DD208823A5 - Verfahren zur herstellung eines plasmids - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung von Plasmiden mit funktioneller Abhaengigkeit vom Plasmid pEL 7, indem man ein oder mehr verschiedene DNA-Segmente,die wenigstenseinem Antibioticum nach Uebertragung in eine sensitiveWirtszelle eine Resistenz verleihen, an ein Restriktionsfragment von Plasmid pEL7 ligiert und die hierdurch erhaltene Rekombinations-DNA dann durch Selbstligation in das gewuenschte Plasmid mit funktioneller Abhaengigkeit ueberfuehrt.

Description

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Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit funktioneller Abhängigkeit vom Plasmid pEL7

Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit funktioneller Abhängigkeit vom Plasmid pEL7· ^.

.Charakteristik der bekannten technischen Lösungen: Ein derartiges Verfahren ist noch nicht bekannt·

Ziel der Erfindung:

Durch die Erfindung sollen Antibiotikaresistenz verleihende Klonierungsvektoren geschaffen werden, die sich in Streptomyceszellen und damit verwandten Wirtszellen verv/enden lassen.

Die Entwicklung und Ausnutzung der Rekorübinations-DiTA-Technologie bei obigen Organismen hat sich bisher dadurch verzögert und besonders schwierig gestaltet, well es allgemein keine selektierbaren Genraarker an KlonierungBvektoren gab. Die vorliegend erhältlichen Vektoren sind demgegenüber nun funktionell und selektierbar sowohl in Stära-

-2-

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men von Streptomyces als auch in anderen Wirtsstänunen, so

daß sie einen bedeutenden technischen Fortschritt dar- ' stellen. : / .' ' ' ν ' . . ... · -. }," '"

Diese Vektoren zeichnen sich vor allem dadurch aus, daß sie versatil sind und sich in irgendeiner Streptomyceszelle transformieren und selektieren lassen, die gegenüber einem Antibiotikum empfindlich ist, auf welches eine Resistenz übertragen wird. Ein hoher Anteil der klinisch wichtigen Antibiotika wird durch Streptomycesstämme gebildet, so daß die Entwicklung von Klonierungssystemen und Klonierungsvektoren besonders wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Erfindungsgemäß werden nun solche Vektoren geöchaffen, wodurch die Klonierung von Genen in Streptomycesstämmen ermöglicht wird, und auf diese Weise kann man sowohl die Ausbeuten an bekannten Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivate erzeugen.

Vorliegend werden einige Spezialbegriffe verwendet, die die im folgenden angegebenen Bedeutungen haben:

Rekombinations-DNA-Klonierungsvektor: Hierunter wird jedes sich autonom replizierende Mittel verstanden, wozu unter anderem auch Plasmide gehören, das ein DNA-Molekül enthält, an das ein oder mehr weitere DNA-Segmente gebunden sein oder gebunden werden können.

Transformation: Hierunter versteht man die Einführung von DNA in eine Rezipientenwirtszelle, die den Genotypus verändert und somit zu einer stabilen und vererbbaren Veränderung in der Rezipientenzelle führt.

Transformant:· Hierunter wird eine Rezipientenwirtszelle verstanden, die eine Transformation erfahren hat.

Sensitive Wirtszelle: Hiermit ist eine Wirtszelle gemeint, die in Anwesenheit eines bestimmten Antibiotikums nicht

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ohne ein DNA-Segment wachsen kann, das ihm Resistenz veir-'.'' . leiht. , ..' _: :.' : ^;: ; ' ' ;. ". .. ,. · ' . / ' ' -^V".'''. ' '

Res tr iktions fragment: Hierunter ist jedes lineare '".Teil-· stück oder Gesamte eines Plasmids zu verstehen, das durch die Einwirkung von ein oder mehr Restriktionsenzymen auf das Plasmid erzeugt worden ist.

Funktionelle Abhängigkeit: Hierunter wird der Zustand verstanden, nach welchem eine Plasmidreplikation und Expres^- sion einer Resistenz bei ein oder mehr Antibiotika die Anwesenheit eines separaten und unterschiedlichen Piasmids erforderlich macht. >

Insertionsisomeres: Hierunter versteht man zwei oder mehr mögliche Rekombinations-DNA-Moleküle, die gebildet werden, wenn ein DNA-Fragment an einer von zwei oder mehreren kompatiblen Stellen in die Rezipienten-DNA inseriert Wer-

20.. . /'*. . .- ' ^; . . . . · ' . ,. ': :^: ' Plasmid pLR2 1.6kb-BamHI Restriktionsfragment: Hierunter wird das gleiche 1.6kb BamHI Thiostreptonresistenzübertragungsfragment verstanden, das im Plasmid p'IJ.6 enthalten ist. : .'· '·· . ' . ·' . '-. .· . ^:"' .-: .-

25.; ; ;·. .· . / '. ,' ' ' ; ' . ' · ' .; ' · ' Plasmid pLR1 oder pLR4 3.4kb BamHI Restriktionsfragment: Hierunter wird das gleiche 3.4kb BamHI Neomycinresistenzübertragungsfragment verstanden, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.

Plasmid pLR1 3.5kb Pstl Restriktionsfragment: Hierunter wird das gleiche 3.5kb Pstl Neomycinresistenzübertragungsfragment verstanden, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.

R '

Amp : Hierunter wird der gegenüber Ampicillin resistente Phenotyp Verstanden.

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Tet : Hierunter wird der gegenüber Tetracyclin sensitive Phenotyp verstanden.

Thio : Hierunter wird der gegenüber Thiostrepton resistente Phenotyp verstanden.

R ' '

Neo : Hierunter wird der gegenüber Neomycin resistente

Phenotyp verstanden

Darlegung des Wesens der Erfindung;

Die Erfindung bezieht sich nun auf ein Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit funktioneller Abhängigkeit vom Plasmid pEL7, das darin besteht, daß man ein oder mehr verschiedene DNA-Segmente, die wenigstens einem Antibiotikum nach Übertragung in eine sensitive Wirtszelle eine Resistenz verleihen, an ein Restriktionsfragment von Plasmid pEL7 bindet und die hierdurch erhaltene Rekombinations-DNA dann durch Selbstbindung in das gewünschte Plasmid mit funktioneller Abhängigkeit überführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht demnach in einer Bindung eines oder mehrerer Antibiotikaresistenz verleihender DNA-Segmente an ein Restriktionsfragment des Plasmids pEL7. Das Plasmid pEL7, aus welchem die Restriktionsfragmente aufgebaut werden, ist etwa 10.9kb groß und enthält mehrere Restriktionsstellen, die sich besonders für eine Molekularklonierung eignen. Die hierdurch herstellbaren resistenzverleihenden Vektoren weisen eine funktioneile Abhängigkeit vom Plasmid pEL7 auf, und diese Vektoren können aus einer Reihe verschiedener pEL7 Restriktionsfragmente gebildet werden. Das Plasmid pEL7, welches sich direkt als Klonierungsvektor eignet, ist dabei sowohl für den Aufbau als auch die Wirkungsweise der Erfindung wesentlich. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan und Funktionsplan für das Plasmid pEL7 geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Die Fig. 1 und alle sich daran anschlie-

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ßenden Figuren stellen jedoch keine maßstabgerechten Zeichnungen dar.

Das Plasmid pEL7 läßt sich am einfachsten aus Streptomyces ambofaciens/pEL7 isolieren, wobei es sich um einen aufgebauten Stamm handelt, der in der ständigen Kulturensammlung von Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, hinterlegt ist und von dort unter der Hinterlegungshummer NRRL 12523 frei bezogen werden kann.

Es lassen sich zwar die verschiedensten unterschiedlichen Restriktionsfragmente von Plasmid pEL7 aufbauen, doch werden vorliegend beispielsraäßig lediglich die Restriktipns-

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fragnicntö; 10. 9kb HcimHI und 10.9kb £stl cm: läutert.:; Diese Fragmente sind an ein oder mehr Antibiotikaresistenz-Übertragungs-DNA-Fragmente ligiert, beispielsweise das Thiostreptonresistenz übertragende 1.6kb BamHI Restriktionsfragment von Plasmid pLR2 und das Neomycinreästenz übertragende 3.5kb Pstl Restriktionsfragment von Plasmid pLRl, wodurch erfindungsgemäße Vektoren gebildet werden.

Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das Thiostreptonresistenz übertragende Fragment, entspricht etwa 18.7kb und wird aufgebaut durch Ligierung von mit Hindlll behandeltem Plasmid pIJ'6 gemäß Nature 286:525 (1980) an das mit Hindlll behandelte Plasmid pBR 322.. Das Plasmid pLRl, welches die Quelle für das Neomycinresistenz übertragende Fragment ist, entspricht etwa 14.8kb und wird ähnlich aufgebaut, mit der Ausnahme, daß zu seiner Konstruktion anstelle von Plasmid pIJ6 das Plasmid pIJ2 gemäß Nature 286:525 (1980) verwendet wird. Beide Plasmide pLR2 und pLRl sind an E. coli funktionell, und sie lassen sich daher für eine nachfolgende Manipulierung einfach amplifizieren und isolieren. Zu einem analogen Aufbau zum Plasmid pLR4 gelangt man durch Ligierung von mit BamHI behandeltem Plasmid pBR322 an mit BamHI behandeltes Plasmid pLRl. Ein Restriktionsplan und ein Funktionsplan für die Plasmide pLRl, pLR2 und pLR4 geht aus den Fig. 2 bis 4 der Zeichnung hervor.

Zur entsprechenden Konstruktion inseriert man das die Thiostreptonresistenz übertragende 1.6kb-BamHI-Fragment und das die Neomycinresistenz übertragende 3.5kb-PstI-Fragment in das Plasmid pEL7 jeweils an den benachbarten BamHI- und Pstl-Restriktionsstellen. Die hierdurch erhaltene Rekombinations-DNA unterzieht man dann einer Selbstligierung, wodurch man erfindungsgemäße Plasmide erhalt. Je nach der Orientierung des inserierten DNA-Fragments gelangt man zu Rekombinationsplasmiden mit zwei Orientierungen. Die Insertion des 1.6kb BamHI-Fragments in Plasmid pEL7 führt zu den Plasmiden pEL7.1 und pEL7.2. Durch Insertion des 3.5kb

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] Psjt I-Fragments gelangt man zu den Plasmiden pEL7.3 und pEL7.4. Die Insertion beider erwähnter Fragmente führt zu den Plasmiden pEL7.5, pEL7.6, pEL7.7 und pEL7 . 8 ,'·,

ς Für die Insertion von DNA-Segmenten lassen,sich verschiedene Plasmid pEL7-Restriktionsstellen verwenden. Ein eine bestimmte Antibiotikaresistenz übertragendes DNA-Segment ist daher nicht auf eine einzelne Stelle beschränkt/ sondern die Insertion kann hier an verschiedenen Stellen erfolgen, sofern das erhaltene Plasmid funktionell abhängig ist vom Plasmid pEL7.

Die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Thiostrepton und Neomycin verleihenden bzw. übertragenden DNA-Segmente

•J5 werden vorliegend zwar anhand der Restriktionsfragmente 1.6kb BamHI und 3.5kb Ps.tl. der Plasmide pLR2 und pLRl erläutert, doch kann der Fachmann selbstverständlich auch entweder einzeln oder in Kombination weitere DNA-Segmente aufbauen und verwenden, die ebenfalls für eine Übertra-9^un<3 einer Resistenz gegenüber Thiostrepton und Neomycin sorgen. Zu weiteren für eine Thiostreptonresistenz sorgenden DNA-Segmenten von Plasmid pLR2 gehören beispielsweise dasl3kb Pstl-Restriktionsfragment und ferner auch das BcII-Subfragment des 1.6kb BamHI-Restriktionsfragments. Zu weiteren, eine Neomycinresistenz übertragenden DNA-Segmenten des Plasmids pLRl gehören beispielsweise das 3.4kb BamHI-Restriktionsfragment und das größere der Sacl-Kpnl-Subfragmente des 3.4kb BamHI- Restriktionsfragments. Ferner lassen sich auch andere DNA-Segmente aufbauen und verwenden, die gegenüber gleichen oder anderen Antibiotika resistent sind, beispielsweise gegenüber Chloramphenicol, Hygromycin, Viamycin, Tylosin oder Erythromycin. Darüber hinaus lassen sich verschiedene funktioneile Derivate der oben erwähnten und eine Antibiotikaresistenz übertragenden DNA-Segmente aufbauen, indem man bestimmte Nucleotide addiert, eliminiert oder substituiert. Die Ligation dieser Derivate oder anderer, eine Antibiotikaresistenz übertragender DNA-Segmente an Plasmid pEL7 anstelle der hierin beispielsmäßig erläu-

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terten und für eine bestimmte Resistenz sorgenden DNA-Segmente führt ebenfalls zu erfindungsgemäßen Plasmiden.

Sowohl die Restriktionsfragmente von Plasmid pEL7 als auch die verschiedenen für eine Antibiotikaresistenz sorgenden DNA-Segmente können zur Erleichterung einer Ligation entsprechend modifiziert sein. So lassen sich beispielsweise entweder an einem bestimmten Plasmid pEL7 Restriktionsfragment und/oder aft für eine bestimmte Resistenz sorgendenDNA-Segmenten Molekularverknüpfer anordnen. Auf diese Weise können ganz einfach bestimmte Stellen für eine anschließende Ligation aufgebaut werden. Ferner lassen sich auch das Plasmid pEL7 und seine Restriktionsfragmente durch Addierung, Eliminierung oder Ersatz be- stimmter Nucleotide so modifizieren, daß es hierdurch zu einer Veränderung der jeweiligen Eigenschaften und Bildung einer Reihe von Restriktionsstellen für eine Ligation von DNA kommt. Der mit der Nucleotidchemie und dem genetischen Code vertraute Fachmann weiß nämlich, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar sind und welche DNA-Modifikationen für einen bestimmten Zweck wünschenswert ".sind. .· ;"' '' ^: . " ·:." ..-. '

Die vorliegenden Vektoren, beispielsweise die Vektoren des Plasmids pEL7, wie die Plasmide pEL7.1, pEL7.2, pEL7.3, pEL7.4, pEL7.5, pEL7.6, pEL7.7 und pEL7.8 lassen sich an ein Restriktionsfragment eines Plasmids von E. coli ligieren, das ein funktiönelles Replikon enthält, und für eine Antibiotikaresistenz sorgt, beispielsweise an die Plasmide pBR322, pBR324 oder pBR325, wodurch in E.coil verwendbare bifunktionelle Plasmide und PlasmidjpEL7 entstehen, die Zellen von Streptornyces enthalten. Diese Konstruktionen, die vorliegend durch die Beispiele für die Plasmide pLR5 und pLR6 erläutert werden, sind besonders günstig, da sich eine Amplifizierung und Manipulierung von Plasmiden rascher und einfacher in E. coli als in Streptomyces erreichen läßt. Nach erfolgtem Abschluß der Verfahren zur Rekombination von DNA in dem aus E. coli bestehenden Wirtssystem

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kann man die jeweilige Streptomyces DNA daher entfernen, wieder zur Plasmidform rekonstruieren und dann zu einem geeignete! Streptomyces oder einer damit verwandten ,Wirtszelle transformieren.

Die erfindungsgemäßen Rekombinations-DNA-Klonuhgsvektoren sind nicht auf eine Verwendung in einer einzelnen Art

' ' oder einem einzelnen Stamm von Streptomyces beschränkt. Die Vektoren lassen sich vielmehr ganz breit anwenden und in Wirtszellen von Streptomyces verschiedenster Taxonoma und insbesondere auf restriktionslose Stämme Wirtschaft- ^ lieh wichtiger Taxonoma, die Antibiotika bilden, wie Aminoglykosid-, Makrolid-, ß-Lactam-, Polyether- oder Glykopeptidantibiotika. Solche restriktionslose Stämme lassen sich ohne weiteres aus entsprechenden Taxonoma von Streptomyces unter Anwendung herkömmlicher Verfahren selektieren und isolieren, und hierzu wird beispielsweise hingewiesen auf Microbiological Reviews 44:206 (1980.).. Wirtszellen restriktionsloser Stämme haben keine Restriktionsenzyme, so daß sie nach Transformation Plasmid DNA nicht verkürzen oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren verkürzen, werden daher vorliegend ebenfalls als restriktionslos angesehen.

. > .-.' . '' . . : .. ' Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Taxöncsna der Streptomyces, die Aminoglykosidantibiotika bilden und an denen die vorliegenden Vektoren besonders geeignet sind und übertragen werden können, sind beispielsweise ™ folgende restriktionslose Zellen: S. kanamyceticus (Kanamycine), S. chrestomyceticus (Aminosidin), S. griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), S. microsporeus (Antibiotikum SF-767), S. ribosidificus (Antibiotikum SF.733), S. flavo-

persicus (Spectinomycin), S. spectabilis (Actinospectacin), rye. .-.. ' . ' ' ·.

