DE68922533T2

DE68922533T2 - Klonier- und Expressionvektoren in einem Aktinomycetenstamm,Verfahren zur Transformation dises Stammes,erhaltener Stamm und Herstellung von Proteinen.

Info

Publication number: DE68922533T2
Application number: DE68922533T
Authority: DE
Inventors: Frederic Boccard; Michel Guerineau; Tamara Smokvina
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1988-05-18
Filing date: 1989-05-16
Publication date: 1995-10-19
Anticipated expiration: 2009-05-17
Also published as: US5688689A; EP0350341A1; ATE122399T1; JPH0269185A; FR2631634B1; ES2073451T3; CA1340746C; FR2631634A1; EP0350341B1; JP2913406B2; DE68922533D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Vektoren zur Klonierung und Expression von Proteinen in Actinomyceten sowie die durch diese Vektoren transformierten Stämme.
Die Bakterien, die zu der Ordnung der Actinomycetalen gehören, und insbesondere diejenigen des Genus Streptomyces, nehmen eine besonders wichtige Stelle in der industriellen Mikrobiologie ein. Seit der Entdeckung eines Streptomycin-bildenden Stammes von Streptomyces durch Waksman wurden nämlich innerhalb der letzten 40 Jahre zahlreiche weitere Stämme von Streptomyces, die Antibiotika bilden, isoliert und industriell ausgebeutet. Die Reichhaltigkeit und Vielfältigkeit der durch die Streptomyces gebildeten Sekundär-Metabolite ergeben sich aus der Tatsache, daß diese 55 % der 1978 gezählten natürlichen 4973 Antibiotika synthetisieren. Etwa 70 % der industriell hergestellten Antibiotika sind solche, die durch Streptomyces gebildet werden. Die Sekundär-Metabolite mikrobiellen Ursprungs werden bisher vor allem verwendet wegen ihrer Antibakterien-, Antifungi- und Antitumor-Aktivität. Substanzen, die diese Aktivitäts-Typen aufweisen, wurden während des Zeitraums von 1950-1970 in sehr großer Anzahl entdeckt. Derzeit verlangsamt sich der Rhythmus der Entdeckungen für diese Anwendungstypen, die Reichhaltigkeit der mikrobiellen Sekundär-Metabolite ist jedoch bei weitem noch nicht ausgeschöpft. Derzeit werden nämlich neue Anwendungsgebiete erforscht, welche die antiparasitären, insektiziden, herbiziden oder pharmakologischen Aktivitäten dieser Produkte betreffen. Auch auf diesen Gebieten sind die Produkte von Streptomyces zahlreich: es können genannt werden das Monensin, das den Markt der Produkte gegen die Kokzidose beherrscht, die Avermectine, die gegenüber den Parasiten-Nematoden des Weidevieh sehr aktiv sind und auch eine insektizide Aktivität aufweisen, die Nikkomyzine, welche die Chitin-Synthese blockieren und daher eine insektizide Aktivität aufweisen. Auch bilden die Streptomyces Substanzen, die interessant sind wegen ihrer pharmakologischen Aktivität, wie antiinflammatorische Substanzen und vasodilatatorische Substanzen.
Ein anderer Grund, sich für Streptomyces zu interessieren, ist ihre Verwendung als Wirt für die Expression von heterologen Genen. Zahlreiche Industriebetriebe besitzen nämlich das Know-How und die Apparaturen, die erforderlich sind, um Streptomyces zu kultivieren und diese Kulturen auszubeuten. Eine Kultur in der stationären Phase kann mehrere Wochen lang stoffwechselaktiv bleiben und weiterhin Proteine und sekundäre Metabolite synthetisieren. Da die Streptomyces eine große Anzahl von extrazellulären Enzymen bilden, von denen mehrere industriell verwendet werden, wie z.B. die Proteasen oder die Glucose-Isomerase, könnte ihr Exkretions-System für die Bildung (Produktion) von heterologen Proteinen verwendet werden. Streptomyces lividans wurde und wird noch immer mit Erfolg als Wirt für die Expression des Rinder-Wachstumshormons von der Firma Biogen verwendet (Gray et al.,
Die Verwendung des Stammes Streptomyces ambofaciens ist besonders geschätzt für die Produktion(Bildung) von Spiramycin, einem Antibiotikum aus der Familie der Makrolide das von der Firma Rhône-Poulenc produziert wird. Darüber hinaus handelt es sich um einen Stamm, der kein Restriktions-Phänomen gegenüber Fremd-DNA aufzuweisen scheint (Cox et al., 1984), was die molekularen Klonierungs-Versuche erleichtert. Die hauptsächlichen Forschungsgruppen, die an der Erforschung der Streptomyces als Makrolid-Bildnern arbeiten und auch S. ambofaciens verwenden, sind diejenige von Pr. Omura in Japan, diejenige von R.H. Baltz der Firma Eli Lilly in USA und diejenige von Dr. A. Sabatier der Firma Rhône-Poulenc Santé.
