー(ＮＡＴＵＲＥ)(ロンドン)２２７、６
８０−６８５]、次いで、ニトロセルロースフィルター
に移した。ニトロセルロース上でのファージタンパクの
免疫学的検出を抗−φ５３または抗−φ５９ウサギ抗体
で行い、次いで、ストレプトアビジン／アルカリホスフ
ァターゼを使用して、抗ウサギマウス抗体(ＥＣＬキッ
ト、アマーシャム(Ａmersham))を用いて免疫複合体を局
在化させた。これらの結果は、プラスミドpＰＦ１４４
−１２を用いても用いなくても、ファージφ５３または
φ５９のタンパクが見いだされるが、このプラスミドの
存在下、生産されたタンパクの量が少なく、これらのタ
ンパクの出現速度がベクターpＶＡ８３８を含有する菌
株と比較して遅くなることを示す。この現象は、φ５３
についてよりもφ５９についての方が明確である。

【００４５】

【発明の効果】少なくとも１つのファージ耐性機構を有
する新規核酸配列およびプラスミドを得ることができ
た。

【００４６】

【配列表】

【００４７】配列番号：１配列の長さ：１８７５塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：ラクトコッカス・ラクティス(Ｌactococcus la
ctis) 配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：２０２..１８２１配列 GAACATAGAA TAGATTACGG GTTAATGGAC AATAAATGCA AACGATTTTG AGAAATTTAA 60 TAAGAAAAGA AGAGTGTCCA GAAAATGACC ATTTTCTGAA CGCCATATTA AAAATTTTTT 120 GATAATTCCC AATATATTAT AATATAGCTT CAATGTTAAA ATTTATATGA TATAATATAA 180 GAAAATTTTT AAAAAAATAG A ATG GAT ATA ATA ATG GAC TTT AAA ACT ATG 231 Met Asp Ile Ile Met Asp Phe Lys Thr Met 1 5 10 TTA AGC TAT CTT GTA AGT CAA GAT GAT GAA ATT TCT TTA AGA AAT GAT 279 Leu Ser Tyr Leu Val Ser Gln Asp Asp Glu Ile Ser Leu Arg Asn Asp 15 20 25 ATT AAA CAT GAA GAA GTA TAT AAA ATT TTA GAG AAT AAG TTT GCT TCT 327 Ile Lys His Glu Glu Val Tyr Lys Ile Leu Glu Asn Lys Phe Ala Ser 30 35 40 ATA ATG CCG AAG TTT AAA ACA AAA GGT TAT AAG TTT AAA GAT ACT ACT 375 Ile Met Pro Lys Phe Lys Thr Lys Gly Tyr Lys Phe Lys Asp Thr Thr 45 50 55 GAA GTT TTG ACA TTC GCT AAA TTT GTA TTT TTG CTA CAA GAG TGG GGG 423 Glu Val Leu Thr Phe Ala Lys Phe Val Phe Leu Leu Gln Glu Trp Gly 60 65 70 TTG AAG GAT ATA CAG TTT TAT AAG AAC ACT AAT AGT TTC TTA TTT GGA 471 Leu Lys Asp Ile Gln Phe Tyr Lys Asn Thr Asn Ser Phe Leu Phe Gly 75 80 85 90 TAT ATT ATA CCG CAA ATT AAT AAA GAA TTT GAT TTA TTG AGA TTT GGG 519 Tyr Ile Ile Pro Gln Ile Asn Lys Glu Phe Asp Leu Leu Arg Phe Gly 95 100 105 GAA AAT TAC AAT ATT AGT ATA GAA CTC AAA AGT AAA ACA ACA GTA GAA 567 Glu Asn Tyr Asn Ile Ser Ile Glu Leu Lys Ser Lys Thr Thr Val Glu 110 115 120 GCA CAA AAG CAA CAA CTT TGT AAG AAC TAT TTT TAC CTA AAT TTT TTA 615 Ala Gln Lys Gln Gln Leu Cys Lys Asn Tyr Phe Tyr Leu Asn Phe Leu 125 130 135 TCA ACT AAA ACT AGG TAT ATT AGT ATA TCC CCA GAT ATA TCT AGT TAC 663 Ser Thr Lys Thr Arg Tyr Ile Ser Ile Ser Pro Asp Ile Ser Ser Tyr 140 145 150 ATA GAA TAT ATT CCA AGT GAA AAT AAG TAT ATC AAT TTA AGT GGA ACT 711 Ile Glu Tyr Ile Pro Ser Glu Asn Lys Tyr Ile Asn Leu Ser Gly Thr 155 160 165 170 GAA ATT TGT GAT ATT ATT ATT AAA CAA GAG TTT TTA GAG TAT AAT ACA 759 Glu Ile Cys Asp Ile Ile Ile Lys Gln Glu Phe Leu Glu Tyr Asn Thr 175 180 185 AAA GAG GTT GAT AGT TTT TTT GAT ATA AAA AAT TAT TTA GTT TCT CCT 807 Lys Glu Val Asp Ser Phe Phe Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Val Ser Pro 190 195 200 TTC AAT GAT GTT GAA AAA TTT CTT GAT GAT AAA TAT TTT TTA ACA CCT 855 Phe Asn Asp Val Glu Lys Phe Leu Asp Asp Lys Tyr Phe Leu Thr Pro 205 210 215 CAC CAA GAC CAG ATT GTT AAA GAA ATT ACT GAA CCA AGT GAC AAA AAA 903 His Gln Asp Gln Ile Val Lys Glu Ile Thr Glu