DE3689925T2

DE3689925T2 - pTR 2030, konjugales Plasmid und Derivate desselben, die an die N-Streptokokken-Gruppe eine Phage-Resistenz abgeben.

Info

Publication number: DE3689925T2
Application number: DE19863689925
Authority: DE
Inventors: Todd Robert Klaenhammer; Rosemary Barbara Sanozky-Dawes; Wesley Davis Sing; Larry Ray Steenson
Original assignee: University of California; University of North Carolina System
Current assignee: University of California; University of North Carolina System
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1986-06-25
Publication date: 1995-02-02
Anticipated expiration: 2006-06-26
Also published as: DE3689925D1; EP0208468B1; EP0208468A2; EP0208468A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Plasmid pTR2030 und Derivate davon. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Plasmid pTR2030, das eine oder mehrere genetische Determinanten für die Phagen-Resistenz von Streptokokken der Gruppe N trägt, und Derivate dieses Plasmids, die ebenfalls mindestens eine der gleichen genetischen Determinanten tragen.
Bei der Produktion von Käse und kultivierten Molkereiprodukten hat man sich lange auf die Fermentation von Milch durch Streptokokken der Gruppe N gestützt. Die Mitglieder dieser Gruppe, die aus Streptokokkus lactis, S. cremoris und der S. lactis-Unterart Diacetylactis zusammengesetzt ist, sind direkt für die Säureentwicklung, Geschmacksbildung und häufig für die Gerinnungseigenschaften mesophiler Molkereifermentationen verantwortlich. Da effiziente Milchfermentationen vom Wachstum und der Aktivität der lactischen Streptokokken abhängig sind, wurde große Sorgfalt darauf verwendet, Starter-Kulturen herzustellen, die hochaktiv sind und nicht mit unerwünschten Mikroorganismen oder Bakteriophagen kontaminiert sind. Der Fermentationsprozeß selber ist jedoch nicht aseptisch und läuft in offenen Bottichen mit einem nichtsterilen Medium ab, nämlich pasteurisierter Milch. Er ist daher hochanfällig gegen Kontamination mit Bakteriophagen. Bei der Mehrzahl der lactischen Streptokokken-Stämme, die bei kommerziellen Molkereifermentationen verwendet werden, können lytische Bakteriophagen, die das Wachstum und die Säureproduktion zum Stocken bringen, innerhalb von 1 bis 2 Tagen nach der Einführung der Kultur in die Käseanlage auftreten. Obwohl bei zahlreichen industriellen Fermentationen die Kontamination mit Bakteriophagen beobachtet wird, ist die zerstörerische Rolle von Bakteriophagen bei Milchfermentationen ohne Parallele bei anderen Fermentationsprozessen.
(Nach der Einreichung dieser Anmeldung ist der taxonomische Name der Streptokokken der Gruppe N zu "Lactokokken" geändert worden und die Mitglieder der Gruppe wurden in L. lactis, L. cremoris bzw. L. lactis-Unterart Diacetylactis umbenannt).
Historisch stützten sich die Milchfermentationen auf Starter-Kulturen, die aus undefinierten Gemischen lactischer Streptokokken zusammengesetzt waren und die ohne irgendeine Kenntnis über oder Schutz vor Bakteriophagen fortgepflanzt wurden. Die natürliche Phagen-Kontamination dieser Kulturen begründete ein Gleichgewicht zwischen der Entwicklung von Bakteriophagen und phagen-resistenten Varianten. Diese Kulturen waren hinsichtlich der von Tag zu Tag produzierten Säuremengen stark variabel, blieben aber mittelmäßig aktiv und konnten kontinuierlich in kleinen Fermentationsfabriken verwendet werden. Seit den letzten 20 Jahren sind aufgrund von Bakteriophagen-Infektion versagende Starter-Kulturen überall in der Molkereiindustrie weit verbreitet. In den letzten Jahren hat eine ansteigende Nachfrage für kultivierte Milchprodukte Erhöhungen sowohl der Produktionskapazität als auch der Verfahrensleistungsfähigkeit notwendig gemacht, so daß größere Volumina Milch verarbeitet wurden, die Käse-Bottiche während eines einzigen Tages wiederholt gefüllt wurden und die Gesamtverarbeitungszeit verkürzt war. Diese Modernisierung der Industrie erhöhte gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit der Phagen-Kontamination und schrieb außerdem die Verwendung von definierten Gemischen lactischer Streptokokken vor, die zur gleichförmigen raschen Säureproduktion in der Lage sind. Mit der Selektion von hochfermentativen lactischen Streptokokken und ihrer Fortpflanzung unter aseptischen Bedingungen (in Abwesenheit von Bakteriophagen) ist die Mehrzahl der nun in der Industrie verwendeten Kulturen nach der Einführung in die Käsefabrik stark anfällig gegen Befall mit Bakteriophagen geworden.
Um mit den Bakteriophagen-Problemen fertig zu werden, wurde eine Reihe von erfolgreichen Verfahren entwickelt, um die Phagen-Wirkung während der kommerziellen Milchfermentationen zu minimieren. Durch die Verwendung von konzentrierten Kulturen, aseptischen Hauptstarter-Gefäßen und Phagen inhibierenden Medien (vgl. beispielsweise US-Patent 4 282 255) kann die Starter-Kultur vor der Infektion mit Bakteriophagen vor der Inokulation des Bottichs geschützt werden. Im Anschluß an den Einlaß in den Fermentationsbottich kann die Phagen-Kontamination jedoch nicht verhindert werden. Daher verschiebt sich hinsichtlich des Schutzes der Kulturen der Schwerpunkt in Richtung auf die Minimierung fruchtbarer Wechselwirkungen zwischen Phage und Wirt, und zwar durch Abwechslung mit Stämmen ohne Beziehung zu Phagen oder die Verwendung von phagen-resistenten Mutanten in Startern mit mehreren Stämmen. Obwohl die Stamm-Abwechslung theoretisch die Entwicklung von Phagen-Populationen in der Anlage minimieren sollte, hat es sich in der Praxis als schwierig erwiesen, Stämme zu identifizieren, die bezüglich der Phagen-Empfindlichkeit völlig unterschiedliche Muster zeigen. Die Gesamtanzahl verschiedener, mit Phagen nicht in Beziehung stehender, lactischer Streptokokken wird weltweit auf ungefähr 25 Stämme geschätzt. In Anbetracht der geringen Zahl verfügbarer, mit Phagen nicht in Beziehung stehender Stämme, ist die Auswahl von Stämmen zur Verwendung in Abwechselprogrammen stark beschränkt. Entsprechend sind wenige mit Phagen nicht in Beziehung stehende Stämme zur Konstruktion von Startern mit mehreren Stämmen, die Zusammensetzungen aus 4 bis 6 Stämmen enthalten, erhältlich.