Die Forschungsgruppe von S. Omura interessiert sich hauptsächlich für Wege der Biosynthese der Makrolide, für das Auffinden neuer Makrolide und für die Herstellung von Hybrid-Makroliden (Omura, 1984). Die Forschungsgruppe von Balz arbeitet hauptsächlich mit S. fradiae und S. erythraeus, die Tylosin bzw. Erythromycin bilden (Baltz et al., 1983), sie verwendet jedoch S. ambofaciens als Wirt in zahlreichen molekularen Klonierungs-Versuchen (Kuhstoss und Rao, 1983; Matsuhima und Baltz, 1985).
Als Folge des Studiums mehrerer Stämme von Streptomyces ambofaciens, die zu zwei Isolaten verschiedenen geographischen Ursprungs gehören, wurde die Anwesenheit eines speziellen Plasmids nachgewiesen: des Plasmids pSAM2 ("Mol. Gen. Genet." (1984) 198:35-41, "Plasmids in different strains of Streptomyces ambofaciens: free and integrated form of plasmid pSAM2"; und "Gene", 59 (1987), 137- 144, "Excision and integration of a self-transmissible replicon of Streptomyces ambofaciens").
Das Plasmid pSAM2 hat eine Größe von 11 kb, es kann im freien und/oder integrierten Zustand vorliegen und kann, wie sich gezeigt hat, von einem Stamm auf einen anderen übergehen. Es konnte auch das Phänomen nachgewiesen werden, daß das Plasmid pSAM2 in die Chromosomen von Empfängerstämmen integriert wird, dieses Phänomen ist bis heute jedoch nicht aufgeklärt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher einen Vektor zur Klonierung und Expression einer DNA-Sequenz, die für ein vorgegebenes Protein in einem Actinomyceten-Stamm codiert, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er umfaßt: eine Bindungs-Sequenz att,
eine DNA-Sequenz, die für eine funktionelle Sequenz int in dem genannten Stamm codiert, und
eine DNA-Sequenz, die für das genannte spezifische Protein und für die Elemente codiert, welche die Expression der genannten Sequenz in dem genannten Stamm gewährleisten.
Dieser Vektor ist insbesondere vorgesehen als Expressionsvektor, der für ein Protein codiert, das selbst von Interesse ist, oder auch die Herstellung von sekundären Metaboliten, z.B. solchen, wie sie weiter oben beschrieben worden sind, fördert, insbesondere die Bildung von Antibakterien-, Antifungi-, Antitumor-Substanzen und Proteinen, wie z.B. Enzymen, die bereits unter Verwendung eines Stammes der Actinomyceten erhalten werden und die auch von anderen Organismen gebildet werden können.
Unter den Sequenzen att können insbesondere die Sequenzen genannt werden, die ausgewählt werden aus:
der Sequenz
TTCTCTCTCGCGGTGGCGGGATFLGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA,
der Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % mit dieser Sequenz aufweist.
Die Erfindung hat nämlich gezeigt, daß der Mechanismus der Chromosomen-Integration des Plasmids pSAM2 eine Bindungs-Sequenz impliziert, die durch diesen Nucleotid- Sequenz-Typ charakterisiert ist.
Es wurde die Restriktions-Karte von pSAM2 bestimmt und sie ist in der Fig. 1 dargestellt. Die Bindungs-Sequenz ist in der Fig. 3 eingerahmt; sie beginnt bei der Position + 24 und endet bei der Position - 24. Das Nucleotid in der Position 0 entspricht dem Zentrum der Bindungs- Stelle (Bindungs-Frequenz).
Die erfindungsgemäßen Vektoren weisen außerdem eine Sequenz auf, die in dem genannten Stamm für eine funktionelle Sequenz int codiert, es handelt sich dabei um eine Sequenz, die für eine Integrase codiert, die der Bindungs- Sequenz im allgemeinen vorhergeht oder in der Nähe derselben angeordnet ist (vgl. Fig. 2). Die Sequenz int spielt eine wichtige Rolle bei dem Integrations-Phänomen.
Die diesem Gen int entsprechende Nucleotid-Sequenz wurde bestimmt und ist in der Fig. 3 dargestellt: sie entspricht einer DNA-Sequenz zwischen den Positionen + 1261 und + 97. Dieser Sequenz int geht meistens das Gen xis voraus, bei dem es sich um das Gen handelt, das für die Exzision codiert, oder es überlappt sich mit diesem. Die Sequenz dieses Gens ist ebenfalls in der Fig. 3. dargestellt.
Die erfindungsgemäßen Vektoren haben größtenteils (meistens) die Eigenschaft, sich mit einer sehr hohen Stabilität in die Chromosomen zu integrieren.
Um eine große Anzahl von Vektor-Kopien pro Genom in Form eines autoreplizierbaren Plasmids zu erhalten, wobei zusätzlich eine Kopie in das Chromosom integriert oder nicht-integriert ist, ist es vorteilhaft, über Vektoren zu verfügen, in denen ein Fragment von 600 bp beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 von pSAM2 deletiert worden ist, d.h. das im wesentlichen aus einem Fragment deletiert worden ist, das sich zwischen zwei wiederkehrenden Sequenzen erstreckt, die beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 angeordnet sind (vgl. Fig. 1). Darüber hinaus können diese Vektoren Fragmente enthalten, welche die Gene int und xis tragen.
