DE60036134T2

DE60036134T2 - Methoden und materialien fur genexpression

Info

Publication number: DE60036134T2
Application number: DE60036134T
Authority: DE
Inventors: Keith Frederick Norwich CHATER; Celia Joyce Norwich BRUTON; Sean Joseph Norwich O'ROURKE; Andreas Wilhelm Norwich WIETZORREK
Original assignee: Plant Bioscience Ltd
Current assignee: Plant Bioscience Ltd
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2020-12-23
Also published as: CA2395442A1; EP1881071A1; GB9930477D0; JP2003518387A; US20040086962A1; DE60036134D1; WO2001048228A1; US7316914B2; WO2001048228A8; ATE371032T1; EP1244799B1; US20080268501A1; EP1244799A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Material, das vom SCP1-Plasmid von Streptomyces coelicolor A3(2) abstammt, sowie Verfahren und Verwendungen, die damit in Verbindung stehen, insbesondere Material, das vom Gencluster zur Methylenomycin-A-Biosynthese abstammt.
Der Erfindung liegt jene Arbeit zugrunde, die von den Erfindern hinsichtlich der Sequenzierung und der Ableitung der Funktion verschiedener Gene im biosynthetischen Methylenomycin-A-Gencluster durchgeführt wurde.
Die natürliche Rolle der DNA, welche die vorliegende Erfindung betrifft, liegt in der Produktion des antibiotischen Methylenomycin A sowie Vertretern derselben Art. Der gesamte Cluster der Methylenomycin-Produktion, -Resistenz sowie -Regulationsgene (der mmy-Gencluster) ist lediglich aus Studien an Streptomyces coelicolor A3(2) und Streptomyces violaceoruber Nr. 2416 SANK 95570 bekannt (Chater und Bruton (1985)). In diesen beiden Bakterien sind die Gene, die sich mit der Methylenomycin-Produktion beschäftigen, auf verschiedenen Plasmiden, SCP1 und pSV1, vorhanden (Aguilar und Hopwood (1982)). Kein weiteres Beispiel der plasmidspezifizierten Antibiotikaproduktion ist in Streptomyces bekannt. In den untersuchten Fällen können alle natürlich vorkommenden Streptomyces-Plasmide, unter anderem SCP1, mittels Konjugation in neue Streptomyces-Wirte transferiert werden.
Die DNA-Sequenz eines 9,5-kb-Abschnitts dieses Genclusters wurde nun entdeckt, und die Erfinder haben mehrere Gene und ihre Transkriptionsorganisation identifiziert. Sie fanden heraus, dass sich die Transkriptionsorganisation dieser Region wesentlich von jener unterscheidet, die zuvor vorgeschlagen wurde, z.B. in Chater und Bruton (1985). Die Funktion gewisser dieser Gene wurde erneut von der Entdeckung abgeleitet, dass sie ein hohes Ausmaß an Homologie mit anderen Genen aufweisen, die in die Regulierung anderer, chromosomal angeordneter biosynthetischer Antibiotika-Gencluster in verschiedenen Streptomyceten involviert sind.
Diese Entdeckung ist besonders hinsichtlich der Tatsache überraschend, dass Methylenomycin das einzige Streptomyces-Antibiotikum ist, dessen Biosynthese be kanntermaßen von einem Plasmid verliehen wird, anstatt von nativer genomischer Streptomyces-DNA. Sie impliziert, dass diese Gene adaptiert werden sollten, um auf eine auf geeignete Art gesteuerte Weise in einem beliebigen Streptomyces-Wirt zu wirken, auf den diese Plasmide übertragen werden können.
Weiters haben die Erfinder herausgefunden, dass die Insertion eines Gens von Interesse in eine bestimmte Transkriptionseinheit innerhalb dieses 9,5-kb-Abschnitts eine Regulation dieses Gens ermöglicht, so dass es nur bei hoher Zelldichte exprimiert wird. Diese Transkriptionseinheit enthält drei biosynthetische Methylenomycin-Gene. Ähnliche Resultate wurden bei einer anderen Transkriptionseinheit des mmy-Genclusters erhalten, was darauf hindeutet, dass andere biosynthetische Gene auf ähnliche Art und Weise gesteuert werden, sowie bei einer Transkriptionseinheit, die selbst Teil des Regulationssystems ist.
Auf der Basis dieser Entdeckungen stellen die Erfinder nun ein Modell der Regulation der Methylenomycin-Expression in Streptomyces bereit.
Dieses Modell ermöglicht Prognosen bezüglich der Wirkung der Zerstörung gewisser Abschnitte des Genclusters.
Es wurden Beobachtungen gemacht, die mit diesen Prognosen übereinstimmen.
Die Erfinder haben einen Block von acht Genen, genannt mmyR, mmfP, mmfH, mmfL, mmfR, mmyT, mmyO und mmyG, sequenziert und identifiziert. Die Anordnung dieser Gene in dem sequenzierten DNA-Abschnitt ist in 1d dargestellt. Die 1a-c zeigen die Position dieses Abschnitts im Methylenomycin-Gencluster und auf dem SCP1-Plasmid.
Die Autoren haben ebenfalls fünf weitere Gene, genannt mmyK, mmyP, mmyA, mmyC und mmyX, sequenziert und identifiziert, wobei diese Teil einer nicht vollständig definierten Transkriptionseinheit, mmy...XCAPK, in einem nahegelegenen Block sind. Die Organisation dieser Gene und weiterer nahegelegener Gene ist in 1e dargestellt. Die Sequenz dieser gesamten Region, zusammen mit abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Genprodukte, ist nun in der GenBank/EMBL-Datenbank unter der Zugriffsnummer AJ276673 erhältlich.
Grundlage des Systems sind die Produkte der zwei Gene mmyR und mmfR. Die Erfinder haben herausgefunden, dass diese beiden Gene für Proteine mit sehr signifikanter Ähnlichkeit mit mehreren anderen Proteinen aus verschiedenen Streptomyces-Spezies kodieren (2). Ein bekanntes Modellmitglied dieser Protein-Sub-Familie ist ArpA, ein Protein von Streptomyces griseus (siehe z.B. Onaka und Horinouchi (1997); Onaka et al. (1997); sowie Sugiyama et al. (1998)). ArpA bindet den A-Faktor, ein Acyl-γ-butyrolacton (GBL), mit hoher Affinität. Bei Fehlen des A-Faktors bindet ArpA an spezifische Sequenzen in den Promotoren von Target-Genen und verhindert ihre Expression. Bindet ArpA den A-Faktor, so verliert es seine DNA-Bindungsaktivität, und die Target-Gene werden exprimiert.
A-Faktor-artige GBLs sind eine weitverbreitete Molekülfamilie in Streptomyces, die sich außerhalb der Zellen in Kultur ansammeln; sie scheinen zwischen dem Zytoplasma und dem Medium frei ausgetauscht worden zu sein. Nur bei hoher Zelldichte reicht die Konzentration außerhalb, und daher innerhalb, der Zellen aus, um eine Abtrennung zugehöriger Bindungsproteine (wie z.B. ArpA) von Promotoren hervorzurufen. Das Resultat davon ist, dass die Target-Gene nur bei hoher Zelldichte aktiv werden. Weiters regulieren zumindest manche dieser Target-Gene die Sporenbildung und/oder die Antibiotika-Produktion, Vorgänge, die nur in dichten Kulturen auftreten.
Die Erfinder haben auch herausgefunden, dass die abgeleitete Aminosäuresequenz des mmfL-Gens auf sehr signifikante Art und Weise Proteinen ähnelt, welche die GBL-Produktion in anderen Streptomyces-Spezies verleihen (3). Aus 1 geht hervor, dass sich das mmfL-Gen zwischen den zwei für den Repressor kodierenden Genen mmyR und mmfR befindet, zusammen mit mmfP und mmfH.
Weiters präsentieren die Erfinder experimentelle Resultate basierend auf der Insertion eines Markergens in die mmyG- und mmfH-Gene, die zeigen, dass mmyG und mmfH bei hoher Zelldichte selektiv exprimiert werden (4). Das ausgewählte Gen war xylE aus einem Plasmid von Pseudomonaden (Bruton et al. (1991)). Das xylE-Genprodukt ist das Enzym Catechin-Oxygenase, das durch Koloniefärbung detektiert werden kann (Ingram et al. (1989)).
Aus der Sequenzanalyse scheint neu hervorzugehen, dass die mmyT-, mmyO- und mmyG-Gene aus einem gemeinsamen Promotor innerhalb der nicht-kodierenden Region zwischen mmfR und mmyT transkribiert werden. Daher schlagen die Erfinder vor, dass alle drei Gene der mmyTOG-Region bei hoher Zelldichte selektiv exprimiert werden. Auf ähnliche Art und Weise scheint es neu so zu sein, dass mmfL, mmfH und mmfP aus einem gemeinsamen Promotor innerhalb der nicht-kodierenden Region zwischen mmfL und mmfR transkribiert werden und dass dieser Promotor auf ähnliche Art und Weise reguliert wird.
Eine ähnliche Regulierung der Expression wurde erhalten, als xylE in die mmy...XCAPK-Transkriptionseinheit insertiert wurde (4 und 5), was darauf hindeutet, dass der Promotor für diese Region auf ähnliche Art und Weise reguliert wird.
Basierend auf ihren Untersuchungen stellen die Erfinder nun ein Modell für die Regulierung der Methylenomycin-Produktion in Streptomyces bereit. Die Produkte der mmyR- und/oder mmfR-Gene, ArpA-Homologe, binden an den/die Promotor(en) eines/von Gens/Genen, von dem/denen angenommen wird, dass es/sie für biosynthetische Methylenomycin-Enzyme oder positive Regulatoren der Methylenomycin-Biosynthese kodiert/kodieren, wodurch die Methylenomycin-Produktion verhindert wird. MmfL, das Produkt des mmfL-Gens, steuert die Synthese eines GBL, das an die Produkte der mmyR- und/oder mmfR-Gene bindet. Bei ausreichend hoher Zelldichte (und daher ausreichend hoher mmfL-spezifizierter GBL-Konzentration im Medium) reicht diese letztere Bindung aus, um die Bindung der mmyR- und/oder mmfR-Genprodukte an den/die Promotor(en) zu verhindern, dessen/deren Aktivierung für die Methylenomycin-Produktion notwendig ist. Unter diesen befinden sich die Promotoren von mmyTOG, mmfLHP und mmy...XCAPK. Es wird weiters abgeleitet, dass die Induktion des mmfLHP-Promotors ein „Steuer"-System bildet, wodurch die Pro duktion von GBL amplifiziert wird und die Zellen zur uninhibierten Expression aus den mmyTOG- und mmy...XCAPK-Promotoren „gezwungen" werden.
Als ein Resultat weiterer Experimente wird ebenfalls vorgeschlagen, dass das Produkt eines anderen Gens, mmyB, auch in diese Festlegung involviert ist (siehe Beispiel 4).
Die Erfinder prognostizieren nun aus diesem Modell, dass die Zerstörung der mmyR- und/oder mmfR-Gene zu einer erhöhten Methylenomycin-Produktion führt, da der Verlust an Repressoren Target-Promotoren aus der Repression freisetzt. Diese Prognose wurde durch Beobachtungen bestätigt, die zeigen, dass keiner der mmyR-, mmfP- und mmfH-Gene ein positiver Regulator ist; dass keiner davon für ein biosynthetisches Enzym kodiert, das für die Methylenomycin-Biosynthese essentiell ist; und dass mmyR negativ wirkt.
Als ein Resultat weiterer Experimente prognostizieren die Erfinder auch, dass ein zusätzliches Gen, mmyB, ebenfalls in den Ablauf des Regulationsschemas involviert ist. Beobachtungen, die in Beispiel 4 erwähnt werden, haben diese Prognose unterstützt.
Die Erfinder sind auch der Ansicht, dass die Gegenwart einer zusätzlichen Kopie von mmfL zu einer erhöhten Methylenomycin-Produktion führen würde, da dies zu einer verstärkten GBL-Synthese führen sollte und daher zu einer wirksameren Anhebung der Repression. Diese Prognose wurde auch durch Beobachtungen bestätigt.
Die Sequenzierung des mmfL-Gens zeigt, dass es ein ungewöhnliches Merkmal enthält, nämlich die Gegenwart eines TTA-Codons (Position in 1 dargestellt). TTA (= UUA in mRNA) ist eines von sechs Codons, die für Leucin kodieren. Aufgrund der Tatsache, dass es voll und ganz lebensfähige Mutantenstämme von Streptomyces gibt, denen die Fähigkeit fehlt, dieses Codon zu translatieren, ist jedoch bekannt, dass das TTA-Codon nicht in etwaigen essentiellen Genen von Streptomyces-Spezies verwendet wird. Solche Mutanten sind im bldA-Gen defekt, das direkt für die Transfer-RNA kodiert, die für die Erkennung des UUA-Codons verantwortlich ist (Leskiw et al. (1991)). Die Translation von mmfL-mRNA in das MmfL-Protein wäre daher in einer bldA-Mutante stark eingeschränkt. Beobachtungen, die in Beispiel 4 dargelegt sind, haben diese Prognose stark unterstützt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung prognostizieren auch, dass es zu einem Versagen der GBL-Produktion in einer bldA-Mutante kommen würde, was zu einer fehlenden Produktion von Methylenomycin führen würde, da ihr Modell zeigt, dass mmfL die Produktion eines GBL verleiht, das benötigt wird, um die Repression der Methylenomycinsynthese abzumildern. Beobachtungen, die in Beispiel 4 dargelegt sind, haben diese Prognose stark unterstützt.
Es werden hierin Experimente beschrieben, in denen ein auf geeignete Art und Weise ausgerichtetes Fremdgen, das für ein leicht detektierbares Enzym (xylE) kodiert, in verschiedene Transkriptionseinheiten im Methylenomycin-Gencluster insertiert wurde. Die Expression von xylE wurde in hohem Ausmaß z.B. in bldA⁺-Stämmen detektiert, die mmyG::xylE-, mmfH::xylE- oder mmy...XCAPK::xylE-Fusionen in sich tragen, war jedoch nicht detektierbar in bldA-Mutanten, welche dieselben Fusionen in sich tragen, was die Prognose des Modells bestätigt.
Das Expressionsmuster von Catechin-Oxygenase in bldA⁺-Stämmen, die mmyG::xylE-, mmy...XCAPK::xylE- oder mmfH::xylE-Fusionen in sich tragen, zeigt, dass es zu einem frühen Zeitpunkt während des Wachstums keine detektierbare Aktivität gab, wohingegen die spezifische Aktivität später im Wachstum sehr stark anstieg (4), was zeigt, dass der Promotor, der die xylE-Expression antreibt, auf sehr spezifische Art und Weise reguliert wird.
Zum Vergleich wurde, als xylE zur Produktion von Undecylprodigiosin, einem anderen Antibiotikum, im Chromosom von S. coelicolor an die redX-Transkriptionseinheit fusioniert wurde, eine viel schwächere spezifische Aktivität erhalten, wenn auch unter anderen Wachstumsbedingungen (Guthrie und Chater (1990)). Daher ist der Promotor, der die mmyG::xylE-Expression steuert, sehr stark im Vergleich zu jenen von Genen für andere Streptomyces-Antibiotika. Auf ähnliche Art und Weise wird eine starke Expression für die Promotoren angegeben, welche die Expression von mmyK und mmfH steuern.
Bei der fortdauernden Sequenzierung der Methylenomycin-Gene wurde eine andere Target-TTA-Sequenz für die bldA-Wirkung entdeckt, was darauf hindeutet, dass das TTA-Codon in mmfL nicht der einzige Grund für die bldA-Abhängigkeit der Methylenomycin-Produktion sein könnte. Diese Prognose wurde durch Beobachtungen verifiziert (siehe Beispiel 4b).
Ausgehend von ihrem Modell lehren die Erfinder, dass die Insertion einer Nucleinsäure von Interesse (z.B. eines Gens oder von Genen) in die mmyTOG-Region in der korrekten Ausrichtung und in Gegenwart der mmyR-mmf-mmyTOG-Region links von der Insertionsstelle zu einer selbstregulierenden, starken Expression der Nucleinsäure von Interesse führt, und zwar besonders spät in der Kultur, um ein hohes Expressionsausmaß nur unter Bedingungen bereitzustellen, wenn die Hauptwachstumsphase beendet wurde (d.h. bei hoher Biomasse- und hoher Mycelium-Dichte). Dies hat vier Hauptvorteile für die Expression der Nucleinsäure von Interesse: (1) eine reduzierte oder keine Expression früher im Wachstum, wobei toxische Wirkungen mancher Genprodukte auf das Wachstum vermieden werden; (2) ein exogen hinzugefügter Induktor ist kein Erfordernis, wodurch verschiedene Beschränkungen bezüglich des Kulturmediums oder Probleme der Kosten des Hinzufügens von Induktoren zu großen Fermentern oder des Entfernens dieser aus dem gewünschten Endprodukt vermieden werden; (3) der Methylenomycin-Cluster, auf natürliche Art und Weise auf einem leicht übertragbaren Plasmid vorhanden, hat sich wahrscheinlich weiterentwickelt, um eine korrekt regulierte Expression in verschiedenen Streptomyces-Wirten (siehe oben) zu ermöglichen, was von kommerzieller Bedeutung ist, da beinahe jedes Antibiotikum oder anderes Streptomyces-Produkt, das kommerziell hergestellt wird, einen anderen Stamm umfasst; sowie (4) die Expression wird von einem starken Promotor gesteuert, was zu einer großen Ausbeute des gewünschten Endprodukts führt. Weitere Experimente scheinen zu zeigen, dass der für die Ex pression verwendete Wirtstamm jene mmy-Gene enthalten sollte, die sich rechts von mmr befinden, oder zumindest das mmyB-Gen.
Auf ähnliche Art und Weise lehren die Erfinder, dass ähnliche Resultate erhalten werden könnten, wenn die Nucleinsäure von Interesse in geeigneter Ausrichtung in die mmy...XCAPK-Region insertiert ist, in Gegenwart der mmy...XCAPK-Region rechts von der Insertionsstelle und in Gegenwart des mmy...XCAPK-Promotors, oder wenn die Nucleinsäure von Interesse in geeigneter Ausrichtung in die mmfLHP-Region insertiert ist, in Gegenwart der mmfLHP-Region rechts von der Insertionsstelle und in Gegenwart des mmfLHP-Promotors.
Ähnliche Resultate können auch erhalten werden, wenn die Nucleinsäure von Interesse in geeigneter Ausrichtung in die mmyBQE-Region insertiert ist, in Gegenwart der mmyBQE-Region rechts von der Insertionsstelle und in Gegenwart des mmyBQE-Promotors, oder wenn die Nucleinsäure von Interesse in geeigneter Ausrichtung in die mmyYF-Region insertiert ist, in Gegenwart der mmyYF-Region links von der Insertionsstelle und in Gegenwart des mmyYF-Promotors.
Weiters wird angenommen, dass gewisse Regionen des 9,5-kb-Abschnitts, der untersucht wurde, von größerer Bedeutung sind als andere. Insbesondere lehrt das Modell, dass das Wechselspiel zwischen den Produkten der mmfR-, mmyR-, mmfL- und mmyB-Gene und den Promotoren der mmyTOG-, mmy...XCAPK- und mmfLHP-Regionen von entscheidender Bedeutung für die Regulierung der Methylenomycin-Produktion ist. Daher wird gelehrt, dass die Kombination der Nucleinsäure von Interesse und minimaler Regulationsabschnitte, die ein mmfR-Gen und/oder ein mmyR-Gen; ein mmfL-Gen; ein mmyB-Gen; sowie einen mmyTOG-Promotor und/oder einen mmy...XCAPK-Promotor und/oder einen mmfLHP-Promotor und/oder einen mmyBQE-Promotor und/oder einen mmyYF-Promotor umfassen, auch zu einer erhöhten Expression der Nucleinsäure von Interesse bei höherer Zelldichte im Vergleich mit geringerer Zelldichte führt.
Es wird jedoch auch in Betracht gezogen, dass die mmfP- und mmfH-Gene bei der Regulierung der Methylenomycin-Produktion von Bedeutung sind, z.B. können ihre Produkte unter einigen Bedingungen die Struktur des GBL modifizieren, dessen Produktion durch das mmfL-Gen verliehen wird, was zu Veränderungen der Details der Wechselwirkungen zwischen den GBL- und den mmyR- und/oder den mmfR-Genprodukten führt. Daher können diese Gene auch im Regulationsabschnitt vorhanden sein.
Weiters erwarten die Erfinder, nachdem sie herausgefunden haben, dass drei verschiedene Promotoren biosynthetischer Methylenomycin- und positiver Regulations-Gene auf dieselbe Art und Weise reguliert werden, dass andere Promotoren biosynthetischer Methylenomycin-Gene auch auf ähnliche Art und Weise reguliert werden.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher eine Expressionskassette zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei die Expressionskassette Folgendes umfasst:
einen Regulationsabschnitt oder Regulationsabschnitte, umfassend:
ein erstes Regulationselement, das entweder ein mmyR-Gen, das für ein MmyR-Polypeptid kodiert, oder ein mmfR-Gen, das für ein MmfR-Polypeptid kodiert, oder beides umfasst;
ein zweites Regulationselement, das ein mmfL-Gen umfasst, das für ein MmfL-Polypeptid kodiert; und
einen Promotor (den „reprimierbaren Promotor"), dessen Funktion durch das Expressionsprodukt des ersten Regulationselements unterdrückt wird, wobei die Unterdrückung durch ein Produkt gemildert oder beseitigt wird, dessen Produktion durch das MmfL-Polypeptid verliehen wird, und
eine heterologe Nucleinsäure von Interesse, die sich in operativer Assoziierung mit dem Promotor befindet, worin:
das MmyR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren);
das MmfR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist; und
das MmfL-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist.
Solch ein Konstrukt stellt die minimale Expressionskassette dar, die durch das oben genannte Modell als Auslöser der Expression der Nucleinsäure von Interesse in Streptomyces bei hoher Zelldichte prognostiziert werden kann.
Vorzugsweise ist die Expressionskassette in der Lage, die Nucleinsäure von Interesse in der stationären Phase von Streptomyces-Kulturen im Vergleich zu Kulturen in früher Exponentialphase in erhöhten Mengen zu exprimieren.
Vorzugsweise werden die Regulationselemente, der Promotor und die Nucleinsäure von Interesse auf einer einzigen Expressionskassette bereitgestellt, es wird jedoch in Betracht gezogen, dass sie getrennt bereitgestellt werden können, z.B. auf zwei Vektoren, die in einen gewünschten Wirt co-eingeführt werden können, oder dass eines oder mehr der Regulationselemente und der Promotor durch das SCP1-Plasmid bereitgestellt werden können.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in diesem ersten Aspekt auch eine Reihe an Nucleinsäuren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei die Reihe an Nucleinsäuren zusammen Folgendes umfasst:
einen Regulationsabschnitt oder Regulationsabschnitte, umfassend:
ein erstes Regulationselement, das entweder ein mmyR-Gen, das für ein MmyR-Polypeptid kodiert, oder ein mmfR-Gen, das für ein MMfR-Polypeptid kodiert, oder beides umfasst;
ein zweites Regulationselement, das ein mmfL-Gen umfasst, das für ein MmfL-Polypeptid kodiert;
einen Promotor (den „reprimierbaren Promotor"), dessen Funktion durch das Expressionsprodukt des ersten Regulationselements unterdrückt wird, wobei die Unterdrückung durch ein Produkt gemildert oder beseitigt wird, dessen Produktion durch das MmfL-Polypeptid verliehen wird, und
eine heterologe Nucleinsäure von Interesse, die sich in operativer Assoziierung mit dem Promotor befindet, worin:
das MmyR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren);
das MmfR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist; und
das MmfL-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist.
Bei der Reihe handelt es sich vorzugsweise um eine isolierte Reihe an Nucleinsäuren.
Vorzugsweise werden sowohl ein mmyR-Gen als auch ein mmfR-Gen in dem/den Regulationsabschnitt(en) dieses Aspekts bereitgestellt.
Vorzugsweise wird ein mmyB-Gen, das für ein MmyB-Polypeptid kodiert, innerhalb der oder zusätzlich zu der Expressionskassette oder der Reihe an Nucleinsäuren als ein Mediator der Regulationswirkungen des Regulationsabschnitts bereitgestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das mmyB-Gen in ein drittes Regulationselement des/der Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitte inkorporiert. Vorzugsweise werden auch manche oder alle anderen mmy-Gene rechts vom mmr-Gen (wie in 1e dargestellt) bereitgestellt.
Die Repression der Funktion des reprimierbaren Promotors durch das Expressionsprodukt des ersten Regulationselements kann eine direkte Repression durch das Expressionsprodukt sein, oder sie kann auf das Fehlen eines Aktivators zurückzuführen sein, der selbst vom ersten Regulationselement reprimiert wird.
Vorzugsweise umfasst/umfassen der/die Regulationsabschnitt(e) zumindest einen Abschnitt des neu sequenzierten 9,5-kb-Abschnitts an Nucleinsäuren, wie in 7 dargestellt, oder eine Variante davon.
Vorzugsweise kodiert das mmyR-Gen für ein MmyR-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8a (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren). Noch bevorzugter umfasst es die Reste 1407 bis 796 aus 7, unterer Strang (gegebenenfalls unter Ausschluss der Reste 1407 bis 1390).
Vorzugsweise kodiert das mmfR-Gen für ein MmfR-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8e. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 4807 bis 5451 aus 7, oberer Strang.