Pro Ser Asp Lys Lys 220 225 230 ACT TTT GGT ATA AAA GGA AAT CCA GGA ACA GGA AAA TCT TTG CTA GTT 951 Thr Phe Gly Ile Lys Gly Asn Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Leu Val 235 240 245 250 TAC CAT ATA TGT AAA AAA TTA ATG GAG AAA AAT AAA AGA GTT GCT ATA 999 Tyr His Ile Cys Lys Lys Leu Met Glu Lys Asn Lys Arg Val Ala Ile 255 260 265 GTT CAT GGA GCA AAT CTA AAT AAT GGT CAA CAA AGA TTA GCT CTG CGT 1047 Val His Gly Ala Asn Leu Asn Asn Gly Gln Gln Arg Leu Ala Leu Arg 270 275 280 GGT TTC ACA ATT TTT CCT GTT AAA TCG ATC ATA GAG GTA TTA GAT AAT 1095 Gly Phe Thr Ile Phe Pro Val Lys Ser Ile Ile Glu Val Leu Asp Asn 285 290 295 GCA GAC AAA TAC GAT TAC ATT GTT GTT GAC GAA GCT CAA CGT CTA AGA 1143 Ala Asp Lys Tyr Asp Tyr Ile Val Val Asp Glu Ala Gln Arg Leu Arg 300 305 310 CAA GAC TTA GGA GAA CAA TAT ACT AAA TTG GTT GAT ACT ATT GAA AAT 1191 Gln Asp Leu Gly Glu Gln Tyr Thr Lys Leu Val Asp Thr Ile Glu Asn 315 320 325 330 TCT CAA ACA AAA TTT ATT ATC TCA CTA GAT GGA AGA CAA ACT TTG AAT 1239 Ser Gln Thr Lys Phe Ile Ile Ser Leu Asp Gly Arg Gln Thr Leu Asn 335 340 345 AAA TAT GAA ATA GAA GAA AAT TCC ATA AAA TTA TTT AAA TAT ATA AAA 1287 Lys Tyr Glu Ile Glu Glu Asn Ser Ile Lys Leu Phe Lys Tyr Ile Lys 350 355 360 AAT AAA GGA GTA ACT TTT AGT CTT AAA GAT AAG TTT AGA ACT AAC CCA 1335 Asn Lys Gly Val Thr Phe Ser Leu Lys Asp Lys Phe Arg Thr Asn Pro 365 370 375 GAA ATG AGC AAA TTT ATC CAA CTT CTA TTC AAA ATA CCC ATG TAT AAA 1383 Glu Met Ser Lys Phe Ile Gln Leu Leu Phe Lys Ile Pro Met Tyr Lys 380 385 390 AAA ATA GAT TTA ATT TCA AAC ATA GAT CAT AAT ATT ATA ATT AAA TAT 1431 Lys Ile Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asp His Asn Ile Ile Ile Lys Tyr 395 400 405 410 TTT GAT AAC AGA GAA TCG GGA AAT GAA TAT ATT TCC GAT ATG GAT TCA 1479 Phe Asp Asn Arg Glu Ser Gly Asn Glu Tyr Ile Ser Asp Met Asp Ser 415 420 425 AAC TCA GAT TGG GAA GTA CTT AAT TAC ACG AAG GAT AGA TTT AGG AAA 1527 Asn Ser Asp Trp Glu Val Leu Asn Tyr Thr Lys Asp Arg Phe Arg Lys 430 435 440 ACA GGA ATT GGT AAA ATG TGT GGT AAT GGT TTA ACA TCA CAT AGT ATT 1575 Thr Gly Ile Gly Lys Met Cys Gly Asn Gly Leu Thr Ser His Ser Ile 445 450 455 ATC GGT CAA GAA TTT GAT AAA GTT ATT ATA CCT TTG GAT TCG AAT TTT 1623 Ile Gly Gln Glu Phe Asp Lys Val Ile Ile Pro Leu Asp Ser Asn Phe 460 465 470 TTT TAT AAA GAA CAA AAA ATA ATT GAT AGT AAA ACG GGT GAA AGT AAA 1671 Phe Tyr Lys Glu Gln Lys Ile Ile Asp Ser Lys Thr Gly Glu Ser Lys 475 480 485 490 GTT TTT AAA TTA TTG GAA ACG ACT GAT AAT TTT TAC CCA CTT GAA AAA 1719 Val Phe Lys Leu Leu Glu Thr Thr Asp Asn Phe Tyr Pro Leu Glu Lys 495 500 505 ATG TTA TAT CAA AAT CTT ACT CGC ACA AGG GGA AAA ATA GAA TTT GTA 1767 Met Leu Tyr Gln Asn Leu Thr Arg Thr Arg Gly Lys Ile Glu Phe Val 510 515 520 ATT ATT GGA AAT CGT TCA ATT TTT AAT GAA ATA TGT GGA TTG CTA GAT 1815 Ile Ile Gly Asn Arg Ser Ile Phe Asn Glu Ile Cys Gly Leu Leu Asp 525 530 535 AGT TTA TAAAGTTCTG TCTCAAAGTT AAAAAAAGTG AAATCACTCG CAACAGAACA 1871 Ser Leu 540 GTTT 1875