Vor zehn Jahren haben Sandine, W. E. et al., J. Milk Food Technol., 35, 176 (1972) das Erfordernis betont, neue Stämme lactischer Streptokokken zur Verwendung in der Molkereiindustrie zu isolieren. Unter den Kriterien zur Selektion dieser Stämme stand an erster Stelle die Resistenz gegen existierende Bakteriophagen. Es ist mittlerweile anerkannt, daß einige Stämme lactischer Streptokokken von keinerlei Phagen befallen werden, wenn sie mit umfangreichen Sammlungen von Laboratoriums-Phagenbänken in Kontakt gebracht werden oder wenn sie in kommerziellen Fermentationen kontinuierlich und lange Zeit verwendet werden. Diese Berichte demonstrieren die Existenz von lactischen Streptokokken, die nicht empfindlich gegen den Befall mit Bakteriophagen sind, und zwar ungeachtet des überwältigenden Phagendrucks wie beispielsweise dem routinemäßig in der Fabrikumgebung auftretenden. Bis heute wurde jedoch lediglich eine beschränkte Anzahl phagen-unempfindlicher Stämme identifiziert und auf die Mechanismen der Phagen-Resistenz untersucht.
Mehrere Mechanismen der Phagen-Resistenz von Streptokokken der Gruppe N sind identifiziert worden und scheinen plasmid-gebunden zu sein. McKay, L. L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 47, 68 (1984) beschreibt ein 40 Megadalton-Plasmid, nämlich pNP40, das in der S. lactis- Unterart Diacetylactis DRC3 gefunden wurde. Wenn das Plasmid durch Konjugation auf S. lactis C2 transferiert wurde, wurden Transkonjuganten isoliert, die bei 21ºC und 32ºC gegen den Phagen c2 resistent waren, aber nicht bei 37ºC. Es wurde gefunden, daß die Resistenz gegen c2 nicht auf einer Inhibition der Phagen-Adsorption oder auf einem klassischen Modifikations-Restriktionssystem beruht, aber es wurde vermutet, daß es sich dabei um eine temperatursensitive DNase handelt. Die Autoren schlußfolgerten, daß die genetische Determinante für diese Resistenz auf pNP40 lokalisiert ist.
Sander, M. E., et al., Appl. Environ. Microbiol. 47, 979 (1984) berichteten, daß S. lactis ME2 gegen eine Vielzahl von Phagen unempfindlich ist. Die Autoren ermittelten, daß diese Unempfindlichkeit das Ergebnis mehrerer temperatursensitiver Mechanismen ist, einschließlich: (a) der Verhinderung der Phagen-Adsorption, (b) des Modifikations- Restriktionssystems und (c) der Unterdrückung der Phagen- Entwicklung. Die Autoren berichteten, daß die genetischen Determinanten für einige dieser Mechanismen sich auf Plasmiden befinden, das aber andere sich auf den Chromosomen zu befinden scheinen.
Sanders, M. E. et al., Appl. Environ. Microbiol. 46, 1125 (1983) offenbaren, daß S. lactis ME2 ein Plasmid enthält, namlich pME0030, das eine Funktion codiert, welche die Phagen-Adsorption verhindert. Sanders, M. E. et al., Appl. Environ. Microbiol. 42, 944 (1981) offenbaren, daß ein in S. cremoris KH gefundenes 10 Megadalton-Plasmid ein Modifikations-Restriktionssystem codiert, daß es diesem Stamm ermöglicht, gegen den Phagen c2 resistent zu sein.
Gonzalez, C. F. et al., Appl. Environ. Microbiol. 49, 627 (1985) berichten, daß zwei Transkonjuganten zweier Paarungen von S. lactis SLA 2.24 oder SLA 3.15 und S. lactis-Unterart Diacetylactis SLA 3.10 bzw. SLA 3.23 eine temperaturunabhängige Phagen-Resistenz zeigen, die nicht auf Adsorption oder Einschränkung des Phagen-Wachstums beruht. Greifbare Beweise für die Beteiligung eines Plasmids gab es jedoch nicht.
Die Identifizierung oder Erzeugung von Plasmiden, die in Streptokokken der Gruppe N Phagen-Resistenz codieren, ist notwendig, um gentechnologisch Stämme herzustellen, welche die industriellen Kriterien für das Fermentationsvermögen und die Langzeit-Phagen-Resistenz erfüllen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Plasmid bereit, das auf Streptokokken der Gruppe N Phagen-Resistenz überträgt. Die das Plasmid oder ein Derivat davon enthaltenden Streptokokken der Gruppe N sind zur Formulierung von Starter-Kulturen verwendbar, die zur Herstellung von Käse und kultivierten Molkereiprodukten verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Plasmid oder ein Derivat davon, das auf Streptokokken der Gruppe N Phagen-Resistenz überträgt. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Streptokokken der Gruppe N, die das Plasmid oder Derivat enthalten. Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem Starter-Kulturen, die derartige Streptokokken enthalten.
Konkreter stellt die vorliegende Erfindung folgendes bereit:
das Plasmid pTR2030, das durch ein Molekulargewicht von 30,0 ± 3,0 Megadalton gekennzeichnet ist und die folgende Empfindlichkeit gegen Restriktionsendonukleasen aufweist:
Enzym Anzahl/Stellen
HindIII 16
HaeIII 4
EcoRI 8
XbaI 5
HpaI 3
NcoII 5
AvaI 2
und eine oder mehrere genetische Determinanten für die Phagen-Resistenz von Streptokokken der Gruppe N (Lactokokken) trägt und die Phänotypen Tra&spplus;, Clu&supmin;, Hsp&spplus; und Hrp&spplus; zeigt, wobei das Plasmid aus S. Lactis TRSI-a(ATCC 53146) oder S. Lactis TEKI (ATCC 53167) erhältlich ist.
