DD215579A5 - Verfahren zur herstellung eines funktionell unabhaengigen rekombinanten dna-klonierungsvektors - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Herstellung eines funktionell unabhaengigen rekombinanten DNA-Klonierungsvektors, indem man (a) ein funktionelles replikonhaltiges Restriktionsfragment des Plasmids pEL7 an (b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenueber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, und (c) gegebenenfalls an ein Restriktionsfragment, das ein Replikon, welches in Escherichia coli funktionell ist, und ein DNA-Segment enthaelt, das eine Antibiotikumresistenz in einer sensitiven Wirtszelle von Escherichia coli verleiht, wobei diese Wirtszelle gegenueber einer Transformation, Zellteilung und Zuechtung suszeptibel ist, bindet.

Description

Verfahren zur Eerstellun . eines, funktionell unabhängigen

rekombinanten DNA-Klonie angsvektor.s

15 Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer rekoirbinanter DNA-Klonierungsvektoren, die einen funktionell unabhängigen rsprung eines replikationshaltigen Restriktionsfrat;: ants 2S Plasm.v 3 pEl.7 und ein oder mehr DNA- egme: ite - thalten,

A (J . .

Le eine 1 sist nz gegenüber Antibiotika ver ] eihen; " ΐ·-;

oc Charakteristik aer bekannten technischen Lösungen:

. ί Die vorliegende Erfindung steht allgemein in Beziehung zu den Paaren an rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren, die in EP-OS 82 305472 beschrieben werden. Die darin beschriebenen Paare an Vektoren enthalten das Plasmid pEL7 und ein zweites Plasmid, das funktionell abhängig ist vom Plasmid pEL7 und das aus einem Restriktionsfragment von pEL7 und ein oder mehr DNA-Segmenten besteht, die eine Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen. Die Vektoren sind sowohl strukturell als auch darin ohne weiteres zu unterscheiden, daß sie nicht funktionell abhängig sind, so d. ß^bei ihnen zur Replikation und Expression der Antibiotil^^resistenz die Gegenwart des-Piasmids pEL7 nicht erforderlich ist.

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Aufgabe der Erfindung:

Klonierungsvektoren, die für eine Antibiotikaresistenz sorgen, lassen sich in Streptomyces und damit verwandten Wirtszellen anwenden. Die Entwicklung und Ausnutzung der rekombinanten DNA-Technik in obigen Organismen hat sich jedoch bisher verzögert und besonders schwierig gestaltet, weil es allgemein keine selektierbaren genetischen Marker auf Klonierungsvektoren gab. Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung funktionell unabhängiger Klonierungsvektoren, die sich in Streptomyces einsetzen lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Diese Aufgabe wird nun durch die erfindungsgemäße erhältlichen Vektoren gelöst, die funktionell unabhängig sind und sich sowohl in Streptomyces als auch anderen Wirtsstämmen selektieren lassen, so daß sie einen beachtlichen technischen Fortschritt darstellen.

Die Vektoren eignen sich vor allem deshalb, weil sie funktionell unabhängig, klein, versatil und in irgendwelchen Zellen von Streptomyces transformierbar und selektierbar sind, die gegenüber einem Antibiotikum sensitiv sind, gegenüber welchem eine Resistenz verliehen wird. Mehr als die Hälfte der klinisch wichtigen Antibiotika wird durch Stämme von Streptomyces produziert, so daß die Entwicklung funktionell unabhängiger Klonierungssysteme und Vektoren wünschenswert ist, die sich auf diese industriell wichtige Gruppe anwenden lassen. Durch die Erfindung werden nun solche Vektoren geschaffen. Sie ermöglichen eine Klonierung von Genen in Streptomyces, wodurch sich sowohl die Ausbeuten bekannter Antibiotika erhöhen als auch neue Antibiotika und Antibiotikaderivate herstellen lassen.

Die Vektoren sorgen für Träger zur Klonierung von DNA in Wirtszellen von Streptomyces und ermöglichen ferner auch eine bequeme Selektion von Transformanten. Eine Transfor-

matiori ist ein Ereignis niit sehr geringer Häufigkeit,' so daß ein solcher Funktionstest eine praktische Notwendig-""

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keit zur Bestimmung darstellt, welche Zellen aus den Millionen Zellen die Plasmid-DNA aufgenommen haben. Dies ist wichtig, weil DNA-Sequenzen, welche nicht selektierbar sind, in die Vektoren inseriert werden können und sich nach erfolgter Transformation dann die Zellen, die den Vektor und die jeweils interessierende besondere DNA-Sequenz enthalten, durch geeignete antibiotische Selektion isoliert werden

können.

Im Zusammenhang mit der Beschreibung der Erfindung werden einige Spezialbegriffe verwendet, die die im folgenden angegebenen Bedeutungen haben:

Rekombinanter DNA-Klonierungsvektor:

Hierunter versteht man jedes sich autonom replizierende Mittel, wozu unter anderem auch Plasmide gehören, das ein DNA-Molekül enthält, an welches ein oder mehr weitere DNA-Segmente gebunden sein oder gebunden worden sein können.

Transformation:

Hierunter versteht man die Einführung von DNA in eine Empfängerwirtszelle, die den Genotypus verändert und somit zu einer Veränderung der Empfängerzelle führt.

Transformant:

Hierunter versteht man eine Empfängerwirtszelle, die eine Transformation erfahren hat

',

Funktionell abhängig:

Hierunter wird der Zustand verstanden, nach welchem eine Plasmidreplikation und Expression einer Resistenz gegenüber einem oder mehreren Antibiotika in einer Wirtszelle die Anwesenheit eines getrennten und unterschiedlichen Plasmids erfordert. ;

1 Funktionell unabhängig:

Hierunter wird der Zustand verstanden, nach welchem eine Plasmidreplikation und Expression einer Resistenz gegenüber einem oder mehreren Antibiotika in einer Wirtszelle in Abwesenheit eines getrennten und unterschiedlichen Plasmids auftritt. . .

Sensitive Wirtszelle:

Hierunter wird eine Wirtszelle verstanden, die in Anwesenheit eines bestimmten Antibiotikums ohne ein DNA-Segment nicht wachsen kann, das ihm eine Resistenz verleiht.

Restriktionsfragment:

Hierunter versteht man irgendeinen linearen Teil oder ein Gesamtes einer Plasmid- oder Chromosomen-DNA, die unter dem Einfluß, von ein oder mehr Restriktionsenzymen erzeugt wird. . .. _r. .,.. . _ . . , . -

Insertionsisomeres: . -

Hierunter versteht man eines von zwei oder mehr möglichen rekombinanten DNA-Moleküleh/ die durch jEnsertion eines * DNA-Fragments an einer von zwei oder mehr verträglichen Stellen der Empfänger-DNA gebildet werden.

Plasmid-p,LR2 etwa 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment:

Hierunter versteht man praktisch das gleiche etwa 1,6 kb BamHI-Thiostreptonresistenz verleihende' Fragment, das im Plasmid pIJ6 enthalten ist.

Plasmid-pLRl oder pLR4 etwa 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment:

Hierunter versteht man das gleiche etwa 3,4 kb BamHI-Neomycinresistenz verleihende Fragment, das im Plasmid pIJ2 enthalten ist.

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Amp : ' .

Hierunter versteht man den gegenüber Ampicillin resistenten Phenotypus.

ι Tet^s: " ; .. ' ·. ... ;.' . .. .[ '[:";::; _; ' ..'V.·.' ν;^:, ' ^-V.VCv^V

Hierunter versteht man den gegenüber Tetracyclin sensitiven Phenotypus.

Thio^R:

Hierunter versteht man den gegenüber Thiöstrepton resisten-'

ten Phenotypus. ,

Hierunter versteht man den gegenüber Neomycin resistenten Phenotypus.

*V' Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die Erfindung bezieht sich im einzelnen auf ein Verfahren zur Herstellung eines funktionell unabhängigen rekombinan-" ten DNA-Klonierungsvektors, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man a) ein funktionelles replikonhaltiges Restriktionsfragment

des Plasmids pEL7 an

b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz g.egen·^- über wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, und c) gegebenenfalls an ein Restriktionsfragment, das ein Replikon, welches in Escherichia coli funktionell ist,

* 25 und ein DNA-Segment enthält, das eine Antibiotikumresi-

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stenz in einer sensitiven Wirtszelle von Escherichia

coli verleiht, wobei diese Wirtszelle gegenüber einer Transformation, Zellteilung und Züchtung suszeptibel ist,

bindet. -

Das Plasmid pEL7, aus dem replikonhaltige Fragmente konstruiert werden, ist etwa 10,9 kb groß und enthält mehrere Restriktionsstellen, die für eine Molekularklonierung von

-

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Vorteil sind. Das Replikon des Plasmids pEL7 ist innerhalb des etwa 6,78 kb BcJLI -Restriktionsfragments lokalisiert, und durch Verdauung des Plasmids mit Restriktions-,enzymen, die den ungefähr 6,78 kb BcJLI-Bereich heraus- > schneiden, läßt sich daher eine Vielfalt unterschiedlicher replikonhaltiger Fragmente bilden. Ein detaillierter Restriktionsstellenplan des Plasmids pEL7 geht aus Fig. 1 der Zeichnung hervor. Die Fig. 1 und alle sich daran anschließenden Figuren sind für die erfindungsgemäßen Zwecke nicht maßstabsgetreu gezeichnet.

Das Plasmid pEL7 läßt sich in herkömmlicher Weise aus Streptomyces ambofaciens/pEL7 isolieren, nämlich einem beim Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A., hinterlegten - und Teil der ständigen Kulturensammlung bildenden Stamm, der die Nr. NRRL 12523 trägt. Dieser Stamm ist von dort frei beziehbar und stellt eine bevorzugte Quelle und ein Reservoir dieses Plasmids dar.

Es lassen sich zwar viele Fragmente des Plasmids pEL7 konstruieren, die einen unterschiedlichen Replikationsursprung enthalten, wobei das ungefähr 6,78 kb Bcll-Restriktionsfragment hierin jedoch beispielsmäßig erläutert wird. Dieses Fragment kann unabhängig an ein oder mehr,eine Antibiotikumresistenz verleihende DNA-Segmente geknüpft werden, beispielsweise an das die Thiostreptonresistenz verleihende ungefähr 1,6 kb BamHI- oder ungefähr 0,8 kb BcII-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2, das die Neomycinresistenz verleihende ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfraqment des Plasmids pLRl oder des Plasmids pLR4 und das ungefähr 2,8 kb SaJLI-Fragment des Plasmids pIJ43, um so Beispiele für erfindungsgemäße funktionell unabhängige Vektoren zu bilden.