Die so erhaltenen Vektoren haben die Eigenschaften, sich in ausreichend großer Anzahl zu vervielfältigen.
Wie bei allen Klonierungs- und Expressions-Vektoren inseriert man vorzugsweise die Elemente, die aus Bakterien, insbesondere E. coli, stammen, um die Konstruktion der Vektoren in diesen Bakterien zu erlauben, bei der Einführung in die Actinomyceten-Stämme können diese den Bakterien E. coli entsprechenden Fragmente jedoch unterdrückt werden. Die in den bakteriellen Konstruktionen verwendbaren Elemente sind bekannt, es handelt sich dabei meistens um einen Replikations-Ursprung, der die Vervielfältigung der Plasmide erlaubt, gegebenenfalls um eine funktionelle Resistenz in den genannten Plasmiden und erforderlichenfalls um andere Elemente, welche den Einbau in E. coli erleichtern.
Die DNA-Sequenz, die für das genannte spezifische Protein und für die Elemente, welche die Expression der genannten Sequenz in dem genannten Stamm gewährleisten, codiert, kann an verschiedenen Stellen in den Vektor inseriert werden.
Wenn man einen Actinomyceten-Stamm herzustellen wünscht, der ein vorgegebenes Protein bildet (produziert), dessen DNA-Sequenz in das Chromosom integriert ist, verwendet man vorzugsweise einen Vektor, wie er weiter oben beschrieben worden ist und in dem die fragliche DNA-Sequenz außerhalb der Sequenzen att und int integriert ist, wobei man in diesem Fall die Integration in das Chromosom begünstigt.
Wenn man dagegen wünscht, daß dieses Plasmid nicht vollständig in das Chromosom integrierbar ist, kann die fragliche DNA-Sequenz in das Gen int inseriert werden. In bestimmten Fällen, in denen man wünscht, daß das Vektor-Plasmid nicht von einem Stamm zum anderen übertragen werden kann, kann die DNA-Sequenz, die für das vorgegebene Protein codiert, im Bereich der Sequenzen inseriert werden, die für die funktionellen Übertragungs-Funktionen des transformierten Stammes codieren.
Unter den Sequenzen, die für ein vorgegebenes Protein codieren, können die Sequenzen, die für Resistenzen gegen bestimmte Typen von Antibiotika codieren, insbesondere die Sequenzen, die für eine Resistenz gegenüber Thiostrepton codieren, genannt werden.
Die Resistenz gegen Thiostrepton kann in bestimmten Fällen als Marker-Gen verwendet werden. In diesem Falle ist es dann, wenn man ein anderes Protein zu exprimieren wünscht, erforderlich, eine andere (weitere) Klonierungsstelle vorzusehen, was beispielsweise mit Hilfe eines polyvalenten Vektors erfolgen kann durch Inserieren einer "Polylinker"-Sequenz in einen der vorstehend beschriebenen Vektoren.
In dem zuletzt genannten Fall wird das Marker-Gen vorzugsweise nach der Bindungs-Stelle (Bindungs-Frequenz) in den erfindungsgemäßen Vektoren angeordnet.
Was die "Polylinker"-Sequenz angeht, so ist sie vorzugsweise stromabwärts von dem Marker-Gen angeordnet, wobei der erhaltene Vektor, bezogen auf die Bindungs-Stelle dann ein integraler Vektor ist. Ein ganz besonders bevorzugtes Beispiel ist der in dem nachstehenden Beispiel 1 beschriebene Vektor pTS55.
Unter den im Rahmen der vorliegenden Erfindung erhaltenen integrativen und replikativen Vektoren kann man die Position der "Polylinker"-Sequenz in der Weise modifizieren, daß die erhaltenen Vektoren in der Lage sind, von einem Stamm auf den andern überzugehen.
Solche Vektoren können insbesondere im Falle von Fremd-Genen verwendet werden, die für Proteine codieren, die besonders vorteilhaft sind für die Gesundheit des Menschen oder des Tieres.
Als Beispiel kann der Vektor pTS12 genannt werden, dessen Konstruktion in den nachfolgenden Beispielen erläutert wird.
Die "Polylinker"-Sequenz kann auch stromaufwärts von dem Marker-Gen, d.h. in dem Gen int so angeordnet sein, daß der erhaltene Vektor sich nicht in das Chromosom der Empfänger-Stämme integrieren kann. Als Beispiel kann der Vektor pTS13 genannt werden, dessen Konstruktion in den nachstehenden Beispieleh näher erläutert wird.
Die erfindungsgemäßen Vektoren sind insbesondere vorteilhaft wegen ihrer Stabilität und ihrer spezifischen Integration in ein großes Wirtsspektrum.
Ihre Stabilität erlaubt es, auf die Anwendung eines Selektions-Druckes, um das Gen im integrierten Zustand zu halten, zu verzichten.
