DE60023158T2

DE60023158T2 - Phagenresistentes streptococcus thermophilus

Info

Publication number: DE60023158T2
Application number: DE60023158T
Authority: DE
Inventors: Harald Bruessow; Sacha Lucchini
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-08
Publication date: 2006-09-28
Anticipated expiration: 2020-08-09
Also published as: ATE306551T1; US7435434B1; AR025410A1; ES2250183T3; GB9920431D0; EP1212425B1; DE60023158D1; WO2001016329A3; EP1212425A2; AU7272900A; WO2001016329A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Bakterium, das resistent gegenüber einem Angriff durch mindestens einen Bakteriophagen ist, ein Verfahren zur Herstellung des Bakteriums und eine Zusammensetzung, die das Bakterium umfasst.
Im Kontext dieser Beschreibung soll das Wort "umfasst" die Bedeutung von "enthält unter anderem" aufweisen. Es soll nicht als "besteht lediglich aus" ausgelegt werden.
DNA-Basen und Aminosäuren werden hierin durch ihre Standardabkürzungen mit einem oder drei Buchstaben gemäß der Definition durch die "IUPAC Biochemical Nomenclature Commission" dargestellt.
Es ist wohl bekannt, dass Bakterien in Starter zur Herstellung von Milchprodukten eingebracht werden. Sie werden zur Optimierung von pH und Geschmack des Milchprodukts verwendet. Tatsächlich beruhte die Herstellung von Käse und Molkereiprodukten lange auf der Fermentation von Milch durch Bakterien. Die Bakterien sind für die Entwicklung von Säure, Geschmacksproduktion und häufig für Koagulum-Charakteristika in mesophilen Milch-Fermentationen verantwortlich. Da leistungsfähige Milch- bzw. Molkerei-Fermentationen von dem Wachstum und der Aktivität der Bakterien abhängig sind, wird große Sorgfalt bei einer Herstellung von Starter-Kulturen angewendet, die in hohem Maße aktiv und mit unerwünschten Mikroorganismen oder Bakteriophagen nicht kontaminiert sind. Das Fermentationsverfahren selbst ist jedoch nicht-aseptisch, wobei es in offenen Behältern (vats) mit einem nicht-sterilen Medium, pasteurisierter Milch, erfolgt. Es ist deshalb in hohem Maße für eine Kontamination durch Bakteriophagen anfällig. Bei der Mehrzahl von Stämmen, die bei kommerziellen Molkerei-Fermentationen verwendet werden, können Bakteriophagen, die bakterielles Wachstum und Säureproduktion anhalten können, innerhalb von einem bis zwei Tagen nach Einführen der Kultur auftreten.
Historisch beruhte eine Milch-Fermentation auf Starter-Kulturen mit Gemischen von Milchsäure-Bakterien. Die Gegenwart von Bakteriophagen oder ein Schutz vor diesen war entweder unbekannt oder fehlte. Bei diesen Kulturen wird angenommen, dass eine natürliche Phagenkontamination ein Gleichgewicht zwischen sich entwickelnden Bakteriophagen und Phagen-resistenten Bakterienvarianten erstellt hat. Die Kulturen waren in hohem Maße variabel hinsichtlich der Pegel an Säureproduktion, verblieben jedoch gemäßigt aktiv und konnten in kleinen Fermentationsbetrieben verwendet werden. Vor kurzer Zeit nahm die Molkereiindustrie Starterkulturversagen aufgrund einer Bakteriophagen-Infektion bewusster wahr und bei einer zunehmenden Nachfrage nach Milchkulturprodukten liegt ein Bedarf sowohl hinsichtlich einer Herstellungskapazitätserhöhung, als auch einer Verfahrenseffzienz-Steigerung vor, so dass größere Volumina an Milch verarbeitet werden und die gesamte Verarbeitungszeit verkürzt wird. Diese Modernisierung der Industrie führte zu einer erhöhten Nachfrage nach gleichförmigen und schnellen Säureproduktionsgeschwindigkeiten. Die Bakterien, welche die besten Milchprodukte bereitstellen können, können jedoch in hohem Maße hinsichtlich eines Bakteriophagenangriffs empfindlich sein.
Zur Lösung von Bakteriophagenproblemen wurde eine Anzahl von Verfahren entwickelt, um eine Phageninfektion bei kommerziellen Milch-Fermentationen zu minimieren. Durch die Verwendung von konzentrierten Kulturen, aseptischen Bulk-Starter-Gefäßen und Phagen-hemmenden Medien (siehe beispielsweise US 4,282,255 ), kann die Starterkultur vor einer Bakteriophageninfektion vor einer Gefäß-Inokulation (vat inoculation) geschützt werden. Die Phagen-Kontamination kann jedoch nicht nach Einführung der Bakterien in das Fermentationsgefäß verhindert werden.
Sandine, W. E., et al., J. Milk Food Technol. 35, 176 (1972) betonte die Notwendigkeit neue Bakterienstämme zur Verwendung in der Molkereiindustrie zu isolieren. Unter den Kriterien für eine Auswahl dieser Stämme ist eine Resistenz auf existierende Bakteriophagen vorrangig. Es ist mittlerweile anerkannt, dass einige Bakterienstämme durch irgendeinen Phagen nicht angegriffen werden, wenn sie einer "Challenge" bzw. Herausforderung durch große Sammlungen von Labor-Phagen-Banken unterworfen sind oder bei einer Verwendung auf einer kontinuierlichen Langzeitbasis bei kommerziellen Fermentationen. Von einigen Gruppen wurde die Existenz von Bakterien berichtet, die hinsichtlich eines Bakteriophagenangriffs nicht empfindlich sind. Bislang wurde jedoch lediglich eine begrenzte Anzahl an Phagen-unempfindlichen Stämmen identifiziert und auf Phagenresistenzmechanismen untersucht.