Das Plasmid pLR2, nämlich die Quelle für das die Thiostreptonresistenz verleihende Fragment, ist etwa 18,7 kb groß und wird konstruiert durch Verknüpfung des mit Hindlll be-

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handelten Plasmids pIJ.6 (Nature 286, 525 (1980))" mit dem mit HindIII behandelten Plasmid pBR322. Das Pläsmid pLRl, nämlich die Quelle für das die Neomycinresistenz verleihende Fragment, ist ungefähr 14,8 kb groß und wird in ähnli-

'

eher Weise konstruiert, mit der Ausnahme, daß man hierzu das in Nature 286, 525 (1980) beschriebene Plasmid pIJ2 anstelle des Plasmids pIJ6 verwendet. Eine analoge Konstruktion, die zum Plasmid pLR4 führt, wird durchgeführt durch Verknüpfung des mit BamHI behandelten Plasmids pBR322 mit dem mit BamHI behandelten Plasmid pLRl. Die Plasmide pLR2, pLRl und pLR4 sind in Escherichia coli funktionell und sie können daher für eine"anschließende Manipulation bequem' amplifiziert und isoliert werden.,

° Das Plasmid pIJ43, nämlich die Quelle für das die Erythromycinresistenz verleihende Fragment, läßt sich aus Escherichia coli 803/pIJ43 erhalten, nämlich einem bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.A., hinterlegten und Teil der dortigen ständigen Kulturensammlung bildenden Stamm. Dieser Stamm ist von dort als bevorzugte Quelle und Reservoir für das Plasmid unter der Nr^ ATCC 39156 frei beziehbar. Ein Restriktionsstellenplän und Funktionsplan für jedes der Plasmide pLRl, pLR2 und pLR4

geht aus Fig.' 2 der Zeichnung hervor. 25

Zur bequemen und leichten Konstruktion verknüpft man das • die Thxostreptonresistenz verleihende, ungefähr 1,6 kb BamHI- oder ungefähr 0,8 kb BeiI-Fragir.ent, das die Neomycinresistenz verleihende, ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragment und das die Erythromycinresistenz verleihende, ungefähr 2,8 kb SaII-Fragment unabhängig mit dem den Replikations-. Ursprung enthaltenden, ungefähr 6,78 kb Bcll-Fragment des Plasmids pEL7. Die erhaltene rekombinante DNA unterzieht man dann einer Selbstverknüpfung, wodurch, erfindungsgemäße funktionell unabhängige Pläsmide gebildet werden. Je nach der Orientierung des jeweiligen resistenzübertragenden DNA-Fragments ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei

Orientierungen. Die Verknüpfung des ungefähr 1,6 kb BamHI-Fragments des Plasmids pLR2 mit dem ungefähr 6,78 kb BcII- .Fragment des Plasmids pEL7 ergibt,daher beispielsweise die Plasmide pNM702A und pNM702B. Durch Verknüpfung des ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragments des Plasmids pLRl oder des Plasmids pLR4 erhält man beispielsweise die Plasmide pNM704A und pNM704B. Durch Verknüpfung beider dieser Fragmente gelangt man beispielsweise zu den Plasmideh pNM705A und pNM7 05B. In ähnlicher Weise erhält man durch Verknüpfung des ungefähr 0,8 kb BeiI-Fragments des Plasmids pLR2 mit dem ungefähr 6,78 kb B_£l I-Fragment des Plasmids pEL7 beispielsweise die Plasmide pNM703A und pNM703B. Durch Verknüpfung von sowohl dem ungefähr 0,8 kb BcII-Fragment als auch dem ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragment gelangt man bei- ^•^ spielsweise zu den Plasmiden" pNM706A und pNM706B. Durch ' Verknüpfung des ungefähr 2,8 kb SaII-Fragments mit einem geeigneten Linker erhält man beispielsweise die Plasmide pNM707A und pNM707B.

Zur Verknüpfung der die Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Segmente lassen sich verschiedene Restriktionsfragmente des Plasmids pEL7 verwenden, sofern der im ungefähr 6,78 kb Bcll-Restriktionsfragment enthaltene Replikationsursprung vorhanden ist. Zu solchen Restriktionsfragmenten des Plasmids pEL7 gehören unter anderem die Fragmente ungefähr 9,1 kb Xhol-Sacl, ungefähr 10,9 kb Sacl, ungefähr 4,75 kb Xhol-Bcll und ungefähr 10,9 kb Bell. Darüber hinaus ist ein besonderes Antibiotikumresistenz verleihendes DNA-Segment nicht auf eine einzelne Stellung beschränkt, sondern kann an unterschiedlichen Stellen des Plasmids pEL7 gebunden oder inseriert werden, sofern es hierdurch zu keiner Störung des Replikationsursprungs oder sonstiger kritischer plasmidgesteuerter physiologischer Funktionen kommt. Der Fachmann weiß oder kann ohne weiteres er- mitteln, welche Stellen für die Verknüpfung oder Insertion eines bestimmten DNA-Segments von Vorteil sind..

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Die eine Resistenz gegenüber den Antibiotika Thiostrepton, Neomycin und Erythromycin verleihenden DNA-Segmente sind zwar jeweils beispielsmäßig belegt durch das ungefähr 1,6 kb BarnHI- oder ungefähr 0,8- kb Bc 1.1-Fragment des Plasmids pLR2, das ungefähr 3,4 kb B_amHI-Fragment des Plasmids pLRl und das ungefähr 2,8 kb Sall-Restriktionsfragment des Plasmids pIJ43, doch kann der Fachmann entweder einzeln oder in Kombination zusätzliche DNA-Segmente konstruieren und verwenden, die ebenfalls eine Resistenz gegenüber den oben erwähnten Antibiotika verleihen. Zu weiteren, eine Thiostreptonresistenz verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pLR2 gehört beispielsweise das ungefähr 13 kb Pstl-Restriktionsfragment. Zu weiteren, eine Neomycinresistenz. verleihenden DNA-Segmenten des Plasmids pLRl gehören beispielsweise das ungefähr 3,5 kb Psti-Restriktionsfragment und ferner auch das größere der Sacl-Kpnl-Subfragmente des ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragments. Zu weiteren Fragmenten, die eine Resistenz gegenüber Erythromycin verleihen, gehören beispielsweise die Restriktionsfragmente ungefähr 2,5 kb Sall-BamHI, ungefähr 2,7 kb Sa 11-BgI'll, ungefähr 3,0 kb HindiII, ungefähr 2,8 kb Xhol-Bglll und ungefähr 4,1 kb EcoRI-BamHI des Plasmids pIJ43.

Es lassen sich auch noch andere DNÄ-Segmente, die eine Resistenz gegenüber den gleichen oder anderen Antibiotika verleihen, wie beispielsweise gegenüber Chloramphenicol, Streptomycin, Hygromycin, Viomycin, Tylosin und dergleichen, in dem Fachmann geläufiger Weise konstruieren und verwenden. Ferner können auch funktioneile Derivate dieser oder irgendwelcher anderer hierin beschriebener,Antibiotikaresistenz verleihender DNA-Segmente durch Addition, Elimination oder Substitution bestimmter Nucleotide in Übereinstimmung mit dem genetischen Code konstruiert werden. Der Fachmann weiß, daß sich durch Verknüpfung dieser Derivate oder irgendeines sonstigen,Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Segments mit Fragmenten, die einen Replikationsursprung für das Plasmid pEL7 enthalten, funktionell

unabhängige Vektoren ergeben, die ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen. ,

Die Restriktionsfragmente der Plasmide pEL7 und ferner auch die verschiedenen,Antibiotikaresistenz verleihenden DNA-Segmente lassen sich zur Erleichterung der Verknüpfung entsprechend modifizieren. So lassen sich beispielsweise entweder an einem bestimmten Restriktionsfragment des Piasmids pEL7 oder einem bestimmten Antibiotikumresistenz verleihenden DNA-Fragment oder an beiden diesen Teilen Molekularlinker anordnen. Auf diese Weise lassen sich bequem spezielle Stellen für eine anschließende Verknüpfung konstruieren. Zusätzlich können auch die den Replikationsursprung enthaltenden Restriktionsfragmente durch Addition, Elimination oder Substitution bestimmter Nucleotide modifiziert werden, wodurch sich eine Vielfalt an Restriktionsstellen für eine Verknüpfung von DNA ergibt. Der mit der Nucleotidchemie und dem genetischen Code vertraute Fachmann weiß nämlich, welche Nucleotide gegenseitig austauschbar und welche DNA-Modifikationen für einen bestimmten Zweck wünschenswert sind.

Die vorliegenden, funktionell unabhängigen Vektoren können auch an ein Restriktionsfragment eines Plasmids von Escherichia coIi gebunden sein, wie beispielsweise an die Piasmide pBR322, pBR324, pBR325, pBR328 und dergleichen, wodurch sich funktionell unabhängige Vektoren ergeben, die sowohl in Escherichia coli als auch in Streptomyces replizierbar und selektierbar sind. Diese bifunktionellen Konstruktionen enthalten den pEL7~Replikationsursprung eines

DNA-Segments, das in Streptomyces eine Antibiotikumresi-S stenz verleiht, ein Replikon, das in Escherichia coli funktionell ist, und ferner auch ein DNA-Segment, das in Escherichia coli eine Antibiotikumresistenz verleiht. Bifunktionelle Konstruktionen,- für die hierin als Beispiele die Plasmide pNM708A und pNM708B angegeben sind, sind besonders von Vorteil, weil sich eine Amplifikation und Manipu-

!ation von Plasmiden in Escherichia cpli schneller urid bequemer durchführen läßt als in Streptoinyces. Nach erfolgter Durchführung der gewünschten rekombinanten DNA-Verfahren im Wirtssystem aus Escherichia colji kann man daher das gesamte Plasmid oder die jeweilige Streptomyces-DNA entfernen und wieder zur Plasmidform (falls erforderlich) umkonstruieren und dann in eine Wirtszelle von Streptomyces oder eine damit verwandte Zelle transformieren.

Die erfindungsgemäßen funktionell unabhängigen rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren sind nicht auf eine Anwendung

' · · in einer einzelnen Art oder einem einzelnen Stamm von Streptomyces beschränkt. Die Vektoren lassen sich vielmehr breit anwenden und in Wirtszellen vieler Taxa von Streptomyces transformieren, insbesondere in restriktionslose Stämme wirtschaftlich wichtiger Taxa, die Antibiotika produzieren, wie Aminoglykosid-, Makrolid-, ß-Lactam-, Polyether- und Glykopeptidantibiotika. Solche restriktionslose Stämme lassen sich aus Taxa von Streptomyces unter Anwendung herkömmlicher Verfahren (Microbiological Reviews 44, 206 (1980)) ohne weiteres selektieren und isolieren. Wirtszellen restriktionsloser Stämme fehlen Restriktionsenzyme, so daß sie nach Transformation Plasmid-DNA nicht schneiden oder abbauen. Wirtszellen, die Restriktionsenzyme enthalten, welche keine der Restriktionsstellen der vorliegenden Vektoren schneiden, werden daher vorliegend als restriktionslos angesehen.

