DE69007298T2

DE69007298T2 - Klonierungsvektor zur verwendung in milchsäurebakterien und verfahren diesen zu konstruieren.

Info

Publication number: DE69007298T2
Application number: DE69007298T
Authority: DE
Inventors: Jytte Dk-2000 Frederiksberg Josephsen; Egil Waagner Dk-3500 Kirke Vaerlose Nielsen; Soile Sf-02230 Espoo Tynkkynen; Finn Dk-3400 Hillerod Vogensen; Atte Sf-70700 Kuopio Von Wright; Stephen Dk-3060 Espergaerde Wessels
Original assignee: Valio Finnish Cooperative Dairies Association
Current assignee: Valio Finnish Cooperative Dairies Association
Priority date: 1989-12-20
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2010-12-21
Also published as: AU7045991A; ES2062757T3; IE66032B1; NZ236570A; US5580787A; CA2072007A1; ATE102652T1; EP0506789B1; IE904621A1; CA2072007C; DE69007298D1; DK0506789T3; WO1991009131A1; AU645459B2; EP0506789A1; WO1991009132A1

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung von verbesserten, als Lebensmittelstarterkulturen geeigneten Milchsäurebakterien. Insbesondere betrifft die Erfindung ein als Clonierungsvektor geeignetes rekombinantes Plasmid, das in transformierten Milchsäurebakterien leicht selektiert werden kann und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Vektors. Die Erfindung betrifft weiterhin die Herstellung von verbesserten Lebensmittelstarterkulturen, die Milchsäurebakterien umfassen, in die gewünschte Gene mittels des Clonierungsvektors eingeführt wurden, und derartige verbesserte Starterkulturen.

Allgemeiner Hintergrund der Erfindung

Seit Jahrhunderten werden Kulturen von Milchsäurebakterien in der Lebensmittelproduktion verwendet. Die Ursache dafür liegt in deren Fähigkeit, Zucker durch Fermentation in konservierende organische Säuren, vorwiegend Milchsäure, und verschiedene metabolische Produkte umzuwandeln, die in dem Lebensmittelprodukt mit der Entwicklung von gewünschtem Geschinack und Aroma zusammenhängen. Einige Milchsäurebakterien stellen hydrolytische Enzyme, einschließlich Peptidasen, Proteasen und lipolytischen Enzymen her. Die Herstellung derartiger Enzyme trägt z.B. in Käse zur Entwicklung von Aroma bei.
Eine interessante Eigenschaft bestimmter Stämme von Milchsäurebakterien liegt in deren Fähigkeit, antimikrobielle Verbindungen oder Bacteriocine mit hemmender Wirkung auf nahe verwandte Bakterienarten herzustellen. Bestimmte Bacteriocine aus Milchsäurebakterien werden in der Lebensmittelindustrie als Konservierungsmittel verwendet.
Zur industriellen Herstellung einer Vielzahl von gewünschten fermentierten Lebensmitteln, wie alle der bekannten, traditionellen Milchprodukte einschließlich Joghurt, Acidophilusmilch, Butter und Käse, fermentiertes Gemüse, fermentierte Fleischprodukte und Tierfutter wird jedoch eine Vielzahl von Milchsäurebakterienkulturen benötigt, von denen jede an bestimmte Lebensmittelprodukte angepaßt ist. Derartige Kulturen werden gegenwärtig aus natürlich vorkommenden Stämmen von Milchsäurebakterien selektiert, wobei von Eigenschaften wie deren Fähigkeit, Zucker in dem zu fermentierenden Lebensmittelprodukt zu fermentieren, spezifischen Erfordernissen bezüglich der Wachstumstemperatur und der Herstellung gewünschter Aroma-verleihender Verbindungen ausgegangen wird. Durch die spezifische Kombination dieser Eigenschaften wird die individuell selektierte Kultur geeignet zur Her-Stellung eines bestimmten Lebensmittelprodukts, aber normalerweise weniger geeignet für die Herstellung von anderen.
Ganz offensichtlich ist das gegenwärtig verwendete Verfahren zur Entwicklung von geeigneten Milchsäurekulturen durch Selektion natürlich vorkominender Stämme beschwerlich und kostenaufwendig. Außerdem hat es sich als schwierig erwiesen, Stämme von Starterkulturen zur Verfügung zu stellen, die alle erforderlichen Eigenschaften in optimaler Ausprägung kombinieren. Gegenwärtig wird dieses Problem normalerweise gelöst, indem Starterkulturen verwendet werden, die eine Vielzahl von selektierten Stämmen von Milchsäurebakterien umfassen, die wiederum jeweils eine oder mehrere der für ein bestimmtes Lebensmittelprodukt gewünschten Eigenschaften aufweisen. Die Notwendigkeit zur Verwendung derartiger Mischkulturen erhöht natürlich die Kosten bei der Herstellung der Starterkulturen.
Ausgehend von ihrer traditionellen und langandauern den Verwendung bei der Lebensmittelherstellung sowie der Tatsache, daß sie als nicht-pathogen betrachtet werden, sind Milchsäurebakterien allgemein als sichere Lebensmittelbestandteile anerkannt, sogar, wenn sie in einem fermentierten Lebensmittelprodukt lebend und in sehr hoher Anzahl vorkommen.
Gegenwärtig wird weithin anerkannt, daß ein beträchtlicher industrieller Bedarf existiert, wirtschaftlich und technisch besser durchführbare Wege zur Entwicklung von Starterkulturen zu finden. Es ist offensichtlich, daß die Gentechnologie die Mittel zur Befriedigung dieses Bedarfs bereitstellen kann. Im vorliegenden Zusammenhang ist es von entscheidender Bedeutung, daß auch Milchsäurebakterien für Lebensmittelstarterkulturen als sicher beim Verbrauch angesehen werden können, die durch Einführen von gewünschten Genen mittels Gentechnologie entwickelt wurden. Es ist daher wichtig, daß rekombinante Plasmide, um als Clonierungsvektoren zur Entwicklung von Milchsäurebakterien geeignet zu sein, alle vorstehend definierten Sicherheitskriterien aufweisen, einschließlich des Merkmals, daß diese Vektoren nur aus Milchsäurebakterien stammende DNA enthalten, einschließlich der aus Milchsäurebakterien isolierten Wildtypplasmide. Es wird angenommen, daß rekombinante Milchsäurebakterien auch als sicher für die Lebensmittelherstellung angesehen werden, da sie nur aus Milchsäurebakterien stammende DNA enthalten.
Eine Vorbedingung für die gewerbliche Nutzung von Gentechnologie bei der Herstellung von genetisch rekombinanten Starterkulturen liegt jedoch darin, daß derartige Kulturen allgemein als sicher für Verbraucher von Lebensmittelprodukten angesehen werden, die lebende rekombinante Milchsäurebakterien enthalten. Ein offensichtliches, mögliches, mit der Aufnahme von lebenden rekombinanten Bakterien verbundenes Risiko ist die Übertragung von unerwünschter genetischer Information aus diesen Bakterien auf die endogene, gastro-intestinale Mikroflora. Dieses Risiko kann im Grunde dadurch umgangen werden, indem rekombinante Starterkulturen so hergestellt werden, daß drei Bedingungen erfüllt werden: (1) Nur aus Milchsäurebakterien einschließlich der daraus isolierten Wildtyp-Plasmiden stammmende DNA wird in natürlich vorkommende Ursprungsstämme eingeführt, (2) die inserierte DNA befindet sich auf einem Clonierungsvektor, der im wesentlichen in anderen Bakterienarten als Milchsäurebakterien nicht repliziert und (3) die inserierte Milchsäurebakterium-DNA codiert keine phänotypischen Eigenschaften, die im Falle einer Übertragung auf die endogene Milchsäurebakterien-Flora eine gesundheitliche Bedrohung darstellen könnten.
Die erste Bedingung beruht auf der Tatsache, daß natürlich vorkommende Milchsäurekulturen gegenwärtig unabhängig von ihrer Herkunft als absolut sicher in Lebensmittelprodukten angesehen werden. Es liegen keine Berichte über gesundheitsschädliche Wirkungen dieser traditionellen Verwendung von Milchsäurebakterien vor. Es wird daher allgemein angenommen, daß Lebensmittelstarterkulturen gleichermaßen sicher sind, die rekombinante Milchsäurebakterium-DNA enthalten. Die vorstehend definierte zweite und dritte Bedingung beruht vorwiegend jedoch auf der Überlegung, daß Mutanten von natürlich vorkommenden Milchsäurebakterium-Stämmen entstehen können, die dabei unerwünschte Eigenschaften entwickeln können, wie Resistenz gegen Antibiotika, die in für die Behandlung von infektiösen Krankheiten geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Wenn derartige Resistenz-Phänotypen auf infektiöse Bakterien übertragen werden, die unter den Nicht-Milchsäurebakterien der menschlichen gastro-intestinalen Flora vorhanden sein können, kann die Behandlung derartiger Infektionen schwierig werden. Wenn Gene aus Milchsäurebakterien, die Resistenz gegenüber pharmazeutisch verwendeten Antibiotika verleihen- in Lebensmittelstarterkulturen inseriert werden, besteht das mögliche Risiko, daß bei Aufnahme von Lebensmittelstarter enthaltenden Lebensmitteln diese Gene in-vivo auf potentiell pathogene, endogene, gastro-intestinale Mikroorganismen übertragen werden können.
Die Technik bezüglich des Clonierens von fremden Genen in Milchsäurebakterien ist noch nicht weit entwickelt. Gegenwärtig ist es möglich, rekombinante Stämme davon herzustellen, indem natürlich vorkommende Stämme mit rekombinanten Plasmiden transformiert werden, in die gewünschte Gene inseriert wurden, und man Expression dieser Gene erhält. Der gegenwärtige Stand der Technik stellt jedoch kein Mittel zur Herstellung von rekombinanten Starterkulturen zur Verfügung, die die vorstehend genannten Erfordernisse einer sicheren, rekombinierten Starterkultur erfüllen. Mindestens drei Hauptprobleme müssen gelöst werden, um derartige sichere Starterkulturen bereitzustellen: (1) Ein geeigneter Clonierungsvektor muß bereitgestellt werden, der nur aus Milchsäurebakterien einschließlich der darin vorhandenen Wildtyp-Plasmiden stammende DNA enthält, (2) der Replikationsbereich des Clonierungsvektors muß in Milchsäurebakterien vorzugsweise aber nicht in anderen Bakterienarten funktionell sein, insbesondere nicht in pathogenen oder potentiell pathogenen Bakterienarten, wodurch das Risiko der Verbreitung des Vektors auf Nicht-Milchsäurebakterien auf ein Minimum reduziert wird, und (3) der Clonierungsvektor muß so hergestellt werden, daß er ein Markergen enthält, das leicht in Milchsäurebakterien und vorzugsweise nicht in anderen Bakterien einschließlich pathogenen, oder potentiell pathogenen gastrointestinalen Bakterien selektierbar ist, und wobei das Markergen für den äußerst unwahrscheinlichen Fall, daß das Gen auf ein potentiell schädliches Bakterium übertragen wird, nicht zur Schädlichkeit dieses Bakteriums beiträgt, z.B. durch Übertragen von Resistenz gegenüber einem nützlichen pharmazeutischen anti-mikrobiellen Agens.
Verfahren zur Herstellung von Clonierungsvektoren sind bekannt, die in Milchsäurebakterien funktionell sind. Mittels dieser bekannten Verfahren hergestellte Vektoren erfüllen jedoch nicht die vorstehend definierten Erfordernisse und sind daher als sichere Clonierungsmittel für Lebensmittelstarterkulturen weniger geeignet.
EP 0 316 677 offenbart beispielsweise einen rekombinierten Vektor, der hergestellt wird, indem ein Vektor, umfassend einen selektierbaren Marker, der vorzugsweise aus Resistenz gegenüber pharmazeutisch verwendeten Antibiotika wie Tetracyclin, Erythromycin und Chloramphenicol verleihenden Genen ausgewählt wird, und einen Replikationsursprung, der in einem Organismus funktionell ist, der sich von Milchsäurebakterien unterscheidet, wie E. coli, mit einem Plasmid verbunden wird, das einen Replikationsbereich enthält, der in Milchsäurebakterien funktionell ist.
EP 0 228 726 offenbart Plasmidvektoren, die sowohl in gram-negativen als auch in gram-positiven, einschließlich Milchsäurebakterien, replizieren. Außerdem sind die verwendeten selektierbaren Marker vorzugsweise solche Antibiotika-Resistenzmerkmale, die die Selektion sowohl in gram-negativen als auch in gram-positiven Bakterien ermöglichen. Ein bevorzugter Selektionsmarker stellt die Resistenz gegenüber Kanamycin dar.
Ein entscheidender Schritt bei der Transformation von Milchsäurebakterien mit fremder DNA ist die Selektion der Transformanten. Normalerweise liegt die Häufigkeit transformierter Zellen in einein Transformationsgemisch in der Größenordnung von 10&sup4; bis 10&sup6; pro ug DNA, wobei die Häufigkeit unter anderem von dem Transformationsverfahren und den Mengen an DNA und Empfängerzellen im Transformationsgemisch abhängt. Eine wirksame Selektion einer relativ geringen Anzahl von transformierten Zellen aus nicht-transformierten Zellen, deren Zahl typischerweise in einem Transformationsgemisch im Bereich von 10&sup8; bis 10¹&sup0; liegt, erfordert einen äußerst wirksamen Selektionsmarker.
In den bekannten Verfahren zur Transformation von Milchsäurebakterien werden die in die Clonierungsvektoren inserierten selektierbaren Marker aus Resistenz gegen Antibiotika verleihenden Genen ausgewählt. In jeder beliebigen Population von Empfängerzellen in einem Transformationsge misch kommen jedoch nicht-transformierte Zellen vor, die durch spontane Mutation resistent gegenüber dem Antibiotikum geworden sind, gegenüber dem der selektierbare Marker Resistenz verleiht. Die Häufigkeit derartiger spontaner Mutantenzellen kann in der gleichen Größenordnung wie die vorstehend angegebene Transformationshäufigkeit liegen. Um eine verläßliche Selektion von Transformanten auf einem das Antibiotikum enthaltendem Selektivmedium zu erhalten, gegenüber dem die transformierten Zellen resistent geworden sind, muß die Menge an Antibiotikum höher als die sein, gegenüber der die spontanen Mutanten resistent sind. Es folgt daraus unter anderem, daß der durch den selektierbaren Marker verliehene Grad an Resistenz entsprechend höher sei muß, als der durch die spontanen Mutationen erworbene.
Im vorliegenden Zusammenhang liegt ein weiteres essentielles Erfordernis für einen geeigneten selektierbaren Marker darin, daß das Gen (die Gene), das (die) die Resistenz verleihenden Produkte codiert (en), in einem ausreichend hohen Maße direkt nach der Transformation exprimiert wird (werden). Wenn dies nicht der Fall ist, wird das Selektionsverfahren unpraktikabel lang, unter Umständen einige Tage, und das Risiko erhöht sich, daß spontane Mutanten die transformierten Zellen überwachsen.
Wie vorstehend definiert, stammt ein geeigneter selektierbarer Marker in einem Clonierungsvektor für die Transformation von Milchsäurebakterien-Lebensmittelstarter kulturen vorzugsweise aus Milchsäurebakterien und verleiht außerdem vorzugsweise keine Resistenz gegenüber Antibiotika, die auch als infektionsbekämpfende Agentien in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden. Daher konzentrierte sich das Interesse auf Marker, die Resistenz gegenüber einer Klasse von Antibiotika verleihen, die natürlicherweise von bestimmten Stämmen von Milchsäurebakterien hergestellt werden, d.h. die sogenannten Bacteriocine. Aus Milchsäurebakterien stammende Bacteriocine werden nicht in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet. Von diesen Bacteriocinen ist das von bestimmten Stämmen von Lactococcus spp hergestellte Polypeptid Nisin am besten beschrieben.
Der Nisin herstellende Lactococcus spp umfaßt gleichzeitig Gene, die Resistenz gegenüber diesem Bacteriocin verleihen, wobei sich die Gene häufig auf Plasmiden befinden (Gasson, FEMS Microbiol. Letters 21 (1984) 7-10). Es wurden verschiedene vergebliche Versuche unternommen, die Nisin-Resistenzgene als selektierbare Marker bei der Konjugation und Transformation von derartigen Nisr-Plasmiden zu verwenden. Diese Versuche schlugen in erster Linie fehl, weil eine hohe Anzahl spontanter Resistenzmutanten auftrat (Klaenhammer und Sanozky, J. Gen. Microbiol. 131 (1985), 1531-1541; McKay und Baldwin, Appl. Environ. Microbiol. 47 (1984), 68-74).
Bei der Untersuchung des Plasmids pNP40, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetvlactis DRC3 isoliert worden war, fand Froseth et al., Appl. Environ. Microbiol. 54 (1988) 2136-2139, daß auf diesem Plasmid eine enge Kopplung zwischen dem nisr-Gen und einer Replikationsfunktion bestand. Es wurde ermittelt, daß ein 7,6 kb-Fragment aus diesem als pFM011 bezeichneten Plasmid unabhängig repliziert, wenn es in Lactococcus-Zellen transformiert worden war. Das auf einem 2,6 kb-Fragment befindliche nisr-Gen war jedoch nicht als selektierbarer Marker geeignet, da es die direkte oder primäre Selektion von Transformanten nicht ermöglichte. Die Autoren schlossen daraus, daß der Nisr-Phänotyp in Clonierungsexperimenten als sekundärer selektierbarer Marker verwendet werden kann, wobei die direkte Selektion zuerst mittels einer anderen Eigenschaft durchgeführt wird. In ihren Experimenten wurde dies mittels Cotransformationsexperimenten gezeigt, wobei die Eryr (Resistenz gegenüber dem pharmazeutischen Antibiotikum Erythromycin) eines Shuttle-Vektors verwendet wurde, der unter anderem in E. coli als primärer selektierbarer Marker repliziert.
Vor kurzem haben dieselben Autoren die Ergebnisse weiterer Experimente veröffentlicht, die darauf hinzielen, den Nisr-Typ von pFM011 als selektierbaren Marker in Transformationsexperimenten in einem Lactococcus sp. (J. Dairy Sci. 72, Supplement 1, (1989), 115) zu verwenden. Die Selektion von Transformanten mittels des nisr-Gens als einzigem selektierbaren Marker war jedoch nur erfolgreich, wenn ein zweistufiges Verfahren verwendet wurde, umfassend als ersten Schritt das Ausplattieren des Transformationsgemisches auf M17-Glucoseagar mit einem pH-Wert von etwa 7,0 und enthaltend 0,25 M Natriumsuccinat oder 30 Internationale Einheiten (IE) Nisin/ml für Protoplastentransformation bzw. Elektroporation. Nach 3 bis 5 Tagen Inkubation wurde ein zweiter Schritt ausgeführt, wobei mutmaßliche Transformanten auf 0,1 % Tween 20 und 20-40 IE Nisin/ml enthaltenden M17- Glucoseagar mit einem pH-Wert von etwa 7,0 Replika-plattiert wurden und anschließend weiter inkubiert wurde.
Es ist nicht wahrscheinlich, daß ein derartiges zweistufiges Verfahren effektiv ist, da der Schritt der Replika-Plattierung ein beträchtliches Risiko aufweist, die wenigen transformierten Zellen zu verlieren, die in dem ersten Inkubationsmedium vorhanden sind. Außerdem ist es wahrscheinlich, daß, wenn das erste Inkubationsmedium Nisin aufweist, dessen Aktivität während der langen Inkubationszeit signifikant abnimmt, da dieses Bacteriocin bei pH-Werten über 5-6 nur eine geringe Stabilität aufweist. Ein weiterer ernster Nachteil liegt in dem zeit- und arbeitsaufwendigen Charakter dieses zweistufigen Verfahrens.
Die gegenwärtigen Erfinder haben jetzt erfolgreich ein rekombinantes Plasmid entwickelt, das als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien für Lebensmittelstarterkulturen ausgezeichnet geeignet ist. Der erfindungsgemäße Vektor erfüllt alle vorstehend definierten Erfordernisse für ein sicheres Lebensmittel-verträgliches Clonierungsvehikej. Bei der Herstellung des Vektors wurde allen theoretischen möglichen Risiken Rechnung getragen, die mit der Verwendung von Gentechnologie bei der Verbesserung von Lebensmittelstarterkulturen verbunden sind. Von besonderer Bedeutung ist, daß der erfindungsgemäße Clonierungsvektor ein sorgfältig selektiertes nisr-Gen enthält, das den transformierten Milchsäurebakterien ein sehr hohes Maß an Resistenz verleiht, wodurch es nun möglich ist, ein nisr-Gen als primären selektierbaren Marker in einem direkten einstufigen Selektionsverfahren zu verwenden.

Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes Plasmid, verwendbar als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis replizieren kann, welches umfaßt: (a) ein aus einem Plasmid isoliertes DNA-Fragment, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, wobei das DNA-Fragment einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis funktionellen Replikationsbereich umfaßt, (b) ein DNA-Fragment, das ein in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbares Markergen umfaßt, dessen Expression eine primäre einstufige Selektion von Milchsäurebakterien erlaubt, die mit einem dieses DNA- Fragment umfassenden rekombinanten Plasmid transformiert sind, wobei das DNA-Fragment aus einem Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, und (c) mindestens eine Restriktionsstelle, die die lnsertion von gewünschte Genprodukte codierender DNA erlaubt, und wobei die Insertion sich nicht auf die Funktionen von (a) und (b) auswirkt, wobei dieses rekombinante Plasmid nur DNA enthält, die von Milchsäurebakterien, einschließlich daraus isolierten Wildtyp-Plasmiden stammt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend definierten rekombinanten Plasmids, wobei das Verfahren im ersten Schritt die Herstellung eines ersten intermediären Plasmids umfaßt, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis replizieren kann, wobei die Herstellung des intermediären Plasmids die folgenden Teilschritte umfaßt:
(i) Isolieren von Plasmid-DNA aus einem Milchsäurebakterium,
(ii) Hybridisieren von isolierter Plasmid-DNA aus Teilschritt (i) mit einem einen Replikationsbereich umfassenden DNA-Fragment, das aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, und wobei dieses Wildtyp-Plasmid in Milchsäurebakterien, E. coli und B. subtilis replizieren kann,
(iii) Isolieren von Plasmid-DNA aus Teilschritt (i), die nicht mit der Wildtyp-Plasmid-DNA aus Teilschritt (ii) hybridisiert,
(iv) Isolieren eines DNA-Fragments (a) aus der in Teilschritt (iii) erhaltenen Plasmid-DNA, das einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis funktionellen Replikationsbereich umfaßt,
(v) Verbinden des isolierten DNA-Fragments aus Teilschritt (iv) unter Ligierungsbedingungen mit einem DNA-Fragment, das ein erstes selektierbares Markergen umfaßt, das die Selektion von mindestens E. coli, B. subtilis und Milchsäurebakterien erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden Plasmid transformiert sind, zum Erhalt des ersten intermediären Plasmids, mit dem getestet werden kann, ob der Replikationsbereich von DNA-Fragment (a) in E. coli und B. subtilis nicht funktionell ist,
einen zweiten Schritt, der das Verbinden des ersten intermediären Plasmids mit einem ein zweites Markergen umfassenden DNA-Fragment (b) unter Ligierungsbedingungen umfaßt, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbar ist, wobei die Expression des Markers die primäre einstufige Selektion von Milchsäurebakterienzellen erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden rekombinanten Plasmid transformiert sind, und das DNA-Fragment aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus einem Milchsäurebakterien isoliert ist, zum Erhalt eines zweiten intermediären Plasmids, und
einen dritten Schritt, der die Entfernung des den ersten selektierbaren Mark er umfassenden DNA-Fragments aus dem zweiten intermediären Plasmid unter für ein Restriktionsenzym geeigneten Bedingungen umfaßt, und im Anschluß daran erneute Ligierung, zum Erhalt des rekombinanten Plasmids, das als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien verwendbar ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestelltes rekombinantes Plasmid, wobei ein DNA-Fragment inseriert wurde, das mindestens ein für ein gewünschtes Genprodukt codierendes Gen enthält und wobei das rekombinante Plasmid außerdem einen Promotor für das inserierte Gen umfaßt. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur eines Milchsäurebakteriums, das mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmid transformiert wurde, in das ein Gen inseriert wurde, das ein gewünschtes Genprodukt codiert und in Milchsäurebakterien exprimiert werden kann. Die Erfindung betrifft auch eine Lebensmittelstarterkultur, die nach dem vorstehend hergestellten Verfahren hergestellt wurde.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1A stellt eine partielle Restriktionskarte eines intermediären Plasmids pVS34 dar. Die verstärkte Linie zeigt DNA aus pVC5 und die dünne Linie aus einem aus Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetvlactis SSD207 isolierten Plasmid stammende DNA.
Figur 1B stellt eine partielle Restriktionskarte eines intermediären Plasmids pVS39 dar, das zusätzlich zu der DNA von pVS34 ein aus dem Plasmid pNis stammendes 3,7 kb EcoRI DNA-Fragment umfaßt, wobei das Plasmid pNis aus Lactococcus lactis subsp lactis 10.084 isoliert wurde und wobei das Fragment in pSW211 (schraffierter Bereich) inseriert wurde.
Figur 1C stellt eine partielle Restriktionskarte des Plasmids pVS40 dar.
Figur 2A und 2B stellen Restriktionskarten eines DNA- Fragments dar, das eine aus dem aus Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 isolierten Plasmid pNis/pSFO1 isolierte Nisin-Resistenz-Determinante umfaßt. Dieses Fragment befindet sich auf pSW211 bzw. pSW221. Die auf der aus pNis stammenden DNA (verstärkte Linie) angegegebenen Restriktionsstellen wurden mittels eines besonderen Plasmids kartiert, auf dem sie sich befanden. Die Lokalisierung der Nisin- Resistenz-Determinante auf pSW221 (kreuzschraffierter Bereich) basiert auf der Beobachtung, daß eine Deletion des kleineren EcoRI - SacI-Fragments zum Verlust der Resistenz führt. pVS2 und pGKV10 (dünne Linie) zeigt DNA an, die aus Plasmiden mit diesen Bezeichnungen stammt.
Figur 3 veranschaulicht die Southern-Hybridisierung einer aus einem 3,8 kb EcoRI-Fragment aus pSW221 bestehenden, die aus pNis isolierte Nisin-Resistenz-Determinante umfassenden Sonde mit verschiedenen erfindungsgemäß verwendeten Plasmiden. Die Sonde wurde mit Digoxigenin ("Randomprimed labelling kit", Boehringer Mannheim GmbH, Penzberg, Deutschland) markiert. Übertragung erfolgte in 10 x SSC auf eine "Gene Screen"-Nylonmembran.
A. Agarosegel (0,8 %). B. Hybridisierungsmembran.
Spur DNA
1 Lambda/HindIII
2 Gesamtplasmid des Stamms 10.084, nicht gespalten
3 pSFO1, nicht gespalten
4 mit Hindlll gespaltene Gesamtplasmid-DNA des Stamms 10.084
5 pSF01, mit HindIII gespalten
6 pVS2, mit HindIII gespalten
7 pSW211, mit HindIII gespalten
8 pGKV10, mit HindIII gespalten
9 pSW211, mit EcoRI gespalten
10 pSW22I, mit EcoRI gespalten
11 pVS40, mit EcoRI gespalten
12 pVS34, mit EcoRI und HindIII gespalten
13 mit EcoRI gespaltene Gesamtplasmid-DNA des Stammes 10.084
14 psF01, mit EcoRI gespalten
15 Lambda/HindIII
Molekulare Größenstandards (Spur 1 und 15) sind links angegeben. Die Größe des HindIII-Nisr-Fragments und seines EcoRI-Subfragments ist rechts eingetragen.
Figur 4 veranschaulicht die Nisinwirkung auf exponentiell wachsende Zellen mit und ohne Nisin-Resistenz-Determinante. Die Kultur LM0230(pVS2) (o) und LM0230(pSW211) ( ) wurden mit GM17-Nährmedium auf eine A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,05 verdünnt. Bei einer A&sub6;&sub0;&sub0; von etwa 0,2 wurde zu den Kulturen 10 IE/ml Nisin zugesetzt, gefolgt von einer zweiten Zugabe nach 1,5 Stunden in der gleichen Menge.
Figur 5 stellt eine Agarose-Gel-Analyse von EcoRI- Fragmenten dar, die aus zwei rekombinanten Plasmiden stammen, umfassend pVS40 als Vektor in den das BclI-B-Fragment eines Derivates des Wildtyp-lactococcalen Plasmids pLP712 in eine der zwei XhoII-Stellen in beiden Orientierungen cloniert worden war. Spur A und F: mit HindIII gespaltene Lambda-DNA, Spur B: pVs40 mit EcoRI gespalten; Spur C und D: zwei unabhängig voneinander isolierte rekombinante, mit EcoRI gespaltene pVS40:lac-Plasmide; Spur E: pLP712, mit EcoRI gespalten.