【００４８】配列番号：２配列の長さ：５４０アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Asp Ile Ile Met Asp Phe Lys Thr Met Leu Ser Tyr Leu Val Ser 1 5 10 15 Gln Asp Asp Glu Ile Ser Leu Arg Asn Asp Ile Lys His Glu Glu Val 20 25 30 Tyr Lys Ile Leu Glu Asn Lys Phe Ala Ser Ile Met Pro Lys Phe Lys 35 40 45 Thr Lys Gly Tyr Lys Phe Lys Asp Thr Thr Glu Val Leu Thr Phe Ala 50 55 60 Lys Phe Val Phe Leu Leu Gln Glu Trp Gly Leu Lys Asp Ile Gln Phe 65 70 75 80 Tyr Lys Asn Thr Asn Ser Phe Leu Phe Gly Tyr Ile Ile Pro Gln Ile 85 90 95 Asn Lys Glu Phe Asp Leu Leu Arg Phe Gly Glu Asn Tyr Asn Ile Ser 100 105 110 Ile Glu Leu Lys Ser Lys Thr Thr Val Glu Ala Gln Lys Gln Gln Leu 115 120 125 Cys Lys Asn Tyr Phe Tyr Leu Asn Phe Leu Ser Thr Lys Thr Arg Tyr 130 135 140 Ile Ser Ile Ser Pro Asp Ile Ser Ser Tyr Ile Glu Tyr Ile Pro Ser 145 150 155 160 Glu Asn Lys Tyr Ile Asn Leu Ser Gly Thr Glu Ile Cys Asp Ile Ile 165 170 175 Ile Lys Gln Glu Phe Leu Glu Tyr Asn Thr Lys Glu Val Asp Ser Phe 180 185 190 Phe Asp Ile Lys Asn Tyr Leu Val Ser Pro Phe Asn Asp Val Glu Lys 195 200 205 Phe Leu Asp Asp Lys Tyr Phe Leu Thr Pro His Gln Asp Gln Ile Val 210 215 220 Lys Glu Ile Thr Glu Pro Ser Asp Lys Lys Thr Phe Gly Ile Lys Gly 225 230 235 240 Asn Pro Gly Thr Gly Lys Ser Leu Leu Val Tyr His Ile Cys Lys Lys 245 250 255 Leu Met Glu Lys Asn Lys Arg Val Ala Ile Val His Gly Ala Asn Leu 260 265 270 Asn Asn Gly Gln Gln Arg Leu Ala Leu Arg Gly Phe Thr Ile Phe Pro 275 280 285 Val Lys Ser Ile Ile Glu Val Leu Asp Asn Ala Asp Lys Tyr Asp Tyr 290 295 300 Ile Val Val Asp Glu Ala Gln Arg Leu Arg Gln Asp Leu Gly Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Thr Lys Leu Val Asp Thr Ile Glu Asn Ser Gln Thr Lys Phe Ile 325 330 335 Ile Ser Leu Asp Gly Arg Gln Thr Leu Asn Lys Tyr Glu Ile Glu Glu 340 345 350 Asn Ser Ile Lys Leu Phe Lys Tyr Ile Lys Asn Lys Gly Val Thr Phe 355 360 365 Ser Leu Lys Asp Lys Phe Arg Thr Asn Pro Glu Met Ser Lys Phe Ile 370 375 380 Gln Leu Leu Phe Lys Ile Pro Met Tyr Lys Lys Ile Asp Leu Ile Ser 385 390 395 400 Asn Ile Asp His Asn Ile Ile Ile Lys Tyr Phe Asp Asn Arg Glu Ser 405 410 415 Gly Asn Glu Tyr Ile Ser Asp Met Asp Ser Asn Ser Asp Trp Glu Val 420 425 430 Leu Asn Tyr Thr Lys Asp Arg Phe Arg Lys Thr Gly Ile Gly Lys Met 435 440 445 Cys Gly Asn Gly Leu Thr Ser His Ser Ile Ile Gly Gln Glu Phe Asp 450 455 460 Lys Val Ile Ile Pro Leu Asp Ser Asn Phe Phe Tyr Lys Glu Gln Lys 465 470 475 480 Ile Ile Asp Ser Lys Thr Gly Glu Ser Lys Val Phe Lys Leu Leu Glu 485 490 495 Thr Thr Asp Asn Phe Tyr Pro Leu Glu Lys Met Leu Tyr Gln Asn Leu 500 505 510 Thr Arg Thr Arg Gly Lys Ile Glu Phe Val Ile Ile Gly Asn Arg Ser 515 520 525 Ile Phe Asn Glu Ile Cys Gly Leu Leu Asp Ser Leu 530 535 540