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa von Streptomyces, die Aminoglykosidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: Streptomyces kanamyceticus (Kanamycine), Streptomyces chrestomyceticus (Aminosidin), Streptomyces griseoflavus (Antibiotikum MA 1267), Streptomyces microsporeus (Antibiotikum SF-767), Streptomyces ribosidificus (Antibiotikum SF733), Streptomyces flayopersicus (Spectinomycin), Strep-

...· .;. - 12 -

tomyces spectabilis (Actinospectacin), Streptomyces rimosus forma paromomycinus (Paromomycine, Catenulin), Streptomyces fradiae var. italicus (Aminosidin), Streptomyces bluensis var. bluensis (Bluensomycin), Streptomyces catenulae (Catenulin), Streptomyces olivoreticuli var. cellulophilus (Destomycin A), Streptomyces tenebrarius (Tobramycin, Apramycin), Streptomyces lavendulae (Neomycin),. Streptpmyces albogriseolus (Neomycine), Streptomyces albus var. metamycinus (Metamycin), Streptomyces hygroscöpicus var. sagamiensis (Spectinomycin),"Streptomyces bikiniensis (Streptomycin) , Streptomyces griseus (Streptomycin), Streptomyces erythrochrompgenes var. narutoensis (Streptomycin), Streptomyces poolensis (Streptomycin), Streptomyces galbus (Streptomycin), Streptomyces rameus (Streptomycin), Streptomyces olivaceus (Streptomycin), Streptomyces mashuensis (Streptomycin), Streptomyces hygroscöpicus var. limoneus (Validamycine), Streptomyces rimofaciens (Destomycine), Streptomyces hygroscöpicus forma glebosus (Glebomycin), Streptomyces fradiae (Hybrimycine, Neomycine), Streptomyces eurocidicus (Antibiotikum A16316-C), Streptomyces aquacanus (N-Methylhygromycin B), Streptomyces crystallinus (Hygromycin A), Streptomyces noboritoensis (Hygromycin), Streptomyces hygroscöpicus (Hygromycine), Streptomyces atrofaciens (Hygromycin), Streptomyces kasugaspinus (Kasugamycine), Streptomyces kasugaensis (Kasugamycine), Streptomyces netropsis (Antibiotikum LL-AM31), Streptomyces lividus (Lividomycine), Streptomyces hofuensis (Seldomycin-Komplex) und Streptomyces canus (Ribosylparomamin)'.

on Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa /"-'VOn^Streptomyces, die Makrolidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen:

Streptomyces caelestis (Antibiotikum Ml88), Streptomyces platensis (Platenomycin), Streptomyces rochei var. volubilis (Antibiotikum T2636), Streptomyces venezuelae (Methy-

Ί mycine), Streptomyces griseofuscus (Bundlin), Streptomyces narbonensis (Josamycin, Narbomycin), Streptomyces fungicidicus (Antibiotikum NA-181), Streptomyces griseofaciens (Antibiotikum PAl33A, B), Streptomyces roseocitreus (Albocyclin), Streptomyces bruneogriseus (Albocyclin), Streptomyces roseochromogenes (Albocyclin), Streptomyces cinerochromogeries (Cineromycin B), Streptomyces albus (Albomycetin), Streptomyces felleus (Argomycin, Picromycin), Streptomyces rochei (Lankacidin, Borrelidih), Streptomyces violaceoniger (Lankacidin), Streptomyces griseus (Borrelidin), Streptomyces maizeus (Ingramycin), Streptomyces albus var* coilmyceticus (Coleimycin), Streptomyces mycarofaciens (Acetylleukomycin, Espinomycin), Streptomyces hygroscopicus (Turimycin, Relomycin, Maridomycin, Tylosin, Carbomycin), Streptomyces griseospiralds (Relomycin), Streptomyces lavendulae (Aldgamycin), Streptomyces rimosus (Neutramycin), Streptomyces deltae (Deltamycine), Streptomyces fungicidicus var. espinomyceticus (Espinomycine), Streptomyces furdicidicus (Mydecamycin), Streptomyces ambofaciens (Foromacidin D), Streptomyces eurocidicus (Methymycin), Streptomyces griseolus (Griseomycin), Streptomyces flavochromogenes (Amaromycin, Shincomycine), Streptomyces fimbriatus (Amaromycin), Streptomyces fasciculus (Amaromycin), Streptomyces erythreus (Ery- thromycine),Streptomyces antibioticus (Oleandomycin), Streptomyces olivochromogenes (Oleandomycin), Streptomyces spinichromogenes var. suragaoensis (Kujimycine), Streptomyces kitasatoensis (Leucomycin), Streptomyces narbonensis var- josamyceticus (Leucomycin A3, Josamycin), Streptomyces albogriseolus (Mikonomycin), Streptomyces bikiniensis (Chalcomycin), Streptomyces cirratus (Cirramycin), Streptomyces djakartensis (Niddamycin), Streptomyces eurythermus (An-

golamycin), Streptomyces fradiae (Tylosin, Lactenocirt, Macrocin), Streptomyces goshikiensis (Bandamycin), Streptomyces griseoflavus (Acumycin), Streptomyces halstedii (Carbomycin), Streptomyces tendae (Carbomycin), Streptomyces macrosporeus (Carbomycin), Streptomyces thermotolerans (Carbomycin) und Streptomyces albireticuli (Carbomycin).

* Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa von Streptornyces, die ß-Lactamantibiotika bilden und in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen:

Streptomyces lipmanii (A16884, MM4550, MM13902), Streptomyces clavuligerus (A16886B, Clavulansäure), Streptomyces lactamdurans (Cephamycin C), Streptomyces griseus (Cepha-

; mycine A, B), Streptomyces hygrosc'opicus (Desacetoxycephalosporin C), Streptomyces wadayamensis (WS-3442-D), Streptomyces chartreusis (SF 1623), Streptomyces heteromorphus und Streptomyces panayensis (C2081X), Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces fimbriatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochei und Streptomyces viridochromogenes (Cephamycine A, B), Streptomyces cattleya (Thienamycin), und Streptomyces olivaceus, Streptomyces flavovirens, Streptomyces flavus, Streptomyces fulvoviridis, Streptomyces argenteolus und Streptomyces sioyaensis (MM 4550 und MM 13902)'. ' ^

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Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von Taxa von Streptomyces, die Polyetherantibiotika bilden und in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: Streptomyces albus (A204, A28695A und B, Salinomycin), Streptomyces hygroscopicus (A218, Emericid, DE3936> A120A, A28695A und B, Etheromycin, Dianemycin), Streptomyces griseus (Grisorixin), Streptomyces conglobatus (Ionomycin), Streptomyces eurocidicus var. asterocidicus (Laidlomycin), Streptomyces iasaliensis (Lasalocid), Streptomyces ribosidificus (Lonomycin), Streptomyces cacaoi var. asoensis (Lysocellin), Streptomyces cinnamonensis (Monensin), Streptomyces aureofaciens (Narasin), Streptomyces galli- narius (RP 30504), Streptomyces longwoodensis (Lysocellin), Streptomyces flaveolus (CP38936), Streptomyces mutabilis (S-11743a) und Streptomyces violaceoniger (Nigericin).

Bevorzugte Wirtszellen restriktionsloser Stämme von T-axa von Streptomyces, die Glykopeptidantibiotika bilden und in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren besonders brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: , Streptomyces orientalis und Streptomyces haranomachiensis (Vanomycin), Streptomyces candidus (A-35512, Avoparcin) und Streptomyces eburosporeus (LL-AM 374).

Bevorzugte Wirtszellen anderer restriktionsloser Stämme von Streptomyces, in denen die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren beson.ders. brauchbar sind und transformiert werden können, sind beispielsweise folgende restriktionslose Zellen: Streptomyces lividans 1326 (J. of Molecular and General Genetics 154, 155 (1977), J. of Bacteriology 146 (1), 360 (1981) und J. of Molecular and General Genetics 148, 230 (1981)), Streptomyces coelicolor, Streptomyces granuloruber, Streptomyces roseosporus, Streptomyces lividans, Streptomyces tenebrarius, Streptomyces espinosus, Streptomyees acrimycins, Streptomyces glaucescens, Streptomyces parvilin, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces violaceoruber, Streptomyces vinaceus und Streptomyces azureus.

Zusätzlich zu den oben beschriebenen Beispielen von Wirtszellen von Streptomyces können die vorliegenden funktionell unabhängigen Vektoren auch verwendet und in Zellen restriktionsloser Stämme anderer Taxa transformiert werden, wie beispielsweise Bacillus, Staphylococcus und verwandten Actinomycetes unter Einschluß von Streptosporangium, Actinoplanes, Nocardia und Micromonospora. Die erfindungsgemäßen Vektoren sind daher breit anwendbar und brauchbar, und sie lassen sich in Wirtszellen einer Vielfalt von Organismen transformieren.

Es sind zwar alle Ausführungsformen der Erfindung brauchbar, wobei jedoch einige der vorliegenden rekombinanten

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:* DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten bevorzugt sind.· Bevorzugte Vektoren sind demnach die Plasmide pNM702A, pNM703A, pNM704A, pNM705A, pNM706A, pNM707A und pNM708A. Bevorzugte Transformanten sind Streptomyces ambofaciens/ ' § . pNM702Aj Streptomyces ambofaciens/pNM703A, Streptomyces lividans 1326/pNM703A, Streptomyces ambofaciens/pNM7 04A, Streptomyces ambofaciens/pNM705A, Streptomyces ambofaciens/ pNM706A, Streptomyces ambofaciens/pNM7 07A, Streptomyces ambofaciens/pNM7 08A und Escherichia coli K12 HBl01/pNM708A.

Von dieser bevorzugten Gruppe sind die Plasmide pNM702A, pNM703A, pNM705A und pNM707A und die Transformanten Strep-. torayces amb.ofacieas/pNM702-A, Streptomyces ambofaciens/ pNM703A, Streptomyces lividans 1326/pNM703A, Streptomyces ambofaciens/pNM705A und Streptomyces ambofaciens/pNM707A

15 am meisten bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen funktionell unabhängigen rekombinanten DNA-Klonierungsvektoren und Transformanten lassen sich breit anwenden und tragen zu einer Auffüllung des Bedarfs ^an geeigneten Klonierungsträgern bei, die in Streptomyces und damit verwandten Organismen eingesetzt werden können. Die Fähigkeit der vorliegenden Vektoren zur Verleihung einer Resistenz gegenüber Antibiotika, welche für nichttransformierte Wirtszellen toxisch sind, eröffnet weiter ein funktionelles Mittel zur Selektion von Transformanten.

Dies ist wichtig wegen der praktischen Notwendigkeit zur Bestimmung und Selektion der besonderen Zellen, die Vektor-DNA aufgenommen haben. Weitere DNA-Segmente, für deren Anwesenheit es keine funktioneilen Tests gibt, können eben-

3Q falls in die vorliegenden Vektoren inseriert werden, worauf sich durch geeignete Antibiotikaselektiori Transformanten isolieren lassen, die die nichtselektierbare DNA enthalten. Solche nichtselektierbare DNA-Segmente können an jeder Stelle inseriert werden, mit Ausnahme der Bereiche,

gg die für eine Plasmidfunktion und Replikation erforderlich

sind, und hierzu gehören unter anderem Gene, die für Anti-", , biotikamodifikationsenzyme spezifizieren, und Regulationsgene aller Arten.