Die Patentschrift US 4,530,904 offenbart ein Verfahren um Bakterien im Allgemeinen vor verschiedenen Bakteriophagentypen zu schützen. Das Verfahren umfasst ein Transformieren eines Bakteriums mit einem rekombinanten DNA-Klonierungsvektor, der umfasst, ein Replikon, das in dem Bakterium funktionell ist, ein Gen, das ein funktionelles Polypeptid (d.h. menschliches Wachstumshormon) in dem Bakterium exprimiert, und ein DNA-Segment, das dem Bakterium eine Restriktions- und Modifikations-Aktivität verleiht. Das transformierte Bakterium wird dann unter großmaßstablichen Fermentationsbedingungen in Kultur gehalten. Dieses Verfahren ist insbesondere für Fermentationsvorgänge zur Herstellung von Polypeptidprodukten, wie Wachstumshormon, ausgelegt. Probleme bei diesem Verfahren sind durch die Tatsache bedingt, dass es auf einen Schutz gegenüber Phagen beruht, der durch einen Restriktions- und Modifikations (R/M) – Phagenresistenzmechanismus bereitgestellt wird, der auf einem Plasmid kloniert ist. Es bestehen zwei Hauptprobleme. Zunächst weist ein Plasmid hohe metabolische Kosten und ebenso Instabilitätsprobleme auf (eine Deletion eines Inserts kann erfolgen, in Abwesenheit einer geeigneten Selektion kann ein Verlust eines Plasmids erfolgen). Zweitens können Restriktions- und Modifikations- (R/M) Systeme leistungsfähig sein; sie arbeiten bei variierenden Wirksamkeitsniveaus (EOP von 10^–1–10^–6). Das Problem hierbei ist jedoch, dass sie einigen Phagen ermöglichen einer Restriktion zu entkommen, was zu modifizierten Nachkommenschaftsvirionen führt. Die modifizierten Phagen können dann einen zweiten Wirt infizieren, der ein identisches R/M-System trägt, ohne dass eine Restriktion stattfindet (EOP = 1,0).
Eine Phagenkontamination wird mittlerweile als ein Hauptgrund einer langsamen Fermentation oder eines vollständigen Versagens eines Starters angesehen. Das Fehlen von Bakterien, die in adäquater Weise überleben, kann zu Milchprodukten führen, die keinen wünschenswerten Geschmack aufweisen. Folglich bildet die Bereitstellung von Bakterien, die alle Merkmale aufweisen, die mit einer Herstellung von gutem Geschmack assoziiert sind, und die einer Infektion durch Bakteriophagen widerstehen können, ein Ziel von Wissenschaftlern, die an einer Herstellung von besseren Milchprodukten arbeiten.
Ein Bakterium, das traditionell bei der Herstellung von Milchprodukten verwendet wird, ist S. thermophilus. Insbesondere wird es bei der Herstellung von Joghurt, Mozzarella und von Käsen Schweizer Art (Swiss type cheeses) verwendet. Bei S. thermophilus ist ein Problem, dass er in sehr hoher Weise hinsichtlich einer Phageninfektion anfällig ist.
Wenig ist über natürliche Phagenresistenzmechanismen von S. thermophilus bekannt. Das Bakterium wurde vergleichsweise erst kürzlich identifiziert und bislang wurden wenige Daten, die das Bakterium betreffen, berichtet. Zusätzlich scheint es, dass S. thermophilus weniger Antiphagenmechanismen, als andere Bakterien, beispielsweise L. lactis aufweist. In Lactococcus lactis, dem hauptsächlichen mesophilen Starter der Molkereiindustrie, sind zahlreiche natürliche Phagenresistenzmechanismen vorhanden, und sind gewöhnlich auf konjugativen Plasmiden kodiert. Diese wurden verwendet, um lebensmittelgeeignete (food-grade) Phagenresistenzmechanismen bei wichtigen Lactococcus-Industriestartern zu konstruieren. Mittlerweile wurden Informationen von einer Phagengenomanalyse erhalten, die keine Pausität in bzw. keine Pausierung in bzw. keinen Mangel an (pausity) Restriktionsstellen zeigen, wie es erwartet wird, wenn Phagen einer Restriktions-/Modifikationsselektion ausgesetzt sind. Darüber hinaus weist S. thermophilus im Gegensatz zu L. lactis, worin die Mehrzahl der Antiphagenmechanismen mit Plasmiden verknüpft wurden, eine vergleichsweise geringe Anzahl an Plasmiden auf.
Deshalb besteht ein Bedarf nach einem Bakterium, das die Merkmale aufweist, die mit einer Herstellung eines guten Geschmacks assoziiert sind, und das einer Infektion durch Bakteriophagen widerstehen kann. Zusätzlich besteht ein Bedarf nach einem Verfahren zur Bereitstellung von Bakterien mit einer Resistenz hinsichtlich eines Phagenangriffs, wodurch eine Selektion von Stämmen auf der Basis ihrer Fähigkeit einen guten Geschmack herzustellen, eher als auf Basis ihrer Fähigkeit Bakteriophagen zu widerstehen, ermöglicht wird.
Spontane Phagen-unempfindliche Mutanten (PIM, phage-insensitive mutants) können durch "Phage Challenge" bzw. Herausforderung durch Phagen selektiert werden und dieser Ansatz wurde auf S. thermophilus angewendet. Derartige Mutanten sind jedoch gewöhnlich langsame Säure-Hersteller und können auch zu Phagen-Empfindlichkeit wieder zurückkehren.
Die vorliegende Erfindung geht die vorstehend angegebenen Probleme an.