Detaillierte Offenbarung der Erfindung

In dem vorliegenden Zusammenhang wird der Begriff "Milchsäurebakterien" zur Bezeichnung einer taxonomisch und morphologisch mannigfaltigen Gruppe von Bakterien verwendet, welche nicht-pathogene, nicht-sporogene, mikroaerophile und katalase-negative Organismen sind. Ihr gemeinsames physiologisches Charakteristikum ist ihre Fähigkeit, aus Lactose und anderen Kohlenhydraten mittels eines in Abwesenheit von Sauerstoff stattfindenden Fermentationsprozesses Milchsäure und andere organische Säuren, wie Essigsäure und Propionsäure, herzustellen. Die am häufigsten als Milchsäurebakterien bezeichneten Bakterien beinhalten Arten der Gattungen Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus und Leuconostoc. Von Streptococcus spp. ist im vorliegenden Zusammenhang die wichtigste Art Streptococcus salivarius subs. thermophilus. Alle diese Organismen sind gram-positiv. Die Gruppe der Milchsäurebakterien umfaßt auch Arten der Gattung Bifidobacterium, die im allgemeinen gramnegative oder gram-labile Bakterien sind.
Zusätzlich zu der Herstellung von organischen Säuren stellen viele Arten der Milchsäurebakterien gewünschte Aroma-verleihende Verbindungen her, die sich von Milchsäure unterscheiden. Aroma-herstellende Milchsäurebakterien beinhalten beispielsweise Leuconostoc cremoris.
Erfindungsgemäße Milchsäurebakterien-Starterkulturen sind für die Herstellung vieler fermentierter Lebensmittelprodukte geeignet, einschließlich Milchprodukte, wie Butter, Käse, Joghurt und Acidophilusmilch; Fleischprodukte, einschließlich fermentierte Wurst; fermentierte Gemüseprodukte, wie Sauerkraut; Weine, in denen Milchsäurebakterien Äpfelsäure ("malolactic acid") in Milchsäure umgewandelt haben; Brot; fermentierte Fischprodukte und auch Tierfutter wie Silage und fermentierte proteinhaltige Futtermittel für fleischfressende Tiere.
Der erfindungsgemäße Clonierungsvektor weist vorzugsweise einen Replikationsbereich auf, der es dem Vektor ermöglicht, nur in Milchsäurebakterien zu replizieren. Dementsprechend umfaßt das vorliegende, als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien geeignete rekombinante Plasmid ein DNA- Fragment, das aus einem Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, wobei das DNA- Fragment einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B.subtilus funktionellen Replikationsbereich umfaßt. Indem ein Replikationsbereich ausgewählt wird, der in Bakterien, die sich von Milchsäurebakterien unterscheiden, nicht funktionell ist, wird mit der höchstmöglichen Wahrscheinlichkeit versucht, zu verhindern, daß von aufgenommenen Starterkultur-Bakterien stammende genetische Information auf endogene, Nicht-Milchsäurebakterien übertragen wird, die in großer Anzahl im gastro-intestinalen Bereich vorhanden sind. Diese endogene bakterielle Flora umfaßt Mitglieder, die pathogen oder potentiell pathogen sind. Es kann nicht akzeptiert werden, daß derartige Organismen neue Phänotypen von rekombinierten Milchsäurebakterien erwerben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde das einen in Milchsäurebakterien, aber nicht in E. coli und B. subtilis funktionellen Replikationsbereich umfassende DNA-Fragment aus einem Wildtypplasmid isoliert, das aus dem als SSD207 bezeichneten Stamm Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis isoliert worden war. Dieser das Plasmid tragende Stamm, aus dem der in Milchsäurebakterien funktionelle Replikationsbereich isoliert worden war, wurde bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, D-3300 Braunschweig, Deutschland, am 11. Dezember 1989 unter der Hinterlegungsnummer DSM 5677 hinterlegt.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist ein geeigneter Selektionsmarker ein Selektionsmarker, der die direkte einstufige Selektion transformierter Milchsäurebakterien ermöglicht, die in einem Transformationsgemisch mit einer Häufigkeit im Bereich von 10&sup4; bis 10&sup6; Transformanten pro ug DNA vorkommen, wobei die Zahl nicht-transformierter Zellen in dem Transformationsgemisch im Bereich von 10&sup8; bis 10¹&sup0; pro ml des Gemisches liegt.
In der Gentechnologie stellen die am häufigsten verwendeten Selektionsmarker DNA-Fragmente dar, die ein Gen (Gene) umfassen, die Resistenz gegenüber einem Antibiotikum verleihen. Die Verwendung von Antibiotikum-Resistenzmarkern setzt voraus, daß die transformierbare Empfängerzelle sensitiv gegenüber dem Antibiotikum ist, gegenüber welchem der Clonierungsvektor Resistenz verleiht. Transformierte, derartige Resistenzgene aufweisende Zellen werden auf einem Medium selektiert, das eine Menge an Antibiotikum enthält, die geringer ist als die Menge, gegenüber der der Marker den Transformanten Resistenz verleiht. Wie jedoch zuvor schon ausgeführt, stellt das Vorkommen von spontanen Mutanten in dem Transformationsgemisch, die Resistenz gegenüber dem Selektions-Antibiotikum erworben haben, und wobei die Häuf igkeit dieser Mutanten gleich oder sogar höher als die Transformationshäufigkeit ist, ein ernstes Problem dar, da Kolonien oder Kulturen derartiger resistenter, in dem selektiven Medium wachsender Mutanten nicht unterscheidbar von den Transformanten sind. Besonders groß ist dieses Problem dann, wenn nur geringe Mengen, wie etwa 10 bis 100 ng zu transformierender DNA vorhanden sind. In derartigen Fällen kann die Anzahl von auf dem Selektionsmedium wachsenden Mutanten um einen Faktor im Bereich von 10 bis 100 größer sein als die der transformierten Zellen.
Die gegenwärtigen Erfinder haben zu einem großen Teil dieses weithin bekannte Problem überwunden, indem sie einen selektierbaren Marker isoliert haben, der, wenn in einem Milchsäurebakterium auf einem Wildtypplasmid vorhanden, dem natürlichen Wirt Resistenz gegenüber einem Antibiotikum in großer Menge verleiht. Beispielsweise wurde aus einem natürlich in einem Lactococcus sp vorkommenden Plasmid ein nisr- Gen isoliert, wobei das Wachstum von Lactococcus sp durch die Gegenwart von 1000 IE Nisin/ml Medium nicht beeinflußt wurde. Zum Vergleich wird darauf hingewiesen, daß das von Froseth et al., vorstehend, offenbarte nisr-Gen des Plasmids pFM011 Resistenz gegenüber einer Menge von nur 160 TE/ml verleiht. Der Hauptvorteil der Verwendung eines selektierbaren Antibiotikum-Resistenzmarkers, der einen hohen Grad an Resistenz verleiht, liegt darin, daß der Abstand zwischen der Menge an selektivem Antibiotikum gegenüber der spontane Mutanten resistent sind und der Menge an Antibiotikum im Selektivmedium vergrößert werden kann, wobei die Wahrscheinlichkeit signifikant vergrößert wird, resistente mutante Zellen vom Wachstum auszuschließen. In dem Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird es als vorteilhaft angesehen, daß das Verhältnis zwischen der Bacteriocin-Menge, gegenüber der Resistenz durch den selektierbaren Marker verliehen wird, und der Bacteriocin-Menge, gegenüber der 10 % der spontanen resistenten Mutanten resistent sind, mindestens 10:1 beträgt, vorzugsweise mindestens 50:1, stärker bevorzugt mindestens 100:1, noch stärker bevorzugt mindestens 500:1 und insbesondere mindestens 1000:1.
Es ist außerdem essentiell, daß der selektierbare Marker des erfindungsgemäßen Vektors eine einstufige primäre Selektion von Milchsäurebakterien ermöglicht, die mit dem Vektor transformiert worden sind. In dem vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "primäre Selektion", daß der selektierbare Marker in den transformierten Zellen so wirksam exprimiert wird, daß er als der einzige selektive Marker verwendet werden kann. In verschiedenen bekannten Verfahren zur Transformation von Milchsäurebakterien werden mindestens zwei selektierbare Antibiotikum-Resistenzmarker benötigt, von denen einer ein Resistenz gegenüber einem pharmazeutisch geeigneten Antibiotikum verleihender Marker ist, der in einem hohen Ausmaß exprimiert wird und als primärer selektierbarer Marker verwendet wird, und der andere ein Marker ist, der Resistenz gegenüber einem von einem Milchsäurebakterium hergestellten Bacteriocin verleiht und als sekundärer selektierbarer Marker verwendet wird. Die beiden Marker können vorzugsweise auf zwei verschiedenen Plasmiden liegen, die dann cotransferiert werden. Die primäre Selektion wird typischerweise ausgeführt, indem auf einem das pharmazeutisch geeignete Antibiotikum enthaltendem Medium selektiert wird und anschließend eine sekundäre Selektion gegenüber dem anderen Antibiotikum ausgeführt wird, das demgemäß als sekundärer Selektionsmarker verwendet wird, um wirklich transformierte Zellen von Zellen zu unterscheiden, die spontan resistent gegenüber dem primären Selektionsantibiotikum geworden sind.
Weiterhin wird der selektierbare Marker des erfindungsgemäßen Clonierungsvektors so selektiert, daß die primäre Selektion als ein einstufiges Verfahren durchgeführt werden kann. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "einstufige Selektion", daß in einem Transformationsgemisch transformierte Zellen nachgewiesen werden können, indem das Gemisch direkt auf das selektive Medium transferiert wird und anschließend das Medium für einen Zeitraum im Bereich von 6 bis 48 Stunden inkubiert wird, um so die Vermehrung der Transformanten zu nachweisbaren Zahlen zu gewährleisten. Wie zuvor beschrieben (Froseth et al., vorstehend) ist es bekannt, Resistenz gegenüber einem Milchsäurebakterium-Bacteriocin als primären Selektionsmarker bei der Transformation von Milchsäurebakterien zu verwenden. Das von diesen Autoren offenbarte Selektionsverfahren war jedoch nur in einem zweistufigen Verfahren möglich, indem zunächst eine erste Inkubation für 3 bis 5 Tage durchgeführt wurde, der eine Replika-Plattierung auf einem das selektive Bacteriocin enthaltendem Medium folgte.
Eine essentielle Eigenschaft eines geeigneten erfindungsgemäßen selektierbaren Markers liegt in der konstitutiven Expression der Resistenz. Daraus folgt, daß der Phänotyp direkt exprimiert wird, ohne daß Induktion des Gens beispielsweise durch Zugabe beliebiger induzierender Agentien nötig ist.
Ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen Clonierungsvektors liegt darin, daß er wenigstens eine Restriktionsstelle umfaßt, die die Insertion eines ein gewünschtes Genprodukt codierenden DNA-Fragments ermöglicht. Eine geeignete Restriktionsstelle ist vorzugsweise eine Restriktionsstelle, die auf dem Vektor an einer Stelle liegt, an der die Insertion fremder Gene sich nicht auf die Funktionen des selektierbaren Markers oder des Replikationsbereichs auswirkt.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das als Clonierungsvektor geeignete rekombinante Plasmid ein rekombinantes Plasmid, das ein DNA-Fragment umfaßt, das einen Replikationsbereich und ein einen selektierbaren Marker umfassendes DNA-Fragment umfaßt, wobei beide wie vorstehend definiert sind und von verschiedenen Wildtyp-Plasmiden isoliert wurden, die aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurden, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Arten der Gattungen Lactococcus, Lactobacillus, Strertococcus, Pediococcus, Leuconostoc und Bifidobacterium.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße rekombinante Plasmid-Clonierungsvektor ein Plasmid, wobei das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbare Markergen ein Marker ist, der den transformierten Zellen Resistenz gegenüber einem von einem Milchsäurebakterium hergestellten Bacteriocin verleiht. Bacteriocine sind Proteine oder Proteinkomplexe mit bakteriozider Wirkung gegen Arten, die normalerweise eng mit dem herstellenden Bakterium verwandt sind. Der Bereich hemmender Aktivität von Bacteriocinen aus Milchsäurebakterien kann entweder eng sein, nur mit dem herstellenden Organismus eng verwandte Arten hemmend, oder breiter sein, eine größere Gruppe von gram-positiven Organismen hemmend, z.B. einschließlich Bacillus spp, Listeria spp und Clostridium spp. Das am besten untersuchte Bacteriocin aus Milchsäurebakterien ist Nisin, das von bestimmten Stämmen von Lactococcus lactis hergestellt wird. Nisin gehört zu einer Gruppe von Bacteriocinen, denen ein hoher Anteil der Aminosäuren Lanthionin und β-Methyllanthionin gemeinsam ist. Andere Beispiele für Bacteriocine aus Milchsäurebakterien sind Lactostrepcin und Diplococcin, die beide von Lactococcus lactis subsp. cremoris hergestellt werden und Pediocine, die von Pediococcus spp. hergestellt werden.
Demgemäß erkannten die gegenwärtigen Erfinder bei der Auswahl eines geeigneten selektierbaren Markers, daß ein ein Bacteriocin herstellendes Milchsäurebakterium inhärent insensitiv gegenüber diesem Bacteriocin sein muß. Es ist bekannt, daß die Menge dieser Insensitivität oder Resistenz sehr variabel ist, wie bereits vorstehend beschrieben. Die Erfinder haben jedoch erkannt, daß ein selektierbarer Bacteriocin-Resistenzmarker, der eine einstufige primäre Selektion ermöglicht, vorzugsweise aus einem Milchsäurebakterium isoliert werden kann, das das selektive Bacteriocin in großen Mengen herstellt. Demgemäß wurden als erster Schritt bei der Isolierung eines geeigneten selektierbaren Markers, wie vorstehend beschrieben, Stämme von Milchsäurebakterien ausgewählt, die ein Bacteriocin in großer Menge herstellen, und auf Resistenz gegenüber dem hergestellten Bacteriocin getestet.
Beispielsweise war ein als 10.084 bezeichneter Stamm von Lactococcus lactis subsp. lactis vollständig resistent gegenüber 1000 IE/ml Nisin, wobei sogar bei 3000 IE/ml das Wachstum des Stamms nur wenig beeinflußt wurde. Aus diesem Stamm konnte ein Plasmid isoliert werden, das einem sensitiven Milchsäurebakterium Resistenz verlieh. Das Plasmid wurde ursprünglich als pNis bezeichnet, wurde anschließend aber in pSF01 umbenannt. Der pNis/psFol umfassende Stamm Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 wurde bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, D-3300 Braunschweig, Deutschland am 11. Dezember 1989 unter der Hinterlegungsnummer DSM 5678 hinterlegt.
Demgemäß wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien geeignetes rekombinantes Plasmid bereitgestellt, wobei der eine einstufige primäre Selektion ermöglichende selektierbare Marker eine Nisin-Resistenzmarker-genetische Determinante ist, die einem transformierbaren Nisin-sensitiven Milchsäurebakterium Resistenz gegenüber einer Menge verleiht, die mindestens 200 IE/ml Nisin, vorzugsweise mindestens 500 IE/ml, stärker bevorzugt mindestens 1000 IE/mi, noch stärker bevorzugt mindestens 2000 IE/ml und insbesondere mindestens 3000 IE/ml verleiht. Die Resistenz wird dabei bestimmt als die minimale Hemmkonzentration in einem flüssigen Medium, die optimales Wachstum der Milchsäurebakterien erlaubt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der rekombinante Plasmid-Clonierungsvektor das Plasmid pVS40, das bei der DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 B, D- 3300 Braunschweig, Deutschland am 11. Dezember 1989 unter der Hinterlegungsnummer DSM 5679 in Form eines transformierten Derivats von Lactococcus lactis subsp. lactis NCDO 712 hinterlegt und als MG1614(pVS40) bezeichnet wurde, oder andere Plasmide, die nur DNA enthalten, die von Milchsäurebakterien, einschließlich daraus isolierten Wildtyp-Plasmiden stammt und die einen selektierbaren Marker und einen Replikationsbereich umfaßt, die im wesentlichen die Eigenschaften des selektierbaren Markers und des Replikationsbereichs von pVS40 aufweisen. Es ist klar, daß der selektierbare Marker und der Replikationsbereich aus jedem beliebigem Milchsäurebakterium, wie vorstehend beschrieben, isoliert werden können.
Ein geeignetes erfindungsgemäßes rekombinantes Plasmid ist vorzugsweise ein Plasmid mit einer Größe im Bereich von 1 - 20 kbp, stärker bevorzugt im Bereich von 2 - 15 kbp und insbesondere im Bereich von 3 bis 10 kbp, wie etwa 7,8 kbp.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend im Detail definierten rekombinanten Plasmid-Clonierungsvektors Das Verfahren umfaßt in einem ersten Schritt die Herstellung eines ersten intermediären Plasmids, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis replizieren kann. Entsprechende und geeignete Verfahren zur Isolierung eines DNA-Fragments, das aus Milchsäurebakterien stammt und einen Replikationsbereich umfaßt, der das definierte Replikationsverhalten codiert, waren nicht vorhanden. Die gegenwärtigen Erfinder erkannten jedoch, daß der gesuchte Replikationsbereich höchstwahrscheinlich aus einem Plasmid isoliert werden konnte, dessen DNA nicht mit der DNA des Replikationsbereichs eines Plasmid mit einem breiten Wirtsbereich hybridisierte, das mindestens in Milchsäurebakterien, E. coli und B. subtilis replizieren kann.