Ein nichtselektierbares DNA-Segment, das ein Gen enthält, wird insbesondere in ein Plasmid, beispielsweise das Plasmid pNM705A, an der zentralen Sa_ll-Restriktionsstelle oder der subterminalen PvulI-Restriktionsstelle des Resistenz verleihenden ungefähr 1,6 kb BamHI-Fragments inseriert. • Eine solche Insertion ergibt eine Inaktivierung des Gens für die Thiostreptonresistenz und ermöglicht somit eine leichte Identifizierung von Transformanten, die das rekombinante Plasmid enthalten. Dies wird erreicht, indem man zuerst eine Selektion bezüglich Nepmycinresistenz durchführt und dann diejenigen neomycinresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Thio.strepton nicht resi-V stent sind. In ähnlicher Weise ergibt eine Insertion eines jeweils interessierenden DNA-Segments beispielsweise an der inneren BamHI-Restriktionsstelle des Resistenz verleihenden ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragments eine Inaktivierung des Gens für die Neomycinresistenz. Transformanten, die dieses rekombinante Plasmid enthalten, lassen sich daher ebenfalls leicht identifizieren, indem man zuerst eine Selek- tion bezüglich Thiostreptonresistenz vornimmt und dann diejenigen thiostreptonresistenten Transformanten identifiziert, die gegenüber Neomycin nicht resistent sind. Eine ähnliche Selektion unter Insertionsinaktivierung des Gens für die Erythromycinresistenz läßt sich ebenfalls durchführen. Die Fähigkeit zur Selektion bezüglich Antibiotikaresistenz in Streptomyces und damit verwandten Zellen ermöglicht daher eine effiziente Isolierung der äußerst seltenen Zellen, die die jeweils interessierende nichtselektierbare DNA enthalten. ', '

30

Der oben beschriebene funktioneile Test' für eine Antibiotikaresistenz läßt sich auch zur Lokalisierung von DNA-Segmenten verwenden, die als Kontrollelemente wirken und eine Expression eines individuellen Gens für eine Antibiotikaresistenz lenken. Solche Segmente, zu denen unter anderem Promotoren, Abschwächer, Repressoren, Induktoren und ribosomale Bindestellen gehören, werden zur Steuerung der Ex-

pression anderer Gene in Zellen von Streptomyces und damit verwandten Organismen verwendet.

Die erfindungsgemäßen funktionell unabhängigen Vektoren, die eine Resistenz gegenüber Thiostrepton, Neomycin und Erythromycin verleihen, sind auch zur Sicherung dafür brauchbar, daß verknüpfte DNA-Segmente in Wirtszellen über viele Generationen stabil gehalten werden. Diese Gene oder DNA-Fragmente, die an das eine Resistenz gegenüber Thiostrepton, Erythromycin oder Neomycin verleihende Frag-ν ment kovalent gebunden sind und die entweder in Streptomyces oder in.den Zellen .verwandter Organismen propagiert werden, werden dadurch aufrechterhalten, daß man die Trans7 formanten solchen Konzentrationen an Thiostrepton, Erythromycin oder Neomycin aussetzt, die für nichttransformierte

f Zellen toxisch sind. Transformanten, die den Vektor und infolgedessen jegliche kovalent gebundene DNA verlieren, können daher nicht wachsen und werden aus der Kultur eliminiert. Durch die erfindungsgemäßen Vektoren läßt sich daher jede gewünschte DNA-Sequenz stabilisieren und aufrechterhalten.

Die erfindungsgemäßen funktionell unabhängigen Klonierungsvektoren und Transformanten ermöglichen eine Klonierung von.Genen unter Verbesserung der Ausbeuten- an verschiedenen Produkten, die gegenwärtig in Streptomyces und damit verwandten Zellen gebildet werden. Zu Beispielen für solche Produkte gehören unter anderem Streptomycin, Tylosin, Cephalosporine, Actaplanin, Narasin, Monensin, Äpramycin, Tobramycin, Erythromycin und dergleichen. Ferner werden durch die vorliegende Erfindung auch sel-ektierbare Vektoren geschaffen, die brauchbar sind für eine Klonierung, Charakterisierung und Rekonstruktion von DNA-Sequenzen, welche für wirtschaftlich wichtige Proteine kodieren, wie beispielsweise für Humaninsulin, Humanproinsulin, Glucagon, Interferon, Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon und dergleichen, für enzymatische Funktionen in Stoff-

• / - 19 - . ·· ' ; ' -. ·

wechselwegen, die zu wirtschaftlich wichtigen Verfahren und Verbindungen führen, oder als Kontrollelemente, die eine Genexpression verbessern. Zu diesen gewünschten DNA-Sequenzen gehört unter anderem DNA, die für Enzyme ko-. ..."

diert, welche eine Synthese von Antibiotikaderivaten katalysieren, wie beispielsweise von Derivaten von Streptomycin, Cephalosporin, Tylosin, Actaplanin, Narasin, Monensin, Apramycin, Tobramycin und Erythromycin', oder die für Enzyme kodiert, die eine Bioproduktion von Antibiotika und anderen Produkten vermitteln und verbessern. Die Möglichkeit zur Insertion und Stabilisierung solcher DNA-Segmen-' ' ' te ergibt da'her eine Erhöhung der Ausbeute *uhd Verfügbarkeit an Antibiotika, die durch Streptomyces und damit verwandte Organismen produziert werden. / 15

Streptomyces ambofaciens/pEL7 kann als Quelle für das Plasmid pEL7 auf verschiedenste Art und Weise unter Einsatz irgendeines von mehreren unterschiedlichen Medien gezüchtet werden. Zu Kohlenhydratquellen, die in einem Kulturmedium

^zu bevorzugt sind, gehören beispielsweise Melasse , Glucose, Dextrin und Glycerin, während zu Stickstoffquellen unter anderem beispielsweise Sojabohnenmehl, Aminosäuregemische und Peptone gehören. Es werden auch anorganische Nährsalze zugesetzt, und hierzu gehören die üblichen Salze, welche S^... ²^ zur Bildung von Ionen von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Phosphat, Chlorid, Sulfat und ähnlichen Ionen befähigt sind. Weiter müssen auch noch essentielle Spurenelemente zugesetzt werden, wie sie für das Wachstum und die Entwicklung anderer Mikroorganismen ebenfalls notwendig sind. Solche Spurenelemente werden normalerweise in Form von Verunreinigungen zugeführt, die in den anderen Bestandteilen des Mediums zufällig vorhanden sind.

Streptomyces ambofaciens/pEL7 wächst unter 'submersen aeroben Züchtungsbedingungen über einen verhältnismäßig breiten pH-Bereich -von etwa 5 bis 9 bei Temperaturen zwischen etwa 15°C und 40⁰C. Zur Produktion des Pläsmids pEL7 in

; . . · · .·. - 20 - . · .··...

höchster Kopienzahl geht man zweckmäßigerweise von einem Kulturmedium mit einem pH-Wert von etwa 6,5 aus und führt die Züchtung in diesem Medium, dann»bei einer Temperatur von etwa 30⁰C durch. Durch Züchtung von Streptomyces ambofaciens/pEL7 unter den oben erwähnten Bedingungen erhält man einen Zellvorrat, aus dem sich das Plasmid pEL7 bequem isolieren läßt.

Ausführüngsbeispiele:

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele im einzelnen' weiter erläutert. Darin werden, falls angebracht, sowohl Erklärungen als auch tatsächliche Verfahren zur Konstruktion der Erfindung beschrieben.

Beispiel 1 Isolierung des Plasmids pEL7

A> Züchtung von Streptomyces ambofaciens/pEL7

Ein vegetatives Inökulum von Streptomyces ambofaqiens/pEL7 (NRRL 12523) wird in herkömmlicher Weise hergestellt, indem man den Stamm unter submersen aeroben Bedingungen in 50 ml sterilem vegetativem Medium mit folgender bevorzugter Zusammensetzung wachsen läßt.

Bestandteile

Menge

Glucose Sojanährmehl * Maisquellwasser * CaCC₃

Wasser (Leitungswasser)

20 g/l 15 g/l 10 g/l 2 g/l 1,1 1

* Sojanährmehl = Nütrisoy flour von Archer Daniels Midland Company, 4666 Faries Parkway, Decatur, Illinois 62526, V.St.A

* Maisquellwasser = Corn steep liquor von CPC Internatio-_X

^:- 21 - ' ^: ..".

\ . . .'. .. .

nal, Corn Products, P.O. Box 3000, Englewood,, N.J. 07632

· v.st.a. " - "·': ' . . · ' . ^:.^:- . '

Das vegetative Inokulum wird 48 Stunden bei einer Temperatur von 30⁰C und einem pH-Wert von 6,5 bebrütet. Nach Bebrütung überträgt man etwa 1 ,«0 ml des Inokulums in 50 ml steriles Zeilproduktionsmedium folgender bevorzugter Zusammensetzung.

. ' '

10 Bestandteile Menge

Trypticasesojabrühe * > 30 g/l

Glucose - 10 g/l

Glycin 1 g/l

Deionisiertes Wasser lg/1

15 '

* Trypticasesojabrühe = Trypticase soy broth von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, V.St.A.

Das inokulierte ZeIlproduktionsmedium wird etwa 20 Stunden bei 30⁰C bebrütet. Der pH-Wert wird nicht eingestellt. Nach Inkubation sind die Zellen von Streptomyces ambofaciens/pEL7 fertig zur Ernte und anschließenden Isolierung der Plasmid-DNA.

-^⁰ B. Isolierung des Plasm.ids

Etwa 10 g (Naßgewicht) Zellen von Streptomyces ambofarciens/pEL7 werden durch Zentrifugation (10 Minuten, 5°C, 10 000 U/min) geerntet. Die Zellen v/erden unter Verwendung eines Gewebemahlwerks homogenisiert, in TES-Puffer (0,05 Mol Tris(hydroxymethy1)aminomethan /TRIs7,0,005 Mol EDTA und 0,05 Mol NaCl, pH 8,0) gewaschen und dann in TES-Puffer suspendiert, der 25 % Saccharose enthält. Nach Zusatz von etwa 120 mg Lysozym in 20 ml TES-Puffer, der 25 % Saccharose enthält, wird die Suspension etwa 20 Minuten bei 35 bis 37⁰C bebrütet, worauf man sie mit 40 ml 0,25 molarem EDTA mit einem pH-Wert von 8,0 versetzt und

i- . . ' ^: · . ' ' ' ' .· ' - ' ·

dann erneut 10 Minuten bei 35°C bebrütet. Hierauf gibt man etwa 40 ml 5 %-iges SDS (Natriumdodecylsulfat) in TE-Puffer zu (0,01 Mol Tris,0,001 Mol EDTA, pH 8,0) und bebrütet das erhaltene Gemisch dann erneut 20 Minuten bei 5 · ,.·. . '-,'- ·

bis 37 C, worauf man 50 riil 5 molares NaCl in deionisiertem Wasser zusetzt/ Das Gemisch wird gerührt, etwa 4 Stunden in ein Eisbad gestellt und dann "zentrifugiert (30 Mi- ' nuten, 4°C, 10 000 U/min). Die NaCl enthaltende überstehende Flüssigkeit wird mit etwa 0,313 Volumina an 42 %-igem Polyethylenglykol in äeionisiertem Wasser versetzt und das erhaltene Gemisch etwa 18 Stunden bei 4⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt (5 Minuten, 4°C, 3000 U/min) und dann in TES-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 gelöst. Durch Zentrifugatioh (40 Stunden, 15⁰C, 35 000 U/min) unter Anwendung eines Gradienten aus Caesiumchlorid und Ethidiumbromid trennt sich die DNA zu zwei sauber definierten Banden auf, wobei die untere Bande das gewünschte Plasmid pEL7 darstellt. Unter Anwendung herkömmlicher Verfahren wird die Plasraidbande

' ''·'- - " " '· · · · ^; entfernt, zweimal mit isoamylälkohol gewaschen, über TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 dialysiert und mit Ethanol ausgefällt. Die. so isolierte Plasmid-pEL7-DNA wird in 0,4 ml TE-Puffer bei einem pH-Wert von 8,0 gelöst und

dann zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.