. S. rimosus forma paromomycinus (Paromonycine, Gatenulin),

S. fradiae var. italicüs (Aminosidin), S. bluensis var. bluensis (Bluensomycin), S. catenulae (Catenulin), S. olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), S. tenebra-

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ί rius (Tobramycin, Apramycin), S. lavendulae (Neomycin), S. albogriseolus (Neomycine), S. albus var. metamycihus (Metamycin) , S. hygroscopicus yar. sagamiensis (Spectinomycin), S. bikiniensis (Streptomycin), S- griseus (Streptomycin), S. erythrochrömogenes var. narutoensis (Streptomy- : ein), S. pöolensis (Streptomycin), S. galbus (Streptomycin), S. rameus (Streptomycin), S. olivaceus (Streptomycin), S. mashuensis (Streptomycin), S. hygroscopicus var. limoneus . (Validamycine), S. rimofaciens (Destomycine), S. hygroscopicus forma glebosus (Glebomycin), S. fradiae (Hybrimycine, Neomycine), S. eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), S. aguacanus (N-Methylhygromycin B), S. crystallinus (Hygromycin A), S. noboritoensis (Hygromycin), S. hygroscopicus (Hygromycine) , S. atrofaciens (Hygromycin),S. kasugaspinus (Kasugamycine), S. kasugaensis (Kasugamycine), S. netropsis (Antibiotikum LL-AM31), S. lividus (Lividomycine), S. hpfuensis (Seldomycin-Komplex) oder S. canus (Ribosylparomamin).

Zu bevorzugten Wirtszellen von restriktionsloseh Stämmen aus der .Taxonoma der Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und bei denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar und transformierbar sind, gehören restriktionslose Zellen von beispielsweise S. caelestis (Antibiotikum M188), S. platensis (Platenomycin), S. rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), S. venezuelae (Methymycine), S. griseofuscus (Bundlin), S. narbonensis (Josamycin, Narbomycin), S. fungicidicus (Antibiotikum NA-181), S. griseofaciens (Antibiotikum PA133A, B), S. roseocitreus (Albocyclin), S. bruneogriseus (Albocyclin), S. roseochromogenes (Albocyclin), S. cinerochromogenes (Cineromycin B), S. albus (Albomycetin), S. felleus (Argomycin, Picromycin), S. rochei (Länkacidin, Borrelidin), S. violaceoniger (Lankacidin), S. griseus (Borrelidin), S. maizeus (Ingramycin),

s. albus yar. coilmyceticus (Coleimycin), S. mycarofaciens (Acetyl.leukomycin. Espinomycin), S. hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), S. griseospiralis (Relomycin), S. lavendulae (Aldgamycin), S. ri-

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mosus (Neütramycin), S· deltae (Deltamycine), S. fungicidicus var. espiriomyceticus (Espinomycine), S. furdicidicus (Mydecamycin) , S.'. ambofaciens (Foromacidin D), S. eürocidi-CUS (Methymycin)/ S. griseolus (Griseomycin) , S. flavochromogenes (Airiaromycin, Shincomycine), S. fimbriatus (Amaromycin), S. fasciculus (Amaromycin), S. erythreus (Erythromycine), S. antibioticus (Oleandomycin), S. olivo- - chromogenes (Oleandomycin), S. spinichromogenes var. süragaoensis (Kujimycine), S . kitasatoensis (Leucomycin), S.

narbonensis yar. josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), S. albogriseplus (Mikonomycin), S. bikiniensis (Chalcomycin), S. cirratüs (Cirramycinj, S. djakartensis (Niddamycin), S. eurythermus (Angolamycin), S. fradiae (Tylosin, Lactenocin, Macrocin), S. goshikiensis (Bandamycin), S.

griseoflayus (Acumycin), S. halstedii (Carbomycin)', S.

tendae (Carbomycin), S. macrosporeus (Carbomycin), S. thermotolerans (Carbomycin) oder S. albireticuli (Carbomycin).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktiorisloser Stämme*' der Taxonoma der Streptomyces, die ß-Läctamantibiotika bilden und bei denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), S. clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), S. lactamdurans (Cephamycin C), S. griseus (Cephamycin A, B), S-. hygroscopicus (Deacetoxycephalosprin C), S. wadayamehsis (WS-3442-D), S. chartreüsis (SF 1623), S. heteromorphus und S. panayensis (C2081X); S. cinnamonensis, S. fimbriatus, S. halstedii, S. rochei und S. viridoehromogenes (Cephamycine A, B); S. cattleya (Thienamycin) oder S. olivaceus, S. flavovirens, S. flavus, S. fulvoviridis, S. argenteolus und S. sioyaensis (MM 4550 und MM 13902).

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Taxonoma der Streptomyces, die Polyetherantibiotika bilden und bei denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören

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die restriktionslosen Zellen von beispielsweise:S. albus (A204, A28695Ä und B, Salinomycin), S. hygroscopicüs (A218, Emericid, DE3936, A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), S. griseus (Grisorixin), S. congTobatus (Ionomycin), S\ eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), S. lasäli.ensis (Lasalocid), S. ribosidificus (Loraomycin), S. cäcäoi var. asoensis (Lysocellin), S. cinnamonensis (Monensin), S. aureofaciens (Narasin), S. gällinarius (RP 30504), S. longwoodensis (Lysocellin), S. fla-]0 veolus (CP38936), S. mutabilis (S-11743a) und S. violaceoniger (Nigericin). .

Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme aus der Taxohoma der Streptömyces, die Glykopeptidantibiotika ]5 bilden und bei denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. orientalis und S. haranomachiensis (Vancomycin), S. candidus (A-35512, Avoparcin) und S. eburosporeus (LL-AM 374).

. ..' -'.' ;..-.-/Yv ' ' .· '.^:. /V ' Zu bevorzugten Wirtszellen restriktionsloser Stämme anderer StreptomyceS/ bei denen die vorliegenden Vektoren besonders brauchbar sind und übertragen werden können, gehören die restriktionslosen Zellen von beispielsweise S. coelicolor, S. granuloruber, S. roseosporus, S. lividans, S. espinosus und S. azureüs.

Zusätzlich zu den oben erwähnten Beispielen von Wirtszellen von Streptömyces können die vorliegenden Vektoren auch verwendet und zu Zellen restriktionsloser Stämme anderer Taxoncina transformiert werden, wie beispielsweise von Bazillen, Streptokokken Und damit verwandten Actinomyceten unter Einschluß von Streptosporangium, Actinoplanes, Nocardia und Micromonospora. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher breit anwendbar und lassen sich zu Wirtszellen aus einer Vielzähl von Organismen transformieren.

Prinzipiell sind alle Ausführungsformen der Erfindung

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ΐ brauchbar. Trotzdem werden jedoch einige der erfindungsgemäßen Rekömbinations-DNÄ-Klonungsvektoren und: Tfansformanten gegenüber anderen stärker bevorzugt. Zu bevorzugten Vektoren gehören daher die Plasmide pEL7, pEL.7.1, pEL7.3, pEL7.5, pLRl und pLR2. Zu bevorzugten Vektörenpaaren gehören die Piasmide pEL7 und pEL7.1, pEL7 und pEL7.3 sowie pEL7und pEL7.5. Bevorzugte Transf ormänten. sind Streptomyees ambofaciens/pEL7, S. ambofaciens/pEL7, pEL7.1, S. . ambofaciens/pEL7, pEL7.3, S. ambofaciens/pEL7, pEL7.5, E. coli K12 HBlOl/pLRl und E. coli K12 HBl01/pL·R2. Besonders bevorzugt sind aus den erwähnten bevorzugten Gruppen Plasmid pEL7 >die Plasmidpaare pEL7 und pEL7.1 sowie pEL7 und pEL7.5 und die Transformänten S. ambofaciens/pEL7, S> ambofaciens/pEL7, pEL7.1 sowie S. ambofaciens/pEL7, pEL7.5. '

.15 .;,. : ' ' -\ :. ;/ ^;.;-:.^; " : ' ' ' . ' .· .; V^, ' '· '-. Die erfindungsgemäßen Rekömbinations-DNA-Klonungsvektoren und Transformänten lassen sich vielseitig einsetzen und tragen zu einer Auffüllung des Bedarfs an geeigneten KIonungsvektoren bei, die sich in Streptomyces und damit verwandten Organismen verwenden lassen. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren zu einer Übertragung einer Resistenz gegenüber Antibiotika, die für nichttransfprmierte Wirtszellen toxisch sind, eröffnet weiter auch eine brauchbare Möglichkeit zur Selektierung von Transformänten. Dies ist wichtig, weil in der Praxis die Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektierung der Zellen besteht, bei denen es sich um Vektor-DNA handelt. Weitere DNA-Segmente, für die es . keine funktionellen Tests bezüglich ihrer Anwesenheit gibt, können in die vorliegenden Vektoren inseriert wer-

^ou den, wobei sich dann durch geeignete antibiotische Selek- : . tion Transf ormänten isolieren lassen, die die nicht selektierbare DNA enthalten. Zu solchen nicht selektierbaren DNA-Segmenten gehören unter anderem Gene, die antibiotische Modifikationsenzyme spezifizieren, und.-Regulations- '

oc .. · . · ' · . ' -

^OJ gene aller Art.