【００４９】配列番号：３配列の長さ：２８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：misc signal 存在位置：３..８他の情報：／機能＝ＥcoＲＩ制限部位配列の特徴特徴を表す記号：misc structure 存在位置：９..２８他の情報：／機能＝配列番号１のヌクレオチド１−２０
と相同性の配列配列 GGGAATTCGA ACATAGAATA GATTACGG 28

【００５０】配列番号：４配列の長さ：２８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：misc signal 存在位置：３..８他の情報：／機能＝ＢamＨＩ制限部位配列の特徴特徴を表す記号：misc structure 存在位置：９..２８他の情報：／機能＝配列番号１のヌクレオチド１８５６
−１８７５に相当するｃＤＮＡと相同性の配列配列 GGGGATCCAA ACTGTTCTGT TGCGAGTG 28

【００５１】配列番号：５配列の長さ：２８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：misc signal 存在位置：３..８他の情報：／機能＝ＥcoＲＩ制限部位配列の特徴特徴を表す記号：misc structure 存在位置：９..２８他の情報：／機能＝配列番号１のヌクレオチド１２９２
−１３１１と相同性の配列配列ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡＣＴＴＴＴＡＧＴＣＴＴ
２８

【００５２】配列番号：６配列の長さ：２８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ配列の特徴特徴を表す記号：misc signal 存在位置：３..８他の情報：／機能＝ＥcoＲＩ制限部位配列の特徴特徴を表す記号：misc structure 存在位置：９..２８他の情報：／機能＝配列番号１のヌクレオチド１７７３
−１７９２に相当するｃＤＮＡと相同性の配列配列 GGGAATTCTA AAAATTGAAC GATTTCCA 28