B e i spiel 2 Konstruktion des Plasmids pLR2

30· ' ' " .' ' ·'..

A- Verdauung des Plasmids pIJ6 mit Hindlll

Etwa 20 μΐ (20 μg) Plasmid-pIJ6-DNA (Nature 286, 525 (1980)), 5 μΐ BSA (Rinderserumalbümin, 1 mg/ml), 19 μΐ Wasser, 1 μ1 HindiII (enthaltend 3 New England Bio Lab-Einheiten) Restriktionsenzym * und 5 >μ1 Reaktionsmischung** werden 2 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ

·· - 23 - ' ; . ;.· " .-

1 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet, in 20 μΐ TE-Puffer suspendiert und zur Aufbewahrung bei -20⁰C eingefroren.

& ' ' ' ·. ' : . " . .- : . V . ' , " : .· ' ^:"

* Solche Restriktionsenzyme sind von folgenden Firmen erhältlich: .·: '

New England Bio Labs., Inc., 32 Tozer Rd., Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A

Boehringer-Mannheim Biochemical^,- 7941 Castleway Dr.,

Indianapolis, Indiana 46250, V.St.A.

**Diese Reaktiqnsmischung für das Hindlll-Restriktionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 600 mMol NaCl,

15 100 mMol Tris-HCl, pH 7,9 70 mMol MgCl₂ 10 mMol Dithiothreit

B. Verdauung des Plasmicls pBR322 mit Hindi 11

Etwa 8 μΐ (4 pg) Plasmici-pBR322-DNA, 5 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ BSA (1 mg/nl), 31 μΐ Wasser und 1 μΐ HindIII-Restriktionsenzym werden 2 Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach Beendigung der Reaktion durch 10 Minuten langes Bebrüten bei 60⁰C werden etwa 50 μΐ Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-iges Ethanol zugesetzt. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 45 μΐ Wasser suspendiert.

C. Verknüpfung der mit Hindlll verdauten Plasmide pIJ6 und pBR322

Etwa 20 μΐ mit Hindlll verdautes Plasmid pIJ6 (von Beispiel 2A), 20 μΐ mit Hindlll behandeltes Plasmid pBR322 (von Beispiel 2B), 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 1 μΐ T4-DNA-*Ligase* und 5 μΐ Ligationsmischung** werden 4 Stunden bei 16°C bebrütet. Die Reaktion wird durch Zusatz von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetat und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet.

Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen^, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer, suspendiert. Die suspendierte DNA stellt das gewünschte Plasmid pLR2 dar.

* Die T4ⁱ-DNA-Ligase ist von folgender Firma erhältlich: New England Bio Labs.·, Inc., 32 Tozer Rd., Beverly, Massachusetts 01915, V.St.A.

** Die Ligationsmischung wird mit folgender Zusammenset-

' ·' . '.-

zung hergestellt: 500 mMol Tris-HCl, pH 7,8 200 mMol Dithiothreit 100 mMol MgCl₂ 10 mMol ATP

is -.'. ; . . ' .

B e i s ρ i e 1 3 '.'.. Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR2

^P Etwa 10 ml gefrorene leistungsfähige Zellen von Escherichia coliK12 HBlOl (Gene 2, 75 bis 93 (1977)) werden durch Zentrifugation pelletisiert und dann in etwa 10 ml 0,01 molarem Natriumchlorid suspendiert. Sodann werden die Zellen erneut pelletisiert, in etwa 10 ml 0,03 molarer

^ Calciumchloridlosung resuspendiert, 20 Minuten auf Eis bebrütet, ein drittes Mal pelletisiert und schließlich in 1,25 ml 0,03 molarer Calciumchloridlosung resuspendiert. Die erhaltene Zellsuspension ist für eine anschließende Transformation leistungsfähig.

Plasmid-pLR2 in TE-Puffer (hergestellt gemäß Beispiel 2C) wird mit Ethanol gefällt, in 150 μΐ·30 mmblarer Calciumchloridlosung suspendiert und in einem Teströhrchen leicht mit etwa 200 μΐ leistungsfähigen Zellen von Escherichia coil K12 ΉΒ101 vermischt. Das erhaltene Ge'misch wird zu- ' erst etwa 45 Minuten auf Eis und dann etwa eine Minute bei 42⁰C bebrütet. Sodann gibt man etwa 3 ml L-Brühe zu

> .. '.. .-' . - 25,- ' ; .. ' ' - . :/ .

(J. Bacteriology 62, 293 (1951)), die 50 μg Ampicillin pro ml enthält. Das Gemisch wird unter Schütteln eine Stunde bei 37⁰C bebrütet und dann auf L-Agar (Miller.1972, Experiments, in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs,

° Cold Spring Harbor, New York, V.St.A.) aufgezogen, der Ampicillin enthält, überlebende Kolonien werden selektiert

RS

und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von

Escherichia coli K12 HB101/pLR2 dar

10

Beispiel 4

""""" Konstruktion des Plasmids pLRl

v> 15. Das Plasmid pLRl wird praktisch nach dem in Beispiel 2A

bis 2C beschriebenen Verfahren hergestellt, wobei man abweichend davon jedoch das Plasmid pIJ2 (Nature 286, 525

(1980)) anstelle des Plasmids pIJ6 verwendet. Das gewünschiv— . ·

te Plasmid pLRl wird in TE-Püffer suspendiert.

Beispiel 5 '

Konstruktion von Escherichia coli Kl2 HBlOl/pLRl

^/ 25 Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon zur Transformation jedoch das Plasmid pLRl und nicht das Plasmid pLR2 verwendet. Überlebende Kolonien werden selektiert

R S und bezüglich des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 HBlOl/pLRl dar.

35

1 Be i s ρ i e 1 6

Konstruktion des Plasmids pLR4 ,

5 A. Teilverdauung des Plasmids pLRl mit BamHI

Etwa 10 μΐ (10 Mg) Plasmid pLRl, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), 29 μΐ Wasser, 1 μΐ BamHI (mit Wasser auf 1:4 verdünnt) Restriktionsenzym und 5 μ1 Reaktionsmischung t werden 15 Minuten bei 37⁰C bebrütet; Die Reaktion wird durch Zugabe von etwa 50 μΐ 4 molarem Ammoniumacetät und 200 μΐ 95 %-igem Ethanol beendet. Der erhaltene DNA-Niederschlag wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 20 μΐ Wasser suspendiert.

;.- / ' ' . . · .· ' - "'·'

* Die Reaktionsmischung für das BamHI-Restriktionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 mMol NaCl 60 mMol Tris-HCl, pH 7,9 60 mMol MgCl₂

B. Verdauung des Plasmids. pBR322 mit BamHI

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch das BamHI-Restriktionsenzym anstelle des HindIH-Restriktionsenzyms verwendet. Das verdaute Plasmid pBR322

wird in 29 μΐ Wasser suspendiert.

C. Verknüpfung des mit BamHI teilverdauten Plasmids pLRl mit dem mit BamHI verdauten Plasmid pBR322

Die gewünschte Verknüpfung wird praktisch wie in Beispiel 2C beschrieben durchgeführt. Die erhaltene verknüpfte DNA 3g. wird in TErRuffer suspendiert und stellt das gewünschte Plasmid pLR4 dar.

.. . . ' ·. -27 - ; ' '' . \ -.; : ,'. . Beispiel 7 Konstruktion von Escherichia coli K12 HB101/pLR4

Die gewünschte Konstruktion wird praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man zur Transformation jedoch das Plasmid pLR4 und nicht das Plasmid pLR2 verwendet. Überlebende Kolonien werden selektiert und bezüglich

RS ' des erwarteten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, und sie stellen die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 HBl01/pLR4 dar.

^ Beispiel 8

^{w 15} Konstruktion der Plasmide pNM702A und pNM702B

A* Verdauung des Plasmids pLR2 mit BamHI und Isolierung des die Thiostreptonresistenz verleihenden ungefähr

1,6 kb-Fragments

Etwa 25 μg Plasmid-pLR2-DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung, 5 μΐ 0,1 molares Dithiothreit, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 45 μΐ Wasser und 5 μΐ (4 Einheiten pro μΐ) BamHI-Restriktionsenzym werden zwei Stunden bei 37⁰C bebrütet. Nach Zugabe eines .^__ 25 'gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von zwei Volumina an 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das gewünschte ungefähr 1,6 kb BamHI-ReStriktionsfragment wird in herkömmlicher Weise aus der DNA-Suspension durch Gelelektrophorese mit Agarose unter praktischer Anwendung des in Analytical Biochemistry 98, 305 (1979) beschriebenen Verfahrens isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in etwa 20 μΐ TE-Puffer für eine anschließende Verknüpfung resuspendiert.

Β» Verdauung des Plasmids pEL7 mit Bell

Die gewünschte Verdauung wird bei ungefähr 5O⁰C praktisch nach dem in Beispiel 8A beschriebenen Verfahren durchgeführt, wobei man abweichend.davon jedoch das Plasmid pEL7, das Bcll-Restriktionsenzym und die Reäktionsmischung* verwendet anstelle des Plasmids pLR2, des BamHI-Restriktionsenzyms und der Reaktionsmischung. Zusätzlich dazu unterzieht man die verdaute DNA auch keiner Elektrophorese, son^{J 1}^ dern suspendiert sie direkt in 20 μΐ TE-Puffer für eine anschließende Verknüpfung. - .

* Die Reaktionsmischung für das Bcll-Restriktionsenzym .

wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 12 mMol NaCl .

12 mMol Tris-HCl, pH 7,4 12 mMol MgCl₂ 0,5 mMol Dithiothreit ,

2Ö c. Verknüpfung .

Ein Gemisch aus etwa 20 μg von mit BeiI restriktierter Pl,asmid-pEL7~DNA, 10 pg des ungefähr 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pLR2, 5 μΐ BSA (1 mg/ml), ίο μΐ Ligationsinischung, 45 μΐ Wasser und 3,5 μΐ T4-DNA-Ligase wird etwa 18 Stunden bei etwa 16⁰C bebrütet. Nach Zusatz von 0,1 Volumina 3 molarem Aminoniumacetat und 2 Volumina kaltem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -2O⁰C gekühlt. Der DNA-Nieder-

3Ö schlag wird durch Zentrifugation gesammelt, mit 70 %-igem Ethanol gewaschen, erneut gesammelt und dann in 50 μΐ Medium P (J. Molecular and General Genetics 162, 307 (1978)) zur anschließenden Transformation suspendiert.