pTR2030 trägt eine oder mehrere genetische Determinanten, die Phagen-Resistenz verleihen. Mit Derivaten von pTR2030 soll hier jedes Plasmid gemeint sein, das zur Replikation, Transkription und Translation in Streptokokken der Gruppe N (Lactokokken) in der Lage ist und die genetischen Determinanten für die Phagen-Resistenz von pTR2030 trägt. Die Erfindung umfaßt außerdem Streptokokken der Gruppe N, die das Plasmid pTR2030 oder Derivate davon enthalten, und Starter-Kulturen, die diese Streptokokken der Gruppe N enthalten. Bevorzugte Streptokokken sind beispielsweise Stämme von S. lactis, S. lactis-Unterart Diacetylactis und S. cremoris.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Plasmid pTR2030 und seine Derivate, die zur Übertragung der Phagen-Resistenz auf Streptokokken der Gruppe N verwendet werden können. Letztere können zur Formulierung von Starter-Kulturen verwendet werden, die zur Herstellung von Käse und kultivierten Molkereiprodukten verwendbar sind. pTR2030 und seine Derivate sind auch zur Übertragung der Phagen-Resistenz auf andere gram-positive Milchsäure-Bakterien verwendbar, die in der Molkerei- und Lebensmittelfermentierung verwendet werden. pTR2030 trägt eine oder mehrere genetische Determinanten, welche die Phagen-Resistenz übertragen. Das Plasmid trägt außerdem genetische Determinanten zur Transferierung durch Konjugation. Die genetische Determinante fördert sowohl ihre eigene Transferierung als auch die Transferierung anderer nicht-konjugativer Plasmide. Mit Derivat von pTR2030 ist hier jedes Plasmid gemeint, das zur Replikation, Transkription und Translation in Streptokokken der Gruppe N oder in anderen gram-positiven Milchsäure-Bakterien in der Lage ist, und bei dem es sich entweder (a) um pTR2030 mit insertierten DNA-Sequenzen oder (b) pTR2030 mit deletierten DNA-Sequenzen oder (c) pTR2030 mit insertierten und deletierten DNA-Sequenzen oder (d) ein Plasmid handelt, in das ein signifikanter Anteil mindestens einer der genetischen Determinanten von pTR2030 für die Phagen-Resistenz insertiert ist.
Das Plasmid pTR2030 wurde aus einem Transkonjugat einer Paarung von S. lactis ME2 und S. lactis LM0230 isoliert. pTR2030 hat ein Molekulargewicht von 30 · 10&sup6; Dalton ± 10%. Dies entspricht etwa 45 Kilobasen. pTR2030 entstand als Ergebnis des Konjugationsvorgangs und unterscheidet sich von Plasmid pME0030, einem 30 Megadalton-Plasmid aus S. lactis ME2, was durch die verfügbaren phänotypischen Merkmale ersichtlich ist. Erstens wurde demonstriert, daß Hsp+ (Sanders, M. E. et al. (1983), supra und Sanders, M. E. et al. (1984), supra) und Tra&spplus; von S. lactis N1, einem Derivat von S. lactis ME2, das mit pME0030 behandelt wurde, gezeigt wird. pTR2030 codiert sowohl Hsp&spplus; als auch Tra&spplus;. Zweitens zeigt, wenn die Gegenwart von pME0030 die Adsorption des Phagen 18 an S. lactis ME2 inhibiert, die Gegenwart von pTR2030 in S. lactis LM0230 keine Wirkung auf die Adsorption des Phagen c2 oder des Phagen 18 (99% Adsorption für beide Phagen). Drittens beträgt die Konjugationsfrequenz für Lac&spplus;, Nisr und Hsp&spplus; bei pTR2030 tragenden Transkonjuganten 10&supmin;¹/Donorzelle, im Vergleich zu einer Frequenz von 10&supmin;&sup6;/Donorzelle bei pME0030 tragenden S. lactis ME2.
Tabelle 1 zeigt die Empfindlichkeiten von pTR2030 gegen Restriktionsendonukleasen. Die Größen der erzeugten Fragmente sind in Tabelle 1 ebenfalls angegeben. Tabelle 1 Restriktionsenzym Anzahl Fragmente* Größen (Md) Gesamt
* Es können sich nicht nachgewiesene kleine Fragmente auf den Gelen befinden, die unter den folgenden Bedingungen laufen gelassen wurden: 0,8% ME-Agarose (FMC), 3 mm dickes Gel (Unterwasser) in Tris-Acetat-Puffer (40 mM Tris, 12 mM Na-Acetat, 1 mM Na&sub2;-EDTA, pH 7,8, mit Eisessig). Elektrophorese-Bedingungen: 5 Volt/cm, 2,5 h.
Das Plasmid pTR2030 zeigte die Phänotypen Tra&spplus;, Clu&supmin;, Hsp&spplus;, Hrp&spplus;. Diese Phänotypen werden wie folgt beschrieben:
Tra&spplus;: pTR2030 ist ein konjugatives Plasmid, das seine eigene Transferierung und die Transferierung von anderen nicht-konjugativen Plasmiden fördert. Beispielsweise ist pTR2030 für die Transferierung des nicht-konjugativen Plasmids pTR1040 (Lac&spplus;, Nisr) verantwortlich. In Abwesenheit von pTR2030 kommt es nicht zur Konjugation von pTR1040. Folglich kann pTR2030 zur Mobilisierung anderer Plasmide in Streptokokken der Gruppe N und möglicherweise anderen gram-positiven Bakterien (d. h. S. faecalis, Lactobacilli) verwendet werden.
Clu&supmin;: pTR2030 zeigt bei Paarungen auf der Oberfläche von Agar eine hohe Frequenz bei der Transferierung durch Konjugation. Bei Paarungen zwischen S. lactis TRS1 (Donor) und S. lactis LM 2302 (Rezipient) beträgt die Frequenz der Transferierung durch Konjugation 10&supmin;¹/Donorzelle. pTR2030 induziert im flüssigen Medium nicht den "Clumping-Phänotyp" (Clu&spplus;), der früher bei mit hoher Frequenz konjugierenden Plasmiden von Streptokokken der Gruppe N beobachtet wurde. (Walsh, P. M. et al., J. Bacteriol. 146, 937 (1983); Anderson, D. G. et al., J. Bacteriol. 158, 954 (1984); Gasson, M. J. et al., J. Bacteriol. 143, 1260 (1980)). Dieser Clu&supmin;-Phänotyp ist am meisten erwünscht, weil die Gegenwart seines konjugalen Plasmids nicht zur Zellaggregation bei pTR2030 tragenden Transkonjuganten führt. Aggregierende Kulturen sind für die meisten Anwendungen in Molkerei- und Lebensmittelfermentierungen ungeeignet.