【００５３】配列番号：７配列の長さ：３２３６塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｇenomic ＤＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：ラクトコッカス・ラクティス(Ｌactococcus la
ctis) 配列 AAGCTTTACG TCTTGCTTTG AAAATTTCTC AGGTCTTCCT CCAAGTCGTC CTCTTGCACG 60 TGCAGCTTCT CTACCAGCGG CAGAACGCTC CAAAATAAGA TTTCGCTCAA ATTCCGCAAA 120 AGCCGCAAAC AAATGAAACA TCAATTGTCC AGTCGAACTT GATTTATCCA TTGTAATATT 180 TTCTTGCAAG CTATGGAAAC TTACTCCTTT ATCATTAAGT GAATTAACTA TGCTAATTAA 240 GTCCTCCATA TTTCTTCCTA ATCTATCTAA CCGCCAAACA ACAATTGTAT CTCCAGAACG 300 AGAAAATTCG ATGGCGGATT TTAAACCAGG TCTTTCTTTT TTACTTCCTG ACATATGGTC 360 AGTAAATATT TTTTCACAGT TATATTTTTT GAGACTATCT TTTTGTAAAT CCAAATTTTG 420 AAGTCCAGTT GAAACTCGTG CGTATCCTAT ATTCATTTTT TTCTCCTTCA TTTTAATTTA 480 TTGTATCATA ACTTAAAAAT ATATGTATAA ATGAACATAG AATAGATTAC GGGTTAATGG 540 ACAATAAATG CAAACGATTT TGAGAAATTT AATAAGAAAA GAAGAGTGTC CAGAAAATGA 600 CCATTTTCTG AACGCCATAT TAAAAATTTT TTGATAATTC CCAATATATT ATAATATAGC 660 TTCAATGTTA AAATTTATAT GATATAATAT AAGAAAATTT TTAAAAAAAT AGAATGGATA 720 TAATAATGGA CTTTAAAACT ATGTTAAGCT ATCTTGTAAG TCAAGATGAT GAAATTTCTT 780 TAAGAAATGA TATTAAACAT GAAGAAGTAT ATAAAATTTT AGAGAATAAG TTTGCTTCTA 840 TAATGCCGAA GTTTAAAACA AAAGGTTATA AGTTTAAAGA TACTACTGAA GTTTTGACAT 900 TCGCTAAATT TGTATTTTTG CTACAAGAGT GGGGGTTGAA GGATATACAG TTTTATAAGA 960 ACACTAATAG TTTCTTATTT GGATATATTA TACCGCAAAT TAATAAAGAA TTTGATTTAT 1020 TGAGATTTGG GGAAAATTAC AATATTAGTA TAGAACTCAA AAGTAAAACA ACAGTAGAAG 1080 CACAAAAGCA ACAACTTTGT AAGAACTATT TTTACCTAAA TTTTTTATCA ACTAAAACTA 1140 GGTATATTAG TATATCCCCA GATATATCTA GTTACATAGA ATATATTCCA AGTGAAAATA 1200 AGTATATCAA TTTAAGTGGA ACTGAAATTT GTGATATTAT TATTAAACAA GAGTTTTTAG 1260 AGTATAATAC AAAAGAGGTT GATAGTTTTT TTGATATAAA AAATTATTTA GTTTCTCCTT 1320 TCAATGATGT TGAAAAATTT CTTGATGATA AATATTTTTT AACACCTCAC CAAGACCAGA 1380 TTGTTAAAGA AATTACTGAA CCAAGTGACA AAAAAACTTT TGGTATAAAA GGAAATCCAG 1440 GAACAGGAAA ATCTTTGCTA GTTTACCATA TATGTAAAAA ATTAATGGAG AAAAATAAAA 1500 GAGTTGCTAT AGTTCATGGA GCAAATCTAA ATAATGGTCA ACAAAGATTA GCTCTGCGTG 1560 GTTTCACAAT TTTTCCTGTT AAATCGATCA TAGAGGTATT AGATAATGCA GACAAATACG 1620 ATTACATTGT TGTTGACGAA GCTCAACGTC TAAGACAAGA CTTAGGAGAA CAATATACTA 1680 AATTGGTTGA TACTATTGAA AATTCTCAAA CAAAATTTAT TATCTCACTA GATGGAAGAC 1740 AAACTTTGAA TAAATATGAA ATAGAAGAAA ATTCCATAAA ATTATTTAAA TATATAAAAA 1800 ATAAAGGAGT AACTTTTAGT CTTAAAGATA