In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten, die Thipstreptonresistenz verleihenden, ungefähr 1,6 kb BamHI-Fragments erhält man rekombinante Pla^mide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM702A ist das erhaltene rekombi-

' . ~ ²⁹ " - .' . '. . : ' ^;'' <; ' V

* nante Plasmid, bei welchem die subterminale SajL^I-Restriktionsstelle des die Resistenz verleihenden Fragments am nächsten zur flankierenden Sacl-Stelle des Plasmids pEL7 inseriert ist. Das Plasmid pNM702B ist das rekombinante

^ Plasmid mit umgekehrter Orientierung. Die erhaltene DNA-Suspension enthält daher die Plasmide pNM702A und pNM702B. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM702A und pNM702B geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor.

B e i s ρ i e 1 9

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pEL702A und ""-' Streptomyces ambofaciens/pEL702B

-— 15. Unter Verwendung von etwa 2 μg DNA von Beispiel 8C und von

8 Ix 10 Protoplasteri von Streptomyces ambofaciens, nämlich einem Stamm, der bei der ständigen Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, V.St.A., hinterlegt und von dort unter der Nummer NRRL 2420 frei beziehbar ist, führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2 der Internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (Internationale Patentanmeldung PCT/GB 79/00095) beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten ^ 25 werden bezüglich einer Thiostreptonresistenz selektiert, indem man sie auf modifiziertes Bennett-Medium* aufträgt, das etwa 50 pg des Antibiotikums Thiostrepton pro ml enthält. Die erhaltenen und gegenüber Thiostrepton resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM702A und Streptomyces ambofaciens/pNM702B werden isoliert, gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und.Gelelektrophorese mit Agarose der in ihnen enthaltenen Plasmide (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)) identifiziert. Die Transformantenkulturen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet.

* Das Bennett-Medium (Agar) ist beschrieben in Waksman,

The Actinomycetes, Band II (1961), The Williams and Wilkins Company, Baltimore, Maryland, V.St.A. und modifiziert durch Zusatz von CoCl₂-6KLO (0,01 g/i) und Ersatz der Glucose durch Dextrin.

' ' ':·& ' :' ' ' · ' . \ .' ' ./

B e i s ρ i e 1 10

Konstruktion der Plasmide pNM704A und pNM704B -

i'O A. Verdauung ides Plasmids pLRl mit BamHI und Isolierung

des die Neomycinresistenz verleihenden ungefähr.3,4 kb-Fragmehts ν

χ . ' ' '

Etwa 50 ^g der Plasmid-pLRl-DNA, 20 μΐ Reaktionsmischung*, -w 15 10 μί 0,1 molares Dithiothreit, 20 μΐ BSA (1 mg/ml), 45 μΐ Wasser und 5 μΐ (4 Einheiten pro μΐ) PsjtI-Restriktionsenzym* werden zwei Stunden bei 37°C bebrütet. Nach Zugabe eines gleichen Volumens an 4 molarem Ammoniumacetat und von zwei Volumina an 95 %-igem Ethanol wird das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C gekühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt und dann in etwa 50 μΐ TE-Puffer suspendiert. Das gewünschte ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment wird in üblicher Weise aus der DNA-Suspension durch Gelelektrophorese mit Agarose (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)). isoliert. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in etwa 20 μΐ TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung resuspendiert.

B. Verknüpfung ., ·

Die gewünschte Verknüpfung wird durchgeführt durch Umset-. zung von etwa 20 ^g von mit Bell restriktierter Plasmid- pEL7-DNA (hergestellt gemäß Beispiel 8B) und etwa 19^g des ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragments des Plasmids pLRl praktisch unter Anwendung des in Beispiel 8C beschriebenen Verfahrens.

In Abhängigkeit von der Orientierung des eine Neomyeinre-

' : ' ' - ;3i - -,. . ;.; .. -, ;. · :,

sistenz verleihenden inserierten ungefähr 3,4 kb BamHl-Fragments erhält man rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM704A ist das rekombinante Plasmid, bei welchem die subterminale Pstl-Restriktionsstelle

' ' '

des die Resistenz verleihenden Fragments am nächsten in die flankierende Sacl-Stelle des Plasmids pEL7 inseriert ist. Das Plasmid pNM704B ist das rekombinante Plasmid mit der umgekehrten Orientierung. Die erhaltene DNA-Suspension enthält daher die Plasmide pNM704A und pNM704B. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM704A und pNM704B geht aus Fig. 3 der Zeichnung hervor.

Beispiel 11

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM7Ö4Ä und Streptomyces ambofaciens/pNM704B

Unter Verwendung von etwa 2 ^g DNA von Beispiel IOC ^nd 1 x 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL

2420) führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2 der Internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (Internationale Patentanmeldung PCT/GB 79/00095) beschriebenen Verfahrens durch: Die gewünschten TranSformanten werden bezüglichι einer Neomycinresistenz selektiert, indem man sie auf modifiziertes Bennett-Medium aufträgt, das etwa 1 μg des Antibiotikums Neomycin* pro ml enthält. Die erhaltenen und gegenüber Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/ pNM70'4A und Streptomyces ambofaciens/pNM704B werden isoliert, gezüchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der in ihnen enthaltenen Plasmide (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)) untersucht. Die Transformantenkulturen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer jeweiligen Plasmide verwendet.

* Das Antibiotikum Neomycin ist von Sigma, St. Louis, Missouri, V.St.A., erhältlich.

:. ... - 32 - , . · ,. .·

· V ' Bei s ρ i e 1 12

Konstruktion der Plasmide pNM705A und pNM705B . A. Isolierung des Plasmids pNM702A

Das gewünschte Plasmid wird aus Streptomyces ambofaciens/ pNM702A (hergestellt gemäß Beispiel 9 und gezüchtet unter Anwendung des in Beispiel IA beschriebenen Verfahrens) praktisch unter Anwendung des in Beispiel IB beschriebenen Isolierungsverfahrens isoliert. Die so isolierte Plasmid-pNM702A-DNA wird in TE-Puffer mit einem pH-Wert von ^" 8,0 zur anschließenden Verdauung mit einem Restriktionsenzym suspendiert.

B. TeilverdauUng des Plasmids pNM702A mit Bell ./

'.' ^r'.-'' ' ·

Die gewünschte Verdauung wird praktisch wie in Beispiel 6A beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon jedoch die Plasmid-pNM702A-DNA^ das Bcll-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung verwendet anstelle der Plasmids pLR4, des BamHI-Restriktionsenzyms und der Reaktionsmischung. Die So verdaute DNA wird in 20 μΐ TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung mit dem ungefähr 3,4 kb BamHI-Re_w 25 striktionsfragment des Plasmids pLRl suspendiert.

, C. Verknüpfung

Die gewünschte Verknüpfung wird durchgeführt durch Umset-• 30 zung von etwa 20 μ9 von mit Bell restriktierter PlasmidpNM702A-DNA und etwa 10 μg des ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragments (hergestellt gemäß Beispiel 10A) un- ....-..,r- ter praktischer Anwendung des in Beispiel IOC beschriebenen Verfahrens

,

In Abhängigkeit von der Orientierung des eine Neomycinresistenz verleihenden inserierten ungefähr 3,4 kb BamHI-

,·'.·· - 33 .- ' . ν . -/ . : ^ ,

Fragments erhält man rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM705A ist das rekombinante .Pias-· mid, bei welchem die subterminale Psti-Restriktionsstelle des die Resistenz verleihenden Fragments am nächsten in die flankierende Sacl-Stelle des Plasmids pNM?t)2A inseriert ist* Das Plasmid pNM705B ist das rekombinante Piasmid mit der umgekehrten Orientierung. Zusätzlich werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pNM705Ä und pNM705B gebildet, weil das Plasmid pNM702A über zwei Bell-Restriktionsstellen für die Insertion des die Neomycinresistenz verleihenden Fragments verfügt. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM705A und pNM705B geht aus Fig. 4 der Zeichnung hervor.

15 Beispiel

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM705A und Streptomyces ambofaciens/pNM705B _______

Unter Verwendung von etwa 2 pg DNA von Beispiel 12C und 1 x 10 Protoplasten von Streptomyces ambofaciens (NRRL 2420) führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch unter Anwendung des in Beispiel 2 der Internationalen Offenlegungsschrift WO79/01169 (Internationale Paitentanmeldung PCT/GB 79/00095) beschriebenen Verfahrens durch. Die gewünschten Transformanten werden bezüglich einer Thiostreptonresistenz und Neomycinresistenz selektiert, indem man sie auf modifiziertes Bennett-Medium aufträgt, das etwa 50 μg des Antibiotikums Thiostrepton pro ml und etwa 1 μ9 des Antibiotikums Neomycin pro ml enthält. Die erhaltenen, gegenüber Thiostreptori und Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM705A und Streptomyces ambofaciens/pNM705B werden in üblicher Weise isoliert, gezüchtet und dann durch Restriktionsenzymanalyse und durch Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der in ihnen enthaltenen Plasmide (Analytical'Biochemistry 98, 305 (1979)) untersucht. Die Transformantenkulturen werden zur an-

* schließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet.

B e i s ρ i e 1 14

;·.-. : .- -. -; ν . ; - . '; :' ".' "-.' ^:'' ^: ' '" . -Konstruktion der Plasmide pNM703A und pNM703B

A. Verdauung des Plasmids pLR2 mit Bell und Isolierung des die Thiostreptonresistenz verleihenden, ungefähr 0,8 kb-Fragments

Die gewünschte Verdauung führt man praktisch wie in Bei- ^' spiel 8A beschrieben durch, wobei man abweichend davon jedoch das Bcl^I-Restriktionsenzym und die Reaktionsmischung v. 15 verwendet anstelle des BamHI-Restriktionsenzyms und der Reaktionsmischung* Das gewünschte, ungefähr 0,8 kb BcIl-Restriktionsfragment wird in üblicher Weise aus der DNA-Susperision durch ..Gelelektrophorese mit Agarose praktisch unter Anwendung des in Analytical Biochemistry 98, 305 (1979) beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Nach erfolgter Isolierung wird das Fragment in etwa 20 μί TE-Puffer zur anschließenden Verknüpfung resuspendiert.

B. Verknüpfung

. Etwa 20 ^g von mit Bc_-II restriktierter Plasmid-pEL7-DNA (hergestellt gemäß Beispiel 8B) und von 10 ^g des ungefähr 0,8 kb Bcll-Restriktionsfragments des Plasmids pLR2 verknüpft man praktisch nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren.