Hsp&spplus;: pTR2030 zeigt hitzeempfindliche Phagen-Resistenz, wenn es in S. lactis LM0230 vorhanden ist. pTR2030 enthaltende Zellen, die bei 30ºC dem Phagen c2 ausgesetzt werden, bilden kleine Plaques (-1 bis 2 mm im Durchmesser), und zwar mit einer Plaque-Bildungsleistung von 0,83. Die normale Plaque-Größe für den Phagen c2 auf S. lactis LM0230 beträgt bei 30ºC im Durchmesser 4 bis 5 mm. Wenn pTR2030 enthaltende Zellen fortgepflanzt und bei 40ºC dem Phagen c2 ausgesetzt werden, sind normale Plaque-Größen von 4 bis 5 mm beobachtbar. Die Plaque-Größe wurde mit der Wurfgröße des Phagen in Beziehung gesetzt und zeigte sich von der Gegenwart von pTR2030 und der Temperatur des Assays abhängig. Die durch pTR2030 bewirkte Verringerung der Wurf- und Plaque-Größe tritt bei 30ºC auf, aber nicht bei 40ºC.
Hrp&spplus;: pTR2030 zeigt hitzebeständige Phagen-Resistenzeigenschaften, wenn es in den S. cremoris-Stämmen, HP, M43a, 924, KH und TDM1 vorhanden ist. Lytische Phagen, die für die Eltern-S.-cremoris-Stämme (Φhp, Φm12r·M12, Φ924, Φkh bzw. Φ18) virulent sind, zeigen bei pTR2030-Transkonjuganten unter Inkubationsbedingnngen von 30ºC oder 40ºC keine Plaque-Bildung (Plaque-Bildungsleistung (EOP) < 10&supmin;&sup9;). Dieser Hrp&spplus;-Phänotyp beschreibt die temperaturunabhängige Einschränkung der Plaque-Bildungsleistung für virulente Phagen auf pTR2030 beherbergenden S. cremoris-Transkonjuganten.
Die Derivate von pTR2030 umfassen die folgenden Plasmide: (a) das Plasmid pTR2030, in das DNA-Sequenzen insertiert sind, (b) das Plasmid pTR2030, aus dem DNA-Sequenzen deletiert sind, (c) das Plasmid pTR2030, in das DNA-Sequenzen insertiert und aus dem DNA-Sequenzen deletiert sind und (d) jedes Plasmid, in das mindestens eine der genetischen Determinanten von pTR2030 für die Phagen-Resistenz insertiert ist. Außerdem kann ein Derivat von pTR2030 jedes Plasmid umfassen, in das irgendeine DNA-Sequenz von pTR2030 insertiert ist. Vorzugsweise enthält jedes dieser Derivate mindestens eine der genetischen Determinanten von pTR2030 für die Phagen-Resistenz. Außerdem enthält jedes dieser Derivate vorzugsweise die genetischen Determinanten von pTR2030 für die Transferierung durch Konjugation.
Die Derivate von pTR2030 können unter Verwendung von Techniken hergestellt werden, die im Fachgebiet gut bekannt sind. So können Insertionen und/oder Deletionen an pTR2030 unter Verwendung von Standardtechniken vorgenommen werden. Viele Standardtechniken sind in Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben. Auf ähnliche Weise kann die genetische Determinante von pTR2030 für die Phagen-Resistenz (oder jede andere pTR2030-DNA-Sequenz) in jedes Plasmid insertiert werden, und zwar unter Verwendung von üblichen Techniken, wie den von Maniatis, T. et al., supra, beschriebenen. Eine genetische Determinante kann zuerst aus pTR2030 isoliert und dann in ein zweites Plasmid insertiert werden. Das zweite Plasmid kann außerdem maßgeschneidert werden, wenn dies erforderlich ist. Eine genetische Determinante von pTR2030 für die Phagen-Resistenz kann folgendermaßen isoliert werden. Die Restriktionsfragmente von pTR2030 werden isoliert und in ein geeignetes Plasmidvehikel für S. cremoris HP (ATCC Nr. 11602) insertiert. Das rekombinante Plasmid wird dann in S. cremoris HP insertiert und die transformierten Bakterien werden auf Empfindlichkeit gegen den Phagen Φhp untersucht. Resistente Kolonien enthalten ein Plasmid, das mindestens eine der genetischen Determinanten von pTR2030 für die Phagen-Resistenz trägt. Das Restriktionsfragment mit dieser Determinante kann unter Verwendung üblicher Techniken so verändert werden, wie es erforderlich ist.
Geeignete Wirte für das Plasmid pTR2030 oder seine Derivate sind alle Mikroorganismen, in denen pTR2030 oder seine Derivate zur Replikation in der Lage sind. Bevorzugte Wirte sind Streptokokken der Gruppe N, die Stämme umfassen, die zur Herstellung von Käse und kultivierten Molkereiprodukten verwendet werden. Beispiele für diese Wirte sind Stämme von S. lactis, S. lactis-Unterart Diacetylactis und S. cremoris. Zusätzliche Wirte sind beispielsweise andere gram-positive Milchsäure-Bakterien, die in Molkerei- und Lebensmittelfermentationen verwendet werden. Beispiele für diese Wirte sind Stämme von Lactobacillus, Pediokokkus und Leuconostoc. Das Plasmid pTR2030 oder seine Derivate können unter Verwendung von Standardtechniken in jeden geeigneten Wirt eingeführt werden. Diese Techniken umfassen beispielsweise sowohl die Transferierung durch Konjugation als auch die Transformation.
Mikroorganismen, die pTR2030 oder seine Derivate enthalten, zeigen vorzugsweise einen phagen-resistenten Phänotyp. Diese Eigenschaft hat zur Folge, daß Mikroorganismen mit pTR2030 oder seinen Derivaten sowohl zur Herstellung von Käse und kultivierten Molkereiprodukten als auch bei Lebensmittel- und Molkereifermentationen extrem nützlich sind. Die Mikroorganismen sind zur leistungsfähigeren Fermentation in der Lage, weil sie nicht empfindlich gegen Phagen sind, die im Fermentationsgefäß vorhanden sind oder dort voraussichtlich auftreten. Die Mikroorganismen, die pTR2030 oder seine Derivate enthalten, sind zur Formulierung von Starter-Kulturen zur Herstellung von Käse und kultivierten Molkereiprodukten verwendbar. Die Herstellung und Verwendung von Starter-Kulturen ist im Fachgebiet gut bekannt. Folglich können Starter-Kulturen formuliert werden, indem ein Mikroorganismus, der pTR2030 oder seine Derivate enthält, anstelle eines gegenwärtig verwendeten Mikroorganismus verwendet wird. Beispielsweise kann ein Stamm von S. cremoris, der pTR2030 enthält, zur Herstellung einer Starter-Kultur verwendet werden, und zwar anstelle des ursprünglichen Stamms von S. cremoris, der pTR2030 nicht enthält.
Die vorliegende Erfindung wird außerdem unter Bezugnahme auf die folgenden nichtbeschränkenden Beispiele beschrieben.