Vorzugsweise umfasst das erste Regulationselement auch einen Promotor, der operativ an das mmyR- oder das mmfR-Gen gebunden ist. In Ausführungsformen, in denen beide Gene vorhanden sind, sind sie vorzugsweise operativ an die jeweiligen Promotoren gebunden. Noch stärker wird es bevorzugt, wenn der Promotor, an den das mmyR-Gen gebunden ist, ein mmyR-Promotor ist und/oder wenn der Promotor, an den das mmfR-Gen gebunden ist, ein mmfR-Promotor ist. Noch stärker wird es bevorzugt, wenn der Promotor, an den das mmyR-Gen gebunden ist, manche oder alle der Reste 1557 bis 1390 aus 7, unterer Strang, umfasst (gegebenenfalls unter Ausschluss der Reste 1409 bis 1390) und/oder wenn der Promotor, an den das mmfR-Gen gebunden ist, manche oder alle der Reste 4613 bis 4806 aus 7, oberer Strang, umfasst.
Vorzugsweise kodiert das mmfL-Gen für ein MmfL-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8d. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 4612 bis 3551 aus 7, unterer Strang.
Vorzugsweise umfasst das zweite Regulationselement auch einen Promotor, der operativ an das mmfL-Gen gebunden ist. Noch bevorzugter handelt es sich bei dem Promotor, an den das mmfL-Gen gebunden ist, um einen mmfL-Promotor. Noch stärker wird es bevorzugt, wenn der Promotor, an den das mmfL-Gen gebunden ist, manche oder alle der Reste 4806 bis 4613 aus 7, unterer Strang, umfasst.
Es ist zu beobachten, dass die bevorzugten Promotoren für mmfL und mmfR beide manche oder alle der Reste 4806 bis 4613 aus 7 umfassen. Von dieser Region wird angenommen, dass sie einen bidirektionalen Promotor für beide dieser Gene umfasst. Vorzugsweise umfasst/umfassen der/die Promotor(en) für mmfL und/oder mmfR eine Palindromsequenz mit einem hohen Ausmaß an Sequenzidentität oder vollständiger Sequenzidentität mit einer Palindromsequenz mit der Halbseite 5'-GG(T/C)CGGT(A/T)(T/C)G(T/G)-3', wobei es sich um die Konsensussequenz für die Bindung von DNA durch das ArpA-Protein handelt. In diesem Kontext stellt eine hohe Sequenzidentität vorzugsweise eine Sequenzidentität an sieben oder mehr, noch bevorzugter 8 oder mehr, 9 oder mehr oder 10 oder mehr, korrespondierenden Positionen innerhalb der Halbseite dar. Noch bevorzugter besitzt die Palindromsequenz die Halbseite 5'-GGAAGGTATTA-3' (oder eine Variante davon). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der Regulationsabschnitt die Reste 3551 bis 5451 aus 7, oberer Strang (oder eine Variante davon).
Bei dem reprimierbaren Promotor handelt es sich vorzugsweise um einen Promotor eines biosynthetischen Methylenomycin- oder -Regulationsgens.
Noch bevorzugter umfasst der reprimierbare Promotor einen mmyTOG-Promotor oder einen mmy...XCAPK-Promotor oder einen mmfLHP-Promotor oder einen mmyBQE-Promotor oder einen mmyYF-Promotor.
Es wird jedoch auch angenommen, dass andere Promotoren biosynthetischer Methylenomycin-Gene auf dieselbe Art und Weise reguliert werden können wie mmyTOG, mmy...XCAPK und mmfLHP. Dementsprechend kann der reprimierbare Promotor einen Promotor eines beliebigen anderen biosynthetischen Methylenomycin-Gens umfassen, dass durch die mmyR- und/oder die mmfR-Gene und das mmfL-Gen reguliert wird, typischerweise durch das mmyB-Gen vermittelt.
Vorzugsweise umfasst der mmyTOG-Promotor manche oder alle der Reste 5452 bis 5657 aus 7, oberer Strang.
Vorzugsweise umfasst der mmfLHP-Promotor manche oder alle der Reste 4613 bis 4806 aus 7, unterer Strang.
Die mmy...XCAPK-, mmyBQE- und mmyYF-Promotoren müssen erst genau lokalisiert werden. Dies kann jedoch routinemäßig durch das Sequenzieren und die Sequenzanalyse z.B. der Restriktionsfragmente A4.2 und A3.13 erreicht werden (Chater und Bruton (1983)), die verschiedene Teile des mmy...XCAPK-Clusters erhältlich machen, oder durch die Analyse der EMBL-Zugriffsnummer AJ276673. Es wird angenommen, dass der mmy...XCAPK-Promotor manche oder alle der Reste 15404 bis 15977 von EMBL AJ276673 umfasst und dass der mmyBQE-Promotor manche oder alle der Reste 18892 bis 19123 von EMBL AJ276673 umfasst oder dass die mmyBQEDXCAPK-Gene alle aus einem einzelnen Promotor transkribiert sind, der manche oder alle der Reste 18892 bis 19123 von EMBL AJ276673 umfasst. Es wird angenommen, dass der mmyYF-Promotor manche oder alle der Reste 18892 bis 19123 von EMBL AJ276673 umfasst.
Abgesehen vom reprimierbaren Promotor befindet sich die Nucleinsäure von Interesse vorzugsweise nicht zusätzlich in operativer Assoziierung mit einem beliebigen exogenen Promotor, d.h. einem beliebigen Promotor, der nicht von einem Promotor (oder einer Variante davon) abstammt, der/die im Methylenomycin-Gencluster vorhanden ist. Z.B. wird bei der Herstellung der Expressionskassette (oder einer Reihe an Nucleinsäuren) gemäß diesem Aspekt der Erfindung die Nucleinsäure von Interesse vorzugsweise in operative Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor in funktionaler Abwesenheit eines beliebigen Promotors gebracht, mit dem sie zuvor assoziiert gewesen sein könnte (z.B. einem Promotor eines Klonierungsvektors).
Vorzugsweise kodiert das mmyB-Gen für ein MmyB-Polypeptid mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die für dieses Gen in EMBL AJ276673 gezeigt wird. Noch bevorzugter umfasst es das Komplement der Reste 18032 bis 18892 der Nucleinsäuresequenz, die in EMBL AJ276673 gezeigt wird.
Vorzugsweise umfasst das dritte Regulationselement auch einen Promotor, der operativ an das mmyB-Gen gebunden ist. Noch bevorzugter handelt es sich bei dem Promotor, an den das mmyB-Gen gebunden ist, um einen mmyB-Promotor. Noch stärker wird bevorzugt, wenn der Promotor, an den das mmyB-Gen gebunden ist, manche oder alle der Reste 18892 bis 19123 von EMBL AJ276673 umfasst.
Da angenommen wird, dass sie bei der Steuerung der Expression hin zu Kulturen mit hoher Zelldichte unter manchen Fermentationsbedingungen von Bedeutung sein könnten, werden vorzugsweise ein mmfP-Gen und/oder ein mmfH-Gen, vorzugsweise beide, in den/die Regulationsabschnitt(e) inkludiert. In manchen Ausführungsformen, in denen ein mmyLHP-Promotor operativ an die Nucleinsäure von Interesse gebunden ist, können jedoch eines oder mehrere dieser Gene durch die Nucleinsäure von Interesse ersetzt oder zerstört werden.
Wird ein mmyTOG-Promotor verwendet, so ist zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyT-, eines mmyO- und/oder eines mmyG-Gens passenderweise im Regulationsabschnitt vorhanden, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmy- TOG-Promotor. Es kann jedoch insbesondere eine 3'-Trunkierung (rechtes Ende) der kodierenden mmyTOG-Region geben.
Wird ein mmfLHP-Promotor verwendet, so ist zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmfH- und/oder eines mmfP-Gens passenderweise im Regulationsabschnitt vorhanden, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmfLHP-Promotor. Es kann jedoch insbesondere eine 3'-Trunkierung (linkes Ende) der kodierenden mmfLHP-Region geben. Vorzugsweise ein intaktes mmfL-Gen befindet sich ebenfalls in operativer Assoziierung mit demselben mmfLHP-Promotor.
Wird ein mmy...XCAPK-Promotor verwendet, so ist zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyX-, eines mmyC-, eines mmyA-, eines mmyP-, eines mmyK-Gens und/oder eines mmyD-Gens (mmyD ist ein co-transkribiertes Gen, das sich zwischen mmyX und dem mutmaßlichen mmy...XCAPK-Promotor befindet) passenderweise im Regulationsabschnitt vorhanden, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmy...XCAPK-Promotor. Es kann jedoch insbesondere eine 3'-Trunkierung (linkes Ende) der kodierenden mmy...XCAPK-Region geben.
Wird ein mmyBQE-Promotor verwendet, so ist zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyB-, eines mmyQ- und/oder eines mmyE-Gens passenderweise im Regulationsabschnitt vorhanden, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyBQE-Promotor. Es kann jedoch insbesondere eine 3'-Trunkierung (linkes Ende) der kodierenden mmyBQE-Region geben.
Dasselbe trifft mutatis mutandis auf den Fall der Verwendung eines mmyBQEDXCAPK-Promotors zu.
Wird ein mmyYF-Promotor verwendet, so ist zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyY- und eines mmyF-Gens passenderweise im Regulationsabschnitt vorhanden, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyYF-Promotor. Es kann jedoch insbesondere eine 3'-Trunkierung (rechtes Ende) der kodierenden mmyYF-Region geben.
Die Position und die Sequenz der einzelnen Gene mit den mmyDXCAPK-, mmyBQE-(oder mmyBQEDXCAPK-) und mmyYF-Regionen wird in EMBL AJ276673 angeführt. Die Sequenzen der korrespondierenden Promotoren können mittels Sequenzanalyse und/oder Routineexperimenten auf der Basis dieser Sequenzinformationen abgeleitet werden (z.B. unter Verwendung von DNase-Footprinting-Experimenten).
Es wird gewünscht, dass die Nucleinsäure von Interesse in den Regulationsabschnitt insertiert wird, vorzugsweise in ein mmyT-, mmyO- oder mmyG-Gen (wenn ein mmyTOG-Promotor verwendet wird) oder in ein mmyD-, mmyX-, mmyC-, mmyA-, mmyP- oder mmyK-Gen (wenn ein mmy...XCAPK-Promotor verwendet wird) oder in ein mmfH- oder mmfP-Gen (wenn ein mmfLHP-Promotor verwendet wird) oder in ein mmyQ- oder mmyE-Gen (wenn ein mmyBQE-Promotor verwendet wird) oder in ein mmyQ-, mmyE-, mmyD-, mmyX-, mmyC-, mmyA-, mmyP- oder mmyK-Gen (wenn ein mmyBQEDXCAPK-Promotor verwendet wird) oder in ein mmyY- oder mmyF-Gen (wenn ein mmyYF-Promotor verwendet wird).
Die Nucleinsäure von Interesse kann in den Regulationsabschnitt mittels homologer Rekombination insertiert werden (z.B. unter Verwendung eines Vektors, enthaltend ein Fragment der kodierenden Region von mmyTOG, mmy...XCAPK, mmyBQE, mmyBQEDXCAPK, mmyYF oder mmfLHP). Dementsprechend kann der Regulationsabschnitt eine gesamte kodierende Region von mmyTOG, mmy...XCAPK, mmyBQE, mmyBQEDXCAPK, mmyYF oder mmfLHP enthalten, die durch die Nucleinsäure von Interesse unterbrochen ist.
Vorzugsweise kodiert das mmyT-Gen für ein MmyT-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8f oder eine Variante davon. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 5676 bis 6401 aus 7, oberer Strang.
Vorzugsweise kodiert das mmyO-Gen für ein MmyO-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8g. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 6432 bis 7553 aus 7, oberer Strang.
Vorzugsweise kodiert das mmyG-Gen für ein MmyG-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8h. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 7636 bis 8817 aus 7, oberer Strang.
Vorzugsweise kodiert das mmfL-Gen für ein MmfL-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8d. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 3551 bis 4612 aus 7, unterer Strang.
Vorzugsweise kodiert das mmfH-Gen für ein MmfH-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8c. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 3554 bis 2352 aus 7, unterer Strang.
Vorzugsweise kodiert das mmfP-Gen für ein MmfP-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8b. Noch bevorzugter umfasst es die Reste 3554 bis 1558 aus 7, oberer Strang.
Dasselbe trifft mutatis mutandis auf die mmyDXCAPK-, mmyBQE- und mmyYF-Gene zu, basierend auf den jeweiligen Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen, die in EMBL AJ276673 angeführt sind.
Die Nucleinsäure von Interesse ist vorzugsweise heterolog, d.h. mit einer Sequenz, die in dem 9,5-kb-Abschnitt der neu sequenzierten DNA nicht vorhanden ist oder nicht davon abstammt, noch bevorzugter ist sie im biosynthetischen Methylenomycin-Gencluster nicht vorhanden oder stammt nicht davon ab.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst/umfassen der/die Regulationsabschnitt(e) ein mmfR-Gen und ein mmfL-Gen mit dem mmfL-Promotor als reprimierbarem Promotor (die Nucleinsäure kann z.B. in das mmfH- oder das mmfP-Gen stromab von mmfL unter der Kontrolle des mmfLHP-Promotors insertiert werden).
In einer noch bevorzugteren Ausführungsform umfasst/umfassen der/die Regulationsabschnitt(e) ein mmfR-Gen, ein mmfL-Gen und ein mmyR-Gen mit dem mmyB- Promotor als reprimierbarem Promotor (die Nucleinsäure kann z.B. in das mmyB-, mmyQ- oder das mmyE-Gen unter der Kontrolle des mmyB-Promotors insertiert werden).
In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst/umfassen der/die Regulationsabschnitt(e) ein mmfR-Gen, ein mmfL-Gen und ein mmyR-Gen mit dem mmy-TOG-Promotor, dem mmyDXCAPK- oder dem mmyYF-Promotor als reprimierbarem Promotor, wobei diese(r) Regulationsabschnitt(e) zur Verwendung in Gegenwart eines mmyB-Gens geeignet sind (entweder als ein dritter Regulationsabschnitt oder als ein anderer Teil des Expressionssystems).
In einer hochgradig bevorzugten Ausführungsform kann/können der/die Regulationsabschnitt(e) eine Nucleinsäure mit der Sequenz von Rest 796 bis zu einem Rest zwischen 5676 und 8817 (inklusive) aus 7 umfassen (oder eine Variante davon). Falls doppelsträngig, enthält diese Nucleinsäure mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene und intergenische Regionen zwischen diesen Genen sowie zumindest eine Region, die einen mmyTOG-Promotor enthält (d.h. die Region stromauf von mmyT), sowie gegebenenfalls manche oder alle einer kodierenden mmyTOG-Region. Die Nucleinsäure von Interesse kann anschließend in operativer Assoziierung mit dem mmyTOG-Promotor in die oder stromab der mmyTOG-Region (oder einen Teil davon) insertiert werden.
In einer weiteren hochgradig bevorzugten Ausführungsform kann/können der/die Regulationsabschnitt(e) eine Nucleinsäure mit der Sequenz von Rest 796 bis Rest 5451 (inklusive) aus 7 umfassen (oder eine Variante davon). Falls doppelsträngig, enthält diese Nucleinsäure mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene und intergenische Regionen zwischen diesen Genen. Die Nucleinsäure von Interesse kann anschließend in operativer Assoziierung mit dem mmfLHP-Promotor in die mmfHP-Region insertiert werden.
Es wird in Betracht gezogen, dass Elemente, die zur Promotoraktivität beitragen (z.B. Enhancer-Elemente) außerhalb der oben beschriebenen, nicht kodierenden interge nischen Regionen liegen können. Dementsprechend wird es besonders bevorzugt, wenn sich die intergenischen Promotor-Regionen in ihrer natürlichen unmittelbaren Umgebung befinden, d.h. zwischen Genen (oder Teilen von Genen), die sie normalerweise flankieren. Dementsprechend werden besonders Ausführungsformen bevorzugt, die eine Kassette verwenden, die eine intakte mmyR-mmf-mmyTOG-Region enthält, gegebenenfalls mit einer Zerstörung von oder einer 3'-Trunkierung (rechtes Ende) der mmyTOG-Region.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der eine Expressionskassette gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Weiters stellt sie eine Reihe an Vektoren bereit, umfassend eine Reihe an Nucleinsäuren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung.
Geeignete Vektoren, die eine Nucleinsäure zur Einführung in Bakterien umfassen, können ausgewählt oder konstruiert werden, enthaltend geeignete zusätzliche Regulationselemente, falls notwendig, unter anderem zusätzliche Promotoren, Terminatorfragmente, Enhancerelemente, Markergene und andere Elemente je nach Eignung. Vektoren können Plasmide sein, viral, z.B. „Phagen-", oder „Phagemid-", je nach Eignung. Für weitere Details siehe z.B. Sambrook et al. (1989). Viele bekannte Verfahren und Arbeitsvorschriften zur Manipulierung von Nucleinsäuren, z.B. zur Herstellung von Nucleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einführung von DNA in Zellen und Genexpression, sowie zur Analyse von Proteinen sind ausführlich in Ausubel et al. (1992) beschrieben. Viele Aspekte der Verwendung dieser Verfahren im Kontext von Streptomyces-Spezies sind ausführlich in Hopwood et al. (1985) und Kieser et al. (2000) beschrieben.
In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Expressionssystem bereit, umfassend eine Expressionskassette oder eine Reihe an Nucleinsäuren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung, sowie ein Expressionssystem, umfassend einen Vektor gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Expressionssystem um eine Wirtszelle, obwohl auch zellfreie Expressionssysteme in Betracht gezogen werden. Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Bakterium, noch bevorzugter ein Aktinomycet, noch stärker bevorzugt ein Streptomycet. Insbesondere wurde gezeigt (siehe Beispiele), dass die Erfindung mit Erfolg in anderen Streptomyceten-Stämmen als S. coelicolor angewandt werden kann, wie auf Basis der Übertragbarkeit des Plasmids SCP1 erwartet wurde.
Das Expressionssystem (normalerweise eine native oder gentechnisch veränderte Wirtszelle) enthält vorzugsweise ein mmyB-Gen, noch stärker bevorzugt als einen zusätzlichen Teil des Vektorsystems, das verwendet wird, um die Expressionskassette/Reihe an Nucleinsäuren einzuführen. Es wird jedoch auch in Betracht gezogen, dass das mmyB-Gen z.B. als Teil des Wirtszellengenoms und/oder auf einem Plasmid, z.B. SCP1 oder pSV1, vorhanden sein kann, auch innerhalb des Expressionssystems vorhanden. Dies ist eine weniger bevorzugte Ausführungsform, da andere Methylenomycin-Genpromotoren das mmyB-Genprodukt maskieren können, wodurch seine Wirksamkeit bei der Vermittlung der Expression aus der Expressionskassette/Reihe an Nucleinsäuren reduziert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform fehlt dem Expressionssystem die Fähigkeit, das Codon TTA (UUA in mRNA) zu translatieren, und der Expressionskassette, der Reihe an Nucleinsäuren oder Vektor(en) fehlen TTA-Codons, und/oder es wurde modifiziert, um ein oder mehrere (vorzugsweise alle) natürlich auftretenden TTA-Codons zu eliminieren. Das Expressionssystem ist z.B. vorzugsweise eine Zelle eines bldA-Mutantenstamms von Streptomyces, und die Expressionskassette enthält vorzugsweise eine Variante des mmfL-Gens, bei dem das natürlich auftretende TTA-Codon (z.B. durch ortsspezifische Mutagenese) in ein anderes, für Leucin kodierendes Codon verändert wurde. Das in diesem System inkludierte mmyB-Gen wurde auch vorzugsweise auf ähnliche Art und Weise verändert (unabhängig davon, ob als Teil einer Expressionskassette oder Teil des Wirtszellengenoms oder auf einem Plasmid, das auch im System vorhanden ist), so dass sein TTA-Codon zu einem anderen, für Leucin kodierenden Codon verändert wurde (siehe Beispiel 10). Dies bringt den Vorteil mit sich, besonders bei Streptomyces-Spezies, dass die Expressi on der Nucleinsäure von Interesse mit reduzierter Expression anderer Produkte (z.B. Antibiotika) erreicht werden kann, die andernfalls auch bei hoher Zelldichte durch bldA-abhängige Mechanismen exprimiert würden; d.h. dieses System stellt einen sauberen Hintergrund für die Expression der Nucleinsäure von Interesse dar. Ein oder mehrere TTA-Codons sind in den biosynthetischen Genclustern für die meisten Streptomyces-Antibiotika vorhanden, insbesondere in signalwegspezifischen Regulationsgenen. TTA-Codons sollten nicht in Genen vorhanden sein, deren Expression in einem bldA-Mutantenwirt ausgeführt wird. Unter manchen Umständen kann es erforderlich sein, ortsspezifische Mutagenese zu verwenden, um ein TTA-Codon in ein anderes Leucin-Codon umzuwandeln.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Anzahl der reprimierbaren Promotoren, die im Expressionssystem vorhanden sind, limitiert. Dies kann die expressionseinschränkende Maskierung von mmyB-Genprodukt durch andere Promotoren als den reprimierbaren Promotor, der die Expression der Nucleinsäure von Interesse kontrolliert, reduzieren. Solch eine Einschränkung kann das Fehlen des SCP1-Plasmids und/oder des pSV1-Plasmids im Expressionssystem involvieren (obwohl in solchen Fällen das mmyB-Gen vorzugsweise anderweitig im Expressionssystem vorhanden ist).
Zusätzlich oder alternativ dazu können der Expressionskassette/Reihe an Nucleinsäuren andere reprimierbare Promotoren als der Promotor fehlen, der die Expression der Nucleinsäure von Interesse steuert (Promotoren, welche die Expression anderer Gene der Expressionskassette/Reihe an Nucleinsäuren steuern, können zu diesem Zweck jedoch als nicht reprimierbare Promotoren angesehen werden, der mmyTOG-Promotor kann z.B. die Expression der Nucleinsäure von Interesse steuern, und die mmfL- und mmyB-Gene können durch ihre nativen Promotoren gesteuert werden). Dieses Fehlen kann relativ (d.h. es gibt weniger reprimierbare Promotoren als im nativen Methylenomycin-Cluster), beträchtlich oder vollständig sein.
Die Einführung der Expressionskassette, der Reihe an Nucleinsäuren oder Vektor(en) in eine Wirtszelle, die (besonders bei der In-vitro-Einführung) allgemein ohne Einschränkung als „Transformation" bezeichnet werden kann, kann unter Anwendung eines beliebigen verfügbaren Verfahrens erfolgen. Bei bakteriellen Zellen können geeignete Verfahren die Calciumchloridtransformation, die polyethylenglykolassistierte Transformation, die Elektroporation, die Konjugation und die Transfektion oder die Transduktion unter Verwendung von Bakteriophagen umfassen.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei das Verfahren das Bereitstellen einer Wirtszelle (oder eines anderen Expressionssystems) entsprechend den bevorzugten Ausführungsformen des dritten Aspekts sowie das Züchten der Wirtszelle, um die Nucleinsäure von Interesse zu exprimieren, umfasst.
Die Nucleinsäure von Interesse wird vorzugsweise nur dann in beträchtlichem Ausmaß exprimiert, wenn die Wirtszellenkultur eine hohe Zelldichte erreicht, noch bevorzugter in der oder nahe der stationären Phase der Wirtszellenkultur. Zellkulturen in der oder nahe der stationären Phase können OD₆₅₀-Werte im Bereich von 1-20 aufweisen.
Bekannte Verfahren zum Züchten von Zellen sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt, z.B. aus Sambrook et al. (1989), Ausubel et al. (1992) und (insbesondere für Streptomyces-Spezies) Hopwood et al. (1985) und Kieser et al. (2000).
In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse bereit, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
die Bereitstellung eines/von Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitten in einem Expressionssystem wie im ersten Aspekt definiert;
die Bereitstellung der Nucleinsäure von Interesse im Expressionssystem;
die operative Assoziierung der Nucleinsäure von Interesse mit dem reprimierbaren Promotor des/der Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitte; und
die Expression der Nucleinsäure von Interesse in dem Expressionssystem.
Die Schritte des Verfahrens müssen nicht in der angeführten Reihenfolge durchgeführt werden. Insbesondere kann die operative Assoziierung vor der Einführung des/der Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitte und der Nucleinsäure von Interesse in das Expressionssystem auftreten.
Die bevorzugten Merkmale, die für den/die Regulationsabschnitt(e) im Kontext des ersten Aspekts der Erfindung spezifiziert werden, können auch in dem/den Regulationsabschnitt(en) vorhanden sein, der/die in diesem Aspekt verwendet wird/werden. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Expressionssystem um eine Zelle, noch bevorzugter um ein Bakterium, noch bevorzugter um einen Aktinomycet und insbesondere um einen Streptomycet. Das Expressionssystem enthält vorzugsweise ein mmyB-Gen, das zusammen mit der Regulationskassette eingeführt werden kann. Die Zelle wird vorzugsweise zur Expression der Nucleinsäure von Interesse gezüchtet.