Demgemäß umfaßt die Herstellung des ersten intermediären Plasmids die folgenden Teilschritte:
(i) Isolieren von Plasmid-DNA aus einem Milchsäurebakterium,
(ii) Hybridisieren der isolierten Plasmid-DNA aus Teilschritt (i) mit einem einen Replikationsbereich umfassenden DNA-Fragment, das aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, und wobei dieses Wildtyp-Plasmid in Milchsäurebakterien, E. coli und B. subtilis replizieren kann,
(iii) Isolieren von Plasmid-DNA aus Teilschritt (i), die nicht mit der Wildtyp-Plasmid-DNA aus Teilschritt (ii) hybridisiert,
(iv) Isolieren eines DNA-Fraginents (a) aus der in Teilschritt (iii) erhaltenen Plasmid-DNA, das einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B.subtilis funktionellen Replikationsbereich umfaßt,
(v) Verbinden des isolierten DNA-Fragments aus Teilschritt (iv) unter Ligierungsbedingungen mit einem DNA-Fragment, das ein erstes selektierbares Markergen umfaßt, das die Selektion von mindestens E. coli, B. subtilis und Milchsäurebakterien erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden Plasmid transformiert sind, zum Erhalt des ersten intermediären Plasmids, mit dem getestet werden kann, ob der Replikationsbereich von DNA-Fragment (a) in E. coli und B. subtilis nicht funktionell ist.
Die Transformationsexperimente sind detailliert in den nachstehenden Beispielen offenbart.
Die Verwendung eines wie vorstehend definierten ersten selektierbaren Markergens ist essentiell, da es dessein Selektierbarkeit in einem weiten Bereich ermöglicht, das Replikationsverhalten des selektierten Replikationsbereichs zu testen. Dieses Testen wird ausgeführt, indem die Transformation von Stämmen von mindestens Milchsäurebakterien, E. coli und B. subtilis mit dem intermediären Plasmid versucht wird. Ein negatives Ergebnis derartiger Transformationsexperimente wird als Hinweis darauf betrachtet, daß der selektierte Replikationsbereich des intermediären Plasmids nicht funktionell ist. Bei den Experimenten wurde Replikation des intermediären Plasmids beispielsweise in Lactobacillus plantarum und Lactococcus lactis spp, jedoch nicht in kompetenten Empfängern E. coli und B. subtilis beobachtet. Im Fachgebiet wird allgemein angenommen, daß bei der Verwendung von kompetenten Empfängerzellen erfolglose Transformationsexperimente klare Hinweise darauf sind, daß der getesteten DNA die Replikationsfähigkeit fehlt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das DNA-Fragment einen zur Replikation in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis fähigen Replikationsbereich und wird aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis SSD207 isoliert wird.
Das Verfahren umfaßt ferner einen zweiten Schritt, der das Verbinden des ersten intermediären Plasmids mit einem ein zweites Markergen umfassenden DNA-Fragment (b) unter Ligierungsbedingungen umfaßt, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbar ist, wobei die Expression des Markers die primäre einstufige Selektion von Milchsäurebakterienzellen erlaubt, die mit einem dieses DNA- Fragment umfassenden rekombinanten Plasmid transformiert sind, und das DNA-Fragment aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, zum Erhalt eines zweiten intermediären Plasmids. Die Eigenschaften des in dem zweiten Schritt bevorzugten zweiten selektierbaren Markers sind jene, die vorstehend definiert wurden. Die detaillierten anwendbaren Verfahren werden im Detail in den nachstehenden Beispielen ausgeführt.
Ein dritter Schritt des Verfahrens umfaßt die Entfernung des den ersten selektierbaren Marker umfassenden DNA- Fragments aus dem zweiten intermediären Plasmid unter für ein Restriktionsenzym geeigneten Bedingungen, gefolgt von erneuter Ligierung zum Erhalt des rekombinanten Plasmids, das als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien verwendbar ist. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens verleiht das erfindungsgemäße selektierbare Markergen den transformierten Zellen Resistenz gegenüber einem von einem Milchsäurebakterium hergestellten Bacteriocin, insbesondere Nisin. Außerdem verleiht das selektierbare Nisin-Resistenz- Markergen vorzugsweise Resistenz gegenüber mindestens 200 IE/ml Nisin, vorzugsweise gegenüber mindestens 500 IE/ml, stärker bevorzugt gegenüber mindestens 1000 IE/ml, noch stärker bevorzugt gegenüber mindestens 2000 IE/ml und insbesondere gegenüber mindestens 3000 IE/ml Nisin. Beispielsweise wird das DNA-Fragment (b) aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 isoliert wurde.
Ein Beispiel für einen besonders geeigneten rekombinanten Plasmid-Clonierungsvektor, der sich aus dem Verfahren ergibt, ist pVS40. Wie in Figur 1 dargestellt, wird pVS4o hergestellt, indem pVS34 als das erste intermediäre Plasmid und pVS39 als das zweite intermediäre Plasmid verwendet wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen rekombinanten Plasmid-Clonierungsvektor, wie vorstehend definiert, wobei ein weiteres DNA-Fragment inseriert wurde, das mindestens ein Gen umfaßt, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, und einen Promotor dazu, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist. Vorzugsweise wird das ein gewünschtes Genprodukt codierende Gen aus einem Milchsäurebakterium, einschließlich darin enthaltener Plasmide, isoliert.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung kann ein gewünschtes Genprodukt jedes beliebige Produkt sein, dessen Expression einem als Lebensmittelstarterkultur verwendeten Milchsäurebakterium einen nützlichen Phänotyp verleiht. Derartige Genprodukte können z.B. aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Enzymen, Bacteriocinen und Phagenresistenzverleihenden Genprodukten besteht. Bei der Verbesserung von Starterkulturen kann es von Interesse sein, den das inserierte gewünschte Gen umfassenden Clonierungsvektor sogar in Stämme von Starterkulturen einzuführen, in denen der verliehene Phänotyp bereits vorhanden ist, um so dessen Expression zu verstärken.
Beispiele nützlicher Enzyme sind Lipasen, Peptidasen, Fleisch-weichmachende Enzyme, Pectinasen, Lysozym, Proteasen, Galactosidasen und andere Enzyme, die es dem Starterkultur-Stamm ermöglichen, Kohlenhydrate zu metabolisieren, einschließlich Enzyme, die bei der Expression in Gegenwart von Lactose zur Bildung von Milchsäure führen. Gewünschte Aroma-verleihende Verbindungen, deren Herstellung durch ein inseriertes Gen codiert sein kann, sind z.B. Acetoin und Diacetyl. Das rekombinante erfindungsgemäße Plasmid kann auch für die Herstellung von Bacteriocinen geeignet sein. Dementsprechend kann das inserierte Gen DNA umfassen, die die Bacteriocin-Herstellung codiert. Eine wichtige Eigenschaft geeigneter Lebensmittelstarterkulturen liegt in deren Resistenz gegenüber Bakteriophagen. Die der Phagen-Resistenz unterliegenden Mechanismen sind ebenso wie die genetischen Determinanten bekannt. Beispielsweise kann die Resistenz gegenüber Bakteriophagen darauf beruhen, daß das resistente Bakterium Restriktionsenzyme herstellt. Der rekombinante erfindungsgemäße Clonierungsvektor ist geeignet, Phagen-sensitiven Milchsäurebakterien Resistenz-Phänotypen gegenüber Phagen zu verleihen. Ein weiteres Beispiel eines nützlichen Phänotyps, der einer Starterkultur verliehen werden kann, liegt in der Temperaturtoleranz der Wirtsorganismen. Bei der Produktion von bestimmten fermentierten Lebensmittelprodukten kann es vorteilhaft sein, den Fermentationsprozeß innerhalb eines bestimmten Temperaturbereichs auszuführen.
Zusätzlich zur Insertion von gewünschte Genprodukte codierenden Genen in Milchsäurebakterien, die in Lebensmittelstarterkulturen verwendbar sind, ist es klar, daß der erfindungsgemäße rekombinante Vektor auch bei der Herstellung von Vektoren mit inserierten Genen geeignet ist, die andere nützliche Produkte codieren, wie pharmazeutisch oder technologisch aktive Polypeptide, beispielsweise Interferone, Insulin oder Chymosin. Weitere Beispiele nützlicher Gene sind Gene, die die Herstellung von Aminosäuren oder Vitaminen codieren.
Die Expressionsrate eines von dem inserierten Gen codierten gewünschten Produktes hängt u.a. von der Kopienzahl des rekombinanten Plasmid-Clonierungsvektors ab. Bei anderen als Milchsäurebakterien ist es bekannt, daß Plasmide infolge von bestimmten Mutationen in hoher Kopienzahl auftreten oder Plasmide mit hoher Kopienzahl aus Wildtyp-Plasmiden mit niedriger Kopienzahl hergestellt werden können, indem hohe Kopienzahl codierende Gene inseriert werden. Die gegenwärtigen Erfinder haben Experimente durchgeführt, die zeigen, daß erfindungsgemäße rekombinante Plasmide durch Mutagenese modifiziert werden können, so daß eine erhöhte Kopienzahl auftritt. Es wurde so gezeigt, daß der Replikationsbereich des Plasmids pVS39 durch in-vitro-Mutagenese mit NH&sub4;OH modifiziert werden kann. Wenn ein Chloramphenicol-sensitiver (Cms) Lactococcus sp.-Empfängerstamm mit einem den mutagenisierten Replikationsbereich umfassenden pVS39 transformiert wird, zeigten die Transformanten eine minimale Hemmkonzentration gegenüber Cm von 100 ug/ml. Vergleichsweise erlangt der gleiche Empfängerstamm, der mit dem den Ursprungs-Replikationsbereich umfassenden pVS39 transformiert wurde, Resistenz bis höchstens 25 ug/ml Cm. Obgleich diese Ergebnisse keinen endgültigen Beweis für das Auftreten des derart modifizierten pVS39 in erhöhter Kopienzahl darstellen, sind sie jedoch starke Hinweise darauf, daß dies der Fall ist. In dem Fachgebiet ist allgemein bekannt, daß der wahrscheinlichste, der erhöhten Chloramphenicol-Toleranz unterliegende Mechanismus in einem Bakterium in einer erhöhten, die Resistenz codierenden DNA-Dosis liegt.
Bei der Anwendung einer Lebensmittelstarterkultur, die auf Milchsäurebakterien basiert, die mit einem rekombinanten erfindungsgemäßen ein wie vorstehend definiertes inseriertes Gen umfassenden Plasmid transformiert wurden, ist es wünschenswert, daß das Plasmid während des Lebensmittelfermentationsverfahrens stabil erhalten bleibt, wobei das Verfahren die Vermehrung der Starterkultur-Bakterien beinhaltet. Es ist daher zu berücksichtigen, daß die vorliegenden rekombinanten Plasmide beispielsweise durch Insertion von Genen in die Plasmide weiter verbessert werden können, die eine Teilungsfunktion codieren. Eine derartige Funktion ist beispielsweise gut in E. coli beschrieben und hat die Wirkung, daß alle Nachkommen eines Plasmid enthaltenden Wirtsbakteriums das Plasmid enthalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorstehend definierten rekombinanten Plasmids, wobei ein weiteres DNA- Fragment inseriert wurde, das mindestens ein Gen umfaßt, das ein gewünschtes Genprodukt codiert und einen Promotor dazu, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist, umfassend das Inserieren eines ein gewünschtes Genprodukt codierenden Gens in eine Restriktionsstelle eines erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmids und wahlweise eines Promotors dazu, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist. Der Promotor kann selbst in dem Plasmid inhärent vorliegen oder wahlweise ein fremder, in Milchsäurebakterien funktioneller Promotor sein, der zusammen mit dem gewünschten Gen inseriert wird. Beispiele für in Milchsäurebakterien funktionelle Promotoren sind aus Lactococcus lactis spp. isolierte Promotoren, offenbart von Jos et al., Appl Environ., Microbiol. 53 (1987), 2452-2457, für Lactococcus lactis subsp. cremoris und aus einem Lactococcus lactis subsp. cremoris temperenten Bakteriophagen isolierte Promotoren für unter anderem Lactococcus lactis (Lakshmidevi et al., Appl. Environ. Microbiol. 56 (1990), 934-942).
Es ist essentiell, daß sich die ausgewählte Insertionsstelle in einer Position auf dem rekombinanten Plasmid befindet, an der die Insertion die Funktion des Replikationsbereichs und der Determinante des selektierbaren Markers nicht beeinflußt. Die ausgewählte Stelle ist vorzugsweise eine einmal vorkommende Restriktionsstelle. Andere Stellen können jedoch auch verwendet werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur eines Milchsäurebakteriums bereitgestellt, umfassend die Transformation eines Milchsäurebakteriums mit einem hier definierten rekombinanten Plasmid, in das ein gewünschtes Gen inseriert wurde, das Selektieren eines transformierten Milchsäurebakteriums, das Züchten der selektierten Transformante, das Isolieren der gezüchteten transformierten Zellen und die Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur davon.
Die Transformation wurde gemäß an sich bekannter Verfahren durchgeführt, wie Protoplastentransformation oder Elektroporation, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben und beispielhaft dargestellt sind. Ist das rekombinante Plasmid eines, das als primären selektierbaren Marker eine Bacteriocin-Determinante umfaßt, werden die Transformanten in einem Medium selektiert, das das Bacteriocin thält, vorzugsweise in einer zu einem Anteil davon führenden Menge, der etwa die Höhe der Menge hat, gegenüber der der selektierbare Marker Resistenz verleiht. Neu transformierte Zellen können jedoch zeitweise empfindlicher gegenüber dem Bacteriocin sein. Demgemäß kann es notwendig sein, die Transformanten bei einer Menge zu selektieren, die geringer als die minimale Hemmkonzentration ist. Die Nisin- Resistenzdeterminante des Plasmids pVS40 verleiht beispielsweise in Wirtszellen, die nicht neu transformiert sind, Resistenz bis zu mindestens 1000 IE/ml, während die Resistenz von neu mit dem Plasmid transformierten Milchsäure-Bakterienzellen um einen Faktor im Bereich von 2 bis 20 verringert sein kann.
Demgemäß kann bei Verwendung des Verfahrens zur Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur von Milchsäurebakterien der Schritt des Selektierens transformierter Zellen vorzugsweise mittels Nisin als selektivem Bacteriocin bei einer Konzentration im Selektionsmedium durchgeführt werden, die mindestens 50 IE/ml, vorzugsweise mindestens 75 IE/ml, stärker bevorzugt mindestens 100 IE/ml und besonders bevorzugt mindestens 500 IE/ml beträgt.
Die Züchtung der transformierten Zellen und die weiteren Verfahrensschritte zum Erhalt der endgültigen Starterkultur-Produkte werden gemäß den in der Lebensmittelstarterkultur-Industrie gut bekannten Verfahren durchgeführt.
Die Erfindung betrifft auch eine Lebensmittelstarterkultur, die eine gemäß dem vorstehend offenbarten Verfahren hergestellte Kultur eines Milchsäurebakteriums umfaßt. In dem gegenwärtigen Zusammenhang wird der Begriff "Lebensmittelstarterkultur" zur Beschreibung einer Zusammensetzung verwendet, die als einen wesentlichen Bestandteil einen oder mehrere Milchsäurebakterien-Stämme umfaßt, die ein rekombinantes erfindungsgemäßes Plasmid umfassen. Die Zusammensetzung ist zur Fermentation eines bestimmten Lebensmittelproduktes bestimmt. Eine Lebensmittel-Starterkultur kann definitionsgemäß beispielsweise eine Milchstarterkultur, eine Fleisch-Starterkultur, eine Brot-Starterkultur, eine Weinmalolaktische Kultur, eine Silagekultur oder eine Gemüse- Starterkultur sein. Innerhalb all dieser Starterkultur-Typen kann es Milchsäurebakterien umfassende Subtypen ergeben, die rekombinante Plasmide mit inserierten Genen umfassen, wodurch der sich ergebende Subtyp einer Starterkultur speziell bei der Herstellung eines besonderen Lebensmittelprodukts verwendbar ist. So können innerhalb der erfindungsgemäßen Milch-Starterkulturen Joghurt- oder Käse-Starterkulturen vorliegen.
Die Starterkultur kann in Form einer flüssigen Zusammensetzung vorliegen, wie eine fermentierte Milch, die wahlweise in einer gefrorenen oder getrockneten Form, z.B. als ein gefriergetrocknetes Pulver vorliegt. Die Lebensmittelstarterkultur kann jedes geeignete erfindungsgemäß hergestellte Milchsäurebakterium umfassen. Vorzugsweise werden die Milchsäurebakterien aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Streptococcus spp, Lactococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Leuconostoc spp und Pediococcus spp besteht.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben.