Im Falle der replikativen Vektoren kann man daran denken, daß die auch integrativen Vektoren die stabilsten sind, wobei die integrierte Kopie in gewisser Weise eine Matrix liefern kann, welche die Regeneration der freien Plasmid-Formen erlaubt.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können sich außerdem in alle Stämme integrieren, welche die vorstehend definierte Integrations-Stelle, d.h. eine Stelle mit einer Sequenz aufweisen, welche die gesamte Nucleotid-Sequenz in der Position + 24 bis - 24, wie sie in Fig. 3 beschrieben ist, oder einen Teil derselben umfaßt. Diese Stelle wurde durch Hybridisierung mit einer Sonde, die von der Position + 21 bis - 18 geht, in S. antibioticus (DSM 40868), S. bikiniensis (ATCC 11062), S. parvulus (ATCC 12434), S. glaucescens (ETH 22794), S. actuosus (ATCC 25421), S. coelicolor (A3(2)), S. ambofaciens, S. lividans TK64 (66) und S. griseofuscus (DSM 40191) nachgewiesen.
Bei dem zuletzt genannten Stamm wurde festgestellt, daß das vierte Nucleotid, d.h. das Nucleotid in der Position + 21, kein Thymidin (T), sondern ein Adenin (A) war.
Ein solcher Ersatz beeinflußt nicht die Möglichkeit einer Integration mit den erfindungsgemäßen Vektoren.
Allgemein müssen mindestens 50 % der Nucleotide unverändert bleiben, damit die Möglichkeit der Integration nicht beeinflußt wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem das Verfahren zur Herstellung eines Actinomyceten-Stammes, der ein vorgegebenes Protein bildet, dessen DNA-Sequenz integriert ist:
entweder in das Chromosom, wobei die fragliche DNA- Sequenz außerhalb der Sequenzen att und int inseriert ist; vorzugsweise ist diese DNA-Sequenz in die Sequenzen inseriert, die für die Übertragungs-Funktionen codieren;
oder in ein Plasmid, das nicht vollständig in das Chromosom integrierbar ist,
das dadurch gekennzeichnet ist, daß die fragliche DNA-Sequenz in das Gen int integriert ist.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf die Actinomyceten-Stämme, insbesondere die Streptomyces-Stämme, die durch die erfindungsgemäßen Vektoren transformiert worden sind. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die industrielle Verwendung dieser transformierten Stämme und diese insbesondere für die Herstellung eines vorgegebenen Proteins durch Fermentation eines erfindungsgemäß transformierten Stammes in einem geeigneten Kulturmedium und die Abtrennung (Gewinnung) des vorgegebenen Proteins. Mit den erfindungsgemäßen Vektoren können sehr zahlreiche Proteine hergestellt werden.
Bestimmte Vektoren sind insbesondere geeignet für Proteine, bei denen eine starke Expression nicht erwünscht ist. Es handelt sich dabei insbesondere um den Vektor pTS55, der die Integration eines einzelnen (einzigen) Gens in das Chromosom erlaubt. Es gibt dann eine einzige Kopie des Plasmids pro transformierter Zelle. Ein solcher Vektor eignet sich für die Expression von enzymatischen Proteinen, wie der Amylase oder von Regulations-Genen, die auf die Bildung (Produktion) von industriell interessanten Proteinen oder Metaboliten einwirken.
Andere Vektoren sind besser geeignet für die Expression von Fremd-Proteinen, wenn eine starke Expression gefordert wird. Dies gilt für die Vektoren pTS13 und ptsl2, die wegen der Deletion beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 von pSAM2 (vgl. die folgenden Beispiele) sich bei einer sehr hohen Anzahl von Kopien halten, wenn sie in Streptomyces und insbesondere in Streptomyces lividans TK64 eingeführt werden. Die Anzahl der Kopien liegt oberhalb 100 pro Genom.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und die beiliegenden Zeichnungen erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 die Restriktions-Karte des Plasmids pSAM2: die Restriktions-Stellen sind numeriert mit 1 bis 33, wobei die erste Stelle PvuII (Nr. 1) und die letzte Stelle EcoRI (Nr. 33) ist;
Fig. 2 die Restriktions-Karte des Fragments BamHI- EcoRI von pSAM2, das für die Integration genügt, wobei dieses Fragment von der Stelle BamHI Nr. 27 bis zur Stelle EcoRI Nr. 33 geht;
Fig. 3 die Sequenz der Region zwischen TthIII Nr. und der Integrations-Stelle att von pSAM2, dessen Restriktions-Karte in der Fig. 2 dargestellt ist, es handelt sich dabei um die Nucleotid-Sequenz des Plasmids pSAM2, dessen Sequenz bestimmt wurde ab 70 Nucleotiden nach der TthIII Nr. 2 bis zu der Integrations-Stelle (att), wobei das Nucleotid 0 der Mitte von att entspricht;
Fig. 4 die Konstruktion von pTS53 in schematischer Form;
Fig. 5 die Restriktions-Karte des Vektors pTS53;
Fig. 6 die Restriktions-Karte des integrativen Vektors pTS55;
Fig. 7 die Oligonucleotid-Sequenz, die in pTS54 eingeführt worden ist, um pTS55 zu konstruieren; Fig. 8 die Konstruktion von pTS11 in schematischer Form;
Fig. 9 die Oligonucleotid-Sequenz, die in pTS11 eingeführt worden ist, um pTS12 und pTS13 zu konstruieren;
Fig. 10 die Restriktions-Karte von pTS11;
Fig. 11 die Restriktions-Karte des Multikopien-Plasmids pTS12; und
Fig. 12 die Restriktions-Karte des Plasmids pTS13.