( ' ' ' ' ' ' . . . '

Je nach der Orientierung des inserierten und die Thiostreptonresistenz verleihenden, ungefähr 0,8 kb Bell-Fragments ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM703A ist das erhaltene rekombinante Plasmid, bei dem die subterminale PvuII-Restriktionsstelle des die Resistenz verleihenden Fragments von der

: ' ' ~'³⁵ " '.. ' " -^: . ^;' ' '

flankierenden Sacl-Stelle des Pläsinids pEL7 entfernt

(nicht nächstliegend) inseriert ist. Das Plasmid pNM703B ist das rekombinante Plasmid mit der umgekehrten Orientierung. Die erhaltene DNA-Suspension enthalt daher die Plasmide pNM703A und pNM703B. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM703Ä und pNM703B geht aus Fig. 4 der Zeichnung hervor.

Beispiel 15

. . 10 ' · · . . "

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM703A und Streptomyces ambofaciens/pNM703B

Unter Verwendung der nach Beispiel 14 hergestellten DNA konstruiert man die gewünschten Transforrnanten praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben. Die gegenüber Thiostrepton resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM703A _v und Streptomyces ambofaciens/pNM703B werden isoliert, ge-

züchtet und dann in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der enthaltenen Plasmide (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)) identifiziert. Die Transformäntenkultüren werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet

^;w 25 -

Beispiel 16

Konstruktion der Plasmide pNM706A und pNM706B

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 12A bis 12C beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß man hierzu das Plasmid pNM703Ä (isoliert aus Streptomyces ambofaciens/pNM703A von¹ Beispiel 15) verwendet und nicht das Plasmid pNM704A.

In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten und die Neomycinresistenz verleihenden, ungefähr 3,4 kb BamHI-

Fragments ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM706A ist das rekombinante Plasmid, bei dem die subterminale Pstl-Restriktionsstelle des die Resistenz verleihenden Fragments am nächsten zur flankierenden Sacl-Stelle des Plasmids pNM70,3A inseriert ist. Das Plasmid pNM706B ist das rekombinante Plasmid mit der umgekehrten Orientierung. Zusätzlich werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pNM706A und pNM706B gebildet, da das Plasmid pNM703A über zwei Bell-Restriktions- stellen für die Insertion des die Neomycinresistenz verleihenden Fragments verfügt. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM706A und pNM706B geht aus Fig. der Zeichnung hervor.

^ 15 β e i s ρ i el 17

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM706A und Streptomyces ambofaciens/pNM706B ' . " ·..:. '

Unter Verwendung von etwa 2 μg der DNA von Beispiel 16 führt man die gewünschten Konstruktionen praktisch wie in Beispiel 13 beschrieben durch. Die erhaltenen und gegenüber Thiostrepton sowie Neomycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM706A und Streptomyces ambo-

V-. 25 faciens/pNM7Ö6B werden isoliert, gezüchtet und durch Restriktionsenzymanalyse sowie Gelelektrophorese mit Agarose

^ bezüglich der sie bildenden Plasmide untersucht (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)). Die Transformantenkultufen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet.

35

Beispiel 18

Konstruktion der Plasmide pNM7Q7A und pNM707B

A. Züchtung von Escherichia coli 803/pIJ43 und Isolierung des Plasmids pIJ43

Mart führt die gewünschte Züchtung von Escherichia coli 803/pIJ43 (ATCC 39156) und die anschließende Isolierung des Plasmids pIJ43 jeweils unter Anwendung des in R.W. Da vis, A Manual For Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York, V*St.A. (1980) beschriebenen Verfahrens durch. Die pIJ43-DNA wird in üblicher Weise in TE-Puffer ¹^ suspendiert und dann zur Aufbewahrung auf -20⁰C gekühlt.

p-r-r.

B. Verdauung und Isolierung des ungefähr 2,8 kb SaII-Fragments des Plasmids pIJ43

Etwa 20 ^g der Plasmid-pIJ43-DNA, 10 μΐ Reaktionsmischung*, 10 μΐ BSA (1 mg/ml), 39 μΐ Wasser und 1 μΐ Sail-Restriktionsenzym (hergestellt durch solche Verdünnung, daß 1 μΐ hiervon etwa 60 New England Bio Labs-^Einheiten enthält) bebrütet man etwa 60 Minuten bei Umgebungstemperatur. Man gibt ein gleiches Volumen an 4 molarem Ammoniumacetat Und 2 Volumina an 95 %-igem Ethanol zu, worauf man das Gemisch zur Ausfällung der DNA etwa 18 Stunden auf -20⁰C kühlt. Der DNA-Niederschlag wird durch Zentrifugation gesammelt. Die gewünschten ungefähr 2,8 kb SaJLI-Fragmente werden in üblicher Weise durch Gelelektrophorese mit Agarp.se abgetrennt und isoliert (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)). ';,;.

* Die Reaktionsmischung für das Sall-Restriktionsenzym wird mit folgender Zusammensetzung hergestellt: 1,5 mMol NaCl 60 mMol Tris-HCl, pH 7,9

. .... - 38 -

mMol MgCl₂ 60 mMol 2-^Mercaptbethanol

, C. Addition von BeiI-Linkern an das ungefähr 2,8 kb SaII-

5 ' . ' : . , Fragment des Plasmids pIJ43

/ 1 :

I- "' ' ' '

Die Addition von Bcll-Linkern* wird praktisch wie in Science 196, 1313 (1977) beschrieben durchgeführt. Das erhaltene Fragment wird mit Bell-Restriktionsenzym behandelt, um so die gewünschten klebrigen Bcll-Termini zu bilden. Das ungefähr 2,8 kb BeiI-Fragment wird dann in üblicher Weise isoliert und bis zur anschließenden Verknüpfung aufbewahft.

* Die Verknüpfer BeiI/d(CGGATCCG)/ und andere Verknüpfer sind von folgender Firma erhältlich: Collaborative Research Inc., 128 Spring Street, Lexington, Massachusetts 02173, V.St.A.

²⁰ D. Verknüpfung

Etwa 1 pg des mit Bell verdauten Plasmids pEL7 (hergestellt gemäß Beispiel 8B) und 1 μ^ des ungefähr 2,8 kb- ', Fragments des Plasmids pIJ43 (hergestellt gemäß Beispiel 18B und 18C) verknüpft man praktisch nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren miteinander.

In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten, die Erythromycinresistenz verleihenden, ungefähr 2,8 kb BcII-Fragments ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM707A ist das rekombinante PlaSmid, bei welchem die subterminale Pstl-Stelle des die Resistenz verleihenden Fragments am nächsten zu der flankierenden Sacl-StelIe des Plasmids pEL7 inseriert ist. Das plasmid pNM707B ist das rekombinante Plasmid mit der umgekehrten Orientierung. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM707A und pNM707B geht aus Fig. 5 der Zeichnung hervor*

• . · . - 39 - ' - .· ^;:- . ·

' .'-.

Beispiel 19

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM707A und Streptomyces ambofaciens/pNM707B ,; ' . _: '

' ⁵ ' . . . '. . ' . ' . ·./ .· ' '·' '' .'

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon hier jedoch die Plasmid-pNM707A-DNA und die PlasmidpNM707B-DNA verwendet und nicht die DNA von Beispiel 8C. *0 Die gewünschten Transformanten werden bezüglich einer Erythroraycinresistenz selektiert, indem man die regenerierenden Protoplasten mit Oberagar aus R2-Medium überdeckt, der so viel Erythromycin enthält, daß sich auf der Platte eine Konzentration von 50 μg/ml ergibt. Die erhaltenen und ge- ^" 15 genüber Erythromycin resistenten Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM707A und Streptomyces ambofaciens/. pNM707B werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert,

gezüchtet und dann in herkömmlicher Weise durch Restrikf; -- . . ' ^:

tionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglieh der enthaltenen Plasmide identifiziert (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)). Die Transformantenkulturen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet. '

_ 25 Beispiel:' 20

'v- Konstruktion der Plasmide pNM708A und pNM708B

A. Addition von BcJ₁I-Linkern an das mit BamHI verdaute Plasmid pBR322

Die Addition von BcII-Linkerη an das mit BamHI verdaute Plasmid pBR322 (hergestellt gemäß Beispiel 6B) wird praktisch wie in Science 196, 1313 (1977) beschrieben dürchgeführt. Das erhaltene Fragment wird mit Bc_Xl-Restriktionsenzym behandelt, um so die gewünschten klebrigen Bcll-Termini zu bilden. Das Fragment wird dann nach bekannten Ver-

* fahren isoliert und bis zur anschließenden Verknüpfung aufbewahrt.

B. Verknüpfung

Etwa 20 μ9 des mit Bell teilverdauten Plasmids pNM702A (hergestellt gemäß Beispiel 12B) und etwa 10 pg der Plasmid-pBR322-DNA mit klebrigen Bcll-Termini verknüpft man praktisch nach dem in Beispiel 2C beschriebenen Verfahren miteinander, bie erhaltene DNA wird zweimal in 70 %-igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer suspendiert. . .

In Abhängigkeit von der Orientierung des inserierten pBR322-Fragments ergeben sich rekombinante Plasmide mit zwei Orientierungen. Das Plasmid pNM708A ist-das rekombinante Plasmid, bei welchem die subterminale Hindlll-Restriktionsstel-Ie des pBR322-Fragments am nächsten zur flankierenden Sacl-Stelle des Plasmids pNM702A inseriert ist. Das Plasmid pNM708B ist das rekombinante Plasmid mit der umgekehrten Orientierung. Zusätzlich werden auch die Insertionsisomeren der Plasmide pNM708A und pNM708B gebildet, da das Plasmid pNM7Ö2A über zwei BcI₁I-Restriktionsstellen für die Insertion des pBR322-Fragments verfügt. Ein Restriktionsstellenplan für jedes der Plasmide pNM708A und pNM708B geht aus Fig. 6 der Zeichnung hervor.

B e i s ρ i e 1 21 /

Konstruktion von Escherichia coli K12 HBl01/pNM708A und Escherichia coli K12 HBl01/pNM708B

Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon zur Transformation jedoch die Plasmid-DNA von Beispiel 2OB und nicht das Plasmid pLR2 verwendet, überlebende Kolonien werden zuerst selektiert und bezüglich des erwarte-

I I

' . - 41 - '· ' ' ' - ' . .·. ; ;

' · R S ' .' ' " ' ' ' ' · '" '

ten Phenotyps (Amp , Tet ) untersucht, worauf man sie in üblicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und Gelelektrophorese mit Agarose bezüglich der in ihnen enthaltenen Plasmide als die gewünschten Transformanten von Escherichia coli K12 HBl01/pNM708A und Escherichia coli K12 HBlOl/ pNM708B identifiziert (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)). Die Transformantenkulturen werden zur anschließenden Produktion und Isolierung ihrer Plasmide verwendet.

Bei.spiel. 22

Konstruktion von Streptomyces ambofaciens/pNM708A und ^v Streptomyces ambofaciens/pNM708B

'-*- 15 Die gewünschten Konstruktionen werden praktisch wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei man abweichend davon zur Transformation jedoch die DNA von Beispiel 20 und nicht die Plasmide pNM702A und pNM702B verwendet. Die er- *' """ haltenen Transformanten werden nach dem in Beispiel 9 be-

schriebenen Verfahren bezüglich ihrer Thiostreptonresistenz selektiert. Die so konstruierten thiostreptonresistenteii Kolonien von Streptomyces ambofaciens/pNM708A und Streptomyces ambofaciens/pNM708B werden unter Anwendung bekannter Verfahren isoliert und dann in herkömmlicher Weise durch Restriktionsenzymanalyse und elektröphoretische Analyse bezüglich der enthaltenen Plasmide identifiziert (Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)).