Ein nicht selektierbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, wird hierzu vor allem in ein Plasmid inseriert, so daß

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beispielsweise das Plasmid pEL7.5 an der PvuIX-Res.triktionsstelle des 1.6.Hd BamHI-Resistenzübertragungsfragments inseriert ist. Durch eine solche Insertion kommt es zu einer Inaktivierung des Gens für die Thiostreptönresistenz, wodurch sich Transformanten, die das Rekombinationsplasmid enthalten, leicht identifizieren lassen. Zu diesem Zweck führt man zuerst eine Selektion bezüglich Neomycinresistenz durch und identifiziert dann diejenigen Transformanten mit einer Neomycinresistenz, die gegenüber Thiostrepton nicht resistent sind. In ähnlicher Weise ergibt eine Insertion eines jeweils interessierenden DNA-Segments beispielsweise an der Kpnl-Restriktionsstelle des Restriktionsübertraqungsfragments 3. 5φ Pstl eine Inaktivierung des Gens für die Neomycinresistenz. Transformanten, die dieses Rekombinationspläsmid tragen, lassen sich daher ebenfalls ohne weiteres, identifizieren, indem man zuerst eine entsprechende Selektierung bezüglich Thiostreptonresistenz vornimmt und dann die Transformanten mit Thiostreptonresistenz identifiziert, die gegenüber Neomycin nicht resi- stent sind. Die Fähigkeit einer Selektierung bezüglich Antibiotikaresistenz bei Streptomyces und damit verwandten Zellen erlaubt daher eine wirksame Isolierung der extrem seltenen Zellen, die die jeweils gewünschte spezielle nicht selektierbare DNA enthalten.

. ' :. ; ^; ' ·' , '.. · ^:·'. . '' .. '. Der oben beschriebene Funktionstest bezüglich einer Antibiotikaresistenz läßt sich ferner auch zur Durchsuchung großer Mengen an DNA nach den Segmenten verwenden, die als Steuerelemente wirken und eine Expression eines bestimmten Gens für eine Antibiotikaresistenz bewerkstelligen können.

Solche Segmente, zu denen unter anderem auch Promotoren, * Abschwächer, Repressoren, Induktoren und ribosomale Bindestellen gehören, werden zur Steuerung der Expression anderer Gene in Zellen von Streptomyces und damit verwandten Organismen verwendet.

Die erfindungsgemäßen Vektoren, die für eine Resistenz gegenüber Thiostrepton und Neomycin sorgen, sind auch zur Si-

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cherung dafür brauchbar, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszelien über eine Reihe von Generationen stabil gehalten werden. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die an das die Thiostreptonresistenz oder Neomyeinresistenz übertragende Fragment kovalent gebunden sind und die entweder iri Streptomyces öder in den Zeilen von damit verwandten Organismen propagiert werden, werden dadurch aufrechterhalten, daß man die Transformanten solchen Konzentrationen an Thiostrepton oder Neomycin aussetzt, die für die nichttransformierten Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen auch jegliche kovalent gebundene DNA verlieren, können daher nicht wachsen und werden infolgedessen aus der Kultur eliminiert. Durch die erfindungsgemäßen Vektoren läßt sich daher die jeweils gewünsch- te DNA^Sequenz stabilisieren und aufrechterhalten.

Die erfindungsgemäßen Klonungsvektoren und Transformanten ermöglichen eine Klonung von Genen unter Verbesserung der Ausbeuten verschiedener Produkte, die gegenwärtig in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporine, Actaplaniri, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin oder Erythromycin. Ferner werden erfindungsgemäß auch selektierbare Vektoren bereitgestellt, die sich zur Klonung Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen eignen, welche wirtschaftlich wichtige Proteine codieren, wie beispielsweise Humaninsulin, Humanproinsulin, Glucagon oder Interferon, und sie sind auch brauchbar bei enzymatischen Vorgängen in metabolischen Vorgängen, die zu technisch wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder a^ls Steu-. erungselemente, durch welche eine Genexpression verbessert wird. Zu solchen wünschenswerten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme codiert, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten katalysieren, wie beispielsweise von Derivaten von Streptomycin, Cephalosporin, Tylosin, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin oder Erythromycin, oder welche für Enzyme codieren, die eine Bio-

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produktion von Antibiotika und anderen Produkten erleichtern und erhöhen. Die Möglichkeit zur Inserierung und Stabilisierung solcher DNA-Segmente ergibt daher eine Erhöhung der Ausbeute und Verfügbarkeit von Antibiotika, die durch Streptomyces und damit verwandte Organismen gebildet wer- ' den.-' _ ' :;.;; '" ' : .' ' . . ·. ^: . -' ;'; '.

Streptomyces ambofaciens/pEL7, welches eine Quelle für Plasmid pEL7 darstellt, kann auf verschiedene Art und WeI-se unter Einsatz mehrerer unterschiedlicher Medien gezüchtet werden. Solche Züchtungsmedien enthalten als Kohlenhydratquellen vorzugsweise Melasse, Glucose, Dextrin oder Glycerin, und als Stickstoffquellen unter anderem beispielsweise Sojabohnenmehl, Aminosauregemische oder Peptone. Ferner sind in solchen Medien auch noch übliche anorganische Nährsa.lze enthalten, beispielsweise Salze, die für Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Phosphat-, Chlorid- und/oder Sulfationen sorgen. Weiter müssen derartige Kulturmedien auch noch essentielle Spurenelemente enthalten, wie sie auch für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen notwendig sind. Derartige Spurenelemente werden normalerweise in Form von Verunreinigung zugeführt, die in den anderen Bestandteilen des Mediums vorhanden sind. ..- ·. / .' . ' '. . -... ,. '" ' ·' '

V . . ' : ' ' ^;:- ' . · .. ·'. ' -^: ' ; ^: .." '

Streptomyces ambofaciens/pEL7 wächst unter submersen aeroben Zuchtungsbedingüngen innerhalb eines verhältnismäßig breiten pH-Bereichs von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen zwischen etwa 15 und 40⁰C. Zur Bildung von Plasmid pEL7 in höchster Kopienanzahl geht man zweckmäßigerweise von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 6,5 aus und führt die Züchtung in diesem Medium dann bei einer Temperatur von etwa 30⁰C durch. Durch Züchtung von Streptomyces ambofaciens/pEL7 unter den oben erwähnten Bedingungen erhält man einen Zellvorrat, aus dem sich das Plasmid pEL7 ohne weiteres isolieren läßt.

244 07 8 0 .I₁

Ausführungsbeispiele:

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen weiter erläutert. /

B e i s ρ i e 1 1. . ': :

Isolierung von Plasmid pEL7 A. Züchtung von Streptomyces ambofaciens/pEL7

IQ Unter Anwendung üblicher Methoden stellt man ein vegetatives Inokulum von Streptomyces ambofaciens/pEL7 (NRRL 12523) her, indem man diesen Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilisiertem vegetativem Medium folgender bevorzugter Zusammensetzung wachsen läßt.

:^: - .. '.' : . . ' ' . ' ' ^: . . ' · :.- ·. - ;' Bestandteile Menge

Glucose v 20 g/l

Sojanährmehl* 15 g/l

Maisquellwasser* lO g/l

CaCO₃ 2 g/l

Wasser (Leitungswasser) 1,1 1

* Sojanährmehl - Nutrisoy flour von Archer Daniels' Midland Company, 4666 Faries Parkway, Decatur, Illinois - ' 62526' -'".:" " ;. .' ; ' . - ' . . '.'. '.' ' ' '^; ' ;

* Maisquellwasser = Corn steep liquor von CPC International Corn Products, P.O. Box 3000, Englewood, N.J. 07632.

Das vegetative Inokulum wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C und einem pH-Wert von 6,5 bebrütet. Nach erfolgter Bebrütung überträgt man etwa 1,0 ml des Inoku-1-ums in 50 ml eines sterilisierten Zellproduktionsmediums folgender bevorzugter Zusammensetzung.