BEISPIELE

Materialien und Verfahren

Bakterienstämme, Plasmide, Medien und Züchtungsbedinungen

Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis SSD207 wird aus einer Milch-Starterkultur isoliert. Bei der Gelelektrophorese zeigen sich wenigstens 12 Plasmidbanden in einem Größenbereich von 2 bis mehr als 30 kbp (von Wright et al., Lett. Appl. Microbiol. 2 (1986), 73-76). Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 wurde aus der Stamm-Sammlung des "Danish Government Research Institute for Dairy Industrie" erhalten. Dieser Stamm trägt 5 oder 6 Plasmide, wie aus Figur 3A, Spur 13 hervorgeht. Empfänger-Stämme und unterschiedliche in den Transformations- und Clonierungs-Experimenten verwendete Plasmide werden in Tabelle I aufgeführt. Für die Experimente mit L. lactis subsp. lactis und Staphylococcus aureus wurde M17 Medium (Terzaghi, B.E. und Sandine, W.E., Appl. Microbiol. 29 (1975), 807-813; Difco, East Molesey, UK) verwendet, das entweder mit 0,5 % Lactose (für SSD207, 10.084 und das Plasmid pNis/psFol tragende Stämme) oder Glucose (für die übrigen Stämme) supplementiert wurde. Escherichia coli und Bacillus subtilis wurde in L- Nährmedium oder L-Agar gezüchtet, wie beschrieben bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982). In Experimenten mit Lactobacillus Dlantarum wurde MRS-Medium verwendet (DeMan, J.C. et al. J.Appl. Bact. 23 (1960), 130-135). Die Inkubationstemperatur betrug für Lactococcus spp. 32ºC, für L. plantarum 30ºC und für die anderen Arten 37ºC.
Dem Stamm MG1614, der ein Derivat von L. lactis subsp. lactis NCD0712 ist, wurden nach einigen Runden "Protoplast-curing" Plasmide und Prophagen entzogen. Der Stamm wurde von M. Gasson erhalten. Der von L.L. McKay erhaltene Stamm LM0230 wird als Derivat von L. lactis subsp. lactis C2 beschrieben, dem Plasmide und Prophagen als Folge von Nitrosoguanidin und UV-Strahlung entzogen worden waren. Die gemischten Stamm-Starterkulturen BOLL1 und D1 wurden von Chr. Hansen's Laboratory Ltd., Horsholm, Dänemark, hergestellt und werden beide routinemäßig von dem "Danish Government Research Institute for Dairy" bei der Herstellung verwendet. BOLL1, der weithin bei der Herstellung von Käse verwendet wird, ist eine "Direct Vat Set" (gefriergetrocknete)-Milch- Starterkultur, von der beschrieben wird, daß sie etwa 1 bis 5 % L. lactis subsp. lactis, 70-75 % L. lactis subsp cremoris, und 2-5 % Leuconostoc cremoris (Chr. Hansen's Laboratorium Ltd., Erklärung mesophiler Milchsäurefermenter kulturen) enthält.

Medien und Züchtungsbedingungen

Für den Nachweis von Lactose- oder Saccharose-Fermentations-Phänotypen wurde der Bromkresol-Viol ett-Indikator von McKay et al., Appl. Microbiol. 23 (1972), 1090-1096, mit 1 % Lactose bzw. Saccharose supplementiert. Der Proteinase- Phänotyp wurde getestet, indem eine Kolonie in 10 ml autoklavierte rekonstituierte mit 0,5 % Glucose und 0,1 % Lackmus supplementierte Magermilch inokuliert wurde. Nach 24- stündiger Inkubation bei 30ºC wurde ein Clon als Proteinasepositiv angesehen, wenn er zur Entfärbung des Lackmus und Koagulation der Milch führte. Um festzustellen, welche Stämme Nisin herstellen, wurde die "Agar-Flip-over-Methode" von Scherwitz et al., Appl. Environ. Microbiol. 45 (1983), 1506-1512 verwendet, wobei der Indikator-Organismus LM0230 ist. Für den Routinenachweis und die Selektion der Nisin- Resistenz-Determinante wurde Nisin in einer Konzentration von 100 IE/ml dem festen Medium zugesetzt. Die Antibiotika Chloramphenicol (Cm) und Erythromycin (Em) wurden zu Endkonzentrationen von 5 bzw. 2,5 ug/ml zugegeben.
Zur Messung des Wachstums im Nährmedium wurde die A&sub6;&sub0;&sub0; mittels eines Spectronic 501 Spektrophotometers (Milton Roy Corp.) festgestellt und lebende Zellen durch Ausplattieren entsprechender Verdünnungen auf GM17-Agar gezählt ("colony forming units", kolonie-bildende Einheit (cfu) pro ml).
Um Einzelzell-Resistenz gegenüber Nisin festzustellen, wurden etwa 10&sup5;cfu einer exponentiell wachsenden Kultur in GM17-Nährmedium auf frisch hergestellten GM17-Platten und Nisin-Konzentrationen im Bereich von 10 bis 3000 IE/ml enthaltenden GM17-Platten ausplattiert. Die Platten wurden 24 Stunden inkubiert und anschließend die näherungsweise Anzahl der Kolonien pro Platte im Verhältnis zu den Platten ohne Nisin abgeschätzt. Tabelle I Stamm Relevanter Phänotyp a Beschreibung und Fundstelle Lactococcus lactis subsp. lactis.biovar.diacetylactis SSD207 Lett. Appl. Microbiol. Die Stamm-Sammlung des "Danish Government Research Institute for Dairy Industry" Plasmid-freies Derivat von L. lactis subsp. lactis NCDO 712; J.Bacteriol Appl. Environ. Microbiol. Diese Erfindung (Transformante der zweiten Runde mit Plasmiden des Stammes E. coli B. subtilus S. aureus Lb. plantarum enthält ein kryptisches Plasmid von etwa Mol. Gen. Genet. Gerard Venema, Universität Groningen Niederlande Richard Novick, Public Health Research Institute of the City of New York, Inc., New York Stamm-Sammlung des "Research and Development Centre of Valio Finnish Cooperative Dairies' Association" Tabelle I - Fortsetzung Plasmid Phänotyp Größe Beschreibung und Fundstelle Gene Das 4,1 kpb ClaI-Fragment enthaltend das Chloramphenicol-Resistenzgen von pGB301, Mol. Gen. Genet. 184, 115-120 (1981), cloniert in die einzige ClaI-Stelle von pBR322 (S. Tynkkynen, M.Sc. Arbeit, 1985, University of Helsinki, Finnland) Das 2,8 kpb ClaI-HpaII-Fragment von pVC5 cloniert in das 1,7 ClaI-Fragment von pSH71; J. Bacteriol. 154, 1-9 (1983) (S. Tynkkynen, M.Sc. Arbeit) Diese Erfindung Appl. Environ. Microbiol. 53, 1584-1588 (1987) Diese Erfindung a Abkürzung: Nip&spplus;, Nisin-Herstellung ist positiv; Nisr, Nisin-resistent, Lac&spplus;, Lactose-fermentierend; Suc&spplus;, Saccharose-fermentierend; Prt&spplus;, Proteinase-Herstellung ist positiv; Rif, Rifampin; Str, Streptomycin; Cm, Chloramphenicol; Em, Erythromycin; Tet, Tetracyclin; s, sensitiv; r, resistent, Ade, Met, Trp, Adenin- Methionin-Tryptothan auxotroph.

Nisin-Lösungen

Nisin wurde in Form des gewerblichen Produkts Nisaplin verwendet, das von Aplin und Barrett Ltd., Trowbridge, Wilts., England hergestellt wird. Entsprechend den Herstellern sind die Hauptbestandteile von Nisaplin Milchproteine (17,12 %), Kohlenhydrate (5,9 %) und NaCl (74,7 %) plus Nisin mit 1026 Einheiten pro mg (Aplin und Barrett, Beipackzettel). Da die spezifische Aktivität von Nisin sehr nahe an 1000 Einheiten/mg liegt, sind die IE-Werte der in der Beschreibung genannten Nisin-Aktivität den ug Nisaplin in etwa entsprechend. Dementsprechend sind Bezugnahmen auf Konzentrationen von Nisin synonym mit Nisaplinkonzentrationen. Stammlösungen von Nisin werden hergestellt, indem 10 mg/ml Nisaplin in 0,02 N HCl aufgelöst wurden. Es wurde keine weitere Sterilisierung vorgenommen.

Häufigkeit spontaner Nisin-Resistenz-Mutanten

Die Häufigkeit spontaner Nisin-Resistenz-Mutanten wurde für die Plasmid-freien Lacotococcus-Stämme MG1614 und LM0230 bestimmt. Zellen jedes in GM17-Nährmedium gezüchteten Stamms wurden mittels Zentrifugation geerntet, in einem Volumen sterilen destillierten Wassers resuspendiert, das 1/10 des Startvolumens entsprach, und in entsprechenden Verdünnungen auf GM17-Agar ausplattiert, der 0, 100 und 1000 IE Nisin/ml enthielt. Die Kolonien wurden nach 24- und 48-stündiger Inkubation gezählt.

Häufigkeit Nisin-resistenter Organismen, die in gewerblichen Milch-Starterkulturen auftreten

Um die in der Milch-Branche übliche Praxis in Bezug auf die Reaktivierung jedes gefriergetrockneten Starterprodukts nachzuahmen, wurden 0,158 g und 1,01 g von BOLLI bzw. D1 keimfrei gewogen, in 1 l frisch autoklavierte rekonstituierte Magermilch inokuliert und 3 Stunden bei 30º inkubiert. Anschließend wurden Verdünnungen auf GM17-Platten ausplattiert, die entweder kein Nisin oder 100 und 1000 IE/ml Nisin enthielten. Die Platten wurden vor Auszählen der Kolonien 24 Stunden inkubiert.

Plasmid-DNA-Isolierung und molekulares Clonieren

Sowohl für die präparative als auch für die Isolierung von Plasmid-DNA im kleinen Maßstab wurde das Verfahren von Anderson und McKay, Appl. Environ. Microbiol. 46 (1983), 5549-552, verwendet. Für präparative Zwecke wurde das Lysat weiter mittels Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation aufgereinigt. Sämtliche Restriktionskartierungen wurden mittels Gradienten-gereinigter DNA durchgeführt. DNA-Konzentrationen wurden nach der von Maniatis et al., vorstehend, vorgeschlagenen Agarose-Platten-Methode bestimmt.
Sämtliche Clonierungen wurden durchgeführt, indem aus dem Stamm MG1614 oder LM0230 isolierte DNA verwendet wurde. Die Ligierungsgemische wurden in jedem Fall in MG1614 transformiert. Anschließend wurden Präparationen im kleinen Maßstab von Transformaten-DNA entweder in MG1614 oder LM0230 zurücktransformiert. Restriktionsendonucleasen, Kälberdarmphosphatase und T4-DNA-Ligase (alle von Boehringer Mannheim GmbH) und "Gene Clean" (Bio 101, Inc.) wurden nach den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Transformation