Beispiel 1

Isolierung von Plasmid pTR2030

Streptococcus lactis ME2 (Konjugationsdonor, Lac&spplus;, Hsp&spplus;, Nisr, Strs) wurde mit Streptococcus lactis LM0230 (plasmidbehandelter Rezipient, Lac&supmin;, Hsp&supmin;, Niss, Strr) auf der Qberfläche von Milch-Glucose-Agarplatten gepaart, und zwar wie von McKay, L. L. et al., Appl. Environ. Microbiol. 40, 84 (1980) beschrieben. Donor- und Rezipienten-Zellen wurden bei 30ºC 4 h in M17-Lactose- oder M17-Glucose-Brühen fortgepflanzt. Die M17-Brühe wurde wie von Tarzaghi, B. E. et al., Appl. Microbiol. 29, 807 (1975) beschrieben verwendet. Lactose oder Glucose waren in einer Konzentration von 0,5% vorhanden. Ein Teil der S. lactis ME2-Zellen wurde mit zwei Teilen S. lactis LM0230-Zellen gemischt und 0,2 ml der Suspension wurden mit einem sterilen Glasstab auf der Qberfläche einer vorgegossenen Milch-Glucose-Agarplatte ausgestrichen. Die Platten wurden bei 30ºC 18 h inkubiert. Dann wurden 2 ml einer Brühe, die 1% Glucose und 5% Nichtfett- Trockenmilch-Feststoffe enthielt, auf die Qberfläche der Platten gegeben und mit einem sterilen Glasstab vermischt. 1 ml dieses Zell-Gemisches wurde entnommen und 0,2 ml Aliquots wurden auf der Oberfläche von fünf Selektionsplatten verteilt, die Lactose-Indikator-Agar (McKay, L. L. et al., Appl. Microbiol. 23, 1090 (1972)) und 1 mg/ml Streptomycinsulfat enthielten. Die Selektionsplatten wurden bei 30ºC 48 h inkubiert und auf das Vorhandensein von gelben Kolonien untersucht. Die Rekombinanten erwiesen sich aufgrund des Phänotyps und des Genotyps als Lac&spplus;/Strr- Transkonjuganten. Die Frequenz des Lac&spplus;-Transfers vom Donor zum Rezipienten durch Konjugation betrug 2,8 · 10&supmin;&sup6;/Donorzelle. Alle Lac&spplus;-Transkonjuganten wurden bezüglich der Nisin-Resistenz oder -Empfindlichkeit bewertet, und zwar zu Anfang in Elliker-Brühe oder Elliker-Agar (1,5% g/v Agar, pH 6,5), die/der 0,1% (v/v) Tween 20 und 100 ng/ml Nisin enthielt. Die Nisin-Stammlösungen wurden wie von McKay, L. L. et al. (1984), supra, beschrieben in 0,02 m HCl hergestellt und mit 10% (g/v) Elliker-Brühe auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Alle Lac&spplus;-Transkonjuganten waren auch Nisr und enthielten ein 40 Megadalton-Plasmid, nämlich pTR1040.
Die Lac&spplus;/Nisr/Strr-Transkonjuganten, die durch Paarungen zwischen S. lactis ME2 und S. lactis LM0230 erzeugt worden waren, wurden auf ihre Empfindlichkeit gegen den lytischen Phagen c2 untersucht. Die Plaque-Assays wurden folgendermaßen durchgeführt. Die Phagen-Adsorption wurde wie von Sanders, M. E. et al., Appl. Environ. Microbiol. 40, 500 (1980), beschrieben gemessen. Der Phagen-Assay, d. h. PFU/ml, wurde wie von Terzaghi, B. E. et al., supra, beschrieben durchgeführt. Die Wurfgröße wurde wie folgt ermittelt. Zellen (1 ml) aus Kulturen, die 3,5 h bei 30ºC oder 40ºC fortgepflanzt worden waren, wurden in ein steriles Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) gegeben.
Nach 3 min. Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, die Pellets wurden in 1 ml frischer M17-Glucose-Brühe und 50 ul 1 M CaCl&sub2;·7H&sub2;O resuspendiert, und dann wurden 100 ul Phage c2 (10&sup8; -10&sup9; p.f.u./ml) zugegeben. Die Brühe wurde vorsichtig durchmischt und 5 min bei 30ºC oder 40ºC inkubiert, um die Adsorption des Phagen zu ermöglichen. Nach 4 min Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt, und die Zellen wurden in 1 ml M17-Glucose-Brühe plus Calcium (50 ul 1 M CaCl&sub2;·7H&sub2;O in 10 ml M17-Glucose) resuspendiert. Diese Zellsuspension wurde mit M17-Glucose-Brühe plus Calcium auf 10 verdünnt. Die verdünnten, phagen-infizierten Zellsuspensionen wurden 45 min bei 30ºC oder 40ºC inkubiert. Nach 0 min und 45 min wurden Proben von 1 ml entnommen und sofort dem Plaque-Assay ohne Behandlung mit Chloroform unterzogen. Die Wurfgröße wurde als Anzahl der Phagennachkommen bei 45 min, dividiert durch die Gesamtzahl infizierter Zentren zur Zeit 0, berechnet. In derartigen Assays zeigten 4% der Transkonjuganten Plaques, die signifikant kleiner waren als die auf dem konjugalen Rezipienten, nämlich S. lactis LM0230, für den Phagen c2 beobachteten. Die Wurfgröße des Phagen c2 auf den Transkonjuganten bei 30ºC war im Vergleich zu einer Wurfgröße von 41 des Phagen c2 auf dem Rezipienten S. lactis LM0230 auf 5 Phagen pro Zelle verringert. Es wurde gefunden, daß ein 30 Megadalton- Plasmid, das mit pTR2030 bezeichnet wurde, für den phagenresistenten Phänotyp verantwortlich ist, der von diesen Lac&spplus;/Nisr-Transkonjuganten gezeigt wird, die aus Paarungen zwischen S. lactis ME2 und S. lactis LM0230 ausgewählt wurden. Einer dieser Transkonjuganten, nämlich S. lactis TRS1, beherbergt sowohl pTR1040 als auch pTR2030. Nach der Züchtung von S. lactis TRS1 bei 40ºC wurde ein Lac&supmin;/Niss- Derivat isoliert. Dieses Isolat zeigte Hsp&spplus;, trug ein 30 ± 3,0 Megadalton-Plasmid (pTR2030) und wurde mit S. lactis TRS1-a (Phänotyp Hsp&spplus;, Strr, Lac&supmin;) bezeichnet. pTR2030- haltiger TRS1-a wurde am 10. Juni 1985 gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection unter der Zugangs-Nr. 53146 hinterlegt.
Das Plasmid pTR2030 wurde aus S. lactis TRS1-a mit dem Verfahren von Klaenhammer, T. R., Current Microbiol. 10, 23 (1984) isoliert, und zwar unter Verwendung der von Sanders, M. E. et al. (1983), supra, beschriebenen Modifikationen. Die Restriktionsendonukleasen wurden von den Bethesda Research Laboratories bezogen, und die Restriktionsverdauungen wurden unter Verwendung des Verfahrens von Maniatis, T. et al., supra, durchgeführt. Die Auftrennung von DNA-Restriktionsfragmenten erfolgte auf 0,8% Agarosegelen. Die durch HindIII- und EcoRI-Verdauungen von X-DNA erzeugten Fragmente wurden als Molekulargewichtsstandards verwendet. Die Ergebnisse der Restriktionsenzymverdauung sind oben in Tabelle 1 gezeigt.