Die Nucleinsäure von Interesse kann auf verschiedenen Wegen in operative Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor gebracht werden. Die Nucleinsäure von Interesse kann z.B. stromab des reprimierbaren Promotors in ein Nucleinsäuremolekül insertiert werden, das den reprimierbaren Promotor enthält (6c und 6d). In einem bevorzugten Beispiel ist der reprimierbare Promotor ein mmyTOG-Promotor, und die Insertionsstelle liegt in einer mmyTOG-Region.
Alternativ dazu kann der Regulationsabschnitt in eine Nucleinsäure insertiert werden, welche die Nucleinsäure von Interesse enthält, z.B. zur homologen Rekombination (6b). Daher kann ein Fragment aus dem 5'-Ende der Nucleinsäure von Interesse stromab von und in operativer Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor inkludiert werden, um die homologe Rekombination des Regulationsabschnitts in die Nucleinsäure von Interesse zu ermöglichen.
Dieses Verfahren kann vorteilbringend in einer bldA-Mutanten-Streptomyces- oder einer anderen Aktinomyces-Wirtszelle mit einem oder mehreren Regulationsabschnitten (und vorzugsweise einem mmyB-Gen), dem/den TTA-Codons fehlen, verwendet werden, um die Expression einer Nucleinsäure von Interesse zu regulieren, die gegenüber der Wirtszelle nativ ist und die vorzugsweise die Produktion eines Antibiotikums verleiht. Diese Ausführungsform besitzt den Vorteil, dass andere Antibiotika, die von der Wirtszelle kodiert werden, allgemein nicht exprimiert werden, da die wegspezifischen Regulationsgene für die Produktion solch anderer Antibiotika in Streptomyces typischerweise ein TTA-Codon umfassen. In einem bevorzugten Expressionssystem, S. coelicolor A(3)2, enthalten z.B. bedeutende wegspezifische Regulationsgene eines jeden der beiden bekannten chromosomal positionierten Antibiotikawege TTA-Codons, und eine bldA-Mutante stellt daher keines dieser Antibiotika in typischem Kulturmedium her (Fernandez-Moreno et al. (1991), White und Bibb (1997)).
Die Expressionsprodukte der Nucleinsäuren von Interesse des vierten und fünften Aspekts können gesammelt und gereinigt werden. Dies kann durch herkömmliche Verfahren erreicht werden. Siehe z.B. McDaniel et al. (1993).
Ist die Nucleinsäure von Interesse z.B. ein biosynthetischer Gen-Cluster, so können sowohl das Endprodukt der Biosynthese als auch die biosynthetischen Enzyme selbst als das Expressionsprodukt angesehen werden, es kommt jedoch häufiger vor, dass das Endprodukt als das Expressionsprodukt angesehen wird.
In einem sechsten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung daher ein Expressionsprodukt bereit, das gemäß dem Verfahren von entweder dem vierten oder dem fünften Aspekt der Erfindung hergestellt wurde.
Die Nucleinsäure von Interesse kann eine beliebige Nucleinsäure sein. Bevorzugte Nucleinsäuren sind Gene, deren Expression erwünscht ist, oder Gen-Cluster, die z.B. für Enzyme kodieren, die für die Biosynthese von z.B. Antibiotika erforderlich sind. Gen-Cluster können eine Vielzahl an Genen innerhalb desselben Transkripti onspromotors aufweisen, um die Expression aller Gene des Clusters aus dem reprimierbaren Promotor zu ermöglichen. Alternativ dazu kann die Nucleinsäure von Interesse eine unbekannte Nucleinsäure sein, die untersucht werden soll, z.B. eine Nucleinsäure, die aus einer Probe, etwa dem Boden, stammt.
In einem siebenten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das ein mmyR- und/oder ein mmfR-Gen, ein mmfL-Gen sowie einen reprimierbaren Promotor umfasst, alles wie im ersten Aspekt definiert, worin das Molekül zur Regulation der Expression einer Nucleinsäure von Interesse in der Lage ist, wenn diese Nucleinsäure in operativer Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor angeordnet ist.
Dieselben bevorzugten und gegebenenfalls vorhandenen Merkmale treffen auf diesen Aspekt zu, genauso wie sie auf den ersten Aspekt zutreffen.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Molekül dieses Aspekts um ein anderes als plJ519, wie in Chater und Bruton (1985) offenbart, und/oder es besteht nicht aus dem oder inkludiert das 350-kb-SCP1-Plasmid von Streptomyces coelicolor und/oder das pSV1-Plasmid aus Streptomyces violaceoruber. Solche Plasmide können jedoch zusammen mit dem Molekül dieses Aspekts verwendet werden (z.B. um ein mmyB-Gen bereitzustellen).
Das Molekül besteht vorzugsweise im Wesentlichen aus einem DNA-Abschnitt von etwa 4,8 bis 8 kb, umfassend mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene und zumindest einen Abschnitt von zumindest einem eines mmyT-Gens, eines mmyO-Gens und eines mmyG-Gens. Noch bevorzugter umfasst das Molekül die gesamten mmyT- und mmyO-Gene und zumindest einen Abschnitt des mmyG-Gens.
Das Molekül besteht vorzugsweise im Wesentlichen aus der Nucleinsäure mit der Sequenz von Rest 796 bis zu einem Rest zwischen 5676 und 8817 (noch bevorzugter zwischen 7636 und 8817) aus 7.
In einer alternativen Ausführungsform besteht das Molekül im Wesentlichen aus einem Nucleinsäure-Abschnitt, umfassend mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene in Kombination mit einem Nucleinsäure-Abschnitt, umfassend einen mmy...XCAPK-Promotor und zumindest einen Abschnitt von zumindest einem eines mmyD-Gens, eines mmyX-Gens, eines mmyC-Gens, eines mmyA-Gens, eines mmyP-Gens, eines mmyK-Gens.
In einer alternativen Ausführungsform besteht das Molekül im Wesentlichen aus einem DNA-Abschnitt von etwa 5 kb, umfassend mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene.
Zusätzlich zu den definierten DNA-Abschnitten umfasst das Molekül vorzugsweise ein mmyB-Gen.
In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das im Wesentlichen aus einem oder mehreren eines mmyR-Gens, eines mmfP-Gens, eines mmfH-Gens, eines mmfL-Gens (bei dem vorzugsweise ein natürlich auftretendes TTA-Codon zu einem anderen (vorzugsweise für Leucin kodierenden) Codon verändert wurde), eines mmfR-Gens, eines mmyT-Gens, eines mmyO-Gens und eines mmyG-Gens, gegebenenfalls mit einer jeweiligen stromauf gelegenen Region oder jeweiligen stromauf gelegenen Regionen, besteht, worin:
das mmyR-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren);
das mmfR-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist;
das mmfL-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist;
das mmyT-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8f aufweist;
das mmyG-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8g aufweist;
das mmyG-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8h aufweist;
das mmfP-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8b aufweist;
das mmfH-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8c aufweist.
Wo vorhanden, kann/können die stromauf gelegene(n) Region(en) Promotoren (vorzugsweise wie zuvor definiert) für die Gene umfassen. Sind zwei oder mehr Gene vorhanden, so kann eine stromauf gelegene Region für eines oder mehrere jener Gene in einer intergenischen Region bereitgestellt werden.
Die Gene können wie zuvor definiert sein.
In einem neunten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem oder mehreren Nucleinsäuremolekülen, wie in einem beliebigen des siebenten oder achten Aspekts definiert, in der oder für die Regulierung der Expression einer Nucleinsäure von Interesse in einem Expressionssystem bereit.
In einem zehnten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das von einem der folgenden Gene kodierbar ist: einem mmyR-Gen, einem mmfP-Gen, einem mmfH-Gen, einem mmfL-Gen, einem mmfR-Gen, einem mmyT-Gen, einem mmyO-Gen und einem mmyG-Gen, worin:
das mmyR-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren);
das mmfR-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist;
das mmfL-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist;
das mmyT-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8f aufweist;
das mmyO-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8g aufweist;
das mmyG-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8h aufweist;
das mmfP-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8b aufweist;
das mmfH-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8c aufweist.
Das Polypeptid wird vorzugsweise im Wesentlichen aus anderen Proteinen isoliert, mit denen es natürlich assoziiert ist.
Das Polypeptid besitzt vorzugsweise eine Aminosäuresequenz, wie sie in einer der 8a bis 8h dargestellt wird. Dieser Aspekt stellt jedoch auch Polypeptide bereit, die Varianten jener Aminosäuresequenzen sind.
In einem elften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Vektor bereit, der eine Nucleinsäure entsprechend dem siebenten oder achten Aspekt umfasst. In Ausführungsformen des siebenten und achten Aspekts, in denen der Nucleinsäure ein Promotor oder Promotoren für das Gen oder die Gene, das/die sie enthält, fehlt/fehlen, umfasst der Vektor vorzugsweise einen Promotor in operativer Assoziierung mit diesem Gen oder jenen Genen.
In einem zwölften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Expressionssystem, das eine oder mehrere Nucleinsäuren entsprechend dem siebenten oder achten Aspekt enthält, sowie ein Expressionssystem, enthaltend einen Vektor entsprechend dem elften Aspekt, bereit.
Das Expressionssystem ist vorzugsweise eine Zelle. Wird es gewünscht, das von der Nucleinsäure kodierte Polypeptid lediglich zu exprimieren anstatt z.B. die Expression einer anderen Nucleinsäure von Interesse zu regulieren, so kann eine beliebige geeignete Zelle verwendet werden (z.B. ein Standard-E.-coli-Überexpressionssystem). Siehe z.B. Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1992). Andernfalls werden bakterielle, Aktinomyceten- und Streptomyceten-Zellen bevorzugt, wie zuvor angegeben.
In einem dreizehnten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß dem zehnten Aspekt bereit, wobei das Verfahren die Herstellung des Polypeptids in einem Expressionssystem gemäß dem zwölften Aspekt umfasst.
Das Polypeptid kann durch herkömmliche Verfahren aus dem Expressionssystem gereinigt werden.
Verweise hierin auf Gene, kodierende Regionen und Nucleinsäuren sind nicht als auf Gene, kodierende Regionen und Nucleinsäuren eingeschränkt anzusehen, welche die spezifischen, hierin oder in EMBL AJ276673 offenbarten Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Gene, kodierende Regionen und Nucleinsäuren mit Varianten dieser Se quenzen sind vielmehr ebenfalls inkludiert. Gene, kodierende Regionen und Nucleinsäuren mit solchen spezifischen Sequenzen sind bevorzugte Ausführungsformen. Daher ist z.B. ein Verweis auf „ein mmfR-Gen" nicht als auf ein Gen mit der Sequenz von Rest 4807 bis Rest 5451 aus 7 beschränkt anzusehen, sondern er umfasst auch Varianten.
Auf ähnliche Art und Weise sind hierin enthaltene Verweise auf Polypeptide nicht als auf Polypeptide mit den spezifischen, hierin oder in EMBL AJ276673 offenbarten Aminosäuresequenzen beschränkt anzusehen. Polypeptide mit Varianten jener Sequenzen sind vielmehr ebenfalls inkludiert. Polypeptide mit solchen spezifischen Sequenzen sind bevorzugte Ausführungsformen. Daher ist z.B. ein Verweis auf „ein MmfR-Polypeptid" nicht als auf ein Polypeptid mit der in 8e dargestellten Aminosäuresequenz beschränkt anzusehen, sondern er umfasst auch Varianten.
Verweise hierin auf Promotoren sind nicht als auf Nucleinsäuren eingeschränkt anzusehen, welche die Sequenz der gesamten oder eines Teils einer spezifischen intergenischen Region aufweisen, die hierin oder in EMBL AJ276673 offenbart ist. Wiederum sind auch Promotoren mit Varianten jener intergenischen Sequenzen inkludiert, und die spezifischen intergenischen Sequenzen (oder Teile davon) stellen bevorzugte Ausführungsformen dar. Daher ist z.B. ein Verweis auf einen „mmyTOG-Promotor" nicht als auf den spezifischen, hierin offenbarten mmyTOG-Promotor (d.h. eine Nucleinsäure mit der gesamten oder einem Teil der Sequenz von Rest 5452 bis 5675 aus 7, oberer Strang) beschränkt anzusehen, sondern er umfasst auch Varianten.
In allen Fällen ist, wenn eine bevorzugte Ausführungsform eines Gens, einer Nucleinsäure, eines Polypeptids oder eines Promotors durch Verweis auf eine spezifische Sequenz definiert wird, die Erfindung in ihrem weiter gefassten Sinn so zu verstehen, dass sie Ausführungsformen mit Varianten dieser spezifischen Sequenz umfasst.
Der Ausdruck „Variante", wie hierin in Bezug auf eine bestimmte Nucleinsäure (die Bezugs-Nucleinsäure) verwendet, bezeichnet: eine beliebige Nucleinsäure mit einer Sequenz, die sich von jener der Bezugs-Nucleinsäure unterscheidet, die jedoch ihr Komplement darstellt oder die eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität mit der oder eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen an die Bezugs-Nucleinsäure oder ihr(em) Komplement oder ein Fragment der Bezugs-Nucleinsäure oder ihres Komplements zeigt; oder eine beliebige Nucleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz kodiert, die eine signifikante Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz aufweist, die von der Bezugs-Nucleinsäure kodiert wird, oder ein Fragment dieser Nucleinsäure. Der Ausdruck „Variante" betrifft auch Nucleinsäuren, die sich lediglich aufgrund der Degeneration des genetischen Codes voneinander unterscheiden und die daher für identische, abgeleitete Aminosäuresequenzen kodieren.
Der Ausdruck „Variante", wie hierin in Bezug auf ein bestimmtes Polypeptid (das Bezugs-Polypeptid) verwendet, bezeichnet: ein beliebiges Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der Aminosäuresequenz des Bezugs-Polypeptids unterscheidet, jedoch eine signifikante Aminosäuresequenzidentität damit aufweist, oder ein Fragment dieses Polypeptids.
Falls nicht anders angegeben, liegt eine signifikante Aminosäuresequenzidentität vorzugsweise bei zumindest 80%, noch bevorzugter bei 85%, 90% oder 95%, noch bevorzugter bei 98% oder 99% und/oder eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität liegt vorzugsweise bei zumindest 50%, noch bevorzugter bei 60%, 70%, 80% oder 90%, noch bevorzugter bei 95%, 98% oder 99%.
Eine signifikante Aminosäuresequenzidentität wird vorzugsweise zwischen der Polypeptidvariante (oder einem Abschnitt davon) und einem Fragment von zumindest 10 Aminosäuren des Bezugs-Polypeptids, noch bevorzugter einem Fragment von zumindest 20, 30 oder 40 Aminosäuren, noch bevorzugter einem Fragment von 60, 80 oder 100 Aminosäuren, noch bevorzugter dem gesamten Bezugs-Polypeptid dargestellt.
Eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität wird vorzugsweise zwischen der Nucleinsäurevariante (oder einem Abschnitt davon) und einem Fragment von zumindest 30 Resten der Bezugs-Nucleinsäure, noch bevorzugter einem Fragment von zumindest 60, 90 oder 120 Resten, noch bevorzugter einem Fragment von 180, 240 oder 300 Aminosäuren, noch bevorzugter der gesamten Bezugs-Nucleinsäure, dargestellt.
In Bezug auf Varianten des hierin offenbarten, spezifischen mmyR-Gens oder seines Produkts, MmyR, wird eine signifikante Aminosäuresequenzidentität vorzugsweise mit den Resten 40 bis 49 aus 8a, noch bevorzugter den Resten 38 bis 49, noch bevorzugter den Resten 38 bis 56, noch bevorzugter den Resten 38 bis 59, noch bevorzugter den Resten 21 bis 59, noch bevorzugter den Resten 3 bis 59 dargestellt, und/oder eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität wird vorzugsweise mit entsprechenden Abschnitten aus 7 dargestellt, die für die oben genannten Aminosäurereste kodieren.
In Bezug auf Varianten des hierin offenbarten, spezifischen mmfR-Gens oder seines Produkts, MmfR, wird eine signifikante Aminosäuresequenzidentität vorzugsweise mit den Resten 61 bis 70 aus 8e, noch bevorzugter den Resten 59 bis 70, noch bevorzugter den Resten 59 bis 77, noch bevorzugter den Resten 59 bis 80, noch bevorzugter den Resten 42 bis 80, noch bevorzugter den Resten 24 bis 80 dargestellt, und/oder eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität wird vorzugsweise mit entsprechenden Abschnitten aus 7 dargestellt, die für die oben genannten Aminosäurereste kodieren.
In Bezug auf Varianten des hierin offenbarten, spezifischen mmfL-Gens oder seines Produkts, MmfL, wird eine signifikante Aminosäuresequenzidentität vorzugsweise mit den Resten 77 bis 87 und/oder den Resten 240 bis 255 aus 8d, noch bevorzugter den Resten 77 bis 95 und/oder den Resten 231 bis 255, noch bevorzugter den Resten 77 bis 107 und/oder den Resten 223 bis 255 dargestellt, und/oder eine signifikante Nucleinsäuresequenzidentität wird vorzugsweise mit entsprechenden Abschnitten aus 7 dargestellt, die für die oben genannten Aminosäurereste kodieren.
„Prozent (%) der Aminosäuresequenzidentität” wird als der Prozentsatz der Aminosäurereste in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Aminosäureresten in der Sequenz, mit der sie verglichen wird, identisch sind, und zwar nach dem Anordnen der Sequenzen und dem Einführen von Lücken, falls notwendig, um den maximalen Prozentsatz der Sequenzidentität zu erreichen, wobei etwaige konservative Substitutionen als Teil der Sequenzidentität nicht in Betracht gezogen werden. Die hierin verwendeten%-Identitätswerte werden von WU-BLAST-2 generiert, erhalten von Altschul et al. (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html. WU-BLAST-2 verwendet mehrere Suchparameter, von denen die meisten auf die Standardwerte eingestellt sind. Die anpassbaren Parameter werden mit den folgenden Werten eingestellt: Überlappungsspanne = 1, Überlappungsfraktion = 0,125, Wortschwelle (T) = 11. Die HSPS- und HSPS2-Parameter sind dynamische Werte und werden vom Programm selbst in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der bestimmten Sequenz und der Zusammensetzung der bestimmten Datenbank, die nach der Sequenz von Interesse durchsucht wird, festgelegt; die Werte können jedoch angepasst werden, um die Empfindlichkeit zu steigern. Ein %-Aminosäuresequenzidentitätswert wird durch die Anzahl an übereinstimmenden identischen Resten, dividiert durch die Gesamtanzahl der Reste der „längeren" Sequenz in der angeordneten Region, mit 100 multipliziert, bestimmt. Die „längere" Sequenz ist diejenige mit den meisten tatsächlichen Resten in der angeordneten Region (Lücken, die von WU-BLAST-2 eingeführt wurden, um das Bewertung der Anordnung zu maximieren, werden ignoriert).
„Prozent (%)Nucleinsäuresequenzidentität" wird als der Prozentsatz der Nucleotidreste in einer Kandidatensequenz definiert, die mit den Nucleotidresten in der Vergleichssequenz identisch sind. Die hierin verwendeten Identitätswerte wurden durch das BLASTN-Modul von WU-BLAST-2, eingestellt auf die Standardparameter mit einer Überlappungsspanne und einer Überlappungsfraktion von 1 bzw. 0,125, generiert.
In Bezug auf die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotorvarianten wird die Nucleinsäuresequenzidentität vorzugsweise über eine Sequenz von etwa 30 Resten, noch bevorzugter 40 oder 50 Resten, noch bevorzugter 60 Resten, unter sucht. Daher können z.B. bevorzugte Varianten des in der Ausführungsform enthaltenen mmyTOG-Promotors Sequenzen besitzen, die 80% (oder mehr) Sequenzidentität über eine Sequenz von 30 (oder mehr) Resten innerhalb der Reste 5452 bis 5675 aus 7, oberer Strang, aufweisen.
„Stringente Bedingungen" oder „hochgradig stringente Bedingungen", wie hierin definiert, können dadurch identifiziert werden, dass sie: (1) eine niedrige Ionenstärke und eine hohe Temperatur zum Waschen verwenden, z.B. 0,015 M Natriumchlorid/0,0015 M Natriumcitrat/0,1% Natriumdodecylsulfat bei 50°C; (2) während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel verwenden, wie z.B. Formamid, z.B. 50 Vol.-% Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 6,5 mit 750 mM Natriumchlorid, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C; oder (3) 50% Formamid, 5 × SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 0,1% Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardt-Lösung, beschallte Lachsspermien-DNA (50 μg/ml), 0,1% SDS und 10% Dextransulfat bei 42°C verwenden, mit Waschschritten bei 42°C in 0,2 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 50% Formamid bei 55°C, gefolgt von einem hochgradig stringenten Waschschritt, bestehend aus 0,1 × SSC, enthaltend EDTA, bei 55°C.
Ist eine Nucleinsäure von Interesse in „operativer Assoziierung" mit einem Promotor, so ist der Promotor in der Lage, die Transkription der Nucleinsäure von Interesse in einem geeigneten Expressionssystem zu steuern, wobei sich die Nucleinsäure von Interesse zur Translation in dem korrekten Leseraster befindet. Befindet sich eine Nucleinsäure von Interesse in operativer Assoziierung mit einem Promotor, so enthält das Transkript der Nucleinsäure von Interesse vorzugsweise eine auf geeignete Art und Weise positionierte Ribosomenbindungsstelle zur Expression in einem geeigneten Expressionssystem des Polypeptids, das von der Nucleinsäure von Interesse kodiert wird. Siehe z.B. Sambrook et al. (1989) und Ausubel et al. (1992).
Varianten der Gene, kodierenden Regionen, Nucleinsäuren, Polypeptide und Promotoren, die hierin spezifisch offenbart sind, besitzen vorzugsweise dieselbe Funktion wie jene, die spezifisch offenbart werden. In Bezug auf die mmyR-, mmfR- und mmfL-Gene kann eine solche Funktion für ein MmyR-, MmfR- bzw. MmfL-Polypeptid kodieren; in Bezug auf die MmyR-, MmfR- und MmfL-Polypeptide und den reprimierbaren Promotor (z.B. den mmyTOG-Promotor, den mmy...XCAPK-Promotor oder den mmfLHP-Promotor) kann eine solche Funktion die Fähigkeit darstellen, miteinander gemäß dem oben angeführten Modell in Wechselwirkung zu stehen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „mmyTOG" eine Nucleinsäure, die mmyT-, mmyO- und mmyG-Gene umfasst. Dasselbe trifft mutatis mutandis auf „mmy...XCAPK" zu, wobei die Punkte auf das zuvor nicht identifizierte mmyD-Gen stromauf von mmyX in derselben Transkriptionseinheit hinweisen, und möglicherweise auf die mmyB-, mmyQ- und mmyE-Gene, obwohl diese eine separate Transkriptionseinheit unter der Steuerung eines anderen (mmyBQE) Promotors bilden können. „mmyBQE" bezeichnet eine Nucleinsäure, die mmyB-, mmyQ- und mmyE-Gene umfasst. „mmyBQEDXCAPK" bezeichnet eine Nucleinsäure, die mmyBQE und mmyDXCAPK umfasst. „mmyYF" bezeichnet eine Nucleinsäure, die mmyY- und mmyF-Gene umfasst. „mmf" bezeichnet eine Nucleinsäure, die mmfP- mmfH-, mmfL- und mmfR-Gene umfasst. „mmfLHP" bezeichnet eine Nucleinsäure, die mmfL- mmfH-, mmfP-Gene umfasst. „mmyR-mmf-mmyTOG" bezeichnet eine Nucleinsäure, die ein mmyR-Gen und mmf und mmyTOG umfasst. Der „mmy...XCAPK-Promotor" kann ein Promotor sein, der die Transkription von mmyBQEDXCAPK steuert, oder ein Promotor, der nur die Transkription von mmyDXCAPK steuert.
Die Erfindung wird nun in ihren verschiedenen Aspekten ausführlich beschrieben, wobei auf die folgenden Figuren verwiesen wird, die Folgendes zeigen:
1 zeigt den Ursprung des Regulationsabschnitts.