AGTTTAGAAC TAACCCAGAA ATGAGCAAAT 1860 TTATCCAACT TCTATTCAAA ATACCCATGT ATAAAAAAAT AGATTTAATT TCAAACATAG 1920 ATCATAATAT TATAATTAAA TATTTTGATA ACAGAGAATC GGGAAATGAA TATATTTCCG 1980 ATATGGATTC AAACTCAGAT TGGGAAGTAC TTAATTACAC GAAGGATAGA TTTAGGAAAA 2040 CAGGAATTGG TAAAATGTGT GGTAATGGTT TAACATCACA TAGTATTATC GGTCAAGAAT 2100 TTGATAAAGT TATTATACCT TTGGATTCGA ATTTTTTTTA TAAAGAACAA AAAATAATTG 2160 ATAGTAAAAC GGGTGAAAGT AAAGTTTTTA AATTATTGGA AACGACTGAT AATTTTTACC 2220 CACTTGAAAA AATGTTATAT CAAAATCTTA CTCGCACAAG GGGAAAAATA GAATTTGTAA 2280 TTATTGGAAA TCGTTCAATT TTTAATGAAA TATGTGGATT GCTAGATAGT TTATAAAGTT 2340 CTGTCTCAAA GTTAAAAAAA GTGAAATCAC TCGCAACAGA ACAGTTTGAC ATTAAGTCCA 2400 TTTCTTATAC CCAAAAATGT ATAATTCTAA TCTATTTATT TTAGGAAATT ATTTTTTCAA 2460 AATGATTTGG AGTGAGATAC CCCAAACTTT GATGGATTCT TTTAAATAAA ATTTCAAAGC 2520 GCTCACTCCA GAAATGCTAA GTTTCGGAAA AAATTTGAAT TTTTCGTAAA GATATTATTT 2580 TTGGAGTGAA AATCATAAAA TTCTTCTTTT AAAAACTTCC GCAAGTTTTT TAAGGAAAAT 2640 AGTTACTTAC GTCCAAACTC AAAAAATTTT TATAAAATTG TAGTTCATTT GACGGTAAGT 2700 CTTATTATTT AATGATACCT AGTAGTTAAT AATTTGATTA TATTTGTAAT TACAGATATA 2760 ATCAAATTAT TTGGAGGTAT TAATAGTATG GAAAGTAAGT TTAACGGAGA TGAGTCTGGA 2820 TATTATGATA ATAAAGATAA TTTTTATATT AATGGCTCTT TAAAATATAA AGACGATATG 2880 GAAGTTGGTC CAATTTTACA GCATGAGCAT GGACATTGGT TTATTTTTAT GACATCTTCA 2940 CTAGGGCTCT TAATTCGTAT GTGTTCAAAA ATATCAATAA CAGACAATAG TAAAGATTTA 3000 ATTTTGGAGG GATTAAGTAA GTATTATAGA AGAATGAATG AGGAAGTTGC TACATATACT 3060 GAGATGATAA CATATCTTAT GATGAATGGT AGAGAACAAT TTCTTCGCAA AGTTGATTAT 3120 CTAAAATATA ATAATAAGTC ATACTATAAA TACTATAAAA AATTATCTTG TAGAAATATT 3180 TTATTGAGTC AGTCAATGAT TTTAACTTAT GATAAAGAAA AACTTAAAAA GCTT 3234

【図面の簡単な説明】

【図１】 pＰＦ１４４−１の３.３kbフラグメントの制
限地図を示す図。

【図２】 pＰＦ１４４−１の３.３kbの内部フラグメン
トのＰＣＲ法による増幅を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ファビアン・プレボフランス31400トゥールーズ、リュ・ボナ 68番バティマン・デー (72)発明者エリザベト・レミーフランス31000トゥールーズ、プラス・デ・カルメス11番 (72)発明者ポール・リッツェンターラーフランス31320カスタネ、シュマン・ゲソ（番地の表示なし)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）配列番号１の核酸配列を有するＤＮ
Ａ配列；ｂ）該配列またはそのフラグメントとハイブリダイズす
るＤＮＡ配列；およびｃ）対応するｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列からなること
を特徴とする、少なくとも１つのファージ耐性機構を有
する核酸配列。
【請求項２】請求項１記載の核酸配列を含有すること
を特徴とする、少なくとも１つのファージ耐性機構を有
するプラスミド。
【請求項３】請求項２記載のプラスミドを少なくとも
１つ含有することを特徴とするファージ耐性乳酸菌。
【請求項４】請求項３記載の乳酸菌を使用することを
特徴とする、産業的に重要な菌株にファージ耐性機構を
与える方法。