Bei der Konstruktion von pVS34, pVS39 und pVS40 wurden L. lactis subsp. lactis MG1614-Protoplasten nach dem in Appl. Environ. Microbiol. 50 (1985), 1100-1102, beschriebenen Verfahren transformiert. Das Verfahren von Mandel und Higa (J. Mol. Biol. 53 (1970), 159-162) wurde verwendet, um E. coli AB259 zu transformieren. Chloramphenicol (5 ug/ml) wurde als Selektionsagens bei MG1614 und entweder alleine oder zusammen mit Ainpicillin (bei Konzentrationen von 5 bzw. 50 ug/ml) bei E. coli verwendet. Der Nisin-resistente Phänotyp von Chloramphenicol-resistenten MG1614-Transformanten wurde auf 500 IE/ml einer Nisinpräparation enthaltendem Agar getestet.
Zur Isolierung der Nisin-Resistenz-Determinante wurde eine Protoplastentransformation im wesentlichen nach Wright et al., Appl. Environ. Microbiol. 50, 1100-1102, mit folgenden Modifikationen durchgeführt: die zu transformierenden Stämme wurden 20-fach aus einer frischen Übernacht-Kultur in GM17-Nährmedium verdünnt und bei 30ºC 3 Stunden inkubiert. Diese Kultur wurde dann 1000-fach in eiskaltes GM17-Nährmedium verdünnt, über Nacht auf Eis gehalten und anschließend etwa 5 Stunden bei 30ºC wachsen gelassen, bevor bei einer A&sub6;&sub0;&sub0; von 0,4 geerntet wurde. Als osmotischer Stabilisator wurde 0,5 M Saccharose verwendet (Haushalts-granulierter Zucker (Perlen), The Danish Sugar Corp., Kopenhagen, Dänemark), und sämtliches verwendetes Wasser war frisch Glas-destilliert. Die Protoplastierung wurde in GM17S-SAM fortgeführt (M17-Nährmedium und 0,5 M Saccharose, autoklaviert; 0,5 % Glucose, 1 mM Mg-Acetat, 4 mM NH4-Acetat, pH 7,0, filtersterilisiert). Ein 10 ml Kulturvolumen des Stammes MG1614 wurde mit 4 mg/ml Lysozym (Sigma, St. Louis, Mo, Grad 1) 15 Minuten bei 37ºC behandelt, während 10 ml von LM0230 in 1 mg pro ml Lysozym 15 Minuten bei 37ºC protoplastiert wurden. Anschließend wurden alle Handhabungen bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Protoplasten wurden einmal im Transformationspuffer SMMC (0,5 M Saccharose, 20 mM Na&sub2;- Maleat, 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM CaCl&sub2;, pH 6,5, filtersterilisiert) gewaschen und anschließend in 500 ul SMMC resuspendiert.
Jedes Transformationsgemisch enthielt DNA in einem Volumen von 10 ul TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA), 10 ul 2 x SMMC, 50 ul Protoplasten und 210 ul 30 % PEG 3350 (Polyethylenglykol MW 3350, Sigma, in 1 x SMMC aufgelöst und filtersterilisiert). Die PEG-Behandlung wurde für 20 Minuten durchgeführt und die phänotypische Expression fand 2 Stunden in GM17S statt. Das gesamte Gemisch wurde auf selektive Platten verteilt und mit 5 ml M17S-Weichagar (0,7 % Agar) überschichtet. Nach 24stündiger Inkubation bei 30ºC wurden die Platten ausgewertet.
Zur Auswertung der Selektions-Wirksamkeit der untersuchten Nisr-Determinante im Verhältnis zur Cmr (Chloramphenicol-Resistenz) in pSW211 und pVS39 wurde Elektroporation verwendet, die entsprechend dem von Holo und Nes, Appl. Environ. Microbiol. 55 (1989), 3119-3123 beschriebenen Verfahren ausgeführt wurde.
Die Selektion für Cmr, Ems (Erythromycin-Resistenz) und Nisr -Transformanten wurde auf GM17S-Platten mit Konzentrationen von 5, 2,5 bzw. 100 ug/ml ausgeführt.
Kompentente Zellen von B. subtilis wurden nach dem Verfahren von Boylan et al., J. Bacteriol. 110 (1972), 281- 290 transformiert. Chloramphenicol (5 ug/ml) wurde für die Selektion verwendet. Um die Auswirkungen multimerer Plasmid- Formen auf die Transformationshäufigkeiten zu überprüfen, wurden die Plasmide mit geeigneten Restriktionsenzymen (HindIII mit pVS2 und EcoRI mit pVS34) linearisiert und vor der Transformation religiert, wobei unbehandelte Plasmide als Kontrollen verwendet wurden.
L. plantarum und S. aureus wurde mittels Elektroporation transformiert. Ein frisches Inokulum wurde unter Verwendung von über Nacht gewachsenen Zellen in entsprechendem Nährmedium hergestellt, wobei man eine Absorption von 0,15 bis 0,18 bei 600 nm erhielt. Die Kulturen wurden bis zu einer Absorption von 0,5-0,7 wachsen gelassen und die Zellen mittels Zentrifugation bei 4ºC geerntet, gefolgt von zweimaligem Waschen und abschließendem Suspendieren in Elektroporationspuffer (272 mM Saccharose, 15 % Glycerin), der 1/20 des Kulturvolumens entsprach. Das Elektroporationsgemisch (200 ul der Zellsuspension werden 2 Minuten in einer Elektroporations-Küvette mit einer 2 mm Elektroden-Lücke auf Eis gehalten, wobei bis zu 20 ul gereinigte Plasmid-DNA in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5 zugegeben wurde) wird einem einzigen elektrischen Puls in einem "Genepulser "- Apparat (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, U.S.A.) ausgesetzt. Die Kapazität betrug 25 uF und die Spannung entweder 2 kV (L. plantarum) oder 2,5 kV (S. aureus). Die Küvette wurde parallel mit einem 1000 Ohm (L. plantarum)- oder 600 Ohm (S. aureus)-Widerstand (Bio-Rad "Pulse Controller") verbunden. Die Zellen wurden 2 Minuten auf Eis gehalten, in 10 ml vorgewärmtem Kultur-Nährmedium suspendiert, 1 bis 2 Stunden inkubiert und mittels Zentrifugation von 9 ml bei Raumtemperatur geerntet, wobei das Pellet in den restlichen 1 ml resuspendiert wurde. Die Suspension wurde auf entweder 10 ug (für L. plantarum) oder 5 ug (für S. aureus) Chloramphenicol pro ml enthaltenen Selektions-Platten ausplattiert. Die L. plantarum-Platten wurden anaerob 48 Stunden bei 30ºC, S. aureus unter aeroben Bedingungen 24 bis 48 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Plasmid-Eliminierung. Novobiocin-Gradienten-Platten wurden wie zuvor beschrieben für die Plasmid-Eliminierung verwendet (Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 1385-1386).
Southern-HVbridisierung Für die Herstellung von pVS34 wurde DNA auf Nitrocellulose-Filter übertragen (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland), wobei Standardtechniken verwendet wurden; Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4045-4049. Die Biotin-markierte Sonde wurde unter Verwendung eines "BRL Nick Translation Reagent kit" (Bethesda Research Laboratories Inc., Gaithersburg, MD, USA) und biotinyliertem dUTP hergestellt (Boehringer GmbH, Mannheim, Deutschland). Das Färben wurde entsprechend den Instruktionen des Herstellers mittels eines "Vectastain ABC Alkaline Phosphatase kit" (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA) durchgeführt.
Um die Abstammung der Nisin-Resistenz-Determinante aufzuzeigen, wurde DNA aus einem 0,8 % Agarosegel (HGT-Agarose, SeaKem, Rockland, ME), das in TAE-Puffer laufen gelassen wurde (Maniatis et al., vorstehend), auf eine "Gene Screen"-Nylonmembran (NEN Research Products, Boston, MA) übertragen, wobei das Verfahren von Southern angewendet wurde, wie bei Maniatis et al. vorstehend beschrieben.
Die Matrizen-DNA für die Sonde wurde durch stufenweise Spaltung von etwa 0,6 4g pSW221-DNA mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BclI hergestellt, wobei sich eine Elektrophorese in 0,8 % Agarose in TAE-Puffer anschloß. Nach Ausschneiden aus dem Gel wurde die größte Bande unter Verwendung von "Gene Clean" gereinigt. Der "DNA Labeling and Detection kit" (nicht radioaktiv) von Boehringer Mannheim wurde nach den Anweisungen des Herstellers für diese Zwecke verwendet.

Segregations-Stabilität von Plasmiden

Eine einzelne Kolonie von LM0230, die das betreffende Plasmid enthält, wurde aus einer selektiven Platte in GM17-Nährmedium inokuliert, über Nacht wachsen gelassen und dann zweimal aus einer 250-fachen Verdünnung zur stationären Phase wachsen gelassen. Dies entspricht einem Wachstum von etwa 20 Generationen. Die Kultur wurde dann zu Einzelkolonien auf GM17-Platten ausplattiert, wobei 92 Clone auf das Auftreten der Nisin-Resistenz (pSW211 und pSW221) oder auf das Auftreten von Cmr für pVS2 oder Emr für pGKV10 abgesucht wurden.

Experimenteller Abschnitt

Beispiel 1A

Herstellung von Plasmid pVS34

Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetvlactis SSD207, der aus einer Milch-Starterkultur isoliert worden war, umfaßt wenigstens 12 Plasmide in einem Größenbereich von 2 bis mehr als 30 kbp. In Hybridisierungs Experimenten hybridisierte keiner der SSD207-Plasmide mit pVS2, einem typischen Vektor mit einem breiten Wirtsbereich, der auf dem 2,1 kbp Lactococcus-Plasmid pSH71 basiert. Dieser Stamm wurde daher auf Plasmid-Replikationsfunktionen mit einer begrenzten Fähigkeit zur Expression außerhalb der Milchsäurebakterien unter Verwendung des folgenden Verfahrens untersucht:
Das 4,0 kbp ClaI-Fragment des Plasmids pVS5 (Soile Tynkkynen, M.Sc. thesis, Universisty of Helsinki, Helsinki, Finnland), das das Chloramphenicol-Resistenzgen eines Streptococcus-Plasmids pGB301 (Mol. Gen. Genet. 184 (1981), 115- 120) enthält, wurde mit der Gesamt-Plasmid-DNA von mit Clal gespaltetenem SSD207 gemischt und ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von MG1614-Protoplasten verwendet, wobei zur Selektion die Chloramphenicol-Resistenz verwendet wurde.
30 Transformanten wurden aus dem Ligierungsgemisch erhalten, die etwa 1 ug DNA enthielten. Die Mehrheit dieser Transformanten enthielt Plasmide mit einer Größe von etwa 8 kbp, wobei der Rest offensichtlich zufällig inserierte zusätzliche ClaI-hergestellte Fragmente enthielt. Ein Clon wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt und als pVS34 bezeichnet. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist in Figur 1A dargestellt. In DNA-DNA-Hybridisierungsexperimenten hybridisierte das 4,1 kbp ClaI BclI-Fragment von pVS34 (das die Replikationsfunktionen enthält) mit dem etwa 28 kbp Plasmid von SSD207.
Um zu testen, ob eine der identifizierten Restriktionsstellen von pVS34 den Replikationsbereich des Plasmids unterbricht, wurden Fusionsplasmide mit pBR322 hergestellt, indem pBR322 mit entweder HindIII, ClaI oder BamHI linearisiert wurde und mit pVS34 ligiert wurde, das mit HindIII, HpaII bzw. XhoII gespalten worden war. E. coli wurde mit diesen Ligierungsgemischen unter Verwendung von Ampicillin- Selektion transformiert. Die Transformanten wurden auf Chloramphenicol (5 ug/ml)-Platten ausgetestet. Plasmid-DNA aus Chloramphenicol-resistenten Transformanten wurde zur Retransformation vom MG1614-Protoplasten verwendet. Lediglich in dem Konstrukt, in dem die HindIII-Ligierung das Hybridplasmid bildete, wurden keine Transformanten erhalten. Mit dem Rest wurden normale Transformationshäufigkeiten (etwa 10&sup4; Chloramphenicol-resistente Clone/ug DNA) erhalten. Die aus den Transformanten extrahierten Plasmide wiesen die erwarteten Größen und Restriktionsmuster auf. Zusammen mit der erfolgreichen Verwendung der EcoRI-Stelle für die Clonierung (siehe nachstehend) läßt diese Tatsache darauf schließen, daß wenigstens ein Teil des Replikationsbereich von pVS34 innerhalb des 2,5 kbp EcoRI-ClaI-Restriktionsfragments vorhanden ist.

Beispiel 1B

Wirtsbereich von Plasmid pVS34

Um festzustellen, ob der Wirtsbereich des clonierten Replikationsbereichs tatsächlich eng ist, wurden Versuche durchgeführt, eine Reihe taxonomisch nicht verwandter Bakterienarten mit pVS34 zu transformieren. Bei all diesen Arten ist bekannt, daß das Chloramphenicol-Resistenz-Markergen auf pVS34 exprimiert werden kann (von Wright, A., S. Tynkkynen und M. Suominen, Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 1584- 1588).
Transformation von E. coli AB259, B. subtilis 3G18, Lb. plantarum 755, und S. aureus RN451 wurde mittels gereinigter pVS34-DNA (aus präparativen Isolierungen aus Lactococcus) versucht. Als positive Kontrollen wurden parallele Experimente durchgeführt, in denen gleiche Mengen von pVS2 (das das gleiche Chloramphenicol-Resistenzgen wie pVS34 enthält) verwendet und die Transformationshäufigkeiten verglichen wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Es läßt sich feststellen, daß außer Lactococcus MG1614, pVS34 nur in der Lage war, Lb. plantarum und mit sehr geringer Häufigkeit S. aureus zu transformieren. Die Gegenwart von pVS34-DNA konnte anschließend in Lb. plantarum und S. aureus-Transformanten gezeigt werden. Tabelle II Transformation verschiedener Empfänger mit den Plasmiden pVS2 und pVS34 Transformationshäufigkeit/ug von Plasmid-DNA Plasmid Lactococcus lactis E. coli B. subtilis S. aureus Lb. plantarum pVS2 gespalten und religiert a) a) Spaltung und Religierung wurde durchgeführt, um Plasmid-Multimere für die B. subtilis-Transformation herzustellen (siehe Materialien und Verfahren) - Experiment nicht durchgeführt, N.N. = keine Transformanten nachgewiesen.
Die verwendete DNA-Menge lag in einem Bereich von 5 bis 100 ng pro Transformation je nach Transformationsverfahren und Empfänger (Optimierungen wurden unter Verwendung von pVS2 als Modellplasmid vorgenommen).