(a) Das Genom von Streptomyces coelicolor A3(2) besteht aus einem linearen Chromosom und zwei Plasmiden – dem zirkulären SCP2 und dem linearen SCP1.
(b) Die Methylenomycin-Produktionsgene bilden einen großen Gen-Cluster auf dem SCP1-Plasmid (Chater und Bruton (1985); Redenbach et al. (1998)).
(c) Etwa 25 kb DNA umfassen Regulations-, Resistenz- und biosynthetische Gene, die mit der Methylenomycin-Produktion assoziiert sind.
(d) Die am weitesten links befindlichen etwa 8 kb des Gen-Clusters umfassen den Regulationsabschnitt der vorliegenden Erfindung, d.h. Gene, die negativ und positiv in Regulierungsspiegel der Methylenomycinproduktion involviert sind, sowie Promotoren unter der Steuerung jener Regulationsgene (es umfasst auch andere Gene, die aus diesen Promotoren transkribiert werden).
(e) DNA rechts vom Regulationsabschnitt, gezeigt in (d), umfassend das mmr-(Methylenomycin-Resistenz-)Gen sowie Gene weiter rechts, was auf die Position von mmyB hindeutet.

2 zeigt einen Vergleich der Produkte von Methylenomycin-Regulationsgenen mit GBL-bindenden Proteinen aus verschiedenen Streptomyces-Spezies. Die Produkte von mmyR (mmyrep) und mmfR (mmyrep2) werden mit GBL-bindenden Proteinen angeordnet, die mit der Produktion von Virginiamycin (bara, barb), Streptomycin (arpa) und Showdomycin sowie Mimimycin (fara) assoziiert sind. Andere wahrscheinliche GBL-bindende Proteine aus S. coelicolor A3(2) (cpra, cprb, scbr) und der Jadomycin-Biosynthese-Gen-Cluster (jadr2) werden ebenso gezeigt.
3 zeigt, dass das Produkt von mmfL (hier als mmy abgekürzt) homolog zu in die Biosynthese von GBLs verwickelten Streptomyces-Proteinen ist. Die letzteren Proteine sind für die Biosynthese von A-Faktor (afsa), ein GBL von S. coelicolor (scba), Virginiae-Butanolid (barx) und IM-2 (farx).
In den 2 und 3 bezeichnen Punkte („.") das Fehlen einer Aminosäure an dieser Position oder die Insertion einer Lücke zur optimalen Sequenzanordnung und Sternchen („*") bezeichnen das Ende einer Aminosäuresequenz.
4a zeigt die Expression eines fremden Gens (xylE) aus einer Expressionskassette, die den Regulationsabschnitt und das fremde Gen umfasst.
Unteres Feld: Organisation des Methylenomycin-Gen-Clusters in einem Stamm, der so verändert wurde, um xylE aus der mmyG-enthaltenden Transkriptionseinheit zu exprimieren. Der Vektor KC861 (Bruton et al. (1991)) wurde verändert, um das PstI-Fragment C2.18 zu enthalten (Chater und Bruton (1983), von dem nun bekannt ist, dass es sich von innerhalb mmyT bis innerhalb mmyG erstreckt: das Insert ermöglichte die Integration des Phagen in die angegebene Konfiguration. mmyG' und mmy'T bezeichnen jeweils 3'- und 5'-trunkierte Kopien dieser Gene.
Oberes Feld: Zeitverlauf für Catechin-Oxygenaseaktivität in einem Stamm (basierend auf J1507: Bruton und Chater (1983)), der die veranschaulichte Fusion in sich trägt. Proben, die auf Zellophanmembranen gezüchtet wurden, die auf R2YE überlagert wurden, wurden nach den angegebenen Kulturzeiten geerntet, und Extrakte wurden hergestellt und getestet, wie in Guthrie und Chater (1990).
4b zeigt die Expression eines fremden Gens (xylE) durch das Fusionieren des fremden Gens an verschiedene Transkriptionseinheiten in dem Methylenomycin-Biosynthese-Cluster. Die Fusionen wurden genau wie in 4a (unteres Feld) hergestellt, jedoch mit reg- oder A3.13-Fragmenten (9), die das C2.18-Fragment ersetzen.

Oberes Feld: Fusion an die mmfLHP-Transkriptionseinheit durch das reg-Fragment;
Unteres Feld: Fusion an die mmy...XCAPK-Transkriptionseinheit durch Fragment A3.13.

5 fasst die Resultate eines Southern-Blots zusammen und zeigt die umfassende Deletion von biosynthetischer Methylenomycin-DNA aus der R333-Mutante. Die Sonde, pIJ518 (Chater und Bruton (1985)), enthält ein großes Segment aus dem Zentrum des Methylenomycin-Clusters. In einem R333-Verdau (nicht dargestellt) feh len die meisten der PstI-Fragmente. Auch die Organisation der Gene innerhalb des biosynthetischen Methylenomycin-Gen-Clusters und rechts von der neu sequenzierten Region ist dargestellt. Es wird auch ein EcoRI-Segment von SCP1-DNA dargestellt, das, wenn es subkloniert wird und in einen SCP1-S.-coelicolor-Wirt eingeführt wird, die Methylenomycinproduktion durch eine angrenzende Kultur des Indikator-„Konvertor"-Stamms R39, beschrieben von Kirby und Hopwood (1977), stimuliert.
6, Teile a-d, zeigen Beispiele für Situationen, in denen der Regulationsabschnitt und/oder die Expressionskassette verwendet werden könnten, um die Produktion von nützlichen Produkten zu verstärken. Siehe Text für Erklärungen. Vorzugsweise in den Teilen b, c und d enthält entweder der verwendete Wirtsstamm das mmyB-Gen, oder das mmyB-Gen ist im Vektor vorhanden, der die Expressionskassette enthält.

7 zeigt die gesamte doppelsträngige Sequenz eines etwa 9,5-kb-Nucleinsäureabschnitts aus dem SCP1-Plasmid, enthaltend die mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL-, mmfR-, mmyT-, mmyO-, mmyG- und mmyJ-Gene und den Beginn des mmr-(Methylenomycin-Resistenz-)Gens. Es werden einige Restriktionsstellen gezeigt. Abgeleitete Beginn- und End-Reste der Gene sind wie folgt:

Gen	Strang	beginnt bei Rest-Nr.	endet bei Rest-Nr.
MmyR	unten	1389 oder 1407	796
MmfP	unten	2352 oder 2355	1558
MmfH	unten	3554	2352
MmfL	unten	4612	3551
MmfR	oben	4807	5451
MmyT	oben	5676	6401
MmyO	oben	6432	7553
MmyG	oben	7636	8817
MmyJ	unten	9115 oder 9151	8780
Mmr	oben	9333	nicht gezeigt

In der Figur bezeichnet:

den Beginn eines Gens;
[ das Ende eines Gens; und
* eine von zwei möglichen Startstellen für ein Gen.

8, Teile a-h, zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der mmyR-, mmfP-, mmfH-, mmfL-, mmfR-, mmyT-, mmyO- bzw. mmyG-Gene.
9 zeigt Restriktionsstellen, die DNA-Fragmente flankieren, die verwendet werden, um die Insertion von fremder DNA (wie z.B. xylE; 4) in die mmfHLP-, mmyTOG- und mmy...XCAPK-Gen-Cluster zu steuern (Information aus Chater und Bruton (1993 und 1995) sowie 7). Es werden nur relevante Stellen gezeigt.
10 zeigt die in einer Restriktionsanalyse von KC861::C2.18-Phagen verwendeten Restriktionsstellen, um die Ausrichtung des C2.18-Inserts zu bestimmen. P = PstI, B = BamHI, S_I = SstI, Bg = BgIII, r = rechtes Ende, l = linkes Ende. Es werden nur relevante Stellen gezeigt.
11 zeigt die Konstruktion von φG-UP-Vektoren.
12 zeigt die Restriktionsstellen und Oligonucleotide, die verwendet wurden, um das salIR-Gen als ein BglII-Fragment bereitzustellen, das zur Expression in einem φG-UP-Vektor geeignet ist.
13 zeigt in Teil a die Konstruktion von pG-UP. Teil b zeigt die bevorzugte Form, pG-UP*, die mmyB enthält. Die HindIII-Stelle der veranschaulichten Version von pG-UP wird verwendet, um mmyB in einer Form einzuführen, die eine einzigartige HindIII-Stelle zwischen der Expressionskassette und mmyB hinterlässt.
14 zeigt die Verwendung von pG-UP für die Expression der J21-Gen-Reihe. Die Zahlen auf den Primern beziehen sich auf Basenpositionen in 7.
15 zeigt in Teil a ein Fragment von Cosmid cos73, enthaltend die Gene von mmyR bis mmyG; Teil b zeigt diese Region verändert, um mit dem mmyTOG-Promotor zu enden, und zwar, um die Expression einer Nucleinsäure von Interesse zu steuern; und Teil c zeigt die Konstruktionsstrategie.
Beispiel 1: Hohe Expressionsmengen eines fremden Gens unter der Steuerung von Promotoren im biosynthetischen Methylenomycin-Gen-Cluster.
Um Expressionsmengen an unterschiedlichen Punkten im biosynthetischen Methylenomycin-Gen-Cluster (hier mmy-Cluster genannt) zu bestimmen, wurden Derivate vom Bakteriophagen C31, enthaltend das fremde Gen xylE (ein Gen, das von Pseudomonas stammt: Zukowski et al. (1983)), verwendet, um xylE in definierten Positionen und Ausrichtungen innerhalb des mmyClusters zu platzieren, der in den S.-coelicolor-Stämmen J1507 (der den mmy-Cluster innerhalb von SCP1^NF, einer chromosomal integrierten Kopie von SCP1, enthält; Bruton und Chater (1983)) oder J1506 (ein Derivat von J1501 (Chater et al. (1982)), das eine autonome Kopie von SCP1 besitzt) enthalten ist.
Da KC861, dem verwendeten Vektor, die attP-Stelle fehlt, die normalerweise von C31 verwendet wird, um seine Integration in das Wirtschromosom während des Aufbaus der Lysogenie zu ermöglichen, kann er auf dem normalen Wege keinen Prophagen bilden (Bruton et al. (1991)). Es ist jedoch möglich, durch das Insertieren eines Stücks von Streptomyces-Wirts-DNA in KC861 einen alternativen Integrationsweg bereitzustellen, so dass die homologe Rekombination den Prophagen an der entsprechenden Position in die Wirts-DNA integrieren kann. Solche Vorkommnisse, die wirklich selten auftreten, können detektiert werden, wenn der Prophage ein selektierbares Resistenzgen, wie z.B. vph (Viomycin-Resistenz) oder tsr (Thiostreptonresistenz), in sich trägt (Chater & Bruton (1983); Bruton et al. (1991)). Im vorliegenden Fall ermöglichten es die in KC861 platzierten mmy-Inserts dem Vektor, sich in bestimmte Positionen in der mmy-DNA von SCP1^NF in J1507 oder von SCP1 in J1506 zu integrieren, mit Ausrichtungen, die von der Ausrichtung des Inserts im Vektor abhingen. pBR327- und pBR322-Rekombinanten (Chater & Bruton (1983, 1985)) waren die DNA-Quelle für das Klonieren der Fragmente reg, C2.18, mmr, A4.2 und A3.13 (9) in die BamHI-Stelle von KC861. Das reg-Fragment war ein SstI-BglII-Subfragment einer größeren Insertion in plJ519 (Chater und Bruton (1985)). Die anderen vier Fragmente besaßen PstI-Begrenzungen. Um sie mit BamHI-kompatiblen Enden auszustatten, wurden sie in das E.-coli-Plasmid pIJ2925 eingeführt (Janssen und Bibb (1993)). Die mmy-Inserts wurden von den pBR327/322-Vektoren durch Verdau mit PstI (oder SstI und BgIII für reg) und Gelelektrophorese getrennt und wurden anschließend ligiert, um pIJ2925 auf geeignete Art und Weise zu schneiden.

JM101 wurde mit den Ligationen transformiert. Die Plasmid-Wirt-Kombination ermöglichte ein Blau/Weiß-Screening nach Rekombinanten. Für jedes Fragment wurde Plasmid-DNA mehrerer weißer Kolonien mittels BglII-Verdau untersucht, um zu zeigen, ob sie die Insertion enthielt. Ein zweites Enzym wurde verwendet, um ihre Ausrichtung in Bezug auf den Polylinker von pIJ2925 zu bestimmen (Tabelle 1). Dies half später bei der Bestimmung der Ausrichtung bezüglich des xylE-Gens im Phagenvektor. Tabelle 1: Die Ausrichtung von mmy-Fragmenten, die in pIJ2925 insertiert wurden

Fragment	Derivat von pIJ2925	zur Bestimmung der Ausrichtung verwendetes Enzym	Ausrichtung*
reg	pIJ560	XhoI	r
C2.18	pIJ561	EcoRI	r
mmr	pIJ562	PvuII	l
A4.2	pIJ563	SstI	l
A3.13	pIJ564	EcoRI	r

* „r" gibt an, dass sich das rechte Ende der Insert-DNA am rechten Ende des pIJ2925-Polylinkers befindet;
„l" gibt an, dass sich das linke Ende der Insert-DNA am rechten Ende des pIJ2925-Polylinkers befindet.

Die Plasmide pIJ560-pIJ564 wurden mit BglII geschnitten, und die gereinigte verdaute DNA wurde an KC861-DNA ligiert, die mit BamHI geschnitten wurde. Protoplasten von S. lividans 1326 wurden mit der ligierten DNA transfiziert. 100-200 gut getrennte Plaques wurden auf Masterplatten zu je 50 Plaques überimpft.

Phagen mit der gewünschten Insertion von mmy-DNA-Fragmenten wurden durch ein Hybridisierungssignal auf Plaquehybridisierungen identifiziert. Die Phagen-DNA wurde von den Plaques auf der Masterplatte auf Nitrocellulose transferiert (Benton & Davis (1977)). Aus den Plasmiden pIJ560-pIJ564 wurden die insertierten DNA-Fragmente isoliert und nicht radioaktiv durch das Digoxigeninsystem von Boehringer-Mannheim markiert, um Sonden-DNA für die Hybridisierung herzustellen. Vier positive Plaques auf der Masterplatte für jede der fünf Insertionen wurden gereinigt, um Phagensuspensionen aus einzelnen Plaques zu erhalten. Phagen-DNA wurde durch Verdau mit Restriktionsenzymen hergestellt und analysiert, um zu verifizieren, dass sie die erwartete Insertion enthielt, und um ihre Ausrichtung zu bestimmen. Als Beispiel wird die Situation für die Insertion von C2.18 in 10 demonstriert. In diesem Beispiel wurden Restriktionsverdauschritte (nicht dargestellt) einer jeden Probe mit PstI bzw. SstI verwendet, um die Ausrichtung des Inserts in der Probe zu bestimmen. Tabelle 2 zeigt die Resultate der DNA-Analyse und gibt die Namen der konstruierten Phagen an. Tabelle 2: Struktur von KC861-Rekombinanten mit mmy-DNA, fusioniert an xylE.

insertiertes Fragment	Phagenbezeichnung	Ausrichtung des insertierten Fragments	Anzahl der Vertreter in vier analysierten Phagen
reg (2,2 kb)	KC133 KC134	r l	3 (A, B, C) 1
C2.18 (2,05 kb)	KC135 KC136	r l	2 (A, B) 2 (A, B)
mmr (2,5 kb)	KC137 KC138	r l	3 (A, B, C) 1
A4.2 (2,75 kb)	KC139 KC140	r l	1 3 (A, B, C)
A3.13 (2,28 kb)	KC141 KC142	r l	3 (A, B, C) 1

A, B und C bezeichnen die verschiedenen isolierten Phagen;
r gibt an, dass sich das rechte Ende der Insert-DNA rechts von KC861 befindet; und
l zeigt, dass sich das linke Ende der Insert-DNA rechts von KC861 befindet.

Die Ausrichtung wurde unter Verwendung von SstI bestimmt, wofür es eine einzigartige Stelle in den Polylinkerregionen von KC861 und pIJ2925 gibt. Die Information über die Ausrichtung des klonierten Fragments in pIJ2925 war notwendig (siehe Tabelle 1).
Phagensuspensionen aus selektierten einzelnen Plaques wurden verwendet, um die Stämme J1506 (SCPI⁺) und J1507 (SCPI^NF) zu lysogenisieren. Die Integration des Phagen verlieh Thiostreptonresistenz auf den Lysogenen und platzierte die xylE-Fusionen in dem mmy-Gen-Cluster des Wirtsstamms (4a; 6a). Um geeignete Lysogene herzustellen, wurden 10-20 l einer Phagensuspension aus einen einzelnen Plaque eines jeden von KC133-KC142 auf eine R5-Platte gesprenkelt, auf der 10⁷-10⁸ Sporen von J1507 oder J1506 ausgebreitet waren. Nach 5-7 Tagen hatten die Kulturen Sporen gebildet und wurden auf Minimalmedium, enthaltend 50 gml^–1 Thiostrepton, repliziert. Nach ca. vier Tagen wurden resistente Kolonien auf R5-Platten, enthaltend 50 gml^–1 Thiostrepton, ausgestrichen, um einzelne Kolonien zu erhalten, die anschließend auf demselben Medium ausgebreitet wurden, um Sporen von gereinigten Lysogenen zu erhalten.