'35· ' .' .· ' . ' ' -..' . ' . ' ·. '

24 4 07 8 0

Bestandteile Menge .

Trypticasesojabrühe * 30 g/l Glucose 5 g/l

Glycin 5 g/l: ; .

Deionisiertes Wasser 1 g/l

* Trypticasesojabrühe = Trypticase soy broth von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.

]0 Das inokulierte Zellproduktionsmedium inkubiert man etwa 20 Stunden bei 3O⁰C. Hierbei wird der pH-Wert nicht eingestellt. Nach erfolgter Inkubation erntet man die erhaltenen Zellen von Streptomyces ambofaciens/pEL7 und isoliert daraus dann die Plasmid DNA.

¹S .·' ' .- ' .' . . ^: . ' ^: ; ' ; ".' ' :/

B. Isolierung des Plasmids

Man erntet etwa IQ g (Naßgewicht) Zellen von Streptomyces ambofaciens/pE L7 durch Zentrifugieren (10 Minuten, 5°C, 10 000 U/min) des bei obiger Stufe A. erhaltenen Reaktionsgemisches. Die Zellen werden mittels eines Gewebemahlwerks homogenisiert, in TES-Puffer {0,05M Tris(hydroxymethyDaminömethan /JSxis/, O,Ö5M EDTA und 0,05M NaCl, pH 8,0) gewaschen und dann in TES-Puffer suspendiert, der 25 % Saccharose enthält. Die nach Zugabe von etwa 120 rag Lysozym in 20 ml TES-Puffer mit einem Gehalt an 25 % Saccharose erhaltene Suspension wird etwa 20 Minuten bei 35 bis 37°C bebrütet, worauf man das Ganze mit 40 ml 0,25 molarer EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 versetzt und die Suspension dann erneut 10 Minuten bei 35°C bebrütet. Sodann gibt man etwa 40 ml 5 % SDS (Natriumdodecylsulfat) in TE—Puffer (Ο,ΟΙΜ Tris, Ο,ΟΟΙΜ EDTA, pH 8,0) zu, bebrütet das erhaltene Gemisch wiederum 20 Minuten bei 35 bis 37⁰C und versetzt es schließlich mit etwa 50 ml 5M NaCl in deionisiertem Wasser. Das Gemisch wird gerührt, etwa 4 Stunden in ein Eisbad gestellt und dann zentrifugiert (30 Minuten, 4°C, 10 000 ü/min). Die NaCl enthaltende überstehende Flüssigkeit wird in etwa 0,313 Volumina

24 4 07 8 O

42 %-igem Polyethylenglykol in deionisiertem Wässer versetzt und das erhaltene Gemisch etwa 18 Stunden auf 4°C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird abzentrifugiert (5 Minuten, 4⁰C, 3000 U/min) .und dann in TES-Puffer bei pH 8,0 gelöst. Durch Zentrifugieren (40 Stunden, 15⁰C, 35 000 U/ min) unter Anwendung eines Gradienten aus Cäsiumchlorid und Ethidiumchlorid trennt sich die DNA zu zwei sauber definierten Banden, von denen die untere Bande das gewünschte Plasmid pEL7 ausmacht. Die Plasmidbande wird in üblieher Weise entfernt, zweimal mit Isoamylälkohol gewaschen, über TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 dialysiert und mit Ethanol ausgefällt. Die hierdurch erhaltene isolierte Plasmid pEL7-DNA wird in 0,4 ml TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst, bei -2O⁰C eingefroren und dann aufbewahrt.

Beispiel 2

Aufbau von Plasmid pLR2

^: · '. . ' ' '. .' ' . V ' . .: \ "' '. ' . ·· ' ' A. HindiII-Digestion von Plasmid pIJ6

Man bebrütet etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid pU6-DNA (Nature , 286:525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbumin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μΐ Hindlll-Restriktonsenzym* (mit einem Gehalt an 3 New-England Bio Lab-Einheiten und 5 μΐ Reaktionsmischung ** 2 Stunden bei 37⁰C. Sodann wird die Umsetzung durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewährung bei -20⁰C eingefroren.

* Solche Restriktionsenzyme sind von folgenden Firmen erhältlich:

New-England-Bio-Labs., Inc.> 32 Tozer Rd., Beverly, Massachusetts 01915

Boehringer Mannheim Biochemicals, 7941 Castleway Dr.,

24 4 07 8 O

] Indianapolis, Indiana 46250

** Diese Reäktionsmischung für das Hindlll-Restriktions-

enzym wird ausgehend von folgender Zusammensetzung her-'. '. gestellt: ' ' ..'' / ' .' .' . -. ' ;. . " -60OmMNaCl V ; >

100 mM Tris-HCl, pH 7,9 70 mM MgCl₂ 10 mM Dithiothreit

TQ B. Hind111-Pigestion von Plasmid pBR322

Man bebrütet etwa 8 μΐ (4 μg) Plasmid pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BAS (1 mg/ml), 31 μΐ Wasserund 1 μΐ HindiII-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37⁰C. Nach Abschluß der Reaktion durch 10 Minuten langes Bebrüten bei 60⁰C versetzt man das Ganze mit etwa 50 μΙ Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.

C. Ligation von Hindlll-Digestions-Plasmiden pIJ6 und

Mari bebrütet etwa 20 μΐ von mit HindiII behandeltem Plasmid pIJ6 (von Beispiel 2A), 20 μΐ von mit HindiII behandeltem Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B), 5 μΐ BSA (1 mg/ ml), Ιμΐ T4~DNA-Ligase* und 5 μΐ Ligationsmischung** 4 Stunden bei'16⁰C. Die Umsetzung wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. Die hierbei erhaltene suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR2 dar.

* Die T4-DNA-Ligase ist von folgender Quelle erhältlich: New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Rd., Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A

** Die Ligationsmischung wird aus folgender Zusammenset-

4078 0

T zung hergestellt.

500 mM Tris-HCl, pH 7,8 V

200 mM Dithiothreit '.

100 mM MgCl₂ ;

10 mM ATP . ; V

.; Be i s ρ i e 1 3 / \/ . . · ·.. . ' . .. "./ .-'. /^: . Aufbau von E.coli K12 HB101/pLR2

'-':'. ' ' ;' / : .'' ·. ' . ' '" : · - ^: '. ^; Man pelletisiert etwa 10 mi gefrorene leistungsfähige E. coli K12 HBlOl-Zellen (Bolivar et al. (1977),Gene 2:75 bis 93) durch Zentrifugieren und suspendiert das Ganze dann in etwa 10 ml 0,01-molarem Natriumchlorid. Hierauf werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03-molarer Calciumchloridlösung resuspendiert, 20 Minuten auf Eis inkubiert, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich in 1,25 ml 0,03 molarer Calciumchloridlösung resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für, eine anschlie-Sende Transformation leistungsfähig und geeignet.

Plasmid pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird in Ethanol ausgefällt, in 150 μΐ 30 mM Calciumchloridlösung suspendiert und in einem Versuchsröhrchen mit etwa 200 μΐ der in obiger Weise erhaltenen E. coli K12-HBIÖI-Zellen leicht durchmischt. Das erhaltene Gemisch inkubiert man zuerst etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa 1 Minute bei 42⁰C. Sodann versetzt man das Ganze mit etwa 3 ml L-Brühe (J. Bacteriology 62:293 (1951) ), die 50 μ§/ ml Ampicillin enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert und dann auf L-Agar aufgegeben (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, New York (1972) von Miller), der Ampicillin enthält. Die überlebenden Kolonien werden selektiert, bezüglich des erwarteten Phenotype (Amp ,

S ' '

Tet ) untersucht und zum gewünschten E. coli K12 HBlOl/ pLR2-Transformanten konstituiert.

24.4078 0 ->-

B e i s ρ i e 1 4

Aufbau von Plasmid pLRl

Unter Anwendung der in Beispiel 2A bis 2C beschriebenen Arbeitsweise stellt man Plasmid pLRl her, wobei man anstelle von .Plasmid pIJ6 hier jedoch Plasmid pIJ2 (Nature 286:525 (1980j) verwendet. Das gewünschte Plasmid pLRl wird in TE-Puffer suspendiert.

ro.', /-^'ry-: :': ': ; . . .. - ; . . .,' ' . ;' . ' .: .· ; . ^:,' '. -..

B e i s ρ i e.:l/;: 5 ";'. . '' · _: ;. ·' ' ' ' · .' ... ' Aufbau von E. coli K12 HBlOl/pLRl

Der gewünschte Aufbau wird unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens durchgeführt, wobei man anstelle von Plasmid pLR2 abweichend davon zur Transformation jedoch Plasmid pLRl verwendet. Die überlebenden Kolonien werden selektiert, bezüglich des erwarteten Phenotyps

' R S ' ' ' '

(Amp , Tet ) untersucht und stellen die gewünschten E. coli K12 HBldl/pLRi-Transformanten dar.