Beispiel 2

Präparation von S. lactis TEK1

Zur Verwendung in Konjugationsexperimenten an Strr-Rezipienten von S. cremoris wurde ein Strs-Donorstamm entwickelt, der pTR1040 (Lac&spplus;, Nisr) und pTR2030 (Hsp&spplus; Tra&spplus;) trug. Die Paarungen wurden zwischen S. lactis TRSI und S. lactis C14&sub5; (plasmid-behandelt, Lack Hsp Strs) wie oben in Beispiel 1 beschrieben vorgenommen. Lac&spplus;-Kolonien wurden auf Lactose-Indikator-Agar ohne Zugabe von Streptomycin selektiert. 100 Lac&spplus;-Kolonien wurden auf Hsp&spplus; und Empfindlichkeit gegen Streptomycin untersucht. S. lactis TEK1 wurde als Lac&spplus;/Hsp&spplus;/Strs-Transkonjugant nachgewiesen, der pTR1040 und pTR2030 trug. Diese Kultur wurde als Donor von pTR2030 in Konjugationsexperimenten mit S. cremoris Strr Rezipienten verwendet, nämlich wie im folgenden beschrieben. pTR2030 und pTR1040 enthaltender TEK1 wurde am 25. Juni 1985 gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection mit der Zugangsnummer 53167 hinterlegt.

Beispiel 3

Präparation von S. cremoris M43a

Zur Verwendung als Konjugationsrezipienten wurden Lack- Varianten von S. cremoris MI2R auf Lactose-Indikator-Agar isoliert und dann 24 h in 2 ug/ml Ethidiumbromid enthaltender M17-Glucose-Brühe gezüchtet. Die Lac&supmin;-Variante M43 wurde durch Einzelkolonie-Isolierung auf Lactose-Indikator- Agar gereinigt und in M17-Glucose-Brühe fortgepflanzt, und 0,1 ml wurden auf der Oberfläche von Ml7-Glucose-Agarplatten, die 250, 500 und 1000 ug/ml Streptomycinsulfat enthielten, ausgestrichen. Nach 24 bis 48 h bei 30ºC wurden einzelne Kolonien, die auf Platten mit der höchsten Konzentration an Streptomycin auftraten, abgekratzt und auf M17- Glucose-Agar, der 1 mg/ml Streptomycin enthielt, ausgestrichen. Auf diese Weise wurde eine streptomycin-resistente (Strr)-Variante selektiert, die mit M43a bezeichnet wurde. Die Identität der Lac&supmin;/Strr-Variante wurde durch die Plasmid-Zusammensetzung und die Empfindlichkeit gegen den lytischen S. cremoris M12R-Phagen (m12r.M12) in wie in Beispiel 1 beschriebenen Standard-Plaque-Assays bestätigt. S. cremoris M43a wurde in M17-Glucose-Brühe und 1 mg/ml Streptomycin gehalten, wurde aber vor der Verwendung in Konjugationsexperimenten einmal in Abwesenheit von Streptomycin fortgepflanzt.