Beispiele für Plasmide und Transformanten, die sich in der oben beschriebenen Weise konstruieren lassen, gehen aus den folgenden Tabellen I und II hervor.

35

X-

ω cn

ω ο

to σι

to ο

σι

TABELLE I Beispiele für Plasmide

Beispiel Nr.

Name des Plasmids

Ungefähre Größe in kb

Konstruktion

23

24 25

26

27

28 29

30

PNM709A

pNM709B PNM710A

PNM710B pNM71IA

pNM7HB pNM712A

12,4

12,4 11,6

11,6 15,2

15,2 14,4

pNM712B 14,4

Verknüpfung des die Neomycinresistenz verleihenden, ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragments mit dem Plasmid pNM702A an der in Fig. 4 gezeigten Stelle A. Die Orientierung des ungefähr 3,4 kb-Fragments ist gleich wie bei pNM705A.

Umgekehrte Orientierung von pNM709A. .

Verknüpfung des die Neomycinresistenz verleihenden, ungefähr 3,4 kb BamHI-Fragments mit dem Plasmid pNM703A an der in Fig. 5 gezeigten Stelle A. Die Orientierung des ungefähr 3,4 kb-Fragments ist gleich wie bei pNM7 06A.

Umgekehrte Orientierung von- pNM710A..

Verknüpfung des die Erythromycinresistenz verleihenden, ungefähr 2,8 kb SaII-Fragments, das mit BcJ₁I-Linkern versehen ist, mit dem mit Bell restriktierten Plasmid pNM705A. Die Orientierung des ungefähr 2,8 kb-Fragments ist gleich wie bei pNM707A.

Umgekehrte Orientierung von pNM711A.

Verknüpfung des die Erythromycinresistenz verleihenden, ungefähr 2,8 kb Sa₁II-Fragments, das mit Bcll-Linkern versehen ist, mit dem mit Bell restriktierten Plasmid pNM706A. Die Orientierung des ungefähr 2,8 kb-Fragments ist gleich wie bei pNM707A.

Umgekehrte Orientierung von pNM712A.

σι

TABELLE I (Fortsetzung)

Beispiel Nr.	Name des Plasmids	Ungefähre Größe in kb	Konstruktion
31	PNM713A	14,4	Verknüpfung des ungefähr 5,4 kb BamHI-Fragments des Plasmids pBR325 mit dem ungefähr 9 kb BcII-Fragment von pNM7 02B. Inser tion und Orientierung des ungefähr 5,4 kb-Fragments sind gleich wie bei pNM708A.
32	PNM713B	, 14,4	Umgekehrte Orientierung von pNM713A.
33	PNM714A	17,2	Verknüpfung des ungefähr 4,8 kb BamHI-Fragments des Plasmids pBR328 mit dem ungefähr 12,4 kb BeiI-Fragment von pNM705A. In sertion und Orientierung des ungefähr 4,8 kb-Fragments sind gleich wie bei pNM708A.
34	PNM714B	17,2 .	Umgekehrte Orientierung von pNM714A.
35	PNM7L5A	17,0	Verknüpfung des ungefähr 5,4 kb BamHI-Fragments des Plasmids pBR325 mit dem ungefähr 11,6 kb Bcll-Fragment von pNM706A. Die Orientierung des ungefähr 5,4 kb-Fragments ist gleich wie bei PNM708A. ' . *... .'.
36	PNM716A	14,0	Verknüpfung des ungefähr 4,4 kb BamHI-Fragments des Plasmids pBR322 mit dem ungefähr 9,6 kb Bcll-Fragment von pNM707A. In sertion und Orientierung des ungefähr 4,4 kb-Fragments sind gleich wie bei pNM708A.
37	PNM717A	17,2	Verknüpfung des ungefähr 4,8 kb-BamHI-Fragments des Plasmids pBR328 mit dem ungefähr 12,4 kb Bcll-Fragment von pNM711A. Orientierung und Insertion des ungefähr 4,8 kb-Fragments sind so, daß sich die Pstl-Stelle am dichtesten an dem die Thio- streptonresistenz verleihenden Fragment befindet.
38	PNM718A	20,7 -	Genau so wie beim Plasmid pNM717A, wobei jedoch das ungefähr 8,3. kb BamHI'-Fragment des Plasmids pBR324 anstelle des ungefähr 4;8 kb-Fragments von pBR328 verwendet wird.

TABELLE I (Fortsetzung)

Beispiel Nr.	Name des Plasmids	Ungefähre Größe in kb	Konstruktio η
39	pNM719A	10,9	Verknüpfung des pEL7, ungefähr 9,1kb Xhol-Sacl-Fragments, das mit BamHI-Linkern versehen ist, mit dem ungefähr 1,8 kb BamHI- Fragment von pLR2. Die Orientierung des ungefähr 1/8 kb-Frag- ments ist gleich wie bei pNM7 02A. ,
40	PNM719B	10,9	Umgekehrte Orientierung von pNM719A.
41	pNM720A	5,55	Verknüpfung des pEL7 ungefähr 4,75 kb Xhol-Bcll-Fragments, das mit Bcll-Linkern versehen ist, mit dem ungefähr 0,8 kb BcII- Fragment von pLR2. Die Orientierung des ungefähr 0,8 kb-Frag- ments ist gleich wie bei pNM703A.
42 -	pNM720B	5,55	Umgekehrte Orientierung von pNM720A.

TABELLE II Beispiele für Transformanten

10

Ötreptomyces R/R ,worin R für ambofaciens, aureofaciens, griseofuscus, fradiae, lividans, lividans 1326, granuloruber, tenebrarius oder cinnamonensis steht und R unabhängig eines der Plasmide pNM702A, pNM702B, PNM704A, pNM704B, pNM705A, pNM705B, pNM703A, pNM703B, PNM706A, pNM706B, pNM707A, pNM707B, pNM708A oder pNM708B oder irgendein anderes, in Tabelle I angegebenes Plasmid bedeutet.

15

20

25

30

2. Escherichia coli R²/R³, worin R² für K12 oder K12 HBlOl steht und R unabhängig eines der PlasmiQe pNM708A, PNM708B, PNM713A, PNM713B, pNM714A, pNM714B, pNM715A, PNM716A, PNM716B oder pNM718A bedeutet.'

35

Claims (13)

1. - 46 - ·..·. · ' . ... ' 1Erfindunqsansprüche:

   1. Verfahren zur Herstellung eines funktionell unabhängigen, rekombinanten DNÄ-Klonierungsvektors, d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t , daß man

   a) ein funktionelles replikonhaltiges Restriktionsfragment des Plasmids pEL7 an

   b) ein oder mehr DNA-Segmente, die eine Resistenz gegenüber wenigstens einem Antibiotikum verleihen, wenn sie .

   in eine sensitive Wirtszelle transformiert sind, und

   c) gegebenenfalls an ein Restriktionsfragment, das ein.Replikon, welches in Escherichia coli funktionell ist, und ein DNA-Segment enthält, das eine Antibiotikumresistenz in einer sensitiven Wirtszelle von Escherichia coli verleiht, wobei diese Wirtszelle gegenüber einer Transformation, Zellteilung und Züchtung suszeptibel ist, .

   bindet.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dad ure h gekennzeichnet, daß das Restriktionsfragment von pEL7 das ungefähr 6,78 kb BcII-Restriktionsfragment ist.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet, daß die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Thiostrepton durch das ungefähr 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment oder das ungefähr 0>8 kb Bcll-Restriktipnsfragment des Plasmids pLR2 verliehen wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Neomycin durch das ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl verliehen wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, d adurch gekenn ζ e i c h η e t ,daß die Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Erythromycin durch die Restriktionsfragmente

   ungefähr 2,8 kb Sail, ungefähr 2,7'kb Sall-Bglll, ungefähr 3,0 kb HindiΓΙ, ungefähr 2,5 kb Sall-BamHI, ungefähr 2,8 kb Xhol-Bglll oder ungefähr 4,1 kb EcoRI-BamHI des P'lasmids pIJ43 verliehen wird.

   ; · . ' ' -.. ' ' :.
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, da durch gekennzeichnet, daß das Replikon, das in Escherichia coli funktionell ist, und das DNA-Segment, das eine Antibiotikumresistenz in Escherichia coli

   1Ό verleiht, ein Restriktionsfragment der Plasmide pBR322, pBR324, pBR325 oder pBR328 enthält.
7. 7. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3 zur Herstellung der Plasmide pNM702A und pNM702B, d a d u r c h g e kennzeichnet, daß man das ungefähr 1,6 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 mit dem ungefähr 6,78 kb BcII-Restriktionsfragment des Plasmids pEL7 verknüpft. ,
8. 8. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 4, zur Herstellung der Plasmide pNM704A und pNM704B, dadurch gekenn ze ichnet , 'daß man das ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pLRl mit dem ungefähr 6,78 kb BcJ₁I-Restriktionsfragment des Plasmids pEL7

   verknüpft. ' ,
9. 9. Verfahren nach Punkt 1 bis 5 zur Herstellung der

   ν

   Plasmide pNM705Ä und pNM705B und der Insertionsisomeren -, hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man das mit BcJ₁I teilverdaute Plasmid pNM702A mit dem ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids¹ pLRl verknüpft. .
10. 10. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 3 zur Herstellung der Plasmide pNM703A und pNM703B, d a du r c h g e k e η η ζ e ich η e t , daß man das ungefähr ,0,8 kb BcII-Restriktionsfragment des Plasmids pLR2 mit dem ungefähr

    6,78'kb Bcll-Restriktionsfragment des PlasmidspEL7 verknüpft.
11. 11. Verfahren nach Punkt 1,2 oder 4 zur Herstellung des ^ Plasmids pNM706B und der Insertionsisomeren hiervon, da durch gekenn ζ e i chnet , daß man das mit Bell teilverdaute Plasmid pNM703A mit dem ungefähr 3,4 kb BamHI-Restriktiönsfragment des Plasmids pLRl Verknüpft.
12. 12. Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 5 zur Herstellung der Plasmide pNM707A und pNM707B, dadurch gek en η ζ eic h η et, daß man ein ungefähr 2,8 kb
    SaJ₁I-Restriktionsfragment des Plasmids pIJ4 3, das klebrige Termini Bell enthält, mit dem ungefähr 6*78 kb BgII-Re-

    15 striktionsfragment des Plasmids pEL7 verknüpft.
13. 13. , Verfahren nach Punkt 1, 2 oder 6 zur Herstellung der Plasmide pNM708A und pNM708B und der Insertionsisomeren . hiervon, dadurch gekennzeichnet, daß man ein replikonhaltiges BamHI-Restriktionsfragment des Plasmids pBR322, das klebrige Termini Bell enthältΓ mit dem mit Bell teilverdauten Plasmid pNM702A verknüpft.

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