Beispiel 6 Aufbau von Plasmid pLR4

A. BanHI-Partialdigestion von Plasmid pLRl

Man inkubiert etwa 10 μΐ (10 μ$) Plasmid pLRl, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI-Restriktionsenzym (mit Wasser auf 1:4 verdünnt) und 5 μΐ Reaktionsmischung* 15 Minuten bei 37⁰C. Die Umsetzung wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene Niederschlag an DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20 μΐ Wasser suspendiert.

2U07 8 O

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird aus folgender Zusammensetzung hergestellt. 1,5 M NaCl 6OmM Tris-HCl, pH 7,9

6OmM MgCl₂ ';' .

B.BamHI-Digestion von Plasmid pBR322

Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt, wobei anstelle von Hindlll-Restriktiönsenzym abweichend jedoch BamHI-Restriktionsenzym verwendet wird. Das dabei erhaltene verdaute Plasmid pBR322 wird in 29 μΐ Wasser suspendiert.

C-. Ligation von BamHI-Partialdigestions-Plasmid pLRl und BamHI-Digestions-Plasmid pBR322

Die gewünschte Ligation wird praktisch wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die dabei erhaltene ligierte DNA wird in TE-Puffer suspendiert und stellt das gewünschte Plasmid pLR4 dar.

B e i s pi el 7 Aufbau von E. coli K12 HBl01/pLR4

Der gewünschte Aufbau wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei zur Transformation abweichend davon statt Plasmid pLR2 jedoch Plasmid pLR4 verwendet wird. Die überlebenden Kolonien werden selektiert, bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht und stellen die gewünschten E. coli K12 HBl01/pLR4-Transformanten dar.

07 8 0

- 24 - ·. ·. ;;;- ;.; .: : B e i spiel 8

Aufbau der Plasmide pEL7.1 und pEL7.2

A. BamHI-Digestion von Plasmid pLR2 und Isolierung des 1.ökb-Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragments

Man inkubiert etwa 50 pg Plasmid pLR2 DNA, 20 μΐ Reaktionsmischung, 10 μΐ Ο,ΙΜ Dithiothreit , 20 μΐ BSA (1 mg/ml), 100 μΐ Wasser und 5 μΐ (4 Einheiten/μΐ) BamHI-Restriktionsenzym 2 Stunden bei 37⁰C. Das Reaktionsgemisch wird dann mit einem gleichen Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat und mit 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol versetzt, worauf man das Ganze zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stundenbei -20⁰C kühlt. Die ausgefallene DNA wird abzentrifugiert und dann in etwa 50 μΓ TE-Puffer suspendiert. Das gewünschte 1.6kb-BamHI-Restriktionsfragment wird aus der DNA-Suspension in üblicher Weise durch Gelelektrophorese isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in etwa 20 μΐ TE-Puf- fer zur anschließenden Ligation resuspendiert.

B. BamHI-Digestion von Plasmid pEL7

Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 8A beschrieben durchgeführt, wobei statt dem Plasmid pLR2 hier jedoch das Plasmid pEL7 verwendet wird. Die hierbei erhaltene verdaute DNA wird jedoch keiner Elektrophorese unterzogen, sondern direkt in-20-μΙ TE-Puffer zur anschließenden Ligation suspendiert.

30. ; -.; .; ^: ; ' . . '. . ' ' ' .^; :. ' ' ' . .

C. Ligation

Ein Gemisch aus etwa 20 μg BamHI-Restriktionsplasmid pEL7-DNA, 10 μ^ 1.6kb-BamHI-Restriktionsfragment von Plasmid pLR2, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 10 μΐ Ligationsmischung, 45 μΐ Wasser und 3,5 μΐ T4-DNA-Ligase wird etwa 18 Stunden bei etwa 16°C inkübiert. Nach Zugabe von 0,1 Volumen 3 molarem Ammoniumacetat und 2 Volumina kaltem Ethanol wird das

24 407 8 0

Reaktionsgeinisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der Niederschlag an DNA wird abzentrifugiert, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut abzentrifugiert und dann in 50 μΐ Medium P (J. Molecular and General Genetics 162:307 (1978) zur anschließenden Transforma- ; tion suspendiert. λ

In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten 1.6kb BamHI-Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragments erhält man Rekombinatiönsplasmide mit zwei Orientierungen. Darüber hinaus wird durch Selbstligation auch Plasmid pEL7 wiederhergestellt. Beim Plasmid pEL7.1 handelt es sich um das erhaltene Rekombinationsplasmid, bei dem die PvuII-Restriktionsstelle des die Resistenz übertragenden Fragments nächst zur flankierenden Sphl-Stelle des Plasmids pEL7 inseriert wird. Das Plasmid pEL7.2 ist das Rekombinationsplasmid mit der Umkehrorientierung. Die schließlich erhaltene DNA-Suspension enthält daher Plasmide unter Einschluß der Plasmide pEL7, pEL7.1 und pEL7.2. Darüber hinaus werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL7,l und pEL7.2 gebildet, da das Plasmid pEL7 über zwei BamHI-Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments für die Thiostreptonresistenz verfügt. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne für die Plasmide pEL7.1 und pEL7.2 gehen aus den Fig. 5 und 6 der Zeichnung her-.· 'vor. . . ; . .. .' ·. , ';'

B e i s ρ i e 1 9

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.1 und Streptomyces ambof aciens/pEL7 , pEL7 . 2

Unter Verwendung von etwa 20 pg DNA von Beispiel 8C und

8 ^: '

von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man den gewünschten Aufbau unter Anwendung des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz selektiert, indem

24 4 07 8 O

T man sie auf ein modifiziertes Bennett-Medium* aufbringt, das etwa 50^r μg/ml Antibiotikum Thiostrepton enthält· Die dabei erhaltenen und gegenüber Thiostrepton resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pEL?, pEL7.1 und S.

ambofaciens/pEL·?, pEL7.2 werden isoliert_r gezüchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymänalyse und Gelelektrophorese bezüglich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

* Das verwendete modifizierte Bennett-Medium (Agar) wird beschrieben in Waksman, 1961, The Actinomycetes, Band II, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, V.St.Ä. und ist durch Zugabe von CoCl₂-H₂O (0,01 g/l) sowie durch Ersatz von Glucose durch Dextrin modifiziert.

.15 .-^: '.· ' '.· ·. . · · ' '.. ' ; \ ' .

B e is pi e 1 10

Aufbau von Plasmiden pEL7.3 und pEL7.4

A.; Pstl-Digestion von Plasmid pLRl und Isolation des 3.5kb Neomycinresistenz-Übertraqunqsfraqmerits

Man inkubiert etwa 50 μg Plasmid pLRl-DNA, 20 μΐ Reaktionsmischung* i 10 μ1 Q,IM Dithiothreit , 20 μΐ BSA (1 mg/ml), 100 μΐ Wasser und 5 μΐ (4 Einheiten/μΐ) Pstl-Restriktionsenzym**2 Stunden bei 37^PC. Das nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol erhaltene Gemisch wird zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der.. Nie-·

3(3 derschlag an DNA wird abzentrifugiert und in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das gewünschte 3.5kb Pstl-Restriktionsfragment wird aus der DNA-Suspension in üblicher Weise durch Gelelektrophorese isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment zur anschließenden Ligation in etwa 20 μΐ TE-Puffer resuspendiert.

* Die Reaktionsmischung für das PstI-Restriktionsenzym wird ausgehend von folgender Zusammensetzung hergestellt.

24 4 07 8 0

50 mM NaCl Γ

6 rriM Tris-HC.l , pH 7,4

6 mM MgCl₂

6 mM 2-Mereaptoethanol 100 Mg/ml BSA

** Die verwendeten Restriktionsenzyme sind von den in Beispiel 2 angegebenen Firmen erhältlich.

B. Pstl-Pigestion von Plasmid pEL7

Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 1OA beschrieben durchgeführt, wobei anstelle von Plasmid pLRl hier jedoch das Plasmid pEL7 verwendet wird. Ferner wird die erhaltene verdaute DNA auch keiner Elektrophorese unterzogen, sondern zur anschließenden Ligation direkt in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert.