Bemerkenswerter Weise wurden nun molekulare Verfahren angewendet, um Phagenresistente Stämme zu erzeugen. Ein neuer und überraschender Ansatz, der auf einer Inaktivierung eines bakteriellen Wirtsgens basiert, erwies sich bei einer Inaktivierung von Prophagen durch eine bakterielle Gen-Inaktivierung durch ein Targeting hiervon mit (einem) lebensmittelgeeigneten Plasmid(en) als erfolgreich. Ein zweiter neuer und überraschender Ansatz basiert auf dem Schutz, der durch eine zumindest teilweise Deletion des Sfi21 Prophagen bereitgestellt wird. Temperente Phagen kodieren gewöhnlich für Superinfektion-Immunitätsgene (superinfection immunity genes), die beim Schützen des Lysogens vor einer Superinfektion sowohl durch temperente, als auch durch lytische Phagen ziemlich wirksam sind. Im Falle des Phagen Sfi21 scheint die Superinfektionssteuerung durch zwei unterschiedliche genetische Elemente vermittelt zu werden: orf 203, einem Superinfektionsimmunitätsgen, und orf 127, dem Phagenrepressor. Ein Nachteil ist, dass Sfi21 Lysogene kontinuierlich infektiöse Phagenteilchen in die Medien abgeben, was das Werk kontaminieren könnte und möglicherweise eine spätere Einführung von wertvollen Startern verhindern könnte, die auf den Phagen Sfi21 empfindlich sind. Ebenfalls wurde gezeigt, dass temperente Phagen die Quelle von lytischen Derivaten sein können. Deshalb wurden in dem Sfi21 Prophagen zielgerichtete Deletionen erzeugt und in den bekannten lysogenen Starter Sfi1cl6 inseriert, um ein Lysogen zu erhalten, das eine Superinfektionssteuerung bewahren würde, aber seine Fähigkeit zur Herstellung infektiöser Virionen verloren hat. Beide Ansätze können leistungsfähige Phagen-resistente, lebensmittelgeeignete Starter für eine industrielle Milch-Fermentation bereitstellen.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Bakterium bereit, das gegenüber einem Angriff von mindestens einem Bakteriophagen resistent ist, das eine Modifikation des Sfi21 Prophagen oder des bakteriellen Chromosoms umfasst.
Gemäß eines zweiten Aspekts stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Bakteriums bereit, das umfasst, die Schritte einer Störung bzw. Unterbrechung des Sfi21 Prophagen oder des bakteriellen Chromosoms durch Inserieren oder Deletieren einer ausreichend großen DNA-Sequenz von dem Gen.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die das erfindungsgemäße Bakterium zusammen mit einem Träger, Adjuvans oder Verdünnungsmittel umfasst.
Vorzugsweise ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bakteriums ein S. thermophilus Bakterium. Bevorzugter handelt es sich um einen S. thermophilus Stamm, der ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Sfi1 und Sfi1c16.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bakteriums ein modifiziertes, bakterielles Chromosom. Bevorzugter umfasst das bakterielle Chromosom zusätzliche DNA. Vorzugsweise umfasst die zusätzliche DNA die Basen-Sequenz von ISS1 (siehe J. Bacteriol 178, 931–935 (1996)) oder ein funktionelles Äquivalent hiervon. Bevorzugter ist die zusätzliche DNA in das bakterielle Chromosom in ORF 90 bei einer Stelle eingeführt, bei der eine Expression eines Gens für die Kette A von Chorismat-Mutase unterbrochen bzw. gestört wird und/oder eine Expression des "down stream" bzw. stromabwärs gelegenen Gens ORF 394 unterbrochen wird; oder in ORF 269 bei einer Stelle, welche die Expression eines Oxidoreduktase-Gens unterbricht.
Vorzugsweise weist eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bakteriums einen modifizierten Sfi21 Prophagen auf, der durch Addition oder Deletion von ausreichend DNA modifiziert ist, um eine Expression des Prophagen durch Deletion mindestens eines Teils von ORF 1560 zu unterbrechen.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens den Schritt eines Modifizierens des bakteriellen Chromosoms, um die Expression von einem oder mehreren Genen zu unterbrechen, die für einen Bakteriophagen erforderlich sind, die jedoch für das Bakterium nicht wesentlich sind. Bevorzugter umfasst das Verfahren den Schritt eines Zufügens von DNA zu dem Chromosom. Vorzugsweise umfasst das Verfahren den Schritt eines Zufügens von DNA, welche die Basen-Sequenz von ISS1 umfasst (siehe J. Bacteriol. 178, 931–935 (1996)) oder ein funktionelles Äquivalent hiervon. Bevorzugter umfasst das Verfahren den Schritt eines Zufügens von DNA zu dem bakteriellen Chromosom in ORF 90 bei einer Stelle, welche eine Expression eines Gens für die Kette A von Chorismat-Mutase unterbricht oder in ORF 269 bei einer Stelle, welche eine Expression von einem Oxidoreduktase-Gen unterbricht.
Vorzugsweise umfasst eine alternative Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens den Schritt eines Modifizierens des Sfi21 Prophagen. Vorzugsweise umfasst sie den Schritt eines Zufügens oder eines Deletierens von einer ausreichenden Menge an DNA, um eine Expression des Prophagen durch Deletieren mindestens eines Teils von ORF 1560 zu unterbrechen.
Vorzugsweise umfasst eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung eine Ausführungsform des Bakteriums zusammen mit einem Träger, Adjuvans oder Verdünnungsmittel. Bevorzugter ist sie eine Starterkultur oder ein Milchprodukt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie ein Bakterium bereitstellt, das hinsichtlich eines Angriffs durch Bakteriophagen resistent ist.
Ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie ein Bakterium bereitstellt, bei dem Bakteriophagen-Empfindlichkeit nicht wiederkehrt und dass das Verfahren, durch das es hergestellt ist, in allgemeiner Weise anwendbar ist.
Noch ein anderer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass sie Bakterien bereitstellt, die einen derart hohen Grad an Phagenresistenz aufweisen, dass die erhaltenen phagenresistenten Bakterien keine spontane Entwicklung mutierter Phagen ermöglichen, welche die Bakterien infizieren könnten. Dies ist bei anderen Phagenresistenz-Mechanismen nicht der Fall. Folglich sollten diese Bakterien über eine lange Zeitspanne geschützt sein, bevor sich neue Phagen entwickeln, die diese infizieren könnten.
Noch ein anderer Vorteil ist, dass Bakterien erhalten wurden, die eine Resistenz gegenüber einem Angriff durch einen breiten Bereich von Phagen aufweisen. Der Wild-Typ-Bakterienstamm Sfi1 ist äußerst empfindlich auf einen Phagenangriff. Er kann durch mehr als 25 verschiedene Phagen (normale Stämme sind auf 1 oder 2 Phagen empfindlich) infiziert werden. In deutlichem Gegensatz hierzu steht, dass keine Phagen die mutierten Sfi1 Stämme gemäß der erfindungsgemäßen Ausführungsformen infizieren konnten. Es ist wichtig zu betonen, dass die Stabilität des Bakteriophagenresistenz-Phänotyps von chromosomal modifizierten Bakterien im Gegensatz zu der schwachen Resistenz von Bakterien steht, die Plasmid-kodierte Phagenresistenz-Mechanismen aufweisen. Darüber hinaus sind gegenwärtig keine bekannten lebensmittelgeeigneten Plasmide verfügbar, die zur Bereitstellung von Phagenresistenz in S. thermophilus verwendet werden können.