Beispiel 4

Transferierung von DTR1040 und pTR2030 durch Konjugation

Zwischen L. lactis ME2 als Donorstamm und S. lactis LM0230 und S. cremoris M43a als Rezipientenstämme wurden wie in Beispiel 1 beschrieben Paarungen vorgenommen. Lac&spplus;-Kolonien wurden auf Lactose-Indikator-Agar und 1 mg/ml Streptomycinsulfat selektiert, nämlich wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Nisin-Resistenz wurde wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht, mit der Ausnahme, daß 50 ng/ml Nisin anstelle von 100 ng/ml verwendet wurden. Die Phagen-Resistenz wurde mit dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren ermittelt. Die Phagen-Resistenz wurde durch (a) die Verringerung der Plaque- und Wurfgrößen des Phagen c2 auf S. lactis LM0230- Lac&spplus;-Transkonjuganten und (b) durch das Unvermögen des Phagen m12r.M12 zur Plaque-Bildung auf S. cremoris M43a- Lac&spplus;-Transkonjuganten bestimmt. Die Ergebnisse des Kon3ugationsexperiments sind in Tabelle 2 gezeigt. Proben von entweder ME2 oder LM0230 alleine ergaben keine Rekombinanten. Die Frequenz war niedriger als 7,6 · 10&supmin;&sup9; Rekombinanten/Donor. Tabelle 2 Rekzipient Lac/Str-Rekombinanten pro ml Frequkenz/Donor % Nisin-Resistenz Phagen-Resistenz S. lactis S. cremoris

Beispiel 5

Hsp&spplus;- und Hrp&spplus;-Phänotypen in pTR2030-Transkonjuganten

Einer der Transkonjuganten von S. lactis LM0230 und S. lactis ME2, die in Beispiel 1 hergestellt worden waren, war gegen den Phagen c2 empfindlich. Dieser Transkonjugant wurde als S. lactis TRS3 identifiziert und es wurde gefunden, daß er nur das Plasmid pTR1040 und kein pTR2030 enthält. Zwischen S. lactis ME2 und S. cremoris M43a wurden Paarungen vorgenommen und wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht. Einer der Transkonjuganten war Lac&spplus;/Nisr, der phagen-resistent war und sowohl pTR1040 als auch pTR2030 enthielt. Dieser Transkonjugant wurde als S. cremoris T2r- 43a identifiziert. Ein zweiter Transkonjugant, der phagenempfindlich war, enthielt lediglich pTR1040 und kein pTR2030. Dieser zweite Transkonjugant wurde als S. cremoris T2s-M43a identifiziert. Die Adsorption, Wurfgröße und Plaque-Bildungsleistung (EOP) des Phagen auf den S. lactis- Stämmen LM0230, TRSI und TRS3 und auf den S. cremoris- Stämmen M43a, T2s-M43a und T2r-M43a wurden wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung des Phagen c2 bzw. m12r.M12 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Stamm Plasamide Phänotyp % Phagen-Adksorption EOP Wurfgröße S. lactis S. cremoris NA = nicht anwendbar ND = nicht bestimmt

Beispiel 6

Tra&spplus;-Demonstration von pTR2030

Zwischen verschiedenen in Tabelle 4 identifizierten Donorstämmen und dem Rezipientenstamm S. lactis LM2302 (Lack Niss Eryr Strr) wurden Paarungen durchgeführt und die Transkonjuganten wurden auf Lactose-Indikator-Agar, der 15 ug/ml Erythromycin und 1 mg/ml Streptomycin enthielt, selektiert, und zwar wie in Beispiel 1 beschrieben. Die in Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse demonstrieren, daß pTR2030 die Transferierung von Hsp&spplus; und Hrp&spplus; (auf pTR2030 gefunden) und des nicht-konjugativen Plasmids pTR1040, das Lac&spplus; und Nisr codiert, mit hoher Frequenz fördert. Tabelle 4 Donor Plasmide Phänotyp des Donors Rekombinanten

Beispiel 7

Transferierung von DTR2030 auf Stämme von S. cremoris durch Konjugation

Zwischen Donorstämmen (Lac&spplus; Nisr Str&supmin; Tra&spplus; Hsp&spplus;) und Rezipientenstämmen (Lack Niss Strr) von S. cremoris wurden wie in Tabelle 5 gezeigt Paarungen durchgeführt, und die Transkonjuganten wurden wie in Beispiel 1 beschrieben selektiert. Die phagen-resistenten Transkonjuganten waren Hrp+ und trugen pTR2030. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß pTR2030 zwischen diesen Stämmen durch Konjugation transferiert werden kann. Tabelle 5 Paarungspartner Transkonjuganten Donor S. lactis Rezipient S. cremoris Freq./Donor % Phagen-Resistenz

Beispiel 8

Phagen-Wirkung auf S. cremoris-Transkonjuganten

Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit verschiedenen S. cremoris-Stämmen Plaque-Assays durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Es ist ersichtlich, daß S. cremoris-Stämme, die pTR2030 trugen, gegen den untersuchten Phagen resistent waren, d. h. die Phagen konnten sich in diesen Stämmen nicht replizieren. Tabelle 6 Stamm Beschreibung Phage PFU/ml* EOP Phagen-empfindlicher Elternteil Transkonjugant
* Plaque-Bildungseinheiten/ml der Phagen-Suspension.