C. Ligation .

Zur Durchführung der gewünschten Ligation setzt man etwa 20 ^g Pstl-Restriktionsplasmid pEL7 DNA und etwa 19 pg 3.5kb-Pstl-Restriktionsfragment von Plasmid pLRl praktisch nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren um. 25 ' : ' .. ; ' ' ' ^; '.'. . . / In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten 3.Skb-Pstl-Neomycinresistenz-Übertragüngsfragments erhält man Rekombinationsplasmide mit zwei Orientierungen. Darüber hinaus wird durch Selbstligation auch Plasmid pEL7 wiederhergestellt. Beim Plasmid pEL7.3 handelt es sich um das erhaltene Rekombinationsplasmid, bei dem die Sacl-Restriktionsstelle des die Resistenz.übertragenden Fragments nächst zur flankierenden Kpnl-Stelle des Plasmids pEL7 inseriert wird. Das Plasmid pEL7.4 ist das Rekombinationsplasmid mit der Umkehrorientierung. Die schließlich erhaltene DNA-Suspension enthält daher Plasmide unter Einschluß der Plasmide pEL7, pEL7.3 und pEL7.4. Darüber hinaus werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide

24 4 07 8 0

Γ pEL7.3 und pEL7.4 gebildet, da das Plasmid pEL7über zwei Pstl-Restriktionsstellen für die Insertion des Fragments für die Neomyciriresistenz verfügt. Die Restriktions-. Stellenpläne und die Funktionsplane für die Plasmide pEL7.3 und pEL7.4 gehen aus den Fig. 7 und 8 der Zeichnung hervor.

B eis pi el 11

Aufbau von Streptomyces ambofacäens/pEL7, pEL7.3 und Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7 . 4 ^; '. ·."" ' ·

Unter Verwendung von etwa 20 μg DNA von Beispiel IOC und von 1 x lO Protoplasten von Streptomyces ambofaci.ens (NRRL.2420) führt man den gewünschten Aufbau unter Anwendung, des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich ihrer Neomycinresistenz selektiert, indem man sie auf ein modifiziertes Bennett-Medium aufbringt, das etwa 1 μςτ/ΐηΐ-· Aatibiptiküm Neomycin * enthält. Die dabei erhaltenen und gegenüber Neor.iycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.3 und S. ambofaciens pEL7, pEL7.4 werden isoliert, gezüchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese bezüglich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

* Das als Antibiotikum verwendete Neomycin ist von Sigma, St. Louis, Missouri, V.St.A. erhältlich.

B e i s pi e 1 ,.12

Aufbau der Plasmide pEL7.5 und pEL7.6 ^ Ä· Isolierung der Plasmide pEL7 und pEL7.1

Die Isolierung der gewünschten Plasmide aus Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.1 (hergestellt gemäß Beispiel 9 und

24Λ078 0

gezüchtet unter Anwendung des in Beispiel IA beschriebenen Verfahrens) wird praktisch nach dem in Beispiel IB beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die hierdurch isolierten Plasmide pEL7 und pEL7.1-DNA werden in TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 zur anschließenden Digestion des Restriktionsenzyms suspendiert.

B. Psti-Digestion der Plasmide pEL7 und pEL7.1

Die gewünschte Digestion wird praktisch wie in Beispiel 1OA beschrieben durchgeführt, wobei man anstelle von Plasmid pLRl DNA hier jedoch ein Gemisch aus Plasmid pEL7 und pEL7.1 -DNA verwendet. Die auf diese Weise verdaute DNA wird zur nachfolgenden Ligation mit dem 3.5kb Pstl-Restriktionsfragment von Plasmid pLRl in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert.

G. Ligation

Die gewünschte Ligation wird durch Umsetzen von etwa 20 μg der Psti-Restriktionsmischung von Plasmid pEL7 und pEL7.1-DNA und etwa 10 pg des 3.5kb-PstI-Restritkionsfragments (hergestellt gemäß Beispiel 10A) praktisch nach dem in Beispiel IOC beschriebenen Verfahren durchgeführt. Bei obiger Umsetzung entsteht ein Gemisch aus Rekombinationsplasmiden, da die 3.5kb-PstI-Fragmente entweder mit ein oder beiden Plasmiden pEL7 und pEL7.1 ligiert werden. Die Rekombinationsplasmide weisen in Abhängigkeit von der Orientierung des 3 . 5kb-P_s_tI-Neomycinresistenz-Übertragungsf ragments ferner, wie bereits oben beschrieben, auch noch zwei Orientierungen auf. Die Ligation mit dem Plasmid pEL7 führt daher zu den Plasmiden pEL7.3 und pEL7.4, während die Ligation mit dem Plasmid pEL7.1 die gewünschten Plasmide pEL7.5 und pEL7.6 ergibt. Darüber hinaus werden die Plasmide pEL7 und pEL7.1 durch Selbstligation auch wiederhergestellt. . - ... ^β

Beim Plasmid pEL7.5 handelt es sich um das Rekombinations-

2U.078.0

plasmid, bei dem die Sacl-RestriktionsstelIe des 3.5kb-Pstl-Neomycinresistenz-Übertragungsfragments am engsten zur PvuIII-Restriktionsstelle des 1.6kb BamHi-Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragments inseriert sind. Das Plasmid pEL7.6 ist das Rekombinationsplasmid, bei welchem das 3. 5kb"-PstI-Neomycinresistenz-Übertragungsfragment die umgekehrte Orientierung hat. Die erhaltene DNA-Suspension enthält demnach Plasmide unter Einschluß der Plasmide pEL7, pEL7.1, pEL7.3, pEL7.4, pEL7.5 und pEL7.6 und, aus den in den Beispielen 8 und 10 angegebenen Gründen, auch noch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL7.3, pEL7.4, pEL7.5 und pEL7.6. Die Restriktionsstellenpläne und Funktionspläne für die beschriebenen Plasmide pEL7.5 und pEL7.6 gehen aus den Fig. 9 und 10 der Zeichnung hervor.

.15 ; ^:.' '. - . Ζ,.'- ": ' " · . - .. ' . _. . . : [ B e i s pi e 1 13

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.5 und S. ambof aciens/pEL7, pEL7 . 6 '.:.;·''-'

Unter Verwendung von etwa 20 μg DNA von Beispiel 12G und von 1 χ 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man den gewünschten Aufbau unter Anwendung des in Beispiel 2 von WO-OS 79/01169 beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich der Thiostreptonresistenz und der Neomycinresistenz selektiert, indem man das Ganze auf ein modifiziertes Behnett-Medium aufbringt, das etwa 50 .μg/ml des Antibiotikums· Thiostrepton und 1 Mg/ml des Antibiotikums Neomycin enthält. Die dabei erhaltenen und gegenüber Thiostrepton sowie Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambof aciens/pEL7, pEL7.5 und S. ambofaciens/pEL7, pE.L7.6 Werden in üblicher Weise isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und durch Gelelektrophorese bezüglich der Plasmide identifiziert, aus denen sie aufgebaut sind.

2ΛΛ078 O

- ³¹ - ' : ' . · . . ·^:. '

Be is pi e 1 14 ; ν

Aufbau der Plasmide pEL7.7 und pEL7.8

ς Die gewünschten Plasmide werden praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2A bis C beschriebenen Verfahrens aufgebaut, wobei man anstelle des Gemisches aus Plasmid pEL7 und pEL7.1-DNA hier jedoch ein Gemisch aus Plasmid pEL7 und pEL7.2-DNA (isoliert aus dem nach Beispiel 9 hergestellten Streptomyces ambofaciens/pEL7> pEL7.2) verwendet.

Bei diesem Verfahren wird ein Gemisch aus Rekombinationsplasmiden gebildet, da die 3.5kb-P_st.I-Fragmente entweder an ein oder beide Plasmide pEL7 und pEL7.2 ligiert sind.

]5 Die Rekombinationsplasmide haben in Abhängigkeit von der Orientierung des 3 . 5kb-Ps_tI-Neomycinresistenz-Übertragungsfragments ferner auch, wie bereits erwähnt, zwei Orientierungen. Die Ligierung mit dem Plasmid pEL7 führt daher zu den Plasmiden pEL7.3 und pEL7.4_; Die Ligierung mit dem Plasmid pEL7.2 ergibt die gewünschten Plasmide pEL7.7 und pEL7.8. Durch Selbstligation werden darüber hinaus auch die Plasmide pEL7 und pEL7.2 wiederhergestellt.