Zusätzliche Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind in der detaillierten Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten, nachstehend angegebenen Ausführungsformen beschrieben und werden aus dieser ersichtlich, wobei eine Bezugnahme auf die Zeichnungen erfolgt, worin:
1 Ergebnisse eines Southern Blots von Gesamt-DNA von Phagen-resistenten Integranden zeigt. Spuren 1–5: Phagen-resistentes Sfi1::pG+host9ISS1. Spur 6: Sfi1. M: DNA Marker (λ-DNA × HindIII). Der Blot wurde mit radioaktiv markiertem pG+host9ISS1 Plasmid und λ-DNA als Sonde behandelt. Anmerkung: Diese Figur ist die Kombination von zwei unabhängigen Blots (Spur 1 wurde zugefügt).
2 die Ergebnisse einer Detektion von intrazellulärer Phagen-DNA zeigt. Die Zahlen entsprechen der Zeit in Minuten, nach der die Probennahme erfolgte (siehe Materialen und Verfahren). Die zwei Linien, die mit M markiert sind, entsprechen dem Größen-Marker (1 kb DNA Ladder, GibcoBRL).
3 Wachstumskurven von Phagen-resistenten S. thermophilus Stämmen im Vergleich mit dem Parentalstamm zeigt. 1: Sfi1. 2: Sfi1-R7. 3: Sfi1-R71. 4: Sfi1-R24.
4 Stellen einer pG⁺host9ISS1 Insertion in Sfi1-R7 und Sfi1-R24 zeigt. Offene Pfeile geben die vorhergesagten offenen Leseraster (orf, open reading frames) an. Die Zahlen geben die Anzahl an Codons für jedes orf an. Falls möglich wurde eine vorläufige Funktion den vorhergesagten Genprodukten zugewiesen.
5 eine Deletion in Sfi1-R7e zeigt. Die in Sfi1-R7e deletierte Sequenz ist fettgedruckt. Der Pfeil gibt die pG⁺host9ISS1 Integrationsstelle an.
6 eine Wachstumskurve von S. thermophilus Sfi1c16D1560 (2) im Vergleich zu Sfi1c16 (1) zeigt.
7 eine Genom-Karte des Phagen Sfi21 zeigt. Sie zeigt eine Anmerkung eines Gens, das ORF 1560 entspicht, das zumindest teilweise deletiert werden kann. Es kodiert für ein mutmaßliches "tail length determining"-Protein, das für eine Phagenmutagenese erforderlich ist.
Ohne dass eine Bindung an diese Theorie gewünscht wird, wird postuliert, dass die Gegenwart von einigen bakteriellen Genen für eine Phagenentwicklung wesentlich, jedoch für ein bakterielles Wachstum in Milch entbehrlich ist. In der Tat wird nunmehr angenommen, dass Bakteriophagen bei vielen Schritten ihres Lebenszyklus, beispielsweise Adsorption, DNA Injektion, Replikation und Morphogenese, von Wirtsfaktoren abhängig sind. Es wird nunmehr angenommen, dass eine Störung bzw. ein Unterbrechen eines dieser Faktoren zu einer Phagen-resistenten Zelle führt.
Da kein Wissen über das S. thermophilus Genom vorlag, wurde eine "Random gene inactivation" bzw. Zufalls-Geninaktivierung mit dem Temperatur-empfindlichen Plasmid pG⁺host9ISS1 ausgeführt. Das Verfahren ist selbst-selektiv: Nach einem "Phage-Challenge" werden nicht-resistente Zellen eliminiert und Mutanten, die zu einer verringerten bakteriellen Tauglichkeit bzw. Fitness bzw. Eignung führen, sind zahlenmäßig unterlegen (are outnumbered).
Materialien und Verfahren
Stämme, Medien, Plasmide und Kulturbedingungen waren wie nachfolgend angegeben. Der E. coli Stamm 101 wurde in LB Brühe oder in LB Brühe, die mit 1,5% (W/V) Agar verfestigt war, bei 37°C vermehrt. Flüssige Kulturen wurden unter Bewegung bzw. Rühren (agitation) (240 rpm) wachsen gelassen. S. thermophilus Stämme Sfi1, sein lysogenes Derivat Sfi1c16 (den Sfi21 Prophagen enthaltend) und ihre Transformanten wurden bei 42°C entweder in M 17, das mit 0,5% Lactose ergänzt ist (LM17), Belliker Medien oder MSK gezüchtet. Erythromycin wurde bei einer finalen Konzentration von 2 und 150 μg/ml für S. thermophilus beziehungsweise E. coli, wenn erforderlich, verwendet. Die bei dieser Studie verwendeten Phagen wurden von der "Nestlé Culture Collection" erhalten und auf ihrem geeigneten S. thermophilus Stamm in LM17 Brühe, wie zuvor beschrieben, vermehrt.
Die Phagen-Aufzählung (phage enumeration) wurde wie zuvor beschrieben erreicht. Für eine "Random-Insertion"- bzw. Zufallsinsertions-Mutagenese und gezielte Mutagenese wurden die Plasmide pG⁺host9ISS1 beziehungsweise pG⁺host9 verwendet.
DNA-Techniken
Phagenreinigung, DNA-Extraktion und Reinigung, Agarose-Gel-Elektrophorese, "Southern Blot"-Hybridisierung und DNA-Markierung wurden wie zuvor beschrieben ausgeführt. Der Qiaprep-Plasmid-Kit (Qiagen) wurde für die rasche Isolierung von Plasmid-DNA von E. coli verwendet. Restriktionsenzyme und T4 Ligase wurden von Boehringer-Mannheim erworben und gemäß den Herstellerangaben verwendet. E. coli wurde wie im BioRad-Anweisungshandbuch angegeben einer Elektrotransformation unterworfen. S. thermophilus wurde unter Verwendung der durch Slos et al. beschriebenen Vorgehensweise einer Elektroporation unterworfen. Die Analyse intrazellulärer Phagen-DNA, PCR und DNA-Sequenzierung wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.