Beispiel 2A

Isolierung einer Nisin-Resistenz-Determinante

Der Stamm Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 wurde aufgrund seiner hohen Herstellungsrate an Nisin als Quelle für das Nisin-Resistenzgen ausgewählt. Dieser Stamm wurde aus einer Sammlung erhalten, die sich beim "Danish Government Research Institute for Dairy Industry" befindet. Aufgrund dieser hohen Herstellungsrate ist der Stamm auch gegenüber großen Mengen an Nisin resistent. So wächst er beispielsweise ungehemmt bei Konzentrationen von 1000 ug/ml, während 3000 ug/ml Nisin lediglich eine leicht negative Wirkung auf das bakterielle Wachstum aufweisen, siehe Tabelle III. Tabelle III Einzelzell-Resistenz verschiedener Lactococcus-Stämme Qeaenüber Nisin Relative Anzahl der Kolonien Nisin-Konzentration Stamm L. lactis subsp. etwa die gleiche Anzahl an Kolonien wie auf GM17-Platten ohne Nisin etwa ein Log weniger Kolonien als auf GM17-Platten ohne Nisin keine Kolonien nicht getestet
Der Stamm 10.084 trägt 5 oder 6 Plasmide. Ausgehend von der Gesamt-Plasmid-DNA des Stammes wurden zwei Transformationsrunden in MG1614 durchgeführt, wobei jedesmal eine Selektion für Nisin-Resistenz folgte. Einer der sich ergebenden Clone enthielt ein einzelnes 46 kbp-Plasmid, das als pNis/pSF01 bezeichnet wurde. Der Stamm MG1614 (pNis/pSF01) ist sowohl Nisr als auch Nip&supmin;, Lac&spplus; und Prt&spplus;, kann jedoch Saccharose nicht fermentieren (Tabelle I).
Die primäre Clonierung des Nisin-Resistenzgens aus dem Plasmid pNis/psFol wurde ausgeführt, indem etwa 0,8 ug pNis/psFol-DNA und 2 ug pVS2 DNA mit HindIII gespalten wurden. Nachdem der Vektor mit Kälberdarm-Phosphatase behandelt worden war, wurden beide DNA-Präparationen mittels "Gene Clean" von den Enzymen befreit, gemischt und über Nacht bei 14ºC ligiert. Eine Hälfte des Ligierungsgemisches wurde zur Transformation von MG1614 verwendet, woran sich eine Selektion für Nisin-Resistenz anschloß. 28 Transformanten wurden für Cmr und Emr abgesucht, wobei 26 davon den richtigen Phänotyp aufwiesen.
Acht dieser Clone wurden gereinigt, ihre Plasmid-DNA isoliert, mit "Gene Clean" gereinigt und mit HindIII gespalten. In allen acht Clonen war ein 7,5 kbp-Fragment sowie der Vektor vorhanden. Die Plasmid-DNA eines lediglich dieses Fragment und den Vektor tragenden Clons wurde in LM0230 zurücktransformiert. Aus diesem als LM0230 (pSW211) bezeichneten Clon wurden mittels CsCl-Ethidiumbromid-Dichtegradienten präparative Mengen an Plasmid-DNA isoliert. Der Phänotyp dieses Organismus (Tabelle I und III) zeigt, daß das clonierte 7,5 kbp-Fragment nur für die Nisin-Resistenz und nicht für irgendeinen anderen Phänotyp des Plasmids pNis codiert.
Die Restriktionskarte des primären clonierten Fragments wird in Figur 2A gezeigt. Um die Größe des Nisin-Resistenz-Fragments zu reduzieren, wurde das EcoRI-Fragment aus einem Agarosegel ausgeschnitten und in den Vektor pGKV10 subcloniert. Dieses Konstrukt wird als pSW221 (Fig. 2B) bezeichnet und weist einen Phänotyp auf, der identisch zu dem des gesamten HindIII-Fragments von pSW211 ist.
Wie in Fig. 3 gezeigt, bestätigte eine aus dein isolierten EcoRI-Fragment von pSW221 hergestellte Hybridisierungssonde das Vorhandensein dieses Fragments in einem Plasmid des ursprünglichen Wildtyp-Spenderorganismus, in dem isolierten Wildtyp-Plasmid pNis und in dem ursprünglich clonierten HindIII-Fragment. Dieses Fragment zeigte keine Homologie mit dem Vektor pVS2.

Beispiel 2B

Charakterisierung der Nisin-Resistenz-Determinante

Häufigkeit spontaner Nisin-resistenter Mutanten in Laborstämmen

Bevor die Eignung einer neuen Resistenz-Determinante als einstufiger primärer selektierbarer Marker in Bakterien bestimmt werden kann, muß gezeigt werden, daß die Bakterien keine inhärente, zu berücksichtigende Resistenz gegenüber der betreffenden Verbindung aufweisen und daß die Bakterien nicht spontan Resistenz in signif ikanter Häufigkeit erwerben. Das Fehlen von Hintergrund-Resistenz oder spontan entstehender Resistenz gegenüber Nisin in zwei weithin verwendeten Laboratoriumsstämmen wurde für die in Beispiel 2A beschriebene Nisin-Resistenz-Determinante wie nachstehend bestimmt.
Die Häufigkeit spontaner Nisin-resistenter Mutanten wurde für die plasmidfreien Lactococcus-Stämme MG1614 und LM0230 bestimmt. Zellen jedes in GM17-Nährmedium gewachsenen Stammes wurden mittels Zentrifugation geerntet, in 1/10 des ursprünglichen Volumens sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und in entsprechenden Verdünnungen auf GM17-Agar plattiert, der 0, 100 und 1000 IE/ml Nisin enthielt. Die Platten wurden bei 30ºC inkubiert und die Kolonien nach 24 und 48 Stunden gezählt. Die Häufigkeiten, mit der Nisr-Kolonien auftraten, lag sogar bei 100 IE/ml Nisin bei den Häufigkeiten, die normalerweise für spontane Mutationen erwartet wurden und sind innerhalb der Häufigkeiten, die für genetische Experimente mit dem betreffenden Gen tolerierbar sind (Tabelle IV). Tabelle IV Häufigkeit spontaner Nisin-resistenter Mutanten. die in plasmidfreien Stämmen von L. lactis subsp. lactis nach 24 und 48 Stunden auftraten aHäufigkeit von Nisr-Kolonien auf GM17 + Nisin-Platten Stamm Inkubationszeit in Stunden a Die Werte stellen den Durchschnitt der Häufigkeiten dar, die in zwei unabhängigen Experimenten ermittelt wurden. Auf Platten mit 1000 ug Nisin/ml wurden keine Kolonien beobachtet.

Auftreten Nisin-resistenter Organismen in zwei gewerblichen Milch-Starterkulturen

Um die Verwendbarkeit der Nisr-Determinante bei der genetischen Rekombination von Organismen in der in der Milchbranche üblichen Praxis zu bewerten, wurde das Auftreten von natürlichen Nisin-resistenten Organismen in zwei gegenwärtig weithin verwendeten gewerblichen Milch-Starterkulturen bestimmt. Die beiden Starterkulturen BOLL1 und D1, die beide eine Vielzahl von Stämmen umfassen, wurden auf GM17- Platten ausplattiert, die 100 und 1000 ug/ml Nisin enthielten. Die Anteile an Gesamt-cfu in der Käse-Starterkultur BOLL1, die Nisr auf 100 und 1000 ug Nisin pro ml waren, betrugen 5,3 x 10&supmin;&sup4; bzw. 5,3 x 10&supmin;&sup5;. In der Butter-Starterkultur DI waren 3,9 x 10&supmin;¹ und 1,3 x 10&supmin;¹ der Gesamt-cfu resistent gegenüber Nisin bei 100 bzw. 1000 ug/ml.

Physiologische Bestätigung des Clonierens der Nisin- Resistenz-Determinante

Die in Tabelle II dargestellten Daten zeigen das Ausmaß der Sensitivität gegenüber Nisin von in der vorliegenden Beschreibung verwendeten Stämmen ebenso wie das Ausmaß an Resistenz, das durch den erfindungsgemäßen selektierbaren Marker verliehen wird. Diese Einzelzell-Resistenzen gegenüber Nisin bestätigen, daß das clonierte HindIII-Fragment von pSW211 ebenso wie sein EcoRI-Subclon (pSW221) dasselbe hohe Maß an Resistenz codieren wie das Genom des ursprünglichen Wildtyp-Spenderstamms.
Es wurden Experimente ausgeführt, um die Wirkung der Zugabe von Nisin zu exponentiell wachsenden sensitiven Zellen und exponentiell wachsenden, eine Nisin-Resistenz-Determinante tragenden Zellen zu untersuchen. Wie in Figur 4 dargestellt, verursachen 10 ug pro ml Nisin in GM17-Nährmedium einen 4 log-Rückgang in der Anzahl lebensfähiger Zellen einer den Vektor pVS2 allein (LM0230(pVS2)) tragenden Population. Eine zweite Zugabe von Nisin 1 1/2 Stunden nach der ersten verursachte einen weiteren Rückgang von wenigstens 2 log in der Zahl lebender Zellen. Sechs Stunden nach dein Beginn des Experiments wurden weniger als 100 lebensfähige Zellen pro ml Kultur nachgewiesen.
In der das HindIII-Fragment (LM0230(psw211)) tragenden Kultur tötete die anfängliche Zugabe von 10 ug/ml Nisin etwa 80 % der Population und die zweite Zugabe des Bacteriocins führte ebenfalls zu einem kleinen Rückgang in der Größe der Population.
Um das genetische Komplement der mit LM0230(psW211) inokulierten und 15 Minuten nach der ersten Nisin-Zugabe noch überlebenden Population zu untersuchen, wurden die Phänotypen von 92 Kolonien der GM17-Platten untersucht, die den unteren Teil des ersten Abfalls in der Kurve bei 1 1/4 Stunden repräsentieren (dargestellt durch ein * in der Kurve in Figur 4). Drei der 92 Clone waren Niss CmsEms. Plasmid-Präparationen im kleinen Maßstab zeigten, daß alle drei dieser Clone die gesamte Plasmid-DNA verloren hatten. Dieses Ergebnis zeigt, daß das rekombinante Plasinid im Hinblick auf Segregation etwas unstabil ist, jedoch nicht weniger stabil, als man der angestiegenen Größe der hergestellten Plasmide im Verhältnis zu den Vektoren alleine zugeschrieben hätte.

Die Verwendung einer Nisin-Resistenz-Determinante als ein selektierbarer Marker

In den nachstehenden Transformationsexperimenten wurde die Fähigkeit zur Selektion von Transformanten verglichen, wobei einerseits eine erfindungsgemäße Nisin-Resistenz-Determinante und andererseite ein herkömmlicher antibiotischer Resistenz-Marker auf genau dem gleichen DNA- Molekül verglichen wurde. Die relative Wirksamkeit der Selektion oder Selektierbarkeit der Nisin-Resistenz-Determinante in Transformationsexperimenten wurde bestimmt als Transformanten-Häufigkeit nach Selektion für Nisin-Resistenz relativ zu der Transformanten-Häufigkeit nach Selektion für Cmr oder Emr. Für das rekombinante Plasmid pSW211 wurde die Nisin-Selektion relativ zu Cm- bestimmt und für pSW221 wurde die Selektion relativ zu Ems bestimmt. Das Cmr-Gen das Vektors pVS2 stammt aus dem Plasmid pGB301 (Appl. Environ. Microbiol. 53 (1987), 1584-1588) und das Emr-Gen von pGKV10 stammt aus pE194 (Appl. Environ. Microbiol. 50 (1985), 540- 542).
Die Stämme LM0230 und MG1614 waren unter den gewählten Bedingungen gleichermaßen kompetent als Empfänger für das Plasinid pVS2 (Tabelle V). Außerdem wurden beide Stämme bei Selektion für ihre Cm- und Em-Resistenzen mit gleichen, aber signifikant geringeren Häufigkeiten durch die beiden Nisin-resistenten, rekombinanten, in dieser Studie untersuchten Plasmide transforiniert. Die Verringerungen der Transformantenhäufigkeiten im Verhältnis zu pVS2 scheint der angestiegenen Größe der Plasmide zu entsprechen.
Bei Selektion für die untersuchte Nisr-Determinante selbst wurden die Transformanten von LM0230 mit der gleichen Wirksamkeit selektiert, mit der die anderen Marker des rekombinanten Plasmids selektiert wurden. Bei Selektion der Nisin-Resistenz in MG1614 wurden Transformanten jedoch nur mit einem Zehntel der Wirksamkeit im Verhältnis zu der anderen Resistenz auf den Plasmiden selektiert. Tabelle V Relative Selektions-Wirksamkeit der Nisin-Resistenz-Determinante bei Transformationsexperimenten in Lactococcus Empfänger-Plasmida Cmr oder Ems Transformantenhäufigkeitb (Transformanten pro ug DNA) Relative Häufigkeit der Selektion für Nisr c Protoplasten-Transformation Elektroporation a Sämtliche Plasmid-DNA wurde aus LM0230 isoliert und mittels eines CsCl-Dichtegradienten gereinigt. b Cmr- und Emr- Transformantenhäufigkeiten stellen den Durchschnitt von wenigstens zwei Experimenten dar und sind auf der Grundlage der auf Cm-Platten (pVS2 und pSW211) oder Em-Platten (pSW221) auftretenden Transformanten bestimmt. c Die relative Selektions-Wirksamkeit der Nisr-Determinante ist definiert als die Transformantenhäufigkeit nach Selektion für Nisr geteilt durch die Transformantenhäufigkeit nach Selektion entweder für Cmr oder Ems. d n.a.: nicht anwendbar.
Die untersuchte Nisin-Resistenz-Determinante ist aufgrund wenigstens zweier Eigenschaften ausgesprochen geeignet als ein selektierbarer Marker. Erstens codiert die Nisr-Determinante ein hohes Ausmaß an Resistenz in den untersuchten Lactococcen. Dies führt zu Resistenz-aufweisenden Stämmen von Milchsäurebakterien, die mehr als 100-mal so viel Nisin tolerieren wie sensitive Stämme. Klaenhammer und Sanozky, 3. Gen. Microbiol. 131 (1985), 1531-1541, konnten für die von ihnen untersuchte Nisr-Determinante keine Selektion durchführen, weil eine hohe Anzahl spontaner Nisr-Mutanten auftrat. Diese Forscher verwendeten in den Konjugationsexperimenten ebenfalls den Stamm LM0230 als Empfänger, aber das Selektionsmedium enthielt nur 100 ng Nisin/ml, was offensichtlich auf dem signifikant geringerem Ausmaß an Resistenz beruhte, das durch deren Nisin-Resistenz-Determinante verliehen wurde. Dieses Problem entsteht nicht, wenn die erfindungsgemäße Nisin-Resistenz-Determinante verwendet wird, da das hohe Ausmaß an Resistenz direkte primäre Selektion der Transformanten bei Konzentrationen des Bacteriocins ermöglicht, bei denen resistente Kolonien nur in Häufigkeiten entstehen, die typisch für wirkliche spontane Mutanten sind.
Eine zweite Eigenschaft, die zu der Eignung der gegenwärtig untersuchten Nisr-Determinante als selektierbarer Marker beiträgt, ist die offensichtliche konstitutive Expression der Resistenz. Die Expression des Gens (der Gene) in dem Stamm LM0230 scheint nicht mehr Induktion zu benötigen, als die beiden pharmazeutischen antibiotischen Resistenzgene, die in dem vorliegenden Beispiel als Basis für den Vergleich der Selektierbarkeit verwendet wurden. Andererseits ist der Stamm MG1614 durch die Nisr-Determinante lediglich zu einem Zehntel transformierbar verglichen mit den antibiotischen Resistenzgenen.