Beispiel 9

Phagen-Wirkung auf S. cremoris M12 und M43a

Virulente Phagen wurden unabhängig aus Käseanlagen isoliert, in denen S. cremoris M12-Zellen enthaltende Starter- Kulturen verwendet wurden. Die Plaque-Assays mit S. cremoris M12 und S. cremoris T2r-43a wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt, aus der ersichtlich ist, daß der pTR2030 enthaltende Transkonjugant, d. h. S. cremoris T2r-M43a, gegen alle untersuchten Phagen resistent war (d. h. die Phagen konnten sich in diesem Stamm nicht replizieren). Tabelle 7 Phage Titer EOP

Beispiel 10

Starter-Kultur-Aktivitätstest

Bei dem Starter-Kultur-Aktivitätstest handelte es sich um eine Modifikation des von Heap, H. A. et al., N. Z. J. Dairy Sci. Technol. 11, 16 (1976) beschriebenen. Die Kulturen wurden durch Übernachtinkubation bei 30ºC in 11%iger wiederhergestellter Magermilch (RSM, eine Stunde mit Dampf behandelt) hergestellt, oder zur Züchtung von proteinasenegativen Stämmen (nur für M43a und T2r-M43a) in 11%iger RSM, die 0,25% Casaminosäuren (RSM/CA) enthielt. Die Phagen-Suspension (200 ul, -10&sup8; PFU/ml) wurde mit 200 ul Milchkultur gemischt und bei Raumtemperatur 10 min inkubiert, um die Adsorption des Phagens zu ermöglichen. Dann wurde RSM oder RSM/CA (9,6 ml), die 40 ug/ml Bromcresolpurpur (BCP) enthielt, zugegeben, und die Röhrchen wurden nacheinander 180 min bei 30ºC, 190 min bei 40ºC und 150 min bei 30ºC bei S. cremoris M 43 und T2r-M43a und 100 min bei 30ºC, 190 min bei 40ºC und 100 min bei 30ºC bei allen anderen Stämme inkubiert. Nach der Inkubation wurden Milchproben auf den pH und den Phagen-Titer untersucht. Der Anfangs-pH der Milch betrug 6,5-6,6. Die in Tabelle 8 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß virulente Phagen sich nicht in Stämmen von S. cremoris replizieren konnten, die pTR2030 enthielten, und die Säureentwicklung während des Starter- Kultur-Aktivitätstests nicht inhibieren konnten. Tabelle 8 Stamm Beschreibung Phage Phagen-Titer Am Anfang Am Ende End-pH S. cremoris Elternteil Transkonjugant Tabelle 8 (Fortsetzung) Stamm Beschreibung Phage Phagen-Titer Am Anfang Am Ende Endp-pH S. cremoris Transkonjugant Elternteil
Dann wurden aufeinanderfolgende Starter-Kultur-Aktivitätstests unter Verwendung des Phagen m12r.M12 durchgeführt, um zu ermitteln, ob virulente Phagen, die gegen den S. cremoris T2r-M43a-Transkonjuganten wirksam sind, erzeugt werden können oder nicht. Wie oben wurden wiederholte Zyklen des Aktivitätstests durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 100 ul der m12r.M12-Phagen-Suspension (-10&sup8; PFU/ml, in M17- Brühe hergestellt) und 100 ul aus dem vorhergehenden Aktivitätstest gesammelte Molke mit 200 ul Zellen vor der Milch-Inokulation gemischt wurden. Es wurde gefunden, daß sich auch der virulente Phage in den aufeinanderfolgenden Starter-Kultur-Aktivitätstests nicht in S. cremoris T2r- M43a, der pTR2030 enthielt, entwickeln konnte.
Obwohl die Erfindung in Verbindung mit konkreten Ausführungsformen davon beschrieben wurde, ist klar, daß weitere Modifikationen möglich sind. Diese Anmeldung soll alle Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken, die den Prinzipien der Erfindung folgen, und diejenigen Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung einschließen, die im Rahmen der bekannten und gebräuchlichen Praxis auf dem Fachgebiet, zu dem die Erfindung gehört, liegen.

Claims

1. Plasmid pTR2030, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 30,0 ± 3,0 Megadalton, daß die folgende Empfindlichkeit gegen Restriktionsendonucleasen aufweist:

Enzym Anzahl/Stellen HindIII 16

HaeIII 4

EcoRI 8

Xbal 5

Hpal 3

NcoII 5

AvaI 2

und eine oder mehrere genetische Determinanten für die Phagen-Resistenz von Streptokokken der Gruppe N (Lactokokken) trägt und die Phänotypen Tra&spplus;, Clu&supmin;, Hsp&spplus; und Hrp&spplus; zeigt, wobei das Plasmid aus S. Lactis TRSI- a(ATCC 53146) oder S. Lactis TEKI (ATCC 53167) erhältlich ist.

2. Plasmid, das ein Derivat des Plasmids pTR2030 nach Anspruch 1 enthält, wobei das Derivat mindestens eine der genetischen Determinanten für die Phagen-Resistenz trägt.

3. Plasmid nach Anspruch 2, wobei das Derivat ausgewählt ist aus:

(a) dem Plasmid pTR2030, in das ein oder mehrere DNA- Segmente insertiert wurden;

(b) dem Plasmid pTR2030, aus dem ein oder mehrere DNA- Segmente deletiert wurden;

(c) dem Plasmid pTR2030, in das ein oder mehrere DNA- Segmente insertiert wurden und aus dem ein oder mehrere DNA-Segmente deletiert wurden, und

(d) jedem Plasmid, in das mindestens eine der genetischen Determinanten für die Phagen-Resistenz aus dem Plasmid pTR2030 insertiert wurde.

4. Plasmid nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei das Derivat außerdem genetische Determinanten des Plasmids pTR2030 zur Transferierung durch Konjugation trägt.

5. Streptokokkus der Gruppe N (Lactokokkus), der ein Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.

6. Streptokokkus der Gruppe N nach Anspruch 5, der aus S. Lactis, S. Lactis-Unterart Diacetylactis und S. Cremoris ausgewählt ist.

7. Starter-Kultur zur Milchfermentierung, die einen Streptokokkus der Gruppe N nach Anspruch 6 enthält.

8. Starter-Kultur zur Lebensmittelfermentierung, die einen Streptokokkus der Gruppe N nach Anspruch 5 enthält.