Beispiel 1 Konstruktion des integrativen Vektors pTS55

Das Pläsmid pSAM2 (Fig. 1) wurde nach dem alkalischen Lyse-Verfahren, wie es von Hopwood in "Genetic Manipulation of Streptomyces" (A Laboratory Manual, 1985), beschrieben ist, aus Streptomyces ambofaciens (J13212) extrahiert und gereinigt.

Erste Stufe:

Das Plasmid pSAM2 wurde durch das Restriktions-Enzym BAMHI digeriert und ein Fragment von 7,57 kb (kb Kilobase) wurde an der Stelle BamHI des Plasmids pBR329 isoliert und kloniert, wobei das Plasmid pOS210 erhalten wurde (Fig. 4).

Zweite Stufe:

Das Plasmid pOS210 wurde mit EcoRI digeriert und das Fragment von 7,25 kb, welches das Fragment von pSAM2 von der Stelle BAMHI Nr. 27 bis zur Stelle EcoRI und das Fragment BAMHI-EcoRI von 3,55 kb des Plasmids pBR329 enthält, wurde isoliert und mit sich selbst geschlossen, wobei man das Plasmid pOS210a (Fig. 4) erhielt.

Dritte Stufe:

Das Plasmid PIJ39 entspricht dem Plasmid pBR322, welches das Resistenz gegenüber Thiostrepton verleihende Gen enthält, das von einem Fragment BAMHI von 1,8 kb von Streptomyces azureus getragen wird (C.J. Thompson; J.M. Ward; D.A. Hopwood, "Nature" 286, 525-527 (1980)).
Das Plasmid pIJ39 wird durch BAMHI digeriert und das Fragment von 1,8 kb, welches die Resistenz gegenüber Thiostrepton trägt, wird isoliert und gemischt mit dem Plasmid pOS210a, das durch BAMHI digeriert worden ist (BAMHI ist eine einzelne Stelle in pOS210A).

Vierte Stufe:

Das Plasmid pTS52 enthält zwei Stellen BAMHI und hat eine Größe von 9,08 kb. Es wird durch BamHI teilweise digeriert und das linearisierte Plasmid von 9,08 kb wird isoliert. Es wird mit dem Klenow-Fragment der Polymerase I behandelt, dann mit sich selbst wieder geschlossen(vereinigt), um eine der beiden Stelle BamHI zu eliminieren.
Man erhält das Plasmid pTS54, das eine einzige Stelle BAMHI trägt, die zwischen den Stellen SphI und BClI lokalisiert ist (Fig. 5).