Sequenzanalyse
Die "Genetics Computer Group (Universität von Wisconsin) Sequence Analysis Package" wurde verwendet, um die Sequenzen zusammenzustellen und zu analysieren. Nukleotid- und vorhergesagte Aminosäuresequenzen wurden mit jenen in kommerziell verfügbaren Datenbanken (GenBank, Veröffentlichung 109, EMBL, Veröffentlichung 56; PIR-Protein, Veröffentlichung 57; SWISS-PROT, Veröffentlichung 36; und PROSITE, Veröffentlichung 15.0) mit FastA und BLAST Programmen (2) verglichen. Eine Vorhersage von Transmembran-Domänen erfolgte unter Verwendung des TMpred Programms.
Plasmid-Konstruktion für eine ortsgerichtete Integration
Um eine Deletion in dem Sfi21 Prophagen zu erzeugen, wurde das wärmesensitive Plasmid pG⁺host9AB1560, ein Derivat von pG⁺host9, erzeugt. Zwei Fragmente von etwa 500 bp, A und B, wurden in dem orf1 560 auf der Prophagensequenz bei einer Entfernung von 2,4 kb ausgewählt, derart dass eine Deletion von der gleichen Größe durch eine homologe Rekombination erzeugt würde. Fragment A wurde durch PCR unter Verwendung von Sfi21 Phagen-DNA als Template und von Primern (5'-AAC TGC AGT CTC AGC TCA AAG GGA C-3' und 5'-GGA ATT CTA GCC GTG ATG TTT TTG-3') erzeugt, die PstI und EcoRI Restriktionsstellen (unterstrichen) enthalten. Fragment B wurde durch PCR unter Verwendung von Primern (5'-GGA ATT CGA CGC AAT TAA AGA CCC-3' und 5'-CCA TCG ATC TGC TTC CAA AAT CTC G-3') erzeugt, die EcoRI und ClaI Restriktionsstellen enthalten. Beide Klone wurden dann in pG⁺host9 kloniert, um derart benachbart zu sein, wobei das Konstrukt pG⁺host9AB 1560 erzeugt wurde. Das Konstrukt wurde zunächst in E. coli 101 erzeugt, dann in S. thermophilus Sfi1c16 transformiert.
Transposition von pG⁺host9ISS1 und pG⁺host9AB1560 in das S. thermophilus Chromosom
S. thermophilus Sfi1 und Sfi1c16, die pG⁺host9ISS1 beziehungsweise pG⁺host9AB1560 enthalten, wurden über Nacht in LM17 Medium, das mit 2 μg/ml an Erythromycin ergänzt ist, wachsen gelassen. Die gesättigten Kulturen wurden in LM17 Medium, das 1 μg/ml an Erythromycin enthält, 100-fach verdünnt und 2 h bei 30°C inkubiert. Die Kulturen wurden dann zu 42°C verschoben, um freie Plasmide zu eliminieren und zur Sättigung wachsen gelassen. Die Integrationshäufigkeit pro Zelle wurde als das Verhältnis der Anzahl an Em^R Zellen bei 42°C zur Anzahl an lebensfähigen Zellen bei 30°C abgeschätzt. Eine Integration der Plasmide wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung überprüft. Zum Exzidieren der transponierten Vektoren wurden serielle Passagen in LM17 Brühe ohne Antibiotikum durchgeführt.
Selektion von Phagen-resistenten Mutanten
Die Kultur, welche die ursprüngliche Population von Sfi1::pG⁺host9ISS1 Integranten enthält, wurde in LM17, ergänzt mit 2 μg/ml an Erythromycin, 100-fach verdünnt und einer Challenge bzw. einem Challenge-Vorgang mit lytischem Phagen Sfi19 bei M. O. I. von 5 unterworfen. Die Kultur wurde dann zur Sättigung wachsen gelassen. Die Experimente wurden als nicht erfolgreich betrachtet, wenn kein Wachstum nach 48h beobachtet wurde.
Einzelne Phagen-resistente Kolonien wurden isoliert; ihre Gesamt-DNA wurde extrahiert und mit EcoRI verdaut und Southern Blots wurden unter Verwendung der Plasmid-DNA als Sonde durchgeführt. Drei verschiedene Hybridisierungsmuster wurden identifiziert, die den Sfi1-R7 (Spur 3), Sfi1-R24 (Spur 1) und Sfi1-R71 (Spuren 2, 4, 5) Insertionsmutanten entsprechen (1).
Phagenadsorptionstest
S. thermophilus Kulturen wurden in LM17 wachsen gelassen bis ein OD₆₀₀ von 0,6 erreicht war. Anschließend wurden Phagen bei M. O. I. von 1 zugegeben und die Kulturen wurden bei Raumtemperentur inkubiert. Sonden bzw. Proben (probes) wurden unmittelbar nach Phagenaddition und nach 30 min genommen. Diese Sonden bzw. Proben wurden dann filtriert, um die bakteriellen Zellen von den Kulturen zu entfernen. Übrige Phagen wurden dann aufgenommen bzw. aufgezählt. Die Adsorption wurde als Phagenzählungen bei Zeit 30, geteilt durch die Phagenzählungen bei Zeit Null, berechnet.
Ergebnisse
Eine Zufallsmutagense von S. thermophilus Sfi1 wurde durchgeführt. Der Starter-Stamm Sfi1 war die beste Indikator-Zelle. Er ist auf etwa 25 der 100 Phagen der "Nestlé Culture Collection" empfindlich. Dies ermöglicht ein Testen von mutierten Startern gegen einen breiten Bereich von Phagen.
Eine Transposition des Plasmids konnte mit einer sehr hohen Integrationshäufigkeit erreicht werden, etwa 50% (siehe Materialien und Verfahren). Integranten wurden zufallsgemäß auf Agar-Platten ausgewählt und in flüssigen Kulturen wachsen gelassen. Ihre Gesamt-DNA wurde dann extrahiert, um durch Southern Blot Hybridisierung die Integration des Plasmids in das Chromosom zu überprüfen. Die Hybridisierung wurde auf EcoRI verdauter chromosomaler DNA unter Verwendung von markiertem pG⁺host9ISS1 als Sonde durchgeführt. Alle Integranten zeigten Signale, die unterscheidbaren bzw. verschiedenen chromosomalen Fragmenten entsprechen (Daten nicht gezeigt), was die Integration des Plasmids und die Zufälligkeit der Transposition bestätigt.