Beim Plasmid pEL7.7 handelt es sich um das Rekombinationsplasmid, bei welchem die Sacl-Restriktionsstelle (flankierendes BamHI) des 3.5kb Pstl-Neomycinresistenz-Übertragungsfragments am weitesten von der PvuII-Restriktionsstel-Ie des 1.Gkb-BamHI-Thiostreptonresistenz-Übertragungsfragments inseriert ist. Das Plasmid pEL7.8 stellt das Rekombinationsplasmid dar, bei dem das 3.5kb-PstI-Neomycinresistenz-Übertragungsfragment die umgekehrte Orientierung hat. Die erhaltene DNA-Suspension enthält daher Plasmide unter Einschluß der Plasmide pEL7, pEL7.2, pEL7.3, pEL7.4, pEL7.7 und pEL7.8 und aus den in den Beispielen sowie 10 beschriebenen Gründen ferner auch noch die Insertionsisomeren der Plasmide pEL7.3, pEL7.4, pEL7.7 und pEL7.8. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne

24 4 07 8 0 -₃₂-

der gewünschten Plasmide pEL7.7 und pEL7.8 gehen aus den Fig. 11 und 12 der Zeichnung hervor.

B e i s ρ i e 1 15

' 5/ ': -V ' ':. ' .' . ' " ' ' ' - : ; ' :' . ' ' ' · Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.7 und S. ambofaciens/pEI.7, pEL7.8 .'-.·..-

Unter Verwendung der nach Beispiel 14 ,hergestellten DNA undAnwendung des in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrens werden die gewünschten Transformanten aufgebaut. Die dabei erhaltenen, gegenüber Thiostrepton sowie Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pEL7.7 und S. ambofaciens/pEL7, pEL7.8 werden in üblicher Weise isoliert, gezüchtet und durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophoiese der sie aufbauenden Plasmide identifiziert. ,

Beispiel 16 20

Aufbau von Plasmid pLR5 und Plasmid pLR6

Zur Herstellung der Plasmide pLR5 und pLR6 geht man praktisch wie in Beispiel 6A bis C beschrieben vor, wobei man anstelle des Plasmids pLRl hier jedoch das Plasmid pEL7 verwendet. In Abhängigkeit von der Orientierung der inserierten Plasmid pEL7-DNA erhält man hierbei Rekombinationsplasmide mit zwei Orientierungen. Aus den in Beispiel 8 beschriebenen Gründen werden ferner auch Insertionsisomere aus den Plasmiden pLR5 und pLR6 gebildet. Die Restriktionsstellenpläne und die Funktionspläne der Plasmide pLR5 und pLR6 gehen aus den Fig. 13 und 14 der Zeichnung hervor.

2U078 O

- 33 Be i s pvi e: 1 Λ 17

Aufbau von-E. coli K12 HB101/pLR5 und E. coli K12 HBlOl/ .... pLR6 . ₍. ; ' ' . ,' ._;- / ' ,,'

Der gewünschte Aufbau wird praktisch unter Anwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Verfahrens durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anstelle des Plasmids pLR2 hier zur Transformation jedoch die Plasmide pLR5 und pLR6 (von 1.0 Beispiel 16) verwendet werden. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und bezüglich des erwarteten Phenotyps

RS" . .

(Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von E. coli K12 HB101/pLR5 und E. coli K12 HBl01/pLR6 dar. Die resistenten Transformantenkolonien werden isoliert, unter Anwendung üblicher Methoden gezüchtet und dann bezüglich der Plasmide, aus denen sie zusammengesetzt sind, in üblicher Weise durch Restriktionsenzymahalyse und Gelelektrophorese indentifiziert.

Beispiel 18

Aufbau von Streptomyces ambofaciens/pEL7, pLR5

Das Plasmid pLR5 wird in üblicher Weise aus E. coli K12 HBl01/pLR5 (hergestellt gemäß Beispiel 17) isoliert und dann unter Anwendung des in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrens zu Streptomyces ambofaciens/pEL7 transformiert. Die überlebenden Kolonien werden selektiert und die gewünschten Streptomyces ambofaciens/pLR5-Transformanten dann durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese der Plasmide, aus denen sie zusammengesetzt sind, identifiziert .

Typische Beispiele von Plasmiden, die sich unter.Anwen-"""... dung der oben beschriebenen Methoden aufbauen lassen, gehen aus folgender Aufstellung hervor.

24 4-07 8 O

Die Bezeichnungen der Plasmide beinhalten alle Insertionsisomeren und Orientierungsisomeren, die bei einem bestimmten Aufbau entstehen.

Bezeichnung der Plasmide Aufbau

pLR7 pBR322 undpEL7.1

pLR8 pBR322 und pEL7.2

pLR9 pBR322 und pEL7.3

pLRlO ν pBR322 und pEL7.4

pLRll . ! pBR322 und pEL7.5

pLR12 pBR322 und pEL7.6

pLRl3 pBR322 undpEL7.7

pLR14 pBR322 und pEL7.8

, ; . :'. ' '' ' '. ^; ' . ' . V ; ;'

Typische Beispiele für Transformanten der oben erwähnten Plasmide pLR7 bis pLRl4 gehen aus folgender Aufstellung her- / ; vor. ' .'. '. ',' ·. ' .

20 E. coli-K12-HBl01/pLR7

E. cpli-Kl;?-HBl01/pLR9 E. coli-KlS-HBlOl/pLRlO E. coli-K12-HBl01/pLRll

*LsJ X!j * CC^ λ. 1 "™* i\ -L £* ""χΐ'ϋ χ U X / T!) Xjx\ X ^ .

E. coli-Kl2-HBl01/pLRl3 E. cöli-K12-HBl01/pLRl4 Streptomyces ambofaciens/pEL7, pLR7 Streptomyces ambofaciens/pEL7, pLR9 streptomyces ambofaciens/pEL7, pLRll

Claims (9)

1. 24 4 07 8 0-35-

   Erfindungsansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung eines Plasmids mit funktioneller Abhängigkeit vom Plasmid pEL7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein oder mehr verschiedene DNÄ-Segmente, die wenigstens einem Antibiotikum nach übertragung in eine sensitive Wirtszelle eine Resistenz verleihen, an ein Restriktionsfragment von Plasmid pEL7 bindet und die hierdurch erhaltene RekombinationsHDNA dann durch Selbstbindung in das gewünschte Plasmid mit funktioneller Abhängigkeit überführt»
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Segment für eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton sorgt.
3. 3. Verfahren nach Punkt 2 zur Herstellung der Plasmide pEL7.1 und pEL7,2, dadurch gekennzeichnet, daß man mit BamHI behandeltes Plasmid pLR2 an mit BamHI behandeltes Plasmid pEL7 ligiert.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet/ daß das DNA-Segment für eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin sorgt.

   ' ' · ' : ..-..· · ; . ; ;. . . '.
5. 5. Verfahren nach Punkt 4 zur Herstellung der Plasmide pEL7,3 und pEL7.4, dadurch gekennzeichnet, daß man mit Pstl behandeltes Plasmid pLR1 an mit Psjtl behandeltes Plasmid pEL7 ligiert.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Segment für eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Thiostrepton und Neomycin sorgt.
7. 7. Verfahren nach Punkt 6 zur Herstellung der Plasmide pEL7.5 und pEL7.6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus mit Pstl behandeltem Plasmid pEL7, mit Pstl

   24ü078 0 -

   36 -

   behandeltem Plasrnid pEL7.1 und mit PsJtI behandeltem PlasmitpLRI ligiert.
8. 8. Verfahren nach Punkt 6 zur Herstellung der Pläsmide pEL7.7 und pEL7.8, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch aus mit Psti behandeltem Plasmid pEL7, mit Pstl behandeltem Plasmid pEL7.2 und mit Pstl behandeltem Plasmit pLR1 ligiert.

   ·.' . -^: . Ί^:'-^:ν· ' '· .·.' ' ' v:\ 9. Verfahren nach Punkt 1 zur Herstellung eines Plasmids, das in E. coli funktionell ist und das funktionell abhängig ist vom Plasmid pEL7, wenn es in Streptomyces transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß man

   (a) ein funktionelles E. coli-Replikon, das ein eine

   Antibiotikaresistenz übertragendes Restriktionsfragment eines E. coli-Plasmids enthält und

   (b) ein Restriktionsfragment aus einem Vertreter eines Paars an Rekombinations-DNA-Klonierungsvektoren gemäß Punkt .1- ligiert.

   20 . . -.'" ^:. ' ; : ; ' ;.; . . ' ' ^:. -' .'
9. 10. Verfahren nach Punkt 9 zur Herstellung der Plasmide pLRS und pLR6, dadurch gekennzeichnet, daß man mit BamHI behandeltes Plasmid pEL7 an mit BamHI behandeltes Plasmid pBR322 ligiert.

   25· :' · · "-^; :' . . . ' ' " : "' '' · ' ·

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