5. Stufe:

Das Doppelstang-Polylinker-Oligonucleotid, das die in der Fig. 7 beschriebene Sequenz aufweist, wird mit der Apparatur "Applied Biosystem" synthetisiert.
Das durch BAMHI digerierte Plasmid pTS54 wird mit dem Polylinker-Oligonucleotid gemischt und mit der Ligase des Phagen T4 ligiert.
Das resultierende Plasmid pTS55 ist in der Fig. 6 beschrieben. Es weist die folgenden einzelnen Restriktions- Stellen auf, die für die Klonierungen zur Verfügung stehen: XbaI, XhoI, HindIII, KpnI, SacI, BAMHI und SphI.
Der Vektor pTS55 kann in E. coli aufrechterhalten werden durch Selektionierung in bezug auf die Resistenz gegenüber Ampicillin.
Durch Digestion mit dem Restriktions-Enzym EcoRI kann der Abschnitt pBR329 entfernt werden, weil er für die Integration in das Chromosom der Streptomyces nicht unerläßlich ist. Man kann so integrative Transformanden von Streptomyces erhalten, die nur die DNA von Streptomyces enthalten.
In den Streptomyces-Transformanden verleiht sie Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton oder Nosiheptid.
Sie trägt das Fragment BAMHI-EcoRI von pSAM2 und die Nucleotid-Sequenz von der Stelle TTHIII Nr. 2 bis zur Integrations-Stelle des Plasmids, die zwischen BglII und BAMHI lokalisiert ist, wurde hergestellt (vgl. Fig. 2) und ist beschrieben in der Fig. 3.
Die codierende Phase, die ausgeht von der Position + 1261 und in der Position + 97 endet, entspricht der Integrase, die erforderlich ist für die Integration des Plasmids in das Chromosom. Die codierende Phase, die ausgeht von der Position + 1448 und bei der Position + 1247 endet, kann dem Gen xis entsprechen.
Die eingerahmte Sequenz, die ausgeht von der Position + 24 und endet in der Position - 24, entspricht der Integrations-Stelle des Plasmids (att). Das Nucleotid in der Position 0 entspricht dem Zentrum der Bindungs-Stelle. Es kann durch Transformation nach dem im "Laboratory Manual" beschriebenen Verfahren in Streptomyces eingeführt werden. Es integriert sich spezifisch in die folgenden Stämme:
- S. ambofaciens,
- S. lividans TK64,
- S. griseofuscus.
Es kann sich in alle Stämme integrieren (einfügen), die eine Integrations-Stelle für das Plasmid aufweisen. Die Stelle kann so definiert werden, daß sie eine ähnliche Sequenz aufweist oder eine vollständige Nucleotid-Sequenz oder einen Teil derselben von der Position + 24 bis zur Position - 24 umfaßt, wie in Fig. 3 beschrieben. Diese Stelle wurde nachgewiesen durch Hybridisierung mit einer Sonde, die von der Position + 21 bis - 18 geht (Fig. 3), in S. antibioticus, S. bikiniensis, S. parvulus, S. actuosus, S. coelicolor, S. glaucescens.
Dieser Vektor erlaubt die Integration eines Gens in das Chromosom an einer spezifischen Stelle. Es gibt somit nur eine Kopie pro Zelle, die Integration ist sehr stabil und es ist nicht erforderlich, einen Selektionsdruck aufrechtzuerhalten, damit das eingeführte Gen integriert bleibt.

Beispiel 2 Konstruktion und Eigenschaften des freien Vektors pTS39

a) Konstruktion

Das Plasmid pSAM2, das aus S. ambofaciens J13212 stammt, wird teilweise digeriert durch EcoRI und das linearisierte Plasmid von 11 kb wird isoliert und kloniert in die Stelle EcoRI des Plasmids PIJ39 (wie weiter oben beschrieben). Das resultierende Plasmid pTS39 enthält das Plasmid pIJ39, das in die Stelle EcoRI Nr. 22 des Plasmids pSAM2 kloniert worden ist (Restriktions-Karte pSAM2, Fig. 1).

b) Eigenschaften

Das Plasmid kann durch Transformation in verschiedene Stämme von Streptomyces eingeführt werden, in denen es sich in freiem Zustand und integriert aufrechterhält, wobei es Resistenz gegenüber Thiostrepton und gegenüber Nosiheptid verleiht. Dies ist ein Vektor mit einem breiten Wirtsspektrum. Die Anzahl der Kopien liegt zwischen 5 und 20 Kopien pro Genom.