Wirkung des Nisin-Resistenz-codierenden Fragments auf die Segregations-Stabilität

Um das Ausmaß an Instabilität der zwei untersuchten rekombinanten Nisin-Resistenz-Plasmide und der in deren Herstellung verwendeten Vektoren pSW211 und pSW221 zu untersuchen, wurde der jedes Plasmid tragende Stamm LM0230 etwa 20 Generationen in Abwesenheit selektiven Drucks auf die Plasmide wachsen gelassen. Es konnten keine Clone nachgewiesen werden, denen pVS2 oder pGKV10 fehlte, während 2,2 % der phänotypisch für pSW211 untersuchten Kolonien das Plasmid verloren hatten und 4,4 % der für pSW221 untersuchten Kolonien den durch dieses Plasmid verliehenen Phänotyp verloren hatten.
Tatsächlich zeigten Plasmidpräparationen der beiden Clone, die pSW211 verloren hatten, keine Plasmid-DNA und drei der vier Clone, die den psW221-Phänotyp verloren hatten, wiesen auch keine Plasmid-DNA auf. Offensichtlich haben das clonierte HindIII-Fragment und sein EcoRI-Subclon lediglich eine sehr kleine negative Wirkung auf die Segregations Stabilität der Vektoren, in die sie cloniert wurden. Dies ist ein bedeutendes Ergebnis für den Fall, daß die Resistenz-Determinante in der Milchindustrie in Vektoren von Lebensmittelstandard verwendet werden. Dort werden in den verschiedenen Produktionen sehr große Konzentrationen an Zellen verarbeitet und in Abwesenheit von jeglicher Art Selektionsdruck wachsen gelassen, abgesehen von dem, der durch Milch als ein Wachstumsmedium bereitgestellt wird.

Beispiel 3

Herstellung von Plasmid rVS39

Das 3,7 kbp EcoRI-Fragment, das die Nisin-Resistenz auf Plasmid pSW211 codiert, wurde in die einzige EcoRI- Stelle von pVS34 ligiert. MG1614-Protoplasten wurden mit diesem Ligierungsgemisch transformiert und auf Chloramphenicol-Resistenz selektiert. Die Transformanten wurden auf Nisin-Resistenz getestet und auf ihren Plasmidinhalt untersucht. Die Restriktionskarte eines der Nisin-Chloramphenicol doppelt resistenten Plasmide, das als pVS39 bezeichnet wurde, wird in Figur 1B gezeigt.

Beispiel 4

Herstellung von Plasmid pVS40

Um ein nur Milchsäurebakterium-DNA enthaltendes Nisin-Resistenz-Plasmid herzustellen, wurde das Streptococcus- Chloramphenicol-Resistenzgen aus pVS39 herausgeschnitten. Dies wurde erreicht, indem pVS39 mit ClaI gespalten, das die Nisin-Resistenz und die Replikationsbereiche von pVS39 umfassende 7,8 kbp ClaI-Fragment aus einem Agarosegel isoliert und das Fragment mit sich selbst ligiert wurde. Diese DNA wurde zusammen mit gleichermaßen topologisch entspannter Plasmid-DNA (codiert die Chloramphenicol-Resistenz) verwendet, um MG1614-Protoplasten zu transformieren. Das in der Cotransformation verwendete Plasmid pVS1 wurde zunächst mit ClaI linearisiert und mit sich selbst ligiert. Das Verhältnis des 7,8 kbp ClaI-Fragments von pVS39 zu pVS1-DNA in dem Cotransformationsgemisch betrug etwa 3:1. Chloramphenicolresistente Transformanten wurden selektiert und weiter auf ihre Resistenz gegenüber Nisin getestet. Unter den 20 getesteten Transformanten befanden sich drei doppelt resistente Clone, die alle zwei Plasmide enthielten, die in ihrer Größe dem intakten pVS1 und der kovalent geschlossenen superhelicalen 7,8 kbp DNA entsprachen. Einer dieser Clone wurde ausgewählt, um mit Novobiocin pVS1 zu entfernen. Nisin (500 IE/ml) wurde in beiden Agarschichten von Novobiocin-Gradientenplatten verwendet. Von 100 aus den Novobiocinplatten aufgenommenen gereinigten Einzelkolonien erwies sich eine als Nisin-resistent und Chloramphenicol-sensitiv. Es wurde ermittelt, daß diese ein einziges Plasmid enthielt, das das mit sich selbst ligierte 7,8 kbp ClaI-Fragment von pVS40 darstellte (Figur 1C).
Nach Testen der Segregations-Stabilität von pVS40 im Stamm LM0230 wurde ermittelt, daß 16 % der untersuchten Clone Nisin-sensitiv geworden sind. Zusammen mit den in Beispiel 2B für die Plasmide pSW211 und pSW221 gezeigten Ergebnissen kann dieses Ergebnis anzeigen, daß die Replikationsfunktion von pVS40 nicht vollständig stabil ist und daß dieses Plasmid aus einer bakteriellen Population verschwinden kann, wenn kein selektiver Druck für seine Anwesenheit vorhanden ist. Das Lac-positive Konstrukt von pVS40, das in Beispiel 5 beschrieben ist, zeigt jedoch vollständige Segregations-Stabilität, wenn die Zellen in einem Medium mit Lactose als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen werden.

Beispiel 5

Clonierung von Lactose-Fermentationsgen(en) in pVS40

Eine der beiden XhoII-Stellen in pVS40 ist erfolgreich verwendet worden, um die Lactose-Fermentationsgene auf dem BclI B-Fragment eines Derivats des Lactococcus-Plasmids pLP712 (Gasson, Hill und Anderson; Molecular genetics of metabolic traits in 1actic streptococci, in: Ferretti und Curtiss (Herausgeber), Streptococcal genetics, American Society for Microbiology, Washington D.C. (1987)) zu clonieren. Die Isolierung von Lac&spplus;-Transformanten wurde durchgeführt, indem eine einstufige primäre Selektion für Nisin-Resistenz wie vorstehend beschrieben ausgeführt wurde, gefolgt von Absuchen auf Lactose-Fermentations-Indikatorplatten. Der Lac&spplus; Nisr-Phänotyp war in weiteren Transformationen mit aus den ursprünglichen Clonen isolierter DNA stabil. Im Hinblick auf Segregation ist das pVS40 und das inserierte Lac&spplus;-Fragment umfassende rekombinante Plasmid tatsächlich stabiler als pVS40 selbst, da es lediglich 9 % Niss-Clone im Vergleich zu 16 % bei pVS40 (Beispiel 4) zeigt.

Claims

1. Rekombinantes Plasmid, verwendbar als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis replizieren kann und umfaßt:

(a) ein aus einem Plasmid isoliertes DNA-Fragment, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, wobei das DNA-Fragment einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis funktionellen Replikationsbereich umfaßt und

(b) ein DNA-Fragment, das ein in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbares Markergen umfaßt, dessen Expression eine primäre einstufige Selektion von Milchsäurebakterien erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden rekombinanten Plasmid transformiert sind, wobei das DNA-Fragment aus einem Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde,

(c) mindestens eine Restriktionsstelle, die die Insertion von für gewünschte Genprodukte codierender DNA erlaubt, und wobei die Insertion sich nicht auf die Funktionen von (a) und (b) auswirkt,

wobei dieses Plasmid nur DNA enthält, die von Milchsäurebakterien, einschließlich daraus isolierten Wild- typ-Plasmiden, stammt.

2. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1, wobei die DNA- Fragmente (a) und (b) aus unterschiedlichen Plasmiden isoliert sind.

3. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das se1ektierbare Markergen den transformierten Zellen Resistenz gegen ein von einem Milchsäurebakterium erzeugtes Bacteriocin verleiht.

4. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 3, wobei das Bacteriocin, gegen das das selektierbare Markergen Resistenz verleiht, Nisin ist.

5. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 4, wobei das selektierbare Nisin-Resistenz-Markergen Resistenz gegen mindestens 200 IE/ml Nisin, bevorzugt mindestens 500 IE/ml, stärker bevorzugt mindestens 1000 IE/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 2000 IE/ml und besonders bevorzugt mindestens 3000 IE/ml verleiht, wobei die Resistenz als minimale Hemmkonzentration in einem flüssigen Medium bestimmt wird, die optimales Wachstum von Milchsäurebakterien erlaubt.

6. Rekombinantes Plasmid nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die DNA-Fragmente (a) und (b) von aus Lactococcus spp isolierten Wildtyp-Plasmiden stammen.

7. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, wobei das DNA- Fragment (a) aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis isoliert ist.

8. Rekombinantes Plasinid nach Anspruch 7, wobei das Wild- typ-Plasmid, aus dem das DNA-Fragment (a) isoliert ist, aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetvlactis SSD207 (DSM 5677) isoliert ist.

9. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 6, wobei das DNA- Fragment (b) aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis isoliert ist.

10. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 9, wobei das Wild- typ-Plasmid, aus dem das DNA-Fragment (b) isoliert ist, aus Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 (DSM 5678) isoliert ist.

11. Rekombinantes Plasmid nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die gesamte DNA von Lactococcus spp stammt.

12. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 11, das pVS40 (DSM 5679) ist.

13. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 12, das im ersten Schritt die Herstellung eines ersten intermediären Plasmids umfaßt, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis replizieren kann, wobei die Herstellung des intermediären Plasmids die folgenden Teilschritte umfaßt:

(i) Isolieren von Plasmid-DNA aus einem Milchsäurebakterium,

(ii) Hybridisieren von isolierter Plasmid-DNA aus Teilschritt (i) mit einem einen Replikationsbereich umfassenden DNA-Fragment, das aus einem Wildtyp- Plasmid isoliert wurde, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert wurde, und dieses Wildtyp-Plas mid in Milchsäurebakterien, E. coli und B. subtilis replizieren kann,

(iii) Isolieren von Plasmid-DNA aus Teilschritt (i), die nicht mit der Wildtyp-Plasmid-DNA aus Teilschritt (ii) hybridisiert,

(iv) Isolieren eines DNA-Fragments (a) aus der in Teilschritt (iii) erhaltenen Plasmid-DNA, das einen in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli und B. subtilis funktionellen Replikationsbereich umfaßt,

(v) Verbinden des isolierten DNA-Fragments aus Teilschritt (iv) unter Ligierungsbedingungen mit einem DNA-Fragment, das ein erstes selektierbares Markergen umfaßt, das die Selektion von mindestens E. coli, B. subtilis und Milchsäurebakterien erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden Plasmid transformiert sind, zum Erhalt des ersten intermediären Plasmids, mit dem getestet werden kann, ob der Replikationsbereich von DNA-Fragment (a) in E. coli und B. subtilis nicht funktionell ist,

einen zweiten Schritt, der das Verbinden des ersten intermediären Plasinids mit einem ein zweites Markergen umfassenden DNA-Fragment (b) unter Ligierungsbedingungen umfaßt, das in Milchsäurebakterien, jedoch nicht in E. coli selektierbar ist, wobei die Expression des Markers die primäre einstufige Selektion von Milchsäurebakterienzellen erlaubt, die mit einem dieses DNA-Fragment umfassenden rekombinanten Plasmid transformiert sind, und das DNA-Fragment aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus einem Milchsäurebakterium isoliert ist, zum Erhalt eines zweiten intermediären Plasmids, und

einen dritten Schritt, der die Entfernung des den ersten selektierbaren Marker umfassenden DNA-Fragments aus dem zweiten intermediären Plasmid unter für ein Restriktionsenzym geeigneten Bedingungen umfaßt, und im Anschluß daran erneute Ligierung, zum Erhalt des rekombinanten Plasmids, das als Clonierungsvektor in Milchsäurebakterien verwendbar ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das selektierbare Markergen den transformierten Zellen Resistenz gegen ein von einem Milchsäurebakterium hergestelltes Bacteriocin verleiht.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Bacteriocin, gegen das das selektierbare Markergen Resistenz verleiht, Nisin ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das selektierbare Nisin-Resistenz-Markergen Resistenz gegen mindestens 200 IE/ml Nisin, bevorzugt mindestens 500 IE/ml, stärker bevorzugt mindestens 1000 IE/ml, noch stärker bevorzugt mindestens 2000 IE/ml und besonders bevorzugt mindestens 3000 IE/ml verleiht.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die DNA-Fragmente (a) und (b) von aus Lactococcus spp isolierten Wildtyp-Plasmiden stammen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das DNA-Fragment (a) aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis isoliert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Wildtyp-Plasmid, aus dem DNA-Fragment (a) isoliert ist, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis SSD207 (DSM 5677) isoliert ist.

20. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das DNA-Fragment (b) aus einem Wildtyp-Plasmid isoliert ist, das aus Lactococcus lactis subsp. lactis isoliert ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Wildtyp-Plasmid, aus dem DNA-Fragment (b) isoliert ist, aus Lactococcus lactis subsp. lactis 10.084 (DSM 5678) isoliert ist.

22. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche 13 bis 21, wobei die gesamte DNA des erhaltenen rekombinanten Plasinids aus Lactococcus spp stammt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das erhaltene rekombinante Plasmid pVS40 (DSM 5679) ist.

24. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das erste intermediäre Plasmid pVS34 ist.

25. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das zweite intermediäre Plasmid pVS39 ist.

26. Rekombinantes Plasinid nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei ein DNA-Fragment inseriert wurde, das mindestens ein Gen umfaßt, das ein gewünschtes Genprodukt codiert, und einen Promotor dazu, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist.

27. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 26, wobei das ein gewünschtes Genprodukt codierende Gen aus einem Milchsäurebakterium, einschließlich darin enthaltener Plasmide, isoliert ist.

28. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 27, wobei das gewünschte Genprodukt aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Enzymen, Phagenresistenz-verleihenden Genprodukten und Bacteriocinen besteht.

29. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 26 oder 27, wobei das (die) ein gewünschtes Genprodukt codierende(n) Gen(e) ein Gen ist bzw. Gene sind, dessen (deren) Expression in Gegenwart von Lactose zur Bildung von Milchsäure führt.

30. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Plasmids nach einem der Ansprüche 26 bis 29, umfassend das Inserieren eines ein gewünschtes Genprodukt codierenden Gens in eine Restriktionsstelle (c) eines Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und wahlweise eines Promotors dazu, der in einem Milchsäurebakterium funktionell ist.

31. Verfahren zur Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur eines Milchsäurebakteriums, das die Transformation eines Milchsäurebakteriums mit einem rekombinanten Plasmid nach einem der Ansprüche 26 bis 29 umfaßt, das Selektieren eines transformierten Milchsäurebakteriums, das Züchten der selektierten Transformante, das Isolieren der gezüchteten transformierten Zellen und die Herstellung einer Lebensmittelstarterkultur davon.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die Transformante in einem Medium selektiert wird, das ein von einem Milchsäurebakterium hergestelltes Antibiotikum enthält.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das von einem Milchsäurebakterium hergestellte Antibiotikum Nisin ist.

34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, wobei die Menge des Antibiotikums im Selektionsmedium mindestens 50 IE/ml, bevorzugt mindestens 75 IE/ml, stärker bevorzugt mindestens 100 IE/ml und besonders bevorzugt mindestens 500 IE/ml ist.

35. Lebensmittelstarterkultur, die eine Kultur eines nach einem der Ansprüche 31 bis 34 hergestellten Milchsäurebakteriums umfaßt.

36. Lebensmittelstarterkultur nach Anspruch 35, die eine Milchstarterkultur ist.

37. Lebensmittelstarterkultur nach Anspruch 35 oder 36, wobei die Kultur in gefrorenem oder gefriergetrocknetem Zustand ist.

38. Lebensmittelstarterkultur nach einem der Ansprüche 35 bis 37, wobei das Milchsäurebakterium aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Streptococcus spp, Lactococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Leuconostoc spp und Pediococcus spp besteht.

39. Rekombinantes Plasmid nach einen der Ansprüche 1 bis 12, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15 hergestellt ist.

40. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 26 bis 29, das nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 35 hergestellt ist.