Um zu kontrollieren, ob die Prophagen sich an den erwarteten Positionen integriert hatten, wurden Southern-Blotting-Verfahren verwendet. Genomische DNA wurde aus 25 ml YEME-Kulturen der Lysogene, enthaltend 4 gml^–1 Thiostrepton, hergestellt. In jedem Fall wurde ein XhoI-Verdau der DNA verwendet, um die Zerstörung im mmy-Gen-Cluster zu untersuchen. Es gibt eine einzigartige XhoI-Stelle in KC861 stromauf des tsr-Gens. Da sich die XhoI-Stellen, welche die klonierten Fragmente flankieren oder sich in diesen befinden, asymmetrisch zu ihren Enden befanden, war es möglich, die Ausrichtung des integrierten Phagen abzuleiten und die Resultate der Phagenanalyse zu bestätigen. Es wurden dieselben nicht radioaktiven DNA-Sonden verwendet wie für die Plaquehybridisierungen. Tabelle 3 listet die Resultate der Southern-Analyse auf. Tabelle 3: Southern-Analyse von Lysogenen von J1507 und J1506.

kloniertes Fragment	charakteristische Bande für wt	integrierter Phage	charakteristische Bande für die Zerstörung	erhalten mit
kloniertes Fragment	charakteristische Bande für wt	integrierter Phage	charakteristische Bande für die Zerstörung	J1507	J1506
reg	3,2 kb, 5,2 kb	KC133 KC134	2,35 kb 3,7 kb	ja ja	- -
C2.18	5,25 kb	KC135 KC136	4,55 kb 6,7 kb	ja ja	ja ja
mmr	6,1 kb	KC137 KC138	7,75 kb 4,75 kb	- ja	ja ja
A4.2	6,1 kb	KC139 KC140	5,25 kb 7,55 kb	- ja	ja ja
A3.13	2,7 kb	KC141 KC142	4,4 kb 4,5 kb	ja -	ja ja

Lysogene mit den erwarteten Hybridisierungsmustern wurden mit jedem Typ Phagen erhalten, obwohl manche der getesteten Stämme nicht das erwartete Muster zeigten. Daher waren J1507::KC137(A), 137(B), 139, 142(A), 142(B) thiostreptonresistent, die Integration erfolgte jedoch nicht an der richtigen Stelle. Da Lysogene mit der korrekten Konstruktion für diese Phagen mit J1506 erhalten wurden, wurden keine weiteren J1507-Lysogene analysiert.
Die BamHI-Restriktionsstelle von KC861, in die die mmy-DNA insertiert wurde, ist Teil einer multiplen Klonierungsstelle (MCS), die sich in der Nähe und gleich stromauf des promotorlosen xylE-Gens befindet. Wie von Guthrie und Chater (1990) und Bruton et al. (1991) veranschaulicht, führt dies nach der Integration des Phagen durch homologe Rekombination dazu, dass xylE unter die Kontrolle der Transkriptionseinheit gestellt wird, von der das bestimmte Insert ursprünglich stammte, vorausgesetzt, die Transkriptionseinheit und xylE haben dieselbe Ausrichtung. Daher wird das Ausmaß der Expression der relevanten Transkriptionseinheit durch die Menge der xylE-Expression angegeben. Die Expression von xylE ist leicht zu beobachten, da das xylE-Genprodukt ein Enzym ist (Catechin-2,3-Dioxygenase), das farbloses Catechin in eine gelbe Verbindung, 2-Hydroxymuconsemialdehyd, überführt. Dies kann nach dem Besprühen mit Catechin (dem Ylo⁺-Phänotypen) durch das Auge als eine gelbe Zone rund um Kolonien detektiert werden oder quantitativ mittels Spektrophotometrie, nachdem zellfreie Extrakte hergestellt wurden (Zukowski et al. (1983), Ingram et al. (1989)).

Der In-vivo-Test für die xylE-Aktivität der Lysogene (d.h. Ylo⁺-Phänotyp) wurde durch das Besprühen der Kolonien mit Catechin durchgeführt (Ingram et al. (1989); Bruton et al. (1991)). Vollständiges Medium (CM; Hopwood et al. (1985)), das die stärkste Expression ergab, wurde während der gesamten Experimente verwendet, und HMM (Hobbs et al. (1992); mit 1% Agar verfestigt), bei dem der Ylo-Phänotyp leichter bewertet wurde, was jedoch eine niedrigere Expression ergab, wurde nur gelegentlich zum Vergleich verwendet. Tabelle 4 zeigt die kombinierten Resultate wiederholter xylE-Tests für alle Fusionspunkte. Die Kulturen waren im Alter von 42 h und 72 h mit Catechin-Lösung besprüht worden. Tabelle 4: Plattentests bezüglich der xylE-Aktivität in J1507- und J1506-Lysogenen (siehe folgende Seite).

Kloniertes Fragment	Lysogen	Ylo-Phänotyp	Schlussfolgerung bezüglich Transkription (siehe Fig. 9)
reg	J1507::KC133 J1507::KC134	- +++	nicht nach rechts über BglII an Pos. 13.0 nach links über SstI an Pos. 10.8
C2.18	J1507::KC135 J1506::KC134 J1507::KC136 J1506::KC136	+++ +++ -- --	nach rechts über PstI an Pos. 16.0 nach rechts über PstI an Pos. 16.0 nicht nach links über PstI an Pos. 13.9 nicht nach links über PstI an Pos. 13.9
mmr	J1506::KC137 J1507::KC138 J1506::KC138	-- + +	nicht nach rechts über PstI an Pos. 19.3 nach links über PstI an Pos. 16.8 nach links über PstI an Pos. 16.8
A4.2	J1506::KC139 J1507::KC140 J1506::KC140	-- ++ --	nicht nach rechts über PstI an Pos. 22.1 nach links über PstI an Pos. 19.3 nach links über PstI an Pos. 19.3
A3.13	J1507::KC141 J1506::KC141 J1506::KC142	-- -- +++	nicht nach rechts über PstI an Pos. 25.0 nicht nach rechts über PstI an Pos. 25.0 nach links über PstI an Pos. 22.7

Von besonderer Bedeutung war die Entdeckung, dass das Insert in KC135 zu einem starken Ylo⁺ ⁺ ⁺-Phänotyp im Stamm J1507::KC135 führte. Dieser wurde ausführlicher durch die Inokulation von ca. 10⁸ J1507::KC135-Sporen auf jede einer Reihe an Platten untersucht, die CM (Hopwood et al. (1985)), ergänzt mit Histidin (50 g ml^–1) und Uracil (7,5 g ml^–1), überlagert mit einer Zellophanscheibe, wie von Tan und Chater (1993) beschrieben, enthielten, wonach das Inkubieren bei 30°C für die in 4a, oberes Feld, angegebenen Zeiten folgte, bevor das Mycelwachstum abgeschabt wurde. Für Catechin-2,3-Dioxygenasetests wurde das Mycel einer Zellophanscheibe in 0,5 ml Extraktionspuffer suspendiert, und zellfreie Extrakte wurden durch Beschallung hergestellt und durch Zentrifugierung geklärt, wie in Ingram et al. (1989) beschrieben. Catechin-2,3-Dioxygenase-spezifische Aktivitäten wurden mittels Spektrophotometrie bestimmt, wie oben stehend beschrieben. Die Resultate sind in 4a, oberes Feld, gezeigt. Die spezifischen Aktivitäten in Proben, die vor 30 h geerntet wurden, lagen nicht signifikant über den niedrigsten verlässlich messbaren Werten, sondern zwischen 30 und 40 h; als das Wachstum auf dem Zellophan dicht wurde und die morphologische Differenzierung begann, gab es eine sehr schnelle Zunahme der Aktivität bis zu 30 mU mg^–1 Protein.
In einem früheren Experiment, in dem xylE an das redX-Gen fusioniert wurde, das in die Synthese eines anderen Antibiotikums in S. coelicolor involviert ist, berichteten Guthrie und Chater (1990) über Peak-Werte von 2 mU mg^–1 Protein. Die mmy-gesteuerte Transkription von xylE in J1507::KC135 war daher sehr stark.
Weitere Experimente (4b) zeigten ein(e) ähnliche(s) Muster und Menge der xylE-Expression, wenn geeignete Fusionen an anderen Punkten in dem mmy-Cluster gemacht wurden. Die Positionen dieser Fusionen sind in 9 gezeigt.
Diese Resultate zeigen, dass ein fremdes Gen (in diesem Beispiel xylE) besonders spät im Wachstum bis zu ziemlich hohen Werten exprimiert werden kann, wenn es an den dargestellten Positionen in den mmy-Cluster insertiert wurde, ohne die Addition etwaiger induzierender Mittel.
Beispiel 2: Eine diffusionsfähige Substanz, die in der Lage ist, die Methylenomycin-Produktion bei gewissen nicht-produzierenden Methylenomycin-Mutanten auszulösen, wird durch eine Mutante produziert, die das am weitesten links befindliche 6,5-kb-Stück des biosynthetischen Methylenomycin-Gen-Clusters enthält, jedoch wenig, falls überhaupt andere mmy-DNA.

(a) In vorheriger Arbeit (Kirby et al. (1975); Kirby und Hopwood (1977)) wurde gezeigt, dass Mutanten, die nicht in der Lage waren, Methylenomycin zu produzieren, nach unterschiedlichen Verfahren isoliert werden konnten. Die Fähigkeit dieser Mutanten, extrazelluläre Substanzen, die für die Methylenomycin-Produktion relevant sind, zu produzieren und/oder auf diese zu reagieren, wurde durch das Züchten von Stämmen eng aneinander auf der Oberfläche von CM-Agar getestet (Kirby und Hopwood (1977)). R333 war eine von zehn Mutanten, die eine extrazelluläre Substanz produzierten, welche die Methylenomycin-Produktion durch eine andere nicht-produzierende Methylenomycin-Mutante, R39, auslösten. In der Arbeit von Kirby und Hopwood (1977) wurde es als wahrscheinlich betrachtet, dass die Substanz, die durch R333 produziert wurde, in Methylenomycin überführt wurde.

Im vorliegenden Beispiel wurde DNA aus R333 isoliert und mit den Restriktionsenzymen PstI und PvuII verdaut. Die verdaute DNA wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen und auf eine Nitrozellulosemembran geblottet (Southern (1975)). Die Membran wurde anschließend mit einer ³²P-markierten Sonde hybridisiert, die durch Nick-Translation von pIJ518, einem Plasmid, das viel des mmy-Clusters enthielt, erhalten wurde (Chater und Bruton (1985); 5). R333 enthielt eine Deletion, die sich nach rechts von einer Position etwa 6,5 kb im linken Ende des mmy-Clusters erstreckte und jenseits des rechten Endes des KC518-Inserts endete. Daher enthält R333 etwa 6,5 kb DNA aus dem linken Ende der mmy-Region und wenig (vielleicht keine) andere methylenomycinverwandte DNA (5).
Nach der Entdeckung des Ausmaßes der Deletion biosynthetischer Gene in R333 schlagen die Erfinder der vorliegenden Erfindung vor, dass diese 6,5-kb-Region die Biosynthese eines extrazellulären Signalmoleküls verleiht und dass dieses, kein Zwischenprodukt der Methylenomycin-Biosynthese, jene Substanz ist, die von R333 sekretiert wird und die in der Lage ist, R39 zu stimulieren, um Methylenomycin zu produzieren.
Dies ist in Einklang mit der Beobachtung, dass nur eine der 16 mmy-Mutanten, die von Kirby und Hopwood (1977) untersucht wurden, induziert werden konnten, um Methylenomycin bei Wachstum in der Nähe von anderen mmy-Mutanten zu induzieren.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung schlagen weiter vor, dass biosynthetische Zwischenprodukte, die sich in blockierten Mutanten ansammeln, allgemein nicht ohne Beschränkung freigesetzt werden und austauschbar zwischen Stämmen sind, sondern beobachten, dass ein Zwischenvorläufer (Desepoxymethylenomycin) vom Wildtyp produziert wird und von SCP1⁺-Stämmen in Methylenomycin umwandelbar ist (Hornemann und Hopwood (1978)). Sie schlagen weiters vor, dass beinahe der gesamte biosynthetische Weg vervollständigt sein muss, bevor ein Vorläufer produziert wird, der in der Lage ist, in Co-Synthese zu funktionieren – eine Anforderung, die wahrscheinlich viel mehr als ca. 6,5 kb biosynthetischer Gene erfordern würde.
Diese Vorschläge und andere Resultate, die eine regulatorische Rolle für einen Teil dieser DNA (siehe oben) zeigen, stehen in Einklang mit der abgeleiteten Funktion von Genen, die durch das Sequenzieren dieser Region des mmy-Clusters entdeckt wurden. Die Resultate dieser Sequenzanalyse sind in Beispiel 3 dargestellt.

(b) In weiterer Bestätigung dieser Prognosen wurde ein 8,3-kb-EcoRI-Fragment von SCP1, enthaltend die Gene von mmyR bis mmyT, mit einem Teil von mmyO (5), aus Cosmid 73 von Redinbach et al. (1998) in pSET152 subkloniert (Bierman et al. (1992)), und das resultierende Plasmid wurde in die φC31-attB-Stelle des SCP1^–-Streptomyces-coelicolor-Stamms J1501 eingeführt (Kieser et al. (2000)). Der resultierende Stamm führte bei Verwendung in „Co-Synthese"-Tests mit R39 (Kirby und Hopwood (1977)) zu einer Methylenomycin-Produktion in dem R39-Stamm (wie durch die Inhibierung des SCP1^–-Indikatorstamms J1501 beurteilt wurde).

Beispiel 3: DNA-Sequenz des linken Endes des biosynthetischen Methylenomycin-Gen-Clusters.
Die DNA-Sequenz der Region vom linken Ende der mmy-Region bis zum zuvor sequenzierten (Neal und Chater (1987)) 2,55-kb-PstI-Fragment, enthaltend mmr (siehe 5), wurde in drei Sektionen bestimmt. Das am weitesten links gelegene XhoI-Fragment (ca. 3,2 kb) wurde durch Didesoxy-Sequenzierung unter Verwendung des Verfahrens von Sanger et al. (1977), angepasst, wie in Bruton und Chater (1987) beschrieben, sequenziert. Nach dem Zufallsprinzip beschallte Fragmente wurden unter Verwendung des M13-Vorwärts-Primers in M13mp19 kloniert, um die Matrizen zur Sequenzierung bereitzustellen (Norrander et al. (1983)). Die überlappenden SstI/PstI-(ca. 5 kb) und PvuII-Fragmente (ca. 2,2 kb) wurden durch automatisierte Fluoreszenzsequenzierung auf einem automatisierten ABI-Sequenzierer unter Verwendung von Matrizen sequenziert, die in pBluescript-Vektoren kloniert wurden. Für eine Ausrichtung wurden Matrizen durch das Exonuclease-III-Verfahren von Henikoff (1984) erzeugt, und in der anderen wurden Oligonucleotide zum „Primer-Walking" kreiert. Alle Sequenzen wurden auf beiden Strängen bestimmt, und jede Basenposition wurde in zumindest zwei Sequenzierungsreaktionen durchgelesen. Die Sequenz ist in 7 dargestellt.
Die Verwendung des FRAME-Programms (Bibb et al. (1984)) führte zu der Erkenntnis, dass es neun mit Methylenomycin verwandte Gene links vom Resistenzgen mmr gab (1 und 5). Nur eines davon, mmyJ, wurde zuvor bereits sequenziert (Neal und Chater (1987)).
Prognostizierte Funktionen von Genen, die durch Sequenzierung identifiziert wurden
Unter Verwendung der BLAST-(Altschul et al. (1990; 1996)) und TFASTA-Programme (Pearson und Lipmann (1988)) zum Absuchen der wichtigen Protein- und DNA-Datenbanken wurden Ähnlichkeiten der abgeleiteten Produkte der acht neu sequenzierten Gene zu Proteinen mit bekannter Funktion entdeckt. Drei der acht – mmfL, mmfR und mmyR – waren von besonderem Interesse, da sie entscheidende Hinweise über die Art der Regulation der mmy-Gene und das mutmaßliche extrazelluläre Signalmolekül gaben, die für die Erschaffung und die Verwendung des Expressionssystems, welches der Gegenstand dieser Patentanmeldung ist, relevant sind. In diesem Abschnitt geben die Erfinder Details dieser Ähnlichkeiten wider. Die Produkte der anderen fünf Gene zeigten alle ein gewisses Ausmaß der Ähnlichkeit mit verschiedenen Enzymen und sind wahrscheinlich direkt in enzymatische Reaktionen involviert, die zu der Biosynthese oder dem Metabolismus von Methylenomycin oder dem GBL-Faktor führen, der in die Regulation der Methylenomycin-Biosynthese involviert ist.
mmfL
Das prognostizierte Produkt von mmfL (MmfL) zeigte eine signifikante Ähnlichkeit mit nur vier Proteinen: AfsA, ScbA, BarX und FarX. Diese Proteine stammen alle von anderen Streptomyces-Spezies und sie sind alle eng mit der Produktion von GBL-Signalmolekülen assoziiert, die in die Regulation der Antibiotikaproduktion involviert sind (von ihnen wird allgemein angenommen, dass sie jene Enzyme sind, die für die GBL-Synthese verantwortlich sind: Horinouchi et al. (1985, 1989); E. Takano, persönliche Mitteilung). Die Ähnlichkeit von MmfL mit diesen Proteinen ist im Wesentlichen von einem Ende zum anderen und ist hochgradig signifikant (3). Die Entdeckung eines solchen Gens in einer kleinen DNA-Region, die für die Produktion einer extrazellulären Substanz kodiert, welche die Methylenomycin-Produktion stimuliert (siehe Beispiel 2), macht es hochgradig wahrscheinlich, dass es sich bei dem Signal um ein GBL handelt und dass das MmfL-Protein für einen kritischen Schritt in seiner Biosynthese kodiert.
mmfR und mmyR
Die MmfR- und MmyR-Proteine zeigen eine signifikante Anordnung mit einer großen Familie bakterieller Regulationsproteine (der TetR-„Überfamilie"), und zwar hauptsächlich in einer beträchtlichen Region in der Nähe des N-Terminus der Proteine. Von dieser Region wurde in ein paar dieser Proteine gezeigt (Hillen und Berens (1994)), dass sie eine α-Helix-Schleife-α-Helix-Organisation annahm, die es ihr ermöglicht, an spezifische Sequenzen in doppelsträngiger DNA zu binden.
Die Proteine mit der stärksten Ähnlichkeit mit MmfR und MmyR bilden eine besondere Untergruppe (oder „Familie"). Es stammen alle von Streptomyces-Spezies, und bei ausreichender Untersuchung sind alle mit der Regulierung der Antibiotika-Produktion und/oder der morphologischen Differenzierung assoziiert (Onaka und Horinouchi (1997); Onaka et al. (1997, 1998); Sugiyama et al. (1998); Nakano et al. (1998)). Die Anordnungen sind in 2 gezeigt.
Die größte Ähnlichkeit liegt in der Region der DNA-Bindungsdomäne, von der erwartet wird, dass sie sequenzspezifische Kontakte mit Target-DNA-Sequenzen aufnimmt, was zu der Erwartung führt, dass MmfR und MmyR Sequenzen binden, die jenen ähneln, die von den anderen Mitgliedern der Familie erkannt werden (siehe unten). Obwohl die zentralen und C-terminalen Regionen dieser Proteine weniger gut konserviert sind, gibt es trotz alledem in allen dieser Regionen Beweise für die Ähnlichkeit, wohingegen andere Mitglieder der TetR-Überfamilie keine Ähnlichkeit mit MmfR über die N-terminale Region hinaus aufweisen. Die angeordneten Proteine haben ein weiteres sehr signifikantes Merkmal gemeinsam – alle bis jetzt untersuchten agieren als spezifische Rezeptoren für verschiedene GBL-Signalmoleküle.
Die vorliegenden Erfinder haben neu entdeckt, dass mmfR und das mutmaßliche GBL-Biosynthese-Gen mmfL auf ähnliche Art und Weise angeordnet sind, und eine genaue Inspektion der Sequenz zwischen ihnen zeigt eine Palindromsequenz (Halbseite 5'-GGAAGGTATTA-3'), die der Konsensussequenz (Halbseite 5'-GG(T/C)CGGT(A/T)(T/C)G(T/G)-3') ähnelt, die für die Bindung von DNA durch das ArpA-Protein definiert ist, das der Archetyp dieser faktorbindenden Proteine ist (Onaka und Horinouchi (1997)).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung schlagen daher vor, dass der chemisch undefinierte extrazelluläre Faktor, der von R333 sekretiert wird (siehe Beispiel 2), ein GBL ist, dessen extrazelluläre Konzentration sich langsam mit der Zunahme der hyphalen Dichte in der Zellkultur aufbaut, und zwar bis zu einem bestimmten entscheidenden Schwellenwert, bei dem es von dem Bindungsprotein, das von mmfR kodiert wird, tatsächlich wahrgenommen wird. Durch diese Wechselwirkung wird MmfR aus seiner Position in der bidirektionalen Promotorregion freigesetzt, was zu einer Derepression von mmfL und daher der Faktor-Biosynthese führt. Den Vorschlägen zufolge führt dies wiederum zu einer Beschleunigung der Geschwindigkeit der Faktorproduktion, die ausreicht, um mit (einem) Repressor(en) wechselzuwirken und diese(n) zu deaktivieren, wobei der/die Repressor(en) entweder an die mmyTOG- und mmy...XCAPK-Promotoren oder an den Promotor eines anderen Regulationsgens (z.B. mmyB) gebunden ist/sind, das benötigt wird, um die mmyTOG- und mmy...XCAPK-Promotoren zu aktivieren, wodurch eine Expression der mmyTOG- und mmy...XCAPK-Gene ermöglicht wird. Eine passende Hypothese wäre, dass es sich beim mmyR-Genprodukt (MmyR, siehe unten) um diesen Repressor handelt und dass MmyR eine höhere GBL-Konzentration für die Deaktivierung seiner Repressorfunktion benötigt, als dies bei MmfR der Fall ist.
Beispiel 4: Die Prävention der Translation von mmfL-mRNA ist mit dem Scheitern der Transkription von mmy-DNA assoziiert.