Beispiel 3 Konstruktion und Eiaenschaften des Vektors pOS11

Erste Stufe:

Das Plasmid pOS7 wurde in dem Artikel von J.M. Simonet et al. in "Gene", 59, S. 137-144, 1987, beschrieben. Die beiden Fragmente BAMHI von 0,88 kb (BamHI Nr. 15 bis 21) und 1,01 kb (BamHI Nr. 21 bis 27) von pSAM2 (Fig. 1) wurden deletiert und ersetzt durch das Fragment BamHI von 1,79 kb von S. azures, das Resistenz gegenüber Thiostrepton und gegenüber Nosiheptid verleiht.
Das Plasmid pOS7 und das Plasmid pBR322 wurden durch EcoRI digeriert, miteinander gemischt und ligiert. Man erhält das resultierende Plasmid pOS11. Es enthält pBR322, das an der Stelle EcoRI Nr. 33 von pSAM2 kloniert ist (vgl. Fig. 8).

Zweite Stufe:

Durch Transformation nach dem üblichen Verfahren wird es in S. lividans eingeführt, in dem es Resistenz gegenüber Thiostrepton und gegenüber Nosiheptid verleiht.
Aus einem Klon von S. lividans-Transformanden wurde das Plasmid pTS11 extrahiert (Fig. 8).
Dieses Plasmid enthält nicht mehr das Plasmid pBR322 und aus ihm wurden 600 Basenpaare, die beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 von pSAM2 angeordnet waren, deletiert. Die Stelle PvuII Nr. 1 und die Stelle Apal Nr. 1 bis sind verschwunden (vgl. die Restriktions-Karte pSAM2, Fig. 1).

Dritte Stufe:

Das Plasmid pTS11 (Fig. 10) wird durch BglII teilweise digeriert, um das Plasmid zu linearisieren, das eine Größe von 10,3 kb hat. Die linearen Moleküle, welche die Größe des Plasmids haben, werden isoliert.
Es wird das Polylinker-Oligonucleotid synthetisiert, das die in der Fig. 10 beschriebene Sequenz aufweist.
Es wird mit dem Fragment BGlII von pTS11 gemischt und ligiert. Das resultierende Plasmid, welches das in die Stelle BglII Nr. 14 inserierte Oligonucleotid trägt, wird als pTS12 bezeichnet (Fig. 11) und dasjenige, welches das in die Stelle BgIII Nr. 28 inserierte Oligonucleotid trägt, wird als pTS13 bezeichnet (Fig. 12).
Auf die gleiche Weise ist es möglich, einen Polylinker in die Stellen BamHI zu inserieren, die an das Fragment BAMHI von 1,79 kb angrenzen, welches das Resistenz- Gen gegenüber Thiostrepton trägt.
Die Eigenschaften der erhaltenen Vektoren sind folgende:
Diese Vektoren unterhalten sich aufgrund der Deletion beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 von pSAM2 mit einer sehr hohen Anzahl von Kopien, wenn sie in Streptomyces, insbesondere in Streptomyces lividans TK64, eingeführt werden. Die Anzahl der Kopien liegt oberhalb 100 pro Genom.
Sie verleihen Resistenz gegenüber Thiostrepton und tragen die Klonierungs-Stellen HindIII, PstI, SphI, XbaI, XhoI und EcoRI.
Der Vektor pTS13 ist nicht in der Lage, sich in das Chromosom zu integrieren und er ist nur autoreplikativ.
Der Vektor pTS12 dürfte nicht mehr in der Lage sein, sich zu transferieren und er dürfte nicht mehr konjugativ sein. Jeder aus pSAM2 stammende Vektor, der diese Deletion enthält, geht über von etwa 10 Kopien auf mehr als 100 Kopien.

Beispiel 4 Expression eines α-Amvlase-Gens von Strebtomyces limosus unter Verwendung eines integrativen Derivats des Plasmids DSAM2

Konstruktions-Verfahren

Das Interposon Omega, das Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Spectinomycin verleiht (Prentki und Krish, 1984, "Gene", 29, S. 303-312) wurde in die Stelle EcoRI des Plasmids pOS210A der Fig. 4 inseriert. Ein Fragment, welches das Struktur-Gen von α-Amylase von S. limosis trägt, sowie die Promotor-Sequenzen (Long et al., 1987, "Journal of Bacteriology", 169, S. 5745-5754) (dieses Gen wurde von der Firma Cetus patentiert) wurden in die Stelle BAMHI des resultierenden Plasmids inseriert. Dieses rekombinante Plasmid wurde durch Transformation in S. lividans eingeführt. Die im Hinblick auf die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Spectinomycin selektionierten Transformanden sind sehr stabil und bilden α-Amylase, ohne daß ein Selektionsdrück erforderlich ist, um das rekombinante Plasmid integriert zu halten.