Selektion von Phagen-resistenten Mutanten
Integranten wurden einem Challenge-Vorgang mit dem lytischen Phagen Sfi19 (M. O. I. = 5) unterworfen, um auf Phagen-resistente Mutanten zu selektieren. In Gegenwart von Phage Sfi19 zeigte die Sfi1::pG⁺host9ISS1 Kultur ein verzögertes Wachstum, wobei ein OD₆₀₀ von 0,85 lediglich nach 8 bis 12 h Inkubation erreicht wurde, im Vergleich zu 3 h für die Transformanten in Abwesenheit von Challenge-Phage. Im Gegensatz hierzu, wurde kein Wachstum für den Sfi1 Parental-Starter nach einem Phage-Challenge-Vorgang beobachtet (OD₆₀₀ < 0,02 nach 48 h). Tatsächlich misslang es uns in konsistenter Weise im LM17 Medium Phagen-resistente Mutanten von Starter Sfi1 nach Challenge mit zahlreichen Phagen zu erhalten.
Drei Mutanten wurden selektiert und mit Sfi1-R7, Sfi1-R24 und Sfi1-R71 bezeichnet.
Charakterisierung der Phagen-resistenten Mutanten
Die 3 Mutanten wurden auf Phagenresistenz hinsichlich 15 verschiedener S. thermophilus Phagen getestet. In keinem Fall wurden Phagen-Plaques beobachtet, was in einigen Fällen auf eine Plattier-Effizienz (efficiency of plating) von < 10^–7 schließen lässt (Tabelle 1).
Tabelle 1
Um eine Angabe zu der Stufe zu erhalten, bei der eine Phagenentwicklung blockiert wird, wurden Phagenadsorptions- und Phagen-DNA-Replikationstests durchgeführt. Der Adsorptionstest wurde unter Verwendung von Sfi19 auf Sfi1 und den drei Mutanten durchgeführt. Nach 30' waren 90% der eingegebenen Phagen an Sfi1, 94% an Sfi1-R7, 91% an Sfi1-R24 und 87% an Sfi1-R71 adsorbiert. Dies zeigt, dass die Mutation eine Phagenadsorption nicht beeinflusste.
Eine DNA-Replikation von Phage Sfi19 in Sfi1 und den Mutanten wurde durch Bestimmen der relativen Menge an intrazellulärer Phagen-DNA zu verschiedenen Zeitpunkten während einer Phageninfektion analysiert. In Sfi1 wurde Phagen-DNA leicht bzw. einfach nach 20 min nach Infektion erfasst (2). Die Menge an DNA stieg zu einem Maximum nach 40 min an. Anschließend wurde eine Abnahme nach 60 und 80 min beobachtet, wahrscheinlich aufgrund von Phagen-induzierter Zelllysis. Eine Phagen-DNA-Replikation in dem Sfi1-R24 Mutant war verzögert und verringert.
Phagen-DNA wurde lediglich nach 40 min erfasst, wobei ein Maximum bei 60 min erreicht wurde. Im Falle von Sfi1-R7 und Sfi1-R71 wurde keine Phagenreplikation beobachtet. Ein sehr niedriger und invariabler Pegel an Phagen-DNA wurde durch Hybridisierung erfasst. Dies könnte die injizierte DNA der infizierenden eingegebenen Phagen oder DNA von nicht-injizierten, jedoch adsorbierten eingegebenen Phagen darstellen. Das Wachstum der Mutanten wurde mit dem des Wild-Typ-Stamms in Milch verglichen. Dies erfolgte durch Erfassen von Änderungen in der Impedanz der Kulturmedien ("Rapid Automated Bacterial Impedance Technique", Don Whitley Systems). Dieses System erfasst in indirekter Weise die Umwandlung eines schwachen elektrischen Leiters, wie der polaren, jedoch ungeladenen Laktose in die elektrisch geladene Milchsäure während eines bakteriellen Wachstums. Die resultierende Kurve (Zeit vs. Konduktivität bzw. Leitfähigkeit) kann sowohl mit einem bakteriellen Wachstum, als auch einer Ansäuerung der Kultur korreliert werden. Alle drei Mutanten zeigten keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich eines Wachstums (und einer Ansäuerung) zu dem Parental-Stamm Sfi1 (3).
Bestimmung der Integrationsstelle
Die Fragmente benachbart zu dem Insertionspunkt wurden durch "Plasmid Rescue", wie von Maguin et al. beschrieben, für die Sfi1-R7 und Sfi1-R24 Mutanten erhalten. Der Ansatz war für Sfi1-R71 nicht erfolgreich. Die Regionen, die den pG⁺host9ISS1 Insertionspunkt flankieren, wurden für die zwei Mutanten sequenziert (4).
Bei Sfi1-R7 erfolgte eine Integration des Plasmids in die letzten 4 Aminosäuren eines mutmaßlichen Gens für die Kette A von Chorismat-Mutase (PheA), orf 90. Diese Integrationsstelle könnte auch als eine Promotor-Region für das "downstream" orf 394 funktionieren. Das orf 394 Genprodukt zeigt Ähnlichkeiten (26% Identität) mit einem hypothetischen konservierten Protein von Methanococcus jannashii (Zugangsnummer MJ0305). Das orf 394 gp kann ein integrales Protein sein, da 9 starke Transmembran-Helices vorhergesagt waren. Das orf 115 gp, das durch ein Gen kodiert ist, das direkt "downstream" bzw. stromabwärts von orf 394 angeordnet ist, zeigte eine signifikante Ähnlichkeit zu dem ribosomalen Protein L19 von zahlreichen Bakterien (Haemophilus influenzae, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Synechocystis sp.). Ein Gen, das nahezu identisch zu einem tRNAArg Gen (Anticodon CCU) ist, folgt diesem Gen von E. coli und interessanterweise der "Phage Attachment Site" attB für eine Prophagenintegration. "Upstream" bzw. stromaufwärts von orf 90 befindet sich ein Gen, das wir als orf 486 identifizierten (siehe 4), das für ein weiteres mögliches Membranprotein kodiert. Das abgeleitete Protein für diesen orf zeigt eine signifikante Ähnlichkeit (50% über 427 aa) mit einem hypothetischen C1-Kanal-ähnlichen Protein von E. coli (Zugangsnummer P37019).
In Sfi-R24 war der pG⁺host9ISS1-Insertionspunkt in einer wahrscheinlichen Oxidoreduktase an einer Fettsäurebiosynthese beteiligt (orf 269). Das vorhergesagte Protein zeigte eine Aminosäure-Identität von 42% mit einer E. coli 3-Oxoacyl-[acyl-Carrier-Protein]-Reduktase.
Interessanterweise ist ein Fragment einer R-Subeinheit eines Typ I – Restriktionsenzyms "downstream" von orf 269 angeordnet. Keine Datenbank-Treffer wurden für die orfs "upstream" von orf 269 gefunden.
Plasmid-Exzision
Um Lebensmittel-geeignete Starter-Stämme zu erhalten, ist es notwendig das Erythromycin-Resistenzgen zu entfernen, das in den Transformanten vorliegt. ISS1 erfährt eine replikative Transposition, die zu einem integrierten Plasmidvektor führt, der von zwei IS-Elementen flankiert ist. Deshalb wird eine homologe Rekombination zwischen diesen zwei Kopien des IS-Elements das Plasmid vollständig entfernen und lediglich eine einzelne Kopie des IS-Elements zurücklassen. Zur Begünstigung einer Rekombination erfolgten serielle Passagen der Transformanten in Abwesenheit einer Antibiotikum-Selektion. Sfi1-R24 verlor den Em^R-Phänotyp nach 29 Passagen (nun Sfi1-R24e), Sfi1-R71 nach 40 (Sfi1-R71e). Aufgrund des Fehlens von Tandem-Wiederholungen (1), war eine Exzision mit Sfi1-R24 einfacher. Sfi1-R7 Em^S (Sfi1-R7e) konnte nach 60 Passagen erhalten werden. Dann wurde eine Phagen-Resistenz für die Em^s Mutanten überprüft. Bei zwei Fällen (Sfi1-R24 und Sfi1-R71) führte der Verlust des Plasmids zu einer vollständigen Rückkehr bzw. Reversion zur Phagen-Empfindlichkeit, während Sfi1-R7e seinen vollen Phagen-Resistenz-Phänotyp bewahrte. Diesem Derivat fehlte die Plasmidsequenz mit Ausnahme einer ISS1 Sequenz. Ein Sequenzieren der flankierenden Sequenzen des verbleibenden ISS1 zeigte zusätzlich eine 69 bp Deletion, die bei der IS-Transpositionsstelle begann und das 3'-Ende von orf 90 und die ersten 15 Codons von orf 394 entfernt (5). Da zwei unabhängig erhaltene Sfi1-R7e Mutanten die gleiche Deletion zeigten, ist es wahrscheinlich, dass die Deletion bereits in dem Sfi1-R7 Parental-Mutant erfolgte.
Deletion von orf 1560 von dem Sfi21 Prophagen
Eine Integration des pG⁺host9AB1560 in den Prophagen wurde einfach erhalten (siehe Materialien und Verfahren). Eine Integration an der richtigen Stelle wurde durch PCR überprüft. Bei mehr als 50% der Integranden konnte gezeigt werden, dass sie ein Signal ergeben, das der vorhergesagten Größe für homologe Rekombinationsereignisse entspricht. Eine Plasmidexzision wurde nach 20 seriellen Passagen erhalten. Da die zweite homologe Rekombination sowohl zu dem Wild-Typ, als auch dem Deletions-Mutant führen kann, wurde PCR zum Testen der Em^S Klone verwendet. Wie erwartet waren etwa 50% der Klone Deletions-Derivate (Sfi1c16Δ1560).
Charakterisierung von Sfi1c16Δ1560
Um zu testen, ob ein wesentliches Gen des Phagen inaktiviert wurde, wurde der Prophage von sowohl Sfic16, als auch Sfi1c16Δ1560 mit 2 μg/ml an Mytomicin C induziert. Sfic16 gab 10⁵ pfu/ml, Sfi1c16Δ1560 gab keine erfassbaren infektiösen Teilchen ab. Anschließend wurde überprüft, ob der Superinfektion-Ausschluß-Phänotyp in dem Lysogen-Derivat bewahrt wurde.
Tabelle 2
Tatsächlich zeigten Plaque-Assays einen identischen Phagen-Ausschluß-Phänotyp bei beiden hinsichtlich einer Unterdrückung der Phageninfektiösität, ausgedrückt als Plattiereffizienz, als auch in dem Bereich von verschiedenen Phagen, die inhibiert wurden (Tabelle 2). Wachstumskurven des Lysogens und von dessen Deletionsderivat waren identisch (6).
Die Erfindung stellt eine Zunahme an Phagenresistenz von S. thermophilus Starter-Stämmen bereit. Zufallsinsertion eines integrativen Plasmids in das Chromosom von S. thermophilus führte zu einer Herstellung von in hohem Maße Phagen-resistenten (e.o.p. < 10^–6) Mutanten.
Der breite Bereich an Anti-Phagen-Aktivität der Sfi1-R7 Mutation lässt darauf schließen, dass die 15 Phagen, die getestet wurden, ähnliche Anforderungen an Wirtsfaktoren stellen, das heißt orf 90 und orf 394 gps. Bei dem erreichten Analyseniveau ist es nicht möglich Wirkungen des IS Elements und/oder der benachbarten Deletion auf die Transkription benachbarter bakterieller Gene auszuschließen. Phagenstrukturproteine Wechselwirken zumindest bei Phagenadsorption und DNA Injektion mit bakteriellen Strukturen. Das ersichtliche Fehlen von intrazellulärer Phagen-DNA in den Sfi1-R7 und Sfi1-R71 Mutanten kann ein Anzeichen einer Interferenz mit Phagen-DNA-Injektion sein. In Phagen von Gram-positiven Bakterien scheint eine anfängliche Phagenadsorption und Phagen-DNA-Injektion einem Zwei-Schritt-Verfahren zu folgen. Zunächst adsorbieren Phagen reversibel an Kohlenhydrat-Komponenten der Zellwand, dann scheint eine irreversible Wechselwirkung mit der Plasmamembran und ein Ausstoß von DNA zu folgen. Für einen Bakteriophagen c2 wurde gezeigt, dass ein Membranprotein, PIP, für eine irreversible Phagenadsorption an den Wirt verantwortlich ist. Der Phage c2 konnte keine Zellen mit defektiven PIP-Proteinen infizieren. Ob PIP auch für eine Phagen-DNA-Injektion verantwortlich ist, oder ob andere Strukturen erforderlich sind, ist nicht bekannt. Beispielsweise erfordert der Bakteriophage λ für eine effektive DNA Injektion zusätzlich zu dem LamB Rezeptor ein Wirtsprotein (Pel). Pel ist anscheinend nicht an einer Phagenadsorption beteiligt, da λ fest an E. coli pel^– Stämme bindet. Es ist folglich möglich, dass im Falle der Sfi1-R7 und Sfi1-R71 Mutanten, Proteine modifiziert wurden, die an einer irreversiblen Phagenadsorption und/oder DNA Injektion beteiligt sind. Tatsächlich zeigt Sequenzinformation an, die für Sfi1-R7 verfügbar ist, dass die Insertion von pG⁺host9ISS1 die Expression eines mutmaßlichen integralen Membranproteins blockiert haben kann.
Der Phagenresistenz-Phänotyp von Sfi1-R24 ähnelt jenem eines abortiven Infektionsmechanismus. Die Phagen-DNA kann in die Zelle eintreten und Phagen-DNA-Replikation erfolgt, ist jedoch verzögert und verringert. Diesbezüglich wird angenommen, dass das Insertionsereignis die Expression eines Wirtsfaktors beeinträchtigt, der an einem Phagenmultiplikationschritt vor einer DNA Replikation beteiligt ist. Eine Blockierung dieses Schritts könnte eine DNA Replikation negativ beeinträchtigen. Im Falle von Sfi1-R24, ist die Oxidoreduktase nicht der Wirtsfaktor, dessen Inaktivierung die Verzögerung bei einer DNA-Replikation bewirkt, da dessen Störung bzw. Unterbrechung durch das IS-Element nach Plasmidexzision keine Phageninhibition bereitstellt. Anscheinend wird die Transkription von benachbarten Genen durch das integrierte Plasmid gestört. Ein Gen, das für eine Subeinheit einer Restriktionsendonuklease kodiert, war der einzige Bioinformatik-Treffer in der Zielregion. Restriktions- und Modifikationsmechanismen sind jedoch ausgeschlossen, da keine Spuren eines Phagen-DNA-Abbaus in dem Southern Blot erfasst wurden (2). Eine direkte Interferenz mit einer Phagen-DNA-Replikation ist unwahrscheinlich, da die inhibierten Phagen anscheinend unterschiedliche DNA-Replikationsmodule aufweisen und folglich wahrscheinlich von verschiedenen Wirtsreplikationsfunktionen abhängig sind.
Der Sfi21 Prophage konnte durch eine gezielte, lebensmittel-geeignete Phagen-Geninaktivierung inaktiviert werden. Keine Abgabe von infektösen Teilchen durch das Sfi1c16Δ1560 Lysogen konnte nach Prophagen-Induktion erfasst werden. Wichtig ist, dass der inaktivierte Prophage seine schützende Wirkung gegen eine Superinfektion bei einem breiten Bereich von temperenten und lytischen S. thermophilus Phagen bewahrte. Folglich können inaktivierte Lysogene nun als wertvolle Starter betrachtet werden. Ihre Schutzkraft überschreitet jene, die mit Starter-Stämmen erhalten wird, die Phagen-Inhibitionsplasmide enthalten. Beispielsweise wurde das Superinfektionsimmunitätsgen von Sfi21 (orf 203) in einem Hochkopienzahlplasmid kloniert und auf einen Schutz gegen Phagen getestet. Er war quantitativ und qualitativ weniger vollständig als jener, der durch den Prophagen vermittelt wird. Zusätzlich war das Plasmid nicht länger Phagen-inhibitorisch, wenn es als einzelne Kopie in das bakterielle Chromosom integriert ist. Deshalb muss die Verwendung von orf 203 auf seinem Vorliegen auf einem Hochkopienzahl-Plasmid beruhen, wobei das Problem hoher metabolischer Kosten und von Plasmid-Instabilität vorliegt. Im Gegensatz hierzu, scheint der integrierte Prophage für die Zelle geringe metabolische Kosten aufzuweisen, da lysogene und nicht-lysogene S. thermophilus Starter identische Wachstumseigenschaften aufweisen. Inaktivierte Prophagen können verwendet werden, um die Phagenresistenz von anderen Stämmen als Sfi1 zu erhöhen, da eine Anzahl an wertvollen S. thermophilus Industriestartern mit dem Phagen Sfi21 lysogenisiert werden kann.

Claims

S. thermophilus Bakterienstamm, der in dem bakteriellen Chromosom oder in dem ΦSfi21 Phagen-Genom mutiert wurde, so dass eine Phagen-Replikation in dem Bakterium verhindert wird, worin das bakterielle Chromosom eine zusätzliche DNA in dem ORF 90 an einer Stelle aufweist, welche die Expression eines Gens für die Kette A der Chorismat Mutase unterbricht und/oder die Expression des stromabwärts liegenden Gens ORF 394 unterbricht, oder worin der Sfi21-Prophage durch Deletion von zum Unterbrechen der Expression des Prophagen ausreichenden DNA modifiziert ist, wobei die Mutation eine Deletion von mindestens einem Teil von ORF1560 umfasst.
Bakterium nach Anspruch 1, welches ein S. thermophilus Stamm ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sfi1 und Sfi1c16.
Verfahren zur Herstellung eines Bakteriums nach einem der Ansprüche 1 bis 2, welches die Schritte umfasst, Unterbrechen der Expression des bakteriellen Chromosoms oder des Sfi21-Prophagen-Genoms durch Inserieren einer DNA-Sequenz oder Deletion einer DNA-Sequenz.
Zusammensetzung, die das Bakterium nach einem der Ansprüche 1 bis 2 zusammen mit einem Träger, Adjuvans oder Verdünnungsmittel enthält.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, die eine Starterkultur oder ein Milchprodukt ist.