(a) In der DNA-Sequenzierung in Beispiel 3 ist mmfL das einzige Gen, das ein TTA-(Leucin-)Codon enthält. Solche Codons werden in hochgradigen bldA-Mutanten nicht exprimiert, da bldA nur für tRNA kodiert, die in der Lage ist, UUA-Codons zu translatieren (Leskiw et al. (1991)). Eine Prognose des Modells zur Regulation der Methylenomycin-Produktion ist, dass mmfL-mRNA in einer bldA-Mutante nicht translatierbar wäre, was zu der Unfähigkeit führt, den GBL-Faktor herzustellen, und daher zu der Unfähigkeit, die Gene für die Methylenomycin-Produktion zu transkribieren. Um dies zu testen, wurden xylE-Fusionen in verschiedene Teile des mmy-Clusters einer bldA-Mutante unter Verwendung der C31KC861-Derivate, beschrieben in Beispiel 1, konstruiert. Die Fähigkeit der resultierenden Stämme, xylE zu exprimieren, wurde anschließend durch das qualitative Plattenverfahren getestet. Die Catechin-Oxygenase-Aktivität wird nicht detektiert, was die Prognose bestätigt und zeigt, dass ein TTA-hältiges Gen in die Regulierung der mmy-Gen-Expression involviert ist.
(b) Um dies zu verifizieren, wurde das TTA-Codon von mmfL zu CTC verändert, und zwar im internen 0,9-kb-SunI-Fragment von mmfL (das in pFA6a subkloniert wurde (Wach et al. (1994)), wodurch das KanMX-Modul ersetzt wurde), unter Verwendung des „Quick-Change"-Systems von Stratagene, gefolgt von der Reinsertion des SunI-Fragments in das 1,7-kb-XhoI-BgIII-Fragment, enthaltend mmfL (in pIJ2925, Kieser et al. (2000)), um mmfL_CTC zu ergeben. Dieses Fragment wurde in pSET151 subkloniert (Bierman et al. (1992)) und in J1703 eingeführt (bldA^–, SCP1^NF: Lawlor (1997)). Die meisten der resultierenden Stämme erwarben die Fähigkeit, R39 zu stimulieren, um Methylenomycin in Co-Synthese zu produzieren, was beweist, dass die Nicht-Translation des TTA-Codons von mmfL für die Faktor-Nicht-Produktion in der bldA-Mutante verantwortlich ist. Keiner der Stämme produzierte jedoch Methylenomycin, was zeigt, dass ein zusätzlicher bldA-abhängiger Schritt zwischen der Faktorproduktion und der Methylenomycin-Produktion liegt. Dies wurde weiter verifiziert, da J1703 nicht durch Wachstum neben dem GBL-Faktor-produzierenden Stamm R333 stimuliert wurde, um Methylenomycin zu erzeugen. Der wahrscheinliche störende Schritt ist ein Gen (mmyB), das sich etwa 9 kb rechts von der in 7 dargestellten Sequenz befindet. Von diesem Gen wird prognostiziert, dass es für ein DNA-Bindungsprotein kodiert und ein TTA-Codon enthält.

Beispiel 5: Konstruktion eines Vektors (φG-UP), der die leichte Insertion kleiner Transkriptionseinheiten in die Expressionsregion des Methylenomycin-Gen-Clusters ermöglicht.
Um die Expression fremder Gene zu erleichtern, wird der Vektor φG-UP zuerst konstruiert. Unter Verwendung der Verfahren in Hopwood et al. (1985) und Kieser et al. (2000) wird DNA aus großflächig angelegten Präparaten von φC31 KC889 extrahiert (11). 5 μg dieser DNA werden durch EcoRI verdaut, und getrennt davon werden 5 μg durch XhoI plus SstI verdaut. Die Vollendung des Verdaus wird durch Agarose-Gelelektrophorese (1% Agarose) von 0,5 μg einer jeden verdauten DNA kontrolliert, und zwar sofort nach dem Erhitzen dieser auf 70°C für eine Zeitspanne von 10 Minuten und dem Abkühlen auf Eis (um kohäsive Enden der Phagen-DNA zu trennen).
Nach der Phenolextraktion werden die zwei Verdaue gemischt und mit Ethanol co-präzipitiert, einmal mit 70% Ethanol gewaschen und anschließend in 100 μl Klenow-Puffer aufgelöst. Die Lösung wird bei 70°C 10 Minuten lang in einem Wasserbad erwärmt, das anschließend abgedreht wird, und sie wird über Nacht abkühlen gelassen (dies ermöglicht es den φC31-cos-Enden, sich an einander zu binden). Die gelöste DNA wird anschließend unter Verwendung von Klenow-Enzym einer Auffüllung der 5'-Enden unterzogen, die durch XhoI und EcoRI erzeugt wurden, bevor eine Phenolextraktion, eine Ethanolpräzipitation, ein Waschschritt mit 70°-Ethanol und das erneute Auflösen in 200 μl Ligationspuffer vor der Ligation über Nacht unter Bedingungen durchgeführt werden, die für eine Ligation stumpfer Enden (wenig ATP, viel T4-DNA-Ligase) geeignet sind. Nach der Ligation wird die DNA mit Ethanol präzipitiert, in 70% Ethanol gewaschen und in 100 μl TE-Puffer aufgelöst, bevor sie im Wesentlichen, wie von Hopwood et al. (1985) und Kieser et al. (2000) beschrieben, für die Transfektion von Streptomyces lividans 1326 verwendet wird.
Von den meisten Plaques wird erwartet, dass sie Phagen mit der gewünschten DNA-Struktur aufweisen (Deletion des XhoI-EcoRI-Fragments, das vph enthält), daher erfolgt das Screening durch Restriktionsanalyse von DNA, die aus den Nachkommen von 12 der Transfektanten-Plaques isoliert wurde. Die Verwendung von PstI, BglII und/oder BamHI stellt diagnostische Verdaumuster bereit.
Es wird ein Phage mit der korrekten Organisation identifiziert. Ein großes DNA-Präparat von diesem Phagen wird mit PstI verdaut, einer Ethanolpräzipitation unterzogen, mit 70% Ethanol gewaschen und erneut in TE-Puffer aufgelöst, bevor es mit einer äquimolaren Menge des 2,05-kb-PstI-Fragments C2.18 (Bruton und Chater (1983)), erhalten von pIJ518 durch PstI-Verdau (bei 100-200 μg ml^–1 DNA), ligiert wird, gefolgt von einer Trennung mittels Agarose-Gelelektrophorese und einer Isolierung aus dem Gel. Nach der Ligation wird die DNA einer Ethanolpräzipitation unterzogen, gewaschen und erneut in 20 μl TE-Puffer aufgelöst. Diese Lösung wird verwendet, um S. lividans zu transfizieren, und die resultierenden Plaques werden vor der Analyse durch Filterhybridisierung (Benton und Davis (1978)) auf Masterplatten angeordnet, um Kandidaten mit der gewünschten Insertion zu identifizieren. Die Sonde für diese Analyse ist das C2.18-PstI-Fragment, nicht radioaktiv mit dem Digoxigeninsystem markiert. Es werden zwölf Kandidatenplaques verwendet, um Phagen für ein DNA-Präparat in kleinem Umfang zu vermehren. Die DNA wird durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von zwei Enzymkombinationen analysiert: BamHI plus PvuII und BglII plus PvuII. Ein Phage mit jeder Ausrichtung des Inserts wird zurückbehalten. Davon wird der Phage, in dem der BglII-plus-PvuII-Verdau ein 1,2-kb-Fragment ergibt und der BamHI-plus-PvuII-Verdau ein 0,8-kb-Fragment ergibt, φG-UP (R) genannt und jener, in dem der BamHI-plus-PvuII-Verdau ein 1,2-kb-Fragment ergibt und der BglII-plus-PvuII-Verdau ein 0,8-kb-Fragment ergibt, φG-UP (L) genannt (11).
Beispiel 6: Produktion des SalI-Restriktionsenzyms durch das Positionieren des salIR-Gens unter die Steuerung der Expressionskassette in einem φG-UP-Vektor.
SalI ist ein Restriktionsenzym mit beträchtlicher Verwendung in der Molekularbiologie und daher mit beträchtlichen Verkaufszahlen. Die Gene für SalI und die SalI-Methylase wurden von Rodicio und Chater (1988) aus dem produzierenden Organismus, Streptomyces albus G, kloniert und von Rodicio et al. (1994) sequenziert. Sie sind in Tandemform angeordnet und werden als ein bicistronisches Operon exprimiert (salIR vor salIM) (Rodicio et al. (1994); Alvarez et al. (1993)). Zusätzlich dazu wird salIM aus seinem eigenen Promotor exprimiert (Alvarez et al. (1993)). Die Expression dieser Gene erfolgt normalerweise in einem sehr geringen Ausmaß, wobei eine sehr hohe spezifische Aktivität von SalI durch eine kleine Menge an Protein (in der Größenordnung von 10⁶ Einheiten μg^–1 Protein) erzeugt wird. Hier zeigen die Erfinder, wie die Expressionskassette in φG-UP für eine Überproduktion von SalI verwendet werden kann.
Die salIRM-Gene sind in pIJ4430 (Rodicio und Chater (1988)) vorhanden. Um das Genpaar in φG-UP einzuführen, wird pIJ4430 zuerst mit BclI und anschließend mit RcaI gespalten, um ein Fragment mit vorstehenden einzelsträngigen 5'-GATC- und 5'-CATG-Enden zu erzeugen. Dieses Fragment wird unter Verwendung der in 12 dargestellten Oligonucleotidadaptoren in den Zwischenvektor pIJ2925 insertiert (Janssen und Bibb (1993)). Das Fragment wird anschließend aus dem Zwischenvektor durch Verdau mit BglII ausgeschnitten und mit φG-UP (L) ligiert, das mit BglII gespalten ist. Das Ligationsgemisch wird verwendet, um S. lividans zu transfizieren, und die resultierenden Plaques werden durch Plaque-Hybridisierung unter Verwendung des Digoxigenin-markierten salIRM-BclI-RcaI-Fragments als Sonde gescreent. Phagen von zwölf Hybridisierungs-Plaques werden für DNA-Präparate in kleinem Rahmen verwendet, und die resultierenden DNA-Proben werden durch Verdau mit BglII analysiert, um die Gegenwart des 2,9-kb-Inserts voller Länge zu zeigen, und mit PstI, um die Ausrichtung des Inserts zu bestimmen. Ein zusätzliches 2,9-kb-PstI-Fragment würde die inkorrekte Ausrichtung zeigen, und das Fehlen eines solchen Fragments würde die korrekte Ausrichtung zeigen.
Einmal identifiziert, wird der gewünschte Phage verwendet, um einen Bestand mit hohem Titer herzustellen, von dem Sprenkel auf einer R2YE-Platte platziert werden, auf der J1507-Sporen verteilt sind. Nach 4-6 Tagen bei 30°C, wenn die Sporenbildung erfolgt ist, wird die Platte zu MM repliziert (wie erforderlich für das Wachstum des auxotrophen J1507 ergänzt), enthaltend Thiostrepton (50 μg ml^–1), und die nach 4 Tagen vorhandenen Kolonien werden mittels Einzelkolonie-Isolierung gereinigt und anschließend verwendet, um konfluente Platten für die Ernte dichter Sporensuspensionen herzustellen.
Um das gewünschte SalI-Enzym, anfänglich in einem Demonstrationsausmaß, zu erhalten, werden die Sporen verwendet, um 50 ml CM in einen 500-ml-Kolben mit Prallplatten zu inokulieren, und die Kultur wird mit Schütteln bei 30°C bis zur stationären Phase inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wird die Expressionskassette autoaktiviert, und die SalI-RM-Gene werden exprimiert. Das klonierte salIM-Gen erfüllt zwei Zwecke: die Verwendung seines eigenen Promotors während der frühen Wachstumsphase ermöglicht die Modifikation der Wirts-DNA, wodurch sie gegen die Spal tung immun wird, wenn schließlich SalI produziert wird; und die Expression von SalIM während der Hauptexpressionszeit stellt die optimale Produktion von salIR sicher. Die weitere Extraktion und Reinigung von SalI folgt Standardverfahren für Restriktionsenzyme.
Beispiel 7
(a) Konstruktion von pG-UP, einem integrativen Plasmidvektor zur Aktivierung kryptischer Gen-Cluster.
Wie in 6(b) gezeigt, ist es möglich, die Expressionskassette dazu zu bringen, sich in gewünschte Positionen in einem Streptomyces-Genom zu integrieren, und dadurch die Expression angrenzender Gene in der stationären Phase auszulösen. In Beispiel 8 wird dies in der Expression kryptischer Gene angewandt, die potentiell für einen neuen Sekundärmetaboliten kodieren könnten. Hier beschreiben die Erfinder die Konstruktion von pG-UP, einem E.-coli-Plasmid, das die Expressionskassette enthält und zum Transfer in Streptomyces in der Lage ist. Die Insertion geeigneter Streptomyces-DNA in pG-UP ermöglicht die Verwendung des Konstrukts zur Genexpression dieser Art. Der Vektor basiert auf pSET151 (Bierman et al. (1992)), obwohl ein beliebiges E.-coli-Replikon mit einem Marker, der eine Selektion in Streptomyces ermöglicht und dem Streptomyces-Replikations- oder chromosomale Integrationsmechanismen fehlen, verwendet werden könnte.
Um pG-UP zu konstruieren, wird das 6,2-kb-BamHI- und das BstZ17I-Fragment von pIJ519 (Chater und Bruton (1985); sowie 7) aus einem Agarosegel isoliert, und seine Enden werden mittels Auffüllung mit Klenow-Enzym abgestumpft. Es wird mit pSET151 ligiert (mit EcoRI vorgespalten und durch Auffüllung mit Klenow-Enzym abgestumpft). Nach der Transformation von E.-coli-Stamm JM101 werden die Transformanten mittels Koloniehybridisierung unter Verwendung des BamHI- und BstZ17I-6,2-kb-Fragments von p1J519 als Sonde analysiert, um das gewünschte Insert zu detektieren, und die Plasmid-DNA wird aus 12 positiven Kolonien extrahiert. Die DNA wird mit BamHI plus BgIII verdaut, um die Ausrichtung des Inserts zu bestimmen. Ein Beispiel mit einem 2,3-kb-Fragment (anstatt eines 4-kb-Fragments) wird als pG-UP ausgewählt (13a).
In der in 13a gezeigten Form würde die wirksame Verwendung von pG-UP in einem Wirt, enthaltend SCP1, garantiert werden, um die zusätzliche genetische Komponente (mmyB) bereitzustellen, die durch in Beispiel 4 beschriebene Experimente aufgezeigt wurde. Die Verwendung von pG-UP in SCP1^–-Stämmen zieht einen Vorteil aus der weiteren Inkorporation von mmyB in pG-UP oder in das Wirtsgenom (siehe Beispiel 7b).
(b) Inkorporation von mmyB in pG-UP, um pG-UP* zu ergeben
Um die wirksame Verwendung von pG-UP unabhängig von einem separat bereitgestellten mmyB-Gen durchzuführen, wird mmyB aus dem SCP1-Plasmid mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung der folgenden Primer erhalten, wobei das Cosmid 73 (Redinbach et al. (1998)) als Matrize verwendet wird:
Nach der Amplifikation und der herkömmlichen Vorbereitung zum Verdau wird das PCR-Produkt mit KnpI verdaut, anschließend vor der Ligation mit dem nicht phosphorylierten Oligonucleotid 5' AGCTGTAC 3' gereinigt. Nach der Gelreinigung wird die lineare DNA mit HindIII gespalten, erneut gereinigt und mit HindIII-gespaltenem pG-UP ligiert. Nach der Transformation des E.-coli-Stamms DH5-α werden Transformanten mittels Koloniehybridisierung mit einer mmyB-spezifischen Sonde gescreent, und das Plasmid wird aus geeigneten Kolonien zur Verifikation mittels Restriktionsanalyse auf Konstrukte, die 13b entsprechen, isoliert.
Beispiel 8: Verwendung der Expressionskassette in pG-UP in erzwungener Expression von Genen, die offensichtlich für ein unbekanntes Polyketidmolekül kodieren.
Das Projekt zur Sequenzierung des Genoms von Streptomyces coelicolor A3(2) (www.sanger.ac.uk/Projects/S_coelicolor) zeigte mehrere Gene und Gen-Cluster, die für Proteine kodieren, die mit manchen verwandt sind, von denen bekannt ist, dass sie in die Produktion wertvoller Antibiotika involviert sind. Ein Beispiel ist in Cosmid J21 zu finden, das (unter anderem) eine Reihe von sechs oder sieben Genen enthält (daher „die J21-Gen-Reihe" genannt), die eine einzige Transkriptionseinheit von vielleicht 18 kb zu formen scheinen, von denen zwei wahrscheinlich für Multidomänen-β-Ketoacyl-Synthasen jenes Typs kodieren, der in die Biosynthese von Erythromycin, Rapamycin, Tylosin, Avermectin und anderen makrozyklischen Polyketiden involviert ist (Hopwood (1997)). Von S. coelicolor A3(2) ist die Herstellung keiner solchen Verbindung bekannt. Um die Expression der J21-Gen-Reihe zu erzwingen, so dass die Kulturflüssigkeiten auf neue Verbindungen gescreent werden können, wird die J21-Gen-Reihe unter der Kontrolle der neuen Expressionskassette platziert. Zu diesem Zweck wird ein PCR-amplifiziertes Fragment von J21-DNA in den pG-UP-Vektor kloniert, wie in 14 dargestellt. Im Überblick wird das Fragment aus J21-DNA unter der Verwendung eines Oligonucleotids amplifiziert, das eine maximale Zugänglichkeit des Start-Codons des ersten Gens für Ribosomen ermöglicht, die mmyG aus der Expressionskassette translatieren, sowie eines Rückwärts-Primer-Oligonucleotids, das die Amplifikation eines ca. 1-kb-Fragments ermöglicht. Primer umfassen Merkmale, die ein schnelles Subklonieren in G-UP ermöglichen. Nach der Transformation von E. coli JM101 und dem Anordnen von Kolonien als Flecken auf einer Masterplatte wird die Koloniehybridisierung verwendet, um Kolonien, die das J21-Insert enthalten, zu identifizieren (mit dem amplifizierten PCR-Fragment, das nicht radioaktiv markiert ist, als Sonde). Plasmid-DNA wird aus Kandidatenkolonien mittels Standard-Alkalilyseverfahren hergestellt und mittels Restriktionsanalyse mit den Enzymen BamHI und HindIII überprüft. Ein Beispiel eines solchen Plasmids, bei dem die Ausrichtung des Inserts seine „Sense"-Transkription aus der Expressionskassette ermöglicht, wird mittels Transformation in den nicht methylierenden E.-coli-Stamm ET12567 (MacNeil et al. (1992)) eingeführt, der das mobilisierende Plasmid, UZ8002, enthält (Flett et al. (1997)); und Transformanten werden in konjugaler Paarung mit S. coelicolor M145 verwendet, wobei thiostreptonresistente, Nalidixinsäureresistente Exkonjugate ausgewählt werden (Bierman et al. (1992)). Von den meisten Transformanten wird erwartet, dass sie pG-UP enthalten, das durch homologe Rekombination am Beginn der J21-Gen-Reihe integriert ist. Nach der Kultur von fünf repräsentativen Transformanten auf R2YE (Hopwood et al. (1985)), enthaltend Thiostrepton (5 μg/ml), werden Sporen geerntet und verwendet, um sowohl Flüssig- als auch Oberflächen-CM-Kulturen zu beimpfen, die anschließend vor der Extraktion mit Ethylacetat, vor der herkömmlichen HPLC und Massenspektrometrie, 3 Tage lang inkubiert werden, um die Strukturen etwaiger neuer Verbindungen zu bestimmen (z.B. McDaniel et al. (1993)).
In einer verbesserten Version dieser Strategie wird mmyB in die Polylinker-HindIII-Stelle von pG-UP insertiert, vorzugsweise in einer Form, die eine HindIII-Stelle nur zwischen der Regulationskassette und dem mmyB-Gen regeneriert (siehe Beispiel 7b und 13b).
Beispiel 9: Fusionieren von Genen an die Kassette in Vektoren, die in Streptomyces-Wirten beibehalten werden können.
Viele Antibiotika-Stoffwechselwege sind für die Expression hochgradig von stoffwechselwegspezifischen Transkriptionsaktivatoren abhängig. Zusätzliche Kopien dieser Gene stimulieren oftmals eine beträchtliche Überproduktion des dazugehörigen Antibiotikums (z.B. Chater (1990)). Die Verwendung der Expressionskassette, um solche Gene zu exprimieren, würde das Beschränken der Überexpression auf dichte Kulturen ermöglichen, wodurch die Antibiotika-Produktion während früherer Wachstumsstadien minimiert wird: die vorzeitige Produktion würde die Gesamtausbeute verringern und könnte tödlich sein, wenn das Antibiotikum eine neue Verbindung wäre, hergestellt durch einen gentechnisch veränderten Hybrid-Stoffwechselweg, für den sich kein Selbstresistenzmechanismus entwickelt hat. Die Fähigkeit, solche Hybrid-Gen-Reihen in einem Standard-Wirt-Vektor-System zu exprimieren, würde das schnelle Screening großer Kombinationsbibliotheken ermöglichen. Beispiele könnten rekombinante Bibliotheken an Typ-I-Polyketid-Synthase-Genen umfassen. In einer anderen Verwendung dieser Art von Vektor kann DNA, die direkt aus der Umwelt (z.B. dem Boden) isoliert wird, aus der Expressionskassette exprimiert werden, was das Screening auf neue Verbindungen ermöglicht (6d). Um diesen Ansatz zu erleichtern, kann die Kassette, hergestellt wie oben stehend beschrieben, mit verschiedenen Vektoren kombiniert werden, die zu einem stabilen Erhalt in Streptomyces-Wirten in der Lage sind. Beispiele solcher Vektoren umfassen: jene, die als autonome Plasmide beibehalten werden, bei einer niedrigen oder mittleren Anzahl an Kopien (normalerweise basierend auf SCP2) oder bei einer hohen Anzahl an Kopien (oftmals basierend auf pIJ101); und jene, die sich wirksam in das Chromosom integrieren, und zwar durch ortspezifische Rekombination, welche die att-Stellen von Prophagen (wie z.B. C31: siehe 6d für ein Beispiel), integrativen Plasmiden (wie z.B. pSAM2) oder ortspezifischen Transposonen (wie z.B. IS117) involvieren.
Beispiel 10: Die Bereitstellung eines sauberen Hintergrunds.
Das bldA-Gen, das ohne Störung des Wachstums deaktiviert werden kann, kodiert für die tRNA für das seltene Codon UUA (TTA in der DNA). TTA-Codons sind in den meisten Antibiotika-Gen-Clustern vorhanden, jedoch nicht in Wachstumsgenen. Aus diesem Grund stellen bldA-Mutanten keine Antibiotika her. Die Expressionskassette enthält ein TTA-Codon, eine TTA-Codon-freie Version wurde jedoch konstruiert, um die Expression von mmfL in einer bldA-Mutante zu ermöglichen (siehe Beispiel 4).
Damit sich die Wirkungen davon in vollem Ausmaße manifestieren können, wird das TTA-Codon von mmyB auf ähnliche Art und Weise unter Verwendung des Strategene-„Quick-Change"-Systems gentechnisch zu einem alternativen Leucin-Codon verändert, und das veränderte Gen wird mittels Standardverfahren in den bldA-Wirtsstamm eingeführt, zusammen mit der Expressionskassette, die an die zu exprimierenden Gene gekoppelt ist. In einem bevorzugten Fall wird das TTA-freie mmyB-Gen in einen pG-UP-Vektor eingeführt, wie in 13b gezeigt. Es kann jedoch separat aus der Expressionskassette eingeführt werden, z.B. als Teil des Plasmids SCP1.
Da beinahe alle der TTA-Codons in Antibiotika-Clustern in Regulationsgenen vorhanden sind, sind neu entdeckte Gen-Reihen für biosynthetische Enzyme normalerweise TTA-frei.
Daher ist die Expression solcher Gene aus der TTA-freien Expressionskassette normalerweise in einem bldA-Wirt wirksam. Jeder beliebige neue Metabolit wird in Abwesenheit anderer Antibiotika hergestellt, was die Untersuchung einer Reihe biologischer und chemischer Aspekte des neuen Metaboliten leichter macht, ohne die Notwendigkeit, ihn von anderen bioaktiven Metaboliten zu trennen. Dementsprechend würden die in den Beispielen 5, 7 und 9 beschriebenen Vektoren auch mit der TTA-freien Version der Kassette konstruiert werden, um ihre Verwendung in bldA-Mutanten-Wirten zu erlauben, wie z.B. J1703, der eine integrierte Kopie von SCP1 enthält [für die Art von Vektor, die in Beispiel 5 beschrieben ist], oder J1700, der keine DNA aus dem Methylenomycin-Cluster enthält [für die Arten von Vektoren, die in den Beispielen 7 und 9 beschrieben sind].
Beispiel 11: Evaluierung des Methylenomycin-Promotors.
Zusammenfassung
Der Methylenomycin-Cluster wird auf dem großen linearen Plasmid, SCP1, von Streptomyces coelicolor getragen. Vorhergehende Arbeiten haben gezeigt, dass die Promotoren in diesem Cluster stark sind und im Handel verwendet werden könnten.
Dieses Beispiel beschreibt eine Reihe von Experimenten, um die Stärke des Methylenomycin-Promotors P_mmyTOG in S. coelicolor und heterologen Wirten, wie z.B. S. lividans und S. erythraea, zu evaluieren.
Um den Promotor zu evaluieren, wurde eine Reihe von Testvektoren gentechnisch verändert, in denen ein Reportergen unter die Kontrolle des Methylenomycin-Promotors platziert wird. Dieses Fragment wurde anschließend in einem geeigneten Vektor zur Einführung in einen passenden Wirt platziert. Das verwendete Reportergen war das für DEBS1-TE kodierende Gen. Die Stärke des Promotors kann auf der Basis der Ausbeute des Triketid-Lactons bewertet werden. Der Actinorhodin-Promotor P_actl wurde als positive Kontrolle verwendet.
Eine Gen-Kassette, enthaltend 5 Gene, mmyR, mmfP, mmfH, mmfL und mmfR, und den Promotor für mmyT, wurde konstruiert und als die Promotorkassette bezeichnet. Zusätzlich dazu wurde ein separates Gen identifiziert, mmyB, das ein seltenes TTA-Codon enthält, von dem ebenfalls wird angenommen, dass es in die Regulation dieses Promotors involviert ist. Nur Spurenmengen von Triketid-Lacton sind zu beobachten, wenn die Promotorkassette alleine in S. coelicolor verwendet wird. Die Ausbeute verbessert sich 40- bis 100fach, wenn das Plasmid SCP1 in den Zellen vorhanden ist. SCP1 nimmt den Methylenomycin-Cluster auf, der mmyB enthält. Die Erfinder schlagen daher vor, dass der beobachtete Anstieg auf die Gegenwart des mmyB-Genprodukts zurückzuführen ist.
Die in der Evaluierung des Methylenomycin-Promotors durchgeführten Experimente werden unten stehend ausführlich beschrieben.
(a) Isolation der Promotorkassette
Der finale Expressionsvektor enthält die Promotorkassette als ein SpeI/NdeI-Fragment, wobei die NdeI-Stelle so positioniert ist, dass sich das ATG-Startcodon des Gens von Interesse in optimalem Abstand von der ribosomalen Bindungsstelle des Promotors befindet. Dies wurde durch Amplifikation eines jeden Endes der Kassette mittels PCR unter Verwendung von Oligonucleotidprimern erreicht, die kreiert wurden, um die Sequenz für das geeignete Restriktionsenzym zu inkorporieren, sowie durch Klonieren in der zentralen Region unter Verwendung existierender Stellen (1).
Die Promotorkassette wurde aus cos73 (Redenbach et al. (1998)) folgendermaßen isoliert (siehe 15):
Das 8366-bp-EcoRI-Fragment von cos73 wurde in die einzigartige EcoRI-Stelle von pUC18 kloniert, um das Plasmid pCJR332 zu ergeben.
Dasselbe EcoRI-Fragment wurde als Matrize zur PCR-Amplifikation der Enden der Promotorkassette verwendet. Der Oligonucleotidprimer CR343 wurde kreiert, um die SpeI-Stelle an 2401-2406 bp einzuführen (Nummerierung vom Anfang des EcoRI-Fragments), das ist 200 bp nach dem Ende von mmyR. Der Oligonucleotidprimer CR344 ist vollständig komplementär zu der Wildtyp-Sequenz und bindet an einer SanDI-Stelle (3429-3435 bp – Nummerierung vom Anfang des Eco-RI-Fragments).
Das 1050-bp-PCR-Produkt wurde durch Behandlung mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in pUC18 kloniert, das zuvor mit SmaI verdaut und dephosphoryliert wurde. Die Ausrichtung wurde mittels Restriktionsenzymverdau bestimmt, und es wurden Inserts aus einer Reihe von Klonen der gewünschten Ausrichtung sequenziert, um nach Fehlern zu suchen, die während der In-vitro-Polymerisation inkorporiert wurden. Keiner der Klone war fehlerfrei, alle Fehler sind Substitutionen und befinden sich innerhalb der primerbindenden Region und nach dem Stopcodon von mmyR. Es wurde berücksichtigt, dass diese die Promotorkassette nicht beeinträchtigen würden, als Vorsichtsmaßnahme wurden jedoch zwei davon ausgewählt, um die Experimente weiterzuführen, und diese wurden pCJR331A und pCJR331B genannt, die Fehler werden unten stehend beschrieben:
pCJR331A enthält ein G an 2415 bp, wo die Wildtyp-Sequenz ein C aufweist;
pCJR331B enthält ein G an 2418 bp, wo die Wildtyp-Sequenz ein C aufweist, und ein
G an 2425 bp, wo die Wildtyp-Sequenz ein C aufweist.
Das 4750-bp-SanDI-Fragment (3431-8180 bp, Nummerierung vom Anfang des 8366-bp-EcoRI-Fragments) aus pCJR332 wurde in die einzige SanDI-Stelle in jedem von pCJR331A und pCJR331B kloniert, um die Plasmide pCJR334A und pCJR334B zu ergeben, die mittels Restriktionsanalyse bestätigt wurden.
Eine zweite PCR wurde verwendet, um die NdeI-Stelle zum Klonieren von Genen unter dem P_mmyTOG einzuführen. Der Oligonucleotidprimer CR346 wurde kreiert, um die NdeI-Stelle an 7481-7486 bp einzuführen (Nummerierung vom Anfang des EcoRI-Fragments). Der Oligonucleotidprimer CR345 ist vollständig komplementär zu der Wildtyp-Sequenz und bindet an einer XcmI-Stelle 6844-6855 bp (Nummerierung) vorn Anfang des Eco-RI-Fragments).
Das 657-bp-PCR-Fragment wurde durch Behandlung mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und in pUC18 kloniert, das zuvor mit SmaI verdaut und dephosphoryliert worden war. Die Ausrichtung wurde mittels Restriktionsenzymverdau bestimmt, und es wurden Inserts aus einer Reihe von Klonen der gewünschten Ausrichtung sequenziert, um nach Fehlern zu suchen, die während der In-vitro-Polymerisation inkorporiert wurden. Ein korrekter Klon wurde ausgewählt und pCJR328 genannt.
Die Plasmide pCJR334A und pCJR334B wurden mit HindIII und XcmI verdaut, und die 4491-bp-Inserts wurden isoliert. Sie wurden verwendet, um in pCJR328 zu ligieren, das mit HindIII und XcmI verdaut worden war. Korrekte Klone wurden unter Verwendung der Restriktionsanalyse identifiziert und pCJR335A und pCJR335B genannt.
Diese zwei Plasmide, pCJR335A und pCJR335B, enthalten die Promotorkassette, wie zuvor auf einem SpeI/NdeI-Fragment definiert. Um die Zweckdienlichkeit dieser Promotorkassette zu testen, wurde sie in verschiedene Hauptkettenvektoren eingeführt, die in einer Reihe verschiedener Wirte verwendet werden konnten, siehe (b) und (c).
(b) Kontruktion der Plasmide pCMS100 und pCMS101
Die Hauptkette für den ersten Expressionsvektor ist pCJR30 (Rowe et al. (1998)), der zuvor bereits für die Produktion des DEBS1-TE-Triketid-Lactons verwendet wurde, aus dem Actinorhodin-Promotor P_actl in Streptomyces coelicolor. Das Plasmid pCJR30 ist daher die positive Kontrolle für diese Experimente und stellt daher auch die Hauptkette für die Expressionsvektoren mit dem Methylenomycin-Promotor bereit.
pCJR30 wurde mit NdeI und SpeI und den Promotorkassetten aus pCJR335A und pCJR335B, als SpeI/NdeI-Fragmente isoliert, verdaut. Die Promotorkassetten wurden an die Hauptketten ligiert, korrekte Klone wurden mittels Restriktionsanalyse identifiziert, und ein einziger Klon aus jeder Ligation wurde, je nach Eignung, pCMS100A und pCMS100B genannt.
pCMS100A und pCMS100B sind finale Konstrukte zum Testen der Stärke des Methylenomycin-Promotors P_mmyTOG. Diese Plasmide können verwendet werden, um Mengen der DEBSI-TE-Triketid-Lacton-Produktion in Actinomyceten-Wirten zu untersuchen, welche den SCP2*-Replikationsstartpunkt beibehalten können.
Die Hauptkette für den zweiten Expressionsvektor ist pCJR65 (pCJR65 ist pCJR24 (Rowe et al. (1998)), enthaltend DEBS1-TE als ein NdeI/XbaI-Fragment), das zuvor bereits für die Produktion des DEBS1-TE-Triketid-Lactons aus dem Actinorhodin-Promotor P_actl in Saccharopolyspora erythraea verwendet wurde. Das Plasmid pCJR65 enthält keinen Replikationsstartpunkt für Actinomyceten und basiert auf der Gegenwart des für DEBS1-TE kodierenden Gens als homologe DNA, um die Integration in das Chromosom zu ermöglichen.
pCJR65 wurde mit NdeI und SpeI und den Promotorkassetten aus pCJR335A und pCJR335B, als SpeI/NdeI-Fragmente isoliert, verdaut. Die Promotorkassetten wurden an die Hauptketten ligiert, korrekte Klone wurden mittels Restriktionsanalyse i dentifiziert, und ein einziger Klon aus jeder Ligation wurde, je nach Eignung, pCMS101A und pCMS101B genannt.
pCMS101A und pCMS101B sind finale Konstrukte zum Testen der Stärke des Methylenomycin-Promotors P_mmyTOG. Diese Plasmide werden verwendet, um Mengen der DEBSI-TE-Triketid-Lacton-Produktion in S. erythraea JC2 (Rowe et al. (1998)) oder die Menge der Erythromycin-Produktion in S.-erythraea-Wildtyp zu untersuchen.
(c) Konstruktion der Plasmide pCMS104 und pCMS105
Die Inkorporation des mmyB-Gens in pCMS100 und pCMS101 wurde folgendermaßen gentechnisch verändert;
Das mmyB-Gen wurde aus cos73 mit den Primern CR349 und CR350 amplifiziert, welche die folgenden Sequenzen aufweisen;
Jeder der Oligonucleotidprimer besitzt eine HindIII-Stelle (AAGCTT), die an den 5'-Enden inkorporiert ist.
In der veröffentlichten Datenbank-Sequenz AJ276673 befindet sich das mmyB-Gen auf dem komplementären Strang zwischen 18032 bp und 18892 bp – die Oligonucleotidprimer binden an den folgenden Positionen;

17854-17890 Bindungsregion von CR350
19095-19122 Bindungsregion von CR349

Das vollständige Fragment bedeckt anschließend die Region 17854-19122 bp mit HindIII-Stellen, die diese direkt flankieren. Die gesamte nicht kodierende DNA von beiden Enden des Gens ist in diesem Fragment inkludiert. Es wird erwartet, dass sich stromauf dieses Gens ein Promotor befindet, und diese Strategie sollte sicherstellen, dass etwaige Promotorsequenzen inkorporiert werden, und falls etwaige Terminatorsequenzen vorhanden sind, sollten diese ebenfalls in das Fragment inkludiert werden. Das PCR-Fragment wurde in pUC18 kloniert, das zuvor mit SmaI verdaut und dephosphoryliert worden war, und Klone, die das Insert enthielten, wurde mittels Restriktionsanalyse identifiziert. Das Insert wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass keine Fehler während der PCR-Amplifikation inkorporiert wurden, und das resultierende Plasmid wurde pMMYBH genannt.
Das mmyB-Gen wurde anschließend auf einem HindIII-Fragment isoliert und in HindIII-verdautes, dephosphoryliertes pCMS100A, pCMS100B, pCMS101A und pCMS101B kloniert, um pCMS104A, pCMS104B, pCMS105A und pCMS105B zu ergeben.
(d) Produktion des DEBS1-TE-Triketid-Lactons aus dem P_mmyTOG-Promotor in Streptomyces coelicolor.
Die folgenden S.-coelicolor-Stämme wurden mit pCMS100A und pCMS100B transformiert.

S. coelicolor J1501 (SCP1–, SCP2–)
S. coelicolor J1506 (SCP1+, SCP2–)
S. coelicolor J1508 (SCP1NF, SCP2–)

Transformanten wurden mittels Resistenz gegenüber Thiostrepton ausgewählt, und die Gegenwart des Plasmids wurde durch erneute Isolierung des Plasmids und Analyse mittels Restriktionsverdau bestätigt.

Die Produktions- und Analyseexperimente wurden folgendermaßen durchgeführt: 6 ml von YEME + Additive (Glycin, MgCl₂, Uracil und Histidin, wie empfohlen) + Thiostrepton in einer Endkonzentration von 5 μg/Liter wurden mit Zellen von einer Platte beimpft und 48 Stunden lang bei 30°C (in Flaschen mit Federn, 250 U/min, 2 Zoll Ausschlag) wachsen gelassen. 300 μl wurden als 5% Inokulum in 6 ml eines jeden von YEME- und modifiziertem vollständigem Medium verwendet (wie in Kieser et al. (2000) beschrieben, jedoch ohne das Hefe-Nucleinsäure-Hydrolysat). Die Kulturen wurden 88 Stunden lang bei 30°C inkubiert. 3 ml jeder Kultur wurden mit Ameisensäure auf pH 3 angesäuert und zwei Mal mit einer gleichen Menge an Ethylacetat extrahiert, und die organische Phase wurde unter Verwendung eines Büchi-Rotationsverdampfers zur Trockene eingedampft. Dieses Rohmaterial wurde in 100 μl Methanol resuspendiert, und 1 μl wurde auf ein Gas-Chromatographieinstrument mit einem Massenspektrometriedetektor aufgebracht. Die Ausbeutewerte werden durch Vergleich mit einem synthetischen Standard berechnet, und die Zahlen ergeben die Menge an Triketid-Lacton in den 3-ml-Proben, die von der Kultur entfernt wurden. Resultate für die Produktion in vollständigem Medium:

Plasmid	Kolonie-Isolat	S. coelicolor J1501	S. coelicolor J1506
pCMS100A	2	kein Produkt
	3	Spurenmenge
pCMS100B	4	Spurenmenge
pCMS100A	6		mg/Liter
	7		mg/Liter
pCMS100B	8		mg/Liter

Diese Resultate zeigen, dass es eine beträchtliche Variabilität von Kolonie zu Kolonie gibt bezüglich der Produktionsmenge, damit ist nach der Protoplastentransformation zu rechnen. Bei Fehlen von SCP1 wurde sehr wenig Produkt festgestellt, eine Spurenmenge zeigt weniger als 0,1 mg/l. Die Erfinder sind sich sicher, dass die Ih nen vorliegenden Spurenmengen jene des Triketid-Lactons sind, da das Verhalten des Triketid-Lactons auf GC-MS vorhersehbar ist und die Massenspektroskopiefragmentierung charakteristisch ist. Die Produktionsmengen bei der Zucht von Kulturen in vollständigem Medium sind vergleichbar mit jenen, die vorhanden sind, wenn dieselben Kolonien in YEME gezüchtet werden (noch keine vollständigen Daten vorhanden). Die S.-coelicolor-J1506-[pCMS100A-]Kolonien 6 und 7 ergaben z.B. 20 bzw. 4 mg/l bei Kultur in YEME.
Weitere Experimente wurden folgendermaßen durchgeführt. Die Kulturen wurden in 6 ml eines geeigneten Mediums gezüchtet, und dies wurde als ein 5% Inokulum für Produktionskulturen verwendet. Auf diese Art und Weise sollten die Produktionskulturen für ein einzelnes Isolat vergleichbar sein, und der Vergleich der Produktionsmengen zwischen Isolaten sollte relativ störungsumempfindlich sein. In allen Fällen basieren die Ausbeutewerte auf 3 oder 4 ml Kultur, die aus den Flaschen abgezogen wurde, dabei wird in keinem der Fälle der Verdunstungsverlust der Flüssigkeit während der Fermentierung in Betracht gezogen. Das bedeutet, dass die angegebenen Ausbeutewerte Ausbeutewerte in den Endkulturen anstatt Produktionsmengen sind. Die Ausbeutewerte werden unter Verwendung der Massenspektrometrie berechnet, die einen assoziierten Fehler aufweist, solche Fehler sollten jedoch für alle Proben ähnlich sein, wobei sich die größten Fehler aufgrund schlecht definierter kleiner Peaks in der Berechnung der niedrigsten Ausbeutewerte befinden.

Es ist ebenso anzumerken, dass die Resultate immer für das Propionat-Starter-Triketid-Lacton [1] angegeben werden. Es gibt ein zweites Produkt aus dem DEBS1-TE-System, und dies ist das äquivalente Acetat-Starter-Triketid-Lacton [2], das hauptsächlich bei starken Produzenten zu beobachten ist oder wenn Propionat im System limitierend wirkt. Allgemein stellt es in diesen Experimenten weniger als 5% des Gesamtprodukts dar. Aus Platten und aus manchen der komplexen Medien kann es jedoch einen signifikanten Prozentsatz dieses Produkts geben, und in diesen Fällen wurde eine Ausbeute basierend auf dem Propionat-Starter-Standard berechnet.

(e) Produktion des DEBS1-TE-Triketid-Lactons aus dem P_mmyTOG-Promotor in Streptomyces coelicolor in verschiedenen Medien.

	Kultur	Yeme	vollständig	Hobbs	SSDM
1	J1501 [pCJR30]_12	Nein	Spur (0,7)	0,7	Nein
2	J1501[pCMS100A]_11	1	Spur	1,1	Nein
3	J1501 [pCMS100A]_12	Spur	Spur	1,4	Nein
4	J1501 [pCMS100B]_7	Spur	Spur	Nein	Nein
5	J1506 [pCJR30]_10	Nein	Spur (0,07)	Spur	Nein
6	J1506 [pCMS100A]_3	20	17	0,02	0,5
7	J1506 [pCMS100A]_9	4	2,3	0,03	0,6
8	J1506 [pCMS100B]_7	Spur	0,5	Spur	Nein

Yeme = Yeme + geeignete Addititive: Glycin, MgCl₂, Uracil und Histidin, wie empfohlen.
vollständig = wie in Kieser et al. (2000) beschrieben, jedoch ohne das Hefe-Nucleinsäure-Hydrolysat.
Hobbs = wie in Hobbs et al. (1992) beschrieben
SSDM = wie in Caffery et al. (1992) beschrieben

In allen Fällen werden Ausbeutewerte von Triketid-Lacton als mg/l auf der Basis des Vergleichs mit einer bekannten Quantität eines Syntheseprodukts mittels Massenspektrometrie angegeben. Die Quantifizierung mittels Massenspektrometrie unterliegt einer gewissen Fehlermenge, bei der die Konzentration eines Moleküls in einem Gemisch und die Zusammensetzung des Gemisches die Ionisierung der jeweiligen Verbindung bewirken. Nein zeigt, dass kein Produkt mittels Massenspektrometrie beobachtet wurde, und Spur zeigt, dass ein kleiner Peak beobachtet wird, der jedoch nicht gut genug definiert ist, um genau integriert zu werden.
Die Variabilität der Produktionsmengen von einem Medium zum anderen ist signifikant; und es wird vorgeschlagen, dass maximale Produktionsmengen unter Umständen nicht erreicht wurden. Dies kann durch statistische Analyse von Produktionsmengen erreicht werden, da unterschiedliche Komponenten der Medien und in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet werden.
In Hobbs-Medium, das für die Methylenomycin-Produktion adaptiert wird (d.h. 10 g/l Glucose wird anstelle von 2 hinzugefügt), scheint es eine höhere Produktion bei Abwesenheit von SCP1 zu geben.
Die Zunahme der Produktion mit vorhandenem SCP1 scheint eine tatsächliche Wirkung zu sein, trotz der kleinen Probengröße. Es wird vorgeschlagen, dass durch die Bereitstellung des mmyB-Gens in Isolation die absolute Ausbeute zunehmen könnte.
(f) Produktion des DEBS1-TE-Triketid-Lactons aus dem P_mmyTOG-Promotor in Saccharopolyspora erythraea in verschiedenen Medien.
Saccharopolyspora erythraea NRRL2338 JC2 (Rowe et al. (1998)) wurde mit pCMS100A, pCMS100B, pCMS105A und pCMS105B transformiert. Transformanten wurden unter Verwendung von Thiostrepton (Endkonzentration 50 μg/Liter) selektiert, und eine zweite Selektionsrunde, umfassend das Isolieren von Sporen und das Filtrieren auf frische Selektionsplatten, wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Isolate die Resistenz aus dem Plasmid enthielten.

Drei Isolate eines jeden von S. erythraea JC2/pCMS100A und S. erythraea JC2/pCMS100B wurden verwendet, um 6 ml TSB + tsr (Endkonzentration 5 μg/Liter) zu beimpfen. Diese Vorkulturen wurden verwendet, um 6 ml eines jeden von zwei verschiedenen Produktionsmedien zu beimpfen, von denen zuvor bereits gezeigt wurde, dass sie gute Mengen an Erythromycin ergeben, SSDM ist ein definiertes Minimalmedium, und SM3 (Ranganathan et al. (1999)) ist komplexer. Produktionskulturen wurden 7 Tage lang wachsen gelassen, und 4 ml einer jeden wurden entnommen und extrahiert. Die Analyse mittels GC-MS ergab die folgenden Resultate.

Kultur	SSDM [1]	SM3
Kultur	SSDM [1]	[1]	[2]
S. ery JC2 [pCMS100A]_1	0,5	8,4	3,0
S. ery JC2 [pCMS100A]_2	0,3	8,2	0,2
S. ery JC2 [pCMS100A]_3	0,6	4,0	0,2
S. ery JC2 [pCMS100B]_1	0,8	7,3	0,2
S. ery JC2 [pCMS100B]_2	0,9	5,5	0,2
S. ery JC2 [pCMS100B]_3	0,5	5,0	0,2

[1] und [2] beziehen sich auf die zwei Triketid-Starter-Lactone, wie oben stehend beschrieben.
Dieses Experiment zeigt, dass die Expressionskassette verwendet werden kann, um die Expression einer Nucleinsäure von Interesse in anderen Wirtszellen als S. coelicolor zu steuern. Ein gewisses Ausmaß an Expression wurde auch in S. lividans gezeigt.
Es wird erneut beobachtet, dass die Zusammensetzung der Medien eine signifikante Wirkung auf das Produktionsausmaß besitzt, und es wird erwartet, dass bei Optimierung und/oder in Gegenwart von mmyB höhere Ausbeutewerte erreicht werden können.
(g) Ein schneller Blick auf vergleichbare Ausbeutewerte von Triketid-Lacton von Flecken auf Platten
Um zu versuchen, einen schnellen Hinweis darüber zu erhalten, ob das mmyB-Gen die Produktionsmengen beeinträchtigen würde oder nicht, wurden Plugs aus Flecken auf R2YE-Platten entnommen und extrahiert, um nach dem Triketid-Lacton-Produkt zu suchen.
Unter Verwendung des Stamms J1501, dem das SCP1-Plasmid fehlt (und daher ein natives mmyB-Gen), wurde ein dramatischer (bis zu Größenordnungen) Anstieg der Ausbeute zwischen pCMS100A (dem mmyB feht) und pCMS104 (dem äquivalenten Plasmid, das auch mmyB besitzt) gezeigt.
Unter Verwendung von Stamm J1506 (der natives SCP1 und mmyB besitzt) wurde eine größere Expression mit pCMS100A gezeigt als sie unter Verwendung dieses Plasmids in J1501 gezeigt wurde, eine geringere Expression als in J1501 wurde jedoch mit pCMS104 in J1506 gezeigt. Die Expression in J1506 war mit beiden Plasmiden ähnlich.
Dies ist in Einklang mit der Tatsache, dass das mmyB-Genprodukt für die Expression von Vorteil ist, jedoch auch mit der Tatsache, dass dieses Produkt durch das (z.B. durch Promotoren von dem) native(n) SCP1-Plasmid maskiert wird, wenn vorhanden, anstatt dass es eine Zunahme der Expression aus der Expressionskassette bewirkt.

Die Ausbeutewerte stellen das aus dem Voll-Agar-Plug erhaltene Gesamtprodukt dar (μg).

R2YE	Kultur	Ausbeute (μg)
R2YE	Kultur	[1]	[2]
26	J1501 [pCMS100A]_6	Spur	keine
27	J1506 [pCMS100A]_8	1,0	0,4
31	J1501 [pCMS104]_2	12	20
32	J1501 [pCMS104]_6	1,5	2,5
33	J1506 [pCMS104]_1	2,3	2,6
34	J1506 [pCMS104]_7	1	1,0

In manchen Fällen war das zweite Produkt das vorherrschende Produkt, was wahrscheinlich die Verfügbarkeit von Substrat widerspiegelt, das daher ein einschränkender Faktor sein kann.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionskassette zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse, wobei die Expressionskassette Folgendes umfasst: einen Regulationsabschnitt oder Regulationsabschnitte, umfassend: ein erstes Regulationselement, das entweder ein mmyR-Gen, das für ein MmyR-Polypeptid kodiert, oder ein mmfR-Gen, das für ein MmfR-Polypeptid kodiert, oder beides umfasst; ein zweites Regulationselement, das ein mmfL-Gen umfasst, das für ein MmfL-Polypeptid kodiert; und einen Promotor (den „reprimierbaren Promotor"), dessen Funktion durch das Expressionsprodukt des ersten Regulationselements unterdrückt wird, wobei die Unterdrückung durch ein Produkt gemindert oder beseitigt wird, dessen Produktion durch das MmfL-Polypeptid verliehen wird, und eine heterologe Nucleinsäure von Interesse, die sich in operativer Assoziierung mit dem Promotor befindet, worin: das mmyR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren); das mmfR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist; und das mmfL-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist.
Reihe von Nucleinsäuren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse, wobei die Reihe von Nucleinsäuren zusammen Folgendes umfasst: einen Regulationsabschnitt oder Regulationsabschnitte, umfassend: ein erstes Regulationselement, das entweder ein mmyR-Gen, das für ein MmyR-Polypeptid kodiert, oder ein mmfR-Gen, das für ein MmfR-Polypeptid kodiert, oder beides umfasst; ein zweites Regulationselement, das ein mmfL-Gen umfasst, das für ein MmfL-Polypeptid kodiert; einen Promotor (den „reprimierbaren Promotor"), dessen Funktion durch das Expressionsprodukt des ersten Regulationselements unterdrückt wird, wobei die Unterdrückung durch ein Produkt gemindert oder beseitigt wird, dessen Produktion durch das MmfL-Polypeptid verliehen wird, und eine heterologe Nucleinsäure von Interesse, die sich in operativer Assoziierung mit dem Promotor befindet, worin: das mmyR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8a aufweist (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren); das mmfR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8e aufweist; und das mmfL-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8d aufweist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der/die Regulationsabschnitt(e) sowohl ein mmyR-Gen als auch ein mmfR-Gen umfasst/umfassen, wie in Anspruch 1 definiert.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend weiters ein drittes Regulationselement, das ein mmyB-Gen umfasst, das für ein MmyB-Polypeptid kodiert, worin das mmyB-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der in EMBL AJ276673 dargelegten mmyB-Aminosäuresequenz aufweist, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der/die Regulationsabschnitt(e) zumindest einen Abschnitt der 9,5-kb-Nucleinsäuresequenz, wie in 7 dargestellt, oder eine Variante davon mit zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der in 7 dargestellten Nucleinsäuresequenz umfasst/umfassen.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der reprimierbare Promotor ein Promotor eines biosynthetischen Methylenomycin- oder -Regulationsgens ist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der reprimierbare Promotor einen mmyTOG-Promotor oder einen mmy...XCAPK-Promotor oder einen mmfLHP-Promotor oder einen mmyYF-Promotor oder einen mmyBQE-Promotor umfasst, worin der mmyTOG-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 5452 bis 5675 aus 7, oberer Strang, umfasst; der mmfLHP-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 4613 bis 4806 aus 7, unterer Strang, umfasst, der mmy...XCAPK-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten des Komplements der Reste 18892 bis 19123 oder 15404 bis 15977 aus EMBL AJ276673 umfasst, der mmyYF-Promotor ein Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 18892 bis 19123 aus EMBL AJ276673 umfasst; und/oder der mmyBQE-Promotor ein Fragment von zumindest 30 Resten des Komplements der Reste 18892 bis 19123 bis 19123 aus EMBL AJ276673 umfasst, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 7, worin zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyT-, eines mmyO- und/oder eines mmyG-Gens im Regulationsabschnitt vorhanden ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyTOG-Promotor; zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyD-, mmyX-, eines mmyC-, eines mmyA-, eines mmyP- und/oder eines mmyK-Gens und/oder gegebenenfalls zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyB-, eines mmyQ- und/oder eines mmyE-Gens im Regulationsabschnitt vorhanden ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmy...XCAPK-Promotor; zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmfP-Gens und/oder eines mmfH-Gens in dem/den Regulationsabschnitt(en) vorhanden ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmfLHP-Promotor; zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyY-Gens und/oder eines mmyF-Gens in dem/den Regulationsabschnitt(en) vorhanden ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyYF-Promotor; und/oder zumindest ein Teil von zumindest einem eines mmyB-Gens, eines mmyQ-Gens und/oder eines mmyE-Gens in dem/den Regulationsabschnitt(en) vorhanden ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyBQE-Promotor, worin das mmyT-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8f aufweist; das mmyO-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8g aufweist; das mmyG-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8h aufweist; das mmfP-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8b aufweist; das mmfH-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8c aufweist; die mmyD-, mmyX-, mmyC-, mmyA-, mmyP-, mmyK-, mmyB-, mmyQ-, mmyE-, mmyF- und mmyY-Gene für Polypeptide kodieren, die zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit den mmyD-, mmyX-, mmyC-, mmyA-, mmyP-, mmyK-, mmyB-, mmyQ-, mmyE-, mmyF- und mmyY-Aminosäuresequenzen aufweisen, die in EMBL AJ276673 dargelegt sind, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 8, worin sich das mmfL-Gen des zweiten Regulationselements auch in operativer Assoziierung mit dem reprimierbaren mmfLHP-Promotor befindet, wie in Anspruch 7 definiert, und/oder worin sich das mmyB-Gen des dritten Regulationselements auch in operativer Assoziierung mit demselben reprimierbaren mmyBQE-Promotor, wie in Anspruch 7 definiert, befindet.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der/die Regulationsabschnitt(e) ein mmfP-Gen und/oder ein mmfH-Gen umfasst/umfassen und worin: das mmfP-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8b aufweist; und/oder das mmfH-Gen für ein Polypeptid kodiert, das zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 8c aufweist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das erste Regulationselement auch einen Promotor umfasst, der operativ an das mmyR- und/oder das mmfR-Gen gebunden ist, worin die mmyR- und die mmfR-Gene wie in Anspruch 1 definiert sind.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 11, umfassend ein mmyR-Gen, das operativ an einen mmyR-Promotor gebunden ist, und/oder ein mmfR-Gen, das operativ an einen mmfR-Promotor gebunden ist, worin: der mmyR-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 1557 bis 1390 aus 7, unterer Strang, umfasst (gegebenenfalls unter Ausschluss der Reste 1409 bis 1390); und/oder der mmfR-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 4613 bis 4806 aus 7, oberer Strang, umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das zweite Regulationselement einen Promotor umfasst, der operativ an das mmfL-Gen gebunden ist, worin das mmfL-Gen wie in Anspruch 1 definiert ist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 13, worin der Promotor ein mmfL-Promotor ist, worin der mmfL-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 4806 bis 4613 aus 7, unterer Strang, umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend einen mmfL-Promotor und/oder einen mmfR-Promotor, umfassend eine Palindromsequenz mit einer Halbseite 5'-GG(T/C)CGGT(A/T)(T/C)G(T/G)-3' oder eine Variante davon mit einer Sequenzidentität an sieben oder mehr korrespondierenden Positionen innerhalb der Halbseite, worin: der mmfL-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 4806 bis 4613 aus 7, unterer Strang, umfasst; und/oder der mmfR-Promotor eine Sequenz mit zumindest 60% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 4613 bis 4806 aus 7, oberer Strang, umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 15, worin die Palindromsequenz die Halbseite 5'-GGAAGGTATTA-3' aufweist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem bidirektionalen mmfL/mmfR-Promotor in operativer Assoziierung mit den mmfL- und mmfR-Genen, wie in einem der Ansprüche 1, 12 und 14 definiert.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit einem Fragment von zumindest 30 Resten der Reste 3551 bis 5451 aus 7, oberer Strang.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Nucleinsäure von Interesse in den Regulationsabschnitt insertiert ist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 19, worin die Nucleinsäure von Interesse in folgende Orte insertiert ist: in ein mmyT-, mmyO- oder mmyG-Gen in operativer Assoziierung mit einem mmyTOG-Promotor; in ein mmyD-, ein mmyX-, ein mmyC-, mmyA-, mmyP- oder ein mmyK-Gen oder gegebenenfalls in ein mmyB-, mmyQ- oder mmyE-Gen in operativer Assoziierung mit einem mmy...XCAPK-Promotor; in ein mmfH- oder mmfP-Gen in operativer Assoziierung mit einem mmfLHP-Promotor; in ein mmyP- oder mmyF-Gen in operativer Assoziierung mit einem mmyYF-Promotor; und/oder in ein mmyB-, mmyQ- oder mmyE-Gen in operativer Assoziierung mit einem mmyBQE-Promotor, wie in Anspruch 7 und Anspruch 8 definiert.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin die Nucleinsäure von Interesse durch homologe Rekombination insertiert wurde.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das MmyR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit den Resten 40 bis 49 aus 8a aufweist; das MmfR-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit den Resten 61 bis 70 aus 8e aufweist; und/oder das MmfL-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit den Resten 77 bis 87 und/oder den Resten 240 bis 255 aus 8d aufweist.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 22, worin das mmyR-Gen zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 7 aufweist, die den Aminosäureresten 40 bis 49 aus 8a entspricht; das mmfR-Gen zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 7 aufweist, die den Aminosäureresten 61 bis 70 aus 8e entspricht; und/oder das mmfL-Gen zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Sequenz aus 7 aufweist, die den Aminosäureresten 77 bis 87 und/oder den Resten 240 bis 255 aus 8d entspricht.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 22, worin: das mmyR-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 1407 bis 796 aus 7, unterer Strang (gegebenenfalls unter Ausschluss der Reste 1407 bis 1390), umfasst das mmfR-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 4807 bis 5451 aus 7, oberer Strang, umfasst; das mmfL-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 4612 bis 3551 aus 7, unterer Strang, umfasst; das mmfH-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 3554 bis 2352 aus 7, unterer Strang, umfasst; das mmfP-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 2355 bis 1558, gegebenenfalls unter Ausschluss der Reste 2355 bis 2353, aus 7, unterer Strang, umfasst; das mmyT-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 5676 bis 6401 aus 7, oberer Strang, umfasst; das mmyO-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 6432 bis 7553 aus 7, oberer Strang, umfasst; das mmyG-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz der Reste 7636 bis 8817 aus 7, oberer Strang, umfasst; und/oder das mmyB-Gen eine Sequenz mit zumindest 50% Nucleinsäureidentität mit der Sequenz des Komplements der Reste 18032 bis 18892 aus EMBL AJ276673 aufweist, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin: das mmyR-Gen für ein MmyR-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8a kodiert (gegebenenfalls unter Ausschluss der ersten 6 gelisteten Aminosäuren); das mmfR-Gen für ein MmfR-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8e kodiert; das mmfL-Gen für ein MmfL-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8d kodiert; das mmfP-Gen für ein MmfP-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8b kodiert; das mmfH-Gen für ein MmfH-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8c kodiert; das mmfT-Gen für ein MmfT-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8f kodiert; das mmfO-Gen für ein MmfO-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8g kodiert; das mmfG-Gen für ein MmfG-Polypeptid mit der Aminosäuresequenz aus 8h kodiert; und/oder das mmyB-Gen für ein MmyB-Polypeptid mit der in EMBL AJ276673 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert, worin die Nucleinsäuresequenz aus EMBL AJ276673 die Sequenz aus 7 umfasst.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, worin die Aminosäuresequenzidentität zumindest 90% beträgt.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 26, worin die Aminosäuresequenzidentität zumindest 95% beträgt.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, worin die Nucleinsäuresequenzidentität zumindest 80% beträgt.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach Anspruch 28, worin die Nucleinsäuresequenzidentität zumindest 90% beträgt.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Nucleinsäure von Interesse, abgesehen von dem reprimierbaren Promotor, sich nicht zusätzlich in operativer Assoziierung mit einem beliebigen exogenen Promotor befindet.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der/die Regulationsabschnitt(e) eine Nucleinsäure mit zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Sequenz von Rest 796 bis zu einem Rest zwischen 5676 und 8817, einschließlich 7, umfasst/umfassen und worin die Nucleinsäuresequenz von Interesse in die mmyTOG-Region oder stromab davon insertiert ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmyTOG-Promotor, wie in Anspruch 7 definiert.
Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der/die Regulationsabschnitt(e) eine Nucleinsäure mit zumindest 50% Nucleinsäuresequenzidentität mit der Sequenz von Rest 796 bis Rest 5451, einschließlich 7, umfasst/umfassen und worin die Nucleinsäure von Interesse in die mmfHP-Region oder stromab davon insertiert ist, und zwar in operativer Assoziierung mit dem mmfLHP-Promotor, worin der mmfLHP-Promotor wie in Anspruch 7 definiert ist.
Vektor oder Reihe von Vektoren, umfassend eine Expressionskassette oder Reihe von Nucleinsäuren nach einem vorhergehenden Anspruch.
Expressionssystem, umfassend eine Expressionskassette, eine Reihe von Nucleinsäuren, einen Vektor oder eine Reihe von Vektoren nach einem vorhergehenden Anspruch.
Expressionssystem nach Anspruch 34, das eine Bakterienzelle umfasst.
Expressionssystem gemäß Anspruch 35, worin es sich bei dem Bakterium um Streptomyces handelt.
Expressionssystem nach einem der Ansprüche 34 bis 36, weiters umfassend ein mmyB-Gen, das für ein MmyB-Polypeptid kodiert, worin das MmyB-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der MmyB-Aminosäuresequenz aufweist, die in EMBL AJ276673 gezeigt ist, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionssystem nach Anspruch 37, worin das mmyB-Gen innerhalb der Expressionskassette, der Reihe von Nucleinsäuren oder des/der Vektors/Vektoren vorhanden ist.
Expressionssystem nach Anspruch 38, worin das mmyB-Gen sich in operativer Assoziierung mit einem mmyBQE-Promotor befindet, wobei der Promotor ein Fragment von zumindest 30 Resten des Komplements der Reste 18892 bis 19123 aus EMBL AJ276673 umfasst, worin die in EMBL AJ276673 gezeigte Nucleinsäuresequenz die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Expressionssystem nach Anspruch 37, worin das mmyB-Gen als Teil des Wirtszellengenoms vorhanden ist.
Expressionssystem nach Anspruch 37, worin sich das mmyB-Gen auf einem SCP1- oder pSV1-Plasmid befindet.
Expressionssystem nach einem der Ansprüche 34 bis 41, dem die Fähigkeit fehlt, das Codon TTA (UUA in mRNA) zu translatieren.
Expressionssystem nach Anspruch 42, worin das mmfL-Gen und/oder das mmyB-Gen modifiziert ist, so dass ihm ein natürlich vorkommendes TTA-Codon fehlt.
Verfahren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse, wobei das Verfahren das Bereitstellen eines Expressionssystems nach einem der Ansprüche 34 bis 43 sowie das Erhalten des Expressionssystems bei Bedingungen, die für die Expression der Nucleinsäure von Interesse geeignet sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44 zur Expression der Nucleinsäure von Interesse im Wesentlichen nur dann, wenn die Wirtszellenkultur eine hohe Zelldichte erreicht.
Verfahren nach Anspruch 45 zur Expression der Nucleinsäure von Interesse im Wesentlichen nur in der oder nahe der stationären Phase der Wirtszellkultur.
Verfahren zur Expression einer Nucleinsäure von Interesse, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das Bereitstellen eines Regulationsabschnitts oder von Regulationsabschnitten, wie in einem der Ansprüche 1 bis 32 definiert, in einem Expressionssystem; das Bereitstellen der Nucleinsäure von Interesse in dem Expressionssystem; das operative Assoziieren der Nucleinsäure von Interesse mit dem reprimierbaren Promotor des/der Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitte; und das Erhalten des Expressionssystems bei Bedingungen, die für die Expression der Nucleinsäure von Interesse geeignet sind.
Verfahren nach Anspruch 47, worin der Schritt der operativen Assoziierung vor dem Einführen des/der Regulationsabschnitts/Regulationsabschnitte und der Nucleinsäure von Interesse in das Expressionssystem auftritt.
Verfahren nach Anspruch 47 oder Anspruch 48, worin das Expressionssystem wie in einem der Ansprüche 34 bis 43 definiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 49, worin die Nucleinsäure von Interesse in operative Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor gebracht wird, indem die Nucleinsäure von Interesse stromab des reprimierbaren Promotors insertiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 49, worin die Nucleinsäure von Interesse in operative Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor gebracht wird, indem der reprimierbare Promotor in die Nucleinsäure, welche die Nucleinsäure von Interesse enthält, insertiert wird.
Verfahren, umfassend die Bereitstellung eines Expressionsprodukts durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 44 bis 51 sowie das Unterziehen des Expressionsprodukts eines oder mehrerer Reinigungsschritte.
Nucleinsäure oder Reihe von Nucleinsäuren, umfassend einen Regulationsabschnitt oder Regulationsabschnitte, wie in einem der Ansprüche 1 bis 32 definiert, worin die Nucleinsäure(n) in der Lage ist oder gemeinsam in der Lage sind, die Expression einer heterologen Nucleinsäure von Interesse zu regulieren, wenn diese Nucleinsäure von Interesse in operativer Assoziierung mit dem reprimierbaren Promotor angeordnet ist, und worin die Nucleinsäure nicht aus dem SCP1-Plasmid besteht.
Nucleinsäure, bestehend aus einem oder mehreren von einem mmyR-Gen, einem mmfP-Gen, einem mmfH-Gen, einem mmfL-Gen, einem mmfR-Gen, einem mmyT-Gen, einem mmyO-Gen und einem mmyG-Gen, wie in Anspruch 1 und Anspruch 8 definiert, gegebenenfalls mit einer jeweiligen stromauf gelegenen Region oder jeweiligen stromauf gelegenen Regionen, wobei die Nucleinsäure nicht aus dem SCP1-Plasmid besteht.
Nucleinsäure nach Anspruch 54, worin das/die Gen(e) wie in einem der Ansprüche 23 bis 25 definiert ist/sind.
Nucleinsäure nach Anspruch 54 oder Anspruch 55, worin die stromauf gelegene Region einen Promotor umfasst.
Nucleinsäure nach Anspruch 56, worin der Promotor wie in einem der Ansprüche 7, 12, 14, 15 oder 16 definiert ist.
Verwendung einer oder mehrerer Nucleinsäuren, wie in einem der Ansprüche 53 bis 57 definiert, bei der oder für die Regulierung der Expression einer heterologen Nucleinsäure von Interesse in einem Expressionssystem.
Isoliertes Polypeptid, das von einem der folgenden Gene kodierbar ist: einem mmyR-Gen, einem mmfP-Gen, einem mmfH-Gen, einem mmfL-Gen, einem mmfR-Gen, einem mmyT-Gen, einem mmyO-Gen und einem mmyG-Gen, wie in Anspruch 1 und Anspruch 8 definiert ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 59 mit einer Aminosäuresequenz wie in einer der 8a bis 8h gezeigt wird.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 53 bis 57.
Expressionssystem, enthaltend eine oder mehrere Nucleinsäuren nach einem der Ansprüche 53 bis 57 oder einen Vektor nach Anspruch 61.
Expressionssystem nach Anspruch 62, das ein mmyB-Gen umfasst, das für ein MmyB-Polypeptid kodiert, worin das MmyB-Polypeptid zumindest 80% Aminosäuresequenzidentität mit der MmyB-Aminosäuresequenz aufweist, die in EMBL AJ276673 dargelegt wird, worin die Nucleinsäuresequenz, die in EMBL AJ276673 gezeigt wird, die in 7 dargestellte Sequenz umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, wie in Anspruch 59 oder 60 definiert, wobei das Verfahren den Erhalt eines Expressionssystems umfasst, wie in Anspruch 62 oder 63 definiert, und zwar unter für die Produktion des Polypeptids geeigneten Bedingungen.
Verfahren nach Anspruch 64, umfassend das Unterziehen des Polypeptids einem oder mehreren Reinigungsschritten.