Ouellennachweis

R.H. Baltz, E.T. Seno, J. Stonesifer und G.M. Wild, "Biosynthesis of the macrolide antibiotic tylosin a preferred pathway from tylactone to tylosin" in "J. of Antibiotics", 36, Nr. 2, 131-141 (1983).
K.L. Cox, R.H. Baltz, "Restriction of Bacteriophage plaque formation in Streptomyces ssp." in "J. Bact." 159 (1984).
G. Gray, G. Seltzer, G. Buel, P.Shaw, S. Escanez, S. Hofer, P. Voegeli und C.J. Thompson, "Synthesis of bovine growth by Streptomyces lividans" in "Gene", 1124, 21-30
S. Kuhstoss und Rao R. Nagaraja, "Expression in Streptomyces ambofaciens of an Escherichia coli K-12 Gen which confers resistance to hygromycin B" in "Gene", 26, 295-299 (1983).
P. Matsushima, R.H. Baltz, "Efficient plasmid transformation of Streptomyces ambofaciens and Streptomyces fradiae protoplasts" in "J. Bact.", 163, 180-185 (1985).
S. Omura, "Macrolide Antibiotics: Chemistry, Biology and Practice", Academic Press (1984).
L. Covarrubias, F. Bolivar, "Construction and characterization of new cloning vehicles. VI. Plasmid pBR329, a new derivative of pBR328 lacking the 482 base-paire inverted duplication" in "Gene" 17: 79-89 (1982).

Claims

1. Vektor zur Klonierung und Expression einer DNA-Sequenz, die für ein vorgegebenes Protein in einem Actinomyceten-Stamm codiert, dadurch gekennzeichnet, daß er im wesentlichen besteht aus:

- einer Bindungs-Sequenz att,

- einer DNA-Sequenz, die für eine funktionelle Integrase (Sequenz int) in dem genannten Stamm codiert, und

- einer DNA-Sequenz, die für das genannte spezifische Protein und für die Elemente codiert, welche die Expression der genannten Sequenz in dem genannten Stamm gewährleisten.

2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz att ausgewählt wird aus:

- der Sequenz

TTCTCTGTCGGGGTGGCGGGATTTGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA

und

- der Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50 % mit dieser Sequenz aufweist.

3. Vektor nch Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz att ausgewählt wird aus solchen, die sich in S. antibioticus (DSM 40868), S. bikiniensis (ATCC 11062), S. parvulus (ATCC 12434), S. glaucescens (ETH22794), S. actuosus (ATCC25421), S. coelicolor (A3(2)), S. ambofaciens, S. lividans TK64(66) und S. griseofuscus (DSM40191) hybridisieren.

4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente att und int aus einem Fragment von pSAM2 stammen, aus dem etwa 600 bp beiderseits der Stelle EcoRI Nr. 33 deletiert worden sind.

5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Deletion Aufschluß gibt über ein Fragment, das sich zwischen zwei wiederkehrenden Sequenzen erstreckt.

6. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem funktionelle Transfer-Funktionen in dem genannten Stamm enthält.

7. Verfahren zur Herstellung eines Actinomyceten-Stammes, der ein vorgegebenes Protein bildet, dessen DNA-Seguenz in das Chromosom integriert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm mit Hilfe eines Vektors nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert, in dem die fragliche DNA-Sequenz außerhalb der Sequenzen att und int inseriert worden ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor nicht transferierbar ist, wobei die DNA-Sequenz, die für das genannte Protein codiert, in die Sequenzen inseriert ist, die für die Transferfunktionen codieren.

9. Verfahren zur Herstellung eines Actinomyceten-Stammes, der ein vorgegebenes Protein bildet, dessen DNA-Sequenz in einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 integriert ist, der ein in das Chromosom nicht vollständig integrierbares Plasmid ist, dadurch gekennzeichnet, daß die genannte DNA-Sequenz in das Gen int integriert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sequenz, die für ein vorgegebenes Protein codiert, die Sequenz ist, die für die Resistenz gegenüber Thiostrepton codiert.

11. Actinomyceten-Stamm, wie er bei Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 7 bis 10 erhalten wird.

12. Stamm nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um einen Streptomyces-Stamm handelt.

13. Verfahren zur Herstellung eines vorgegebenen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm nach einem der Ansprüche 11 oder 12 in einem geeigneten Kulturmedium fermentieren läßt und daß man das vorgegebene Protein daraus gewinnt (abtrennt).

14. Bindungssequenz att, wie sie in einem der Ansprüche 2 bis 5 definiert ist.

15. Sequenz int, wie sie in den Ansprüchen 4 oder 